CN101370828A

CN101370828A - 抗炎dAb

Info

Publication number: CN101370828A
Application number: CNA2006800527583A
Authority: CN
Inventors: B·P·沃尔温; I·M·汤姆林森; J·A·李; A·G·多伊尔; P·A·詹宁斯
Original assignee: Arana Therapeutics Ltd
Current assignee: Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-20
Publication date: 2009-02-18
Also published as: NZ569405A; NZ569406A; ZA200805827B; BRPI0620115A2

Abstract

本发明提供了与人TNF－α结合的重组结构域抗体(dAb)，所述dAb包含免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至少一个具有来源于新世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所述CDR选自YAATKLQS(SEQ ID No：1)、YEASSLQS(SEQ ID No：2)、YEASKLQS(SEQ ID No：3)和YSASNLET(SEQ ID No：4)。所述重组结构域抗体用于检测样品中的人TNF－α或者用于治疗特征在于人TNF－α活性的病症。

Description

抗炎dAb

发明领域

本发明涉及可用于人类治疗的重组结构域抗体(dAb)。更具体而言，本发明涉及与人TNF-α结合的结构域抗体(dAb)以及其在治疗特征在于人TNF-α活性的病症中的用途。

发明背景

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由众多细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)产生的一种细胞因子，它参与介导休克和多种人类疾病和病症的病理生理学，所述人类疾病和病症包括脓毒症、感染、自身免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病。

在对抗由人TNF-α介导的有害效应的努力中，已寻找结合并中和人TNF-α的抗体作为抑制TNF-α活性的手段。一些最早期的针对人TNF-α的抗体是由杂交瘤细胞系分泌的小鼠单克隆抗体，所述杂交瘤细胞系是从收获自用人TNF-α免疫的小鼠的淋巴细胞制备的。虽然这样的抗体能有效地结合并中和人TNF-α，但它们在体内疗法中的用途却由于与给人类施用小鼠抗体相关的问题而受到限制，特别是在人体中引发针对小鼠抗体的不希望的免疫应答，即所谓人抗小鼠抗体(HAMA)反应。

在为克服这些问题所做的一项尝试中，对鼠抗人TNF-α抗体进行遗传改造以更像人类。例如，已形成了人/小鼠嵌合抗体，其中将来自小鼠基因组的抗体可变区序列与来自人基因组的抗体恒定区序列相组合。所述嵌合抗体展现了亲本小鼠抗体的结合特征和与人恒定区相关的效应子功能。虽然这些嵌合抗体已经在人类治疗中使用，但它们仍然保留了一些鼠类的序列，因此仍然可能在人接受者中引发抗嵌合抗体的反应，特别是当在延长的时间内进行施用时，因而限制了它们的治疗应用。

已经用人杂交瘤技术开发了针对人TNF-α的人单克隆抗体。然而，这种方法遭到关于免疫接种人受试者的伦理的、临床的和免疫学的限制。

假定这些非人灵长类抗体在人中将是耐受的，因为它们在结构上类似于人抗体(Ehrlich PH等人，Human and primate monoclonalantibodies for in vivo therapy.Clin Chem.34：9pg 1681-1688(1988))。此外，因为人抗体是在恒河猴中是非免疫原性的(Ehrich PH等人，Rhesus monkey responses to multiple injections of humanmonoclonal antibodies.Hybridoma 1987；6：151-60)，所以可能反过来也是可行的，并且灵长类抗体在人中将是非免疫原性的。

进化上遥远的灵长类，例如新世界灵长类，不仅足够不同于人以允许产生针对人抗原的抗体，还足以类似于人以具有类似于人抗体的抗体，从而使得当衍生自此类灵长类的抗体被引入人中时，宿主不产生抗抗体免疫应答。新世界灵长类(广鼻猴下目(Platyrrhini))包含至少53个种，其通常分成2个科：狨科(Callithricidae)和悬猴科(Cebidae)。狨科由狨和

组成。悬猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、夜或枭猴和吼猴。

先前的研究已表征了表达的普通狨(Callithrix jacchus)的免疫球蛋白重链储库(von Budingen H-C等人，Characterization of theexpressed immunoglobulin IGHV repertoire in the New Worldmarmoset Callithrix jacchus.Immunogenetics 2001；53：557-563)。鉴定了6个IGHV亚群，其显示了与它们的人IGHV对应物的高度序列相似性。当与互补决定区(CDR)相比较时，构架区是更保守的。普通狨与人IGHV序列之间的相似性程度小于旧世界灵长类与人之间的相似性程度。

结构域抗体

结构域抗体(dAb)是抗体的最小功能性结合单元，并且相应于抗体的重链可变区(V_H)或轻链可变区(V_L)。结构域抗体具有约13kDa的分子量，或小于完整抗体大小的十分之一。

免疫球蛋白轻链被称为κ或λ轻链，和重链被称为γ、μ、δ、α或ε。可变区给予抗体以特异性。在每个可变区内是具有高可变性的区域，或者被称为互补决定区(CDR)，其侧翼是被称为构架区的更保守的区域。每个可变区内是3个CDR和4个构架区。

与常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物系统中良好表达。它们的小尺寸允许更高的摩尔量/克产物，从而提供了效力/剂的显著增加。此外，结构域抗体可以用作构建部件，以制备治疗产物例如多重靶向性dAb，其中包含两个或更多个可变结构域的构建体结合至两个或更多个治疗靶，或靶向肺或口服施用的dAb。

发明概述

第一方面，本发明提供了与人TNF-α结合的重组结构域抗体(dAb)，所述dAb包含免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至少一个具有来源于新世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所述CDR选自YAATKLQS(SEQ ID No：1)、YEASSLQS(SEQ ID No：2)、YEASKLQS(SEQ ID No：3)和YSASNLET(SEQ IDNo：4)。

第二方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据本发明第一方面的dAb，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

第三方面，本发明提供了根据本发明第一方面的dAb在检测人TNF-α的诊断应用中的用途。

第四方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF-α活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用根据本发明第二方面的药物组合物。

第五方面，本发明提供了编码本发明第一方面的dAb的核酸序列。

附图简述

图1显示了接纳体(acceptor)dAb的氨基酸序列(SEQ ID No：6)和核苷酸序列(SEQ ID No：5)。

图2显示了十一个(11)狨和六个(6)枭猴Vκ基因区段的核苷酸和氨基酸序列。

图3显示了接纳体dAb的氨基酸和核苷酸序列(两条链)。图中标示了KpnI和SanDI的限制性消化位点，其切出包含CDR2的区域。被除去的CDR2残基以下划线标示。

图4显示了图2中所示的核苷酸(A)和氨基酸(B)序列的序列比对，其中显示了在克隆和最终序列验证过程中所使用的寡核苷酸。

图5证明了嫁接有CDR2的dAb抑制TNF与重组TNF受体结合的能力。受试dAb如下：枭猴1(CDR＝YAATKLQS；SEQ ID NO：1)、枭猴2(CDR＝YEASSLQS；SEQ ID NO：2)、狨1(CDR＝YEASKLQS；SEQ IDNo：3)、狨2(CDR＝YSASNLET；SEQ ID No：4)和接纳体dAb(CDR＝YSASELQS；SEQ ID NO：49)。

图6证明了相对于接纳体dAb(化合物145)而言化合物100和123在小鼠L929成纤维细胞上中和TNF的细胞毒活性的经改善的能力。

发明详述

优选地，所述CDR为CDR2。

在一个优选的实施方案中，所述dAb具有选自下列的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物145；SEQ ID No：7]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物123；SEQ ID No：8]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物100；SEQ ID No：9]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物196；SEQ ID No：10]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物134；SEQ ID No：50]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物137；SEQ ID No：51]

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR

[化合物121；SEQ ID No：52]。

在进一步的方面，本发明提供了编码本发明第一方面的dAb的核酸序列。

此处所用的术语“与......结合”意指抗原被免疫球蛋白可变区以1μM或更低的解离常数(K_d)进行结合，如使用例如BI Acore^TM表面等离子体共振系统和BIAcore^TM动力学评估软件(例如，2.1版)通过表面等离子体共振分析所测量的。特异性结合相互作用的亲和力或解离常数(K_d)优选地为约500nM或更低，更优选地约300nM或更低，以及优选地至少300nM至50pM，200nM至50pM，和更优选地至少100nM至50pM，75nM至50pM，10nM至50pM。

此处所用的术语“可变结构域”是指折叠的多肽结构域，其包含免疫球蛋白重链或轻链可变结构域所特征性的序列并且与抗原特异性地结合。结构域抗体或dAb与单个可变结构域多肽是等价的。

本领域技术人员将会意识到，可变结构域序列的其余部分可以来源于人、新世界灵长类或旧世界灵长类可变结构域序列，其由于和人类在进化上的关联而与人的序列分享高度的同源性。因此，例如，可以将选自上面序列的CDR嫁接到人或灵长类可变区序列中以替代野生型CDR。

因此，本发明还基于用于扩增新世界灵长类免疫球蛋白可变结构域基因的方法，例如使用对于重链和轻链可变结构域基因家族特异的引物通过聚合酶链式反应(PCR)从提取自新世界灵长类淋巴细胞的核酸中进行扩增。例如，关于重链和轻链可变结构域基因(分别为VH和V_L)的边界的信息可以用于设计PCR引物，所述引物从经克隆的重链或轻链编码序列中扩增可变结构域，所述重链或轻链编码序列编码已知与给定抗原相结合的抗体。然后，将扩增的可变结构域单独地或者作为与另一多肽序列的融合物插入合适的表达载体中。然后，就与所需抗原的高亲和力结合来对所表达的可变结构域进行筛选。

V_H和V_L结构域储库可以是天然存在的免疫球蛋白序列储库或合成的储库。天然存在的储库是例如从表达免疫球蛋白的细胞制备的储库，所述表达免疫球蛋白的细胞从一种或多种灵长类中收获。此类储库可以是原初的(na ve)，即从新生的表达免疫球蛋白的细胞制备，或者是重排的，即从例如成年灵长类B细胞制备。需要时，随后对从天然储库或任何储库中鉴定的结合靶抗原的克隆实施诱变并进一步进行筛选，以产生和选择具有改善的结合特征的变体。

单个免疫球蛋白可变结构域的合成储库是通过向经克隆的可变结构域中人工引入多样性来制备的。

可以通过例如噬菌体展示，就所希望的结合特异性和功能行为来筛选V_H和V_L结构域储库。用于构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法在本领域中是众所周知的。噬菌体展示技术已在本领域中进行了广泛描述，以及用于产生和筛选这样的文库以及对它们的产物进行亲和力成熟的方法和化合物的例子可以在例如下列文献中找到：Barbas等人，(1991)PNAS 88：7978-7982；Clarkson等人.(1991)Nature 352：624：628；Dower等人，PCT.91/17271，美国专利号5,427,908，美国专利号5,580,717和EP527,839；Fuchs等人，(1991)Bio/Technology 9：1370-1372；Garrad等人，(1991)Bio/Technology9：1373：1377；Garrard等人，PCT WO 92/09690；Gram等人，(1992)PNAS89：3576-3580；Griffiths等人，(1993)EMBO J 12：725：734；Griffiths等人，美国专利号5,885,793和EP589,877；Hawkins等人，(1992)J Mol Biol 226：889-896；Hay等人，(1992)Hum AutibodHybridomas 3：81-85；Hoogenboom等人，(1991)Nuc Acid Res 19：4133-4137；Huse等人，(1989)Science 246：1275-1281；Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86；Knappik等人，PCT WO 97/08320；Ladner等人，美国专利号5,223,409,5,403,484,5,571,698，5,837,500和EP 436,597；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554；McCafferty等人，PCT.WO 92/01047，美国专利号5,969,108和EP 589,877；Salfeld等人，PCT WO 97/29131，美国临时申请号60/126,603；和Winter等人，PCT WO 92/20791和EP368,684。

表达V_H和V_L结构域储库的重组文库可以在微生物例如酵母或细菌的表面上进行表达(参见PCT公开WO99/36569和98/49286)。

选择性淋巴细胞抗体法(Selective Lymphocyte AntibodyMethod)或SLAM(如在现有技术中所称呼的)，是快速产生高亲和力抗体的另一种方法。与噬菌体展示方法不同，所有抗体全都是二价的。为了产生新世界灵长类抗体，用人抗原例如TNF-α多肽免疫新世界灵长类。在免疫后，取出细胞并在独个微量孔中进行选择性增殖。从孔中取出上清液并就结合和功能进行测试。可以回收基因序列用于后续操作，例如人源化、Fab片段、scFv或dAb产生。因此，另一个例子是通过SLAM及其衍生形式(Babcock，J.S.等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci，USA 93；7843-7848，美国专利5,627,052和PCT公开WO92/02551)对本发明的抗体或抗体种类进行衍生化。SLAM的调整形式，例如使用备选方法来测试上清液，例如淘选，也在本发明的范围内。

在一种表达系统中，在核糖体上展示重组肽/蛋白质文库(例如参见Roberts，RW和Szostak，J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94：12297-123202以及PCT公开号WO98/31700)。因此，另一个例子涉及DNA文库(例如，优选从经免疫的细胞制备的抗体或衍生物的DNA文库，但不限于此)的产生和体外转录，翻译该文库，从而使得蛋白质和“经免疫的”mRNA停留在核糖体上，亲和力选择(例如通过与RSP结合)，mRNA分离，反向翻译和后续扩增(例如通过聚合酶链式反应或相关技术)。必要时可以偶联另外的选择和扩增循环，以通过在这种系统中引入体细胞突变或通过现有技术中已知的其他亲和力成熟方法来进行亲和力成熟。

另一个例子考虑应用乳状液区室化技术(emulsioncompartmentalisation technology)以产生本发明的结构域抗体。在乳状液区室化中，将体外和光学分选方法与在乳状液的油滴内的水相中翻译的蛋白质及其核苷酸编码序列的共区室化相组合(参见PCT公开号WO99026711和WO0040712)。用于生产和选择抗体的主要要素基本上类似于核糖体展示的体外方法。

CDR序列可以得自几个来源，例如数据库，如国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information)蛋白质和核苷酸数据库，The Kabat Database of Sequences of Proteins ofImmunological Interest。备选地，可以从V_H和V_L结构域储库预测CDR区(参见例如Kabat EA和Wu TT.Attempts to locatecomplementarity determining residues in the variable positionsof light and heavy chains.Ann.NYAcad.Sci.190：382-93(1971))。CDR序列可以是基因组DNA或cDNA。

存在许多方法可以把替代CDR嫁接到可变结构域序列中，并且这样的方法对于本领域技术人员将会是熟悉的。本发明的优选方法涉及经由引物指导的诱变来替换可变区结构域中的CDR2。该方法由下述步骤组成：使编码所需突变的合成寡核苷酸与靶区域退火，其中它充当引物用于起始体外DNA合成；通过DNA聚合酶延伸寡核苷酸以产生携带所需突变的双链DNA；和将该序列连接并克隆到合适的表达载体中。

优选地，根据本发明的结构域抗体在人中具有低免疫原性。

术语“低免疫原性”是指结构域抗体在人中不产生这样的抗体应答，即所述抗体应答的量级足以减少以达到治疗效果来说足够的时间连续施用所述抗体的功效。

优选地，其中嫁接了CDR的可变区序列是图1中所提供的“dAb接纳体序列”(命名为化合物128)。

该dAb接纳体序列由SEQ ID No：5所示的氨基酸序列组成：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASELQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID No：6)。

该序列由SEQ ID No：5所示的核苷酸序列编码：

GAC ATC CAG ATG ACC CAG TCT CCA TCC TCT CTG TCT GCA TCT GTA GCA GAC CGT GTC ACC

ATC ACT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GAT AGT TAT TTA CAT TGG TAC CAG CAG AAA CCA

GGG AAA GCC CCT AAG CTC CTG ATC TAT AGT GCA TCC GAG TTG CAA AGT GGG GTC CCA TCA

CGT TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG CAA CCT

GAA GAT TTT GCT ACG TAC TAC TGT CAA CAG GTT GTG TGG CGT CCT TTT ACG TTC GGC CAA

GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG。

在本发明的一个优选实施方案中，将狨CDR序列YSASNLET(SEQ IDNo：4)嫁接入该dAb接纳体序列中，以便替代该dAb接纳体序列的CDR2序列(YSASELQS；SEQ ID No：49)，从而产生下面的dAb(命名为化合物145)：

化合物145

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID

No：7)。

因此，在一个优选的实施方案中，与人TNF-α结合的dAb包含SEQID No：7的氨基酸序列。

dAb序列可以进一步经历亲和力成熟以便改善其抗原结合特征，这在本发明的范围之内。这可能需要对CDR1和CDR3中的某些氨基酸残基进行修饰。

例如，如“材料和方法”中所述的，对SEQ ID No：7所示的嫁接了狨CDR的dAb进行亲和力成熟，并就TNF-结合进行测试。在进一步的优选实施方案中，与人TNF-α结合的dAb包含SEQ ID No：8或SEQID No：9的氨基酸序列。这些被分别命名为化合物123和化合物100，并且它们的序列如下所示：

化合物123

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ

ID No：8)

化合物100

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLETG

VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ ID

No：9)。

在一个特别优选的实施方案中，与人TNF-α结合的dAb包含SEQID No：10的氨基酸序列。这被命名为化合物196，并且序列提供在下面：

化合物196

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSASNLET

GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKVEIKR(SEQ

ID No：10)。

根据本发明的dAb还可以包含与其连接的免疫球蛋白恒定区(Fc区)。恒定区序列可以来源于人或灵长类序列。灵长类序列可以是新世界或旧世界灵长类序列。合适的旧世界灵长类包括黑猩猩，或其他类人猿例如大猩猩或猩猩，它们由于其与人的紧密的系统发生接近性而与人恒定区序列共享高度的同源性。

所述dAb(与其连接有或没有恒定区)可以衍生化或与另一种功能分子连接。例如，dAb可以通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式与一种或多种其他分子实体进行功能上连接，所述其他分子实体例如为另一种抗体、可检测的试剂、细胞毒剂、药物试剂和/或可以介导所述抗体与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。

dAb可以与之衍生的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。dAb还可以用可检测的酶进行衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。当dAb用可检测的酶进行衍生化时，它通过添加该酶用于产生可检测的反应产物的另外试剂来检测。dAb还可以用生物素进行衍生化，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。

本发明还扩展至聚乙二醇化的dAb(与其连接有或没有恒定区)，其相对于非聚乙二醇化的抗体多肽而言提供了增加的半衰期和针对降解的抗性而无活性(例如，结合亲和力)的损失。

dAb可以使用本领域已知的方法与聚合物分子(优选PEG)偶联，所述聚合物分子对于达到增加的半衰期和降解抗性性质是有用的。可以在本发明中使用的聚合物部分可以是合成的或天然存在的，并且包括但不限于，直链或支化的聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或杂多糖。可以在本发明中使用的合成聚合物的优选例子包括直链或支化的聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于与dAb连接的特别优选的取代的聚合物包括取代的PEG，包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖或糖原，以及将由本领域技术人员认可的其衍生物。

聚合物分子的衍生形式包括例如这样的衍生物，其中存在另外的部分或反应性基团以允许与本文所述的结构域抗体多肽的氨基酸残基相互作用。此类衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，琥珀酰亚胺基丙酸酯聚合物，和巯基-选择性反应试剂例如马来酰亚胺，乙烯砜和硫醇。可用于本发明的PEG聚合物可以是线性分子，或可以是分支的，其中多个PEG部分存在于单个聚合物中。

反应性基团(例如，MAL、NHS、SPA、VS或巯基)可以直接与PEG聚合物连接，或可以经由连接体分子与PEG连接。

在本发明中可用的聚合物的大小可以为500Da-60kDa，例如，1000Da-60kDa，10kDa-60kDa，20kDa-60kDa，30kDa-60kDa，40kDa-60kDa，以及高达50kDa-60kDa。在本发明中使用的聚合物，特别是PEG，可以是直链聚合物或可以具有分支的构象。

在本发明中可用的聚合物(PEG)分子可以使用本领域众所周知的方法与结构域抗体附着。在PEG或其他聚合物部分与本发明的抗体多肽单体或多聚体附着中的第一个步骤是用包含亲电子体的官能团替换PEG聚合物的羟基末端基团。特别地，将PEG聚合物与结构域抗体中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基附着。所述半胱氨酸和赖氨酸残基可以是天然存在的，或可以被改造到抗体多肽分子中。例如，半胱氨酸残基可以在dAb多肽的C-末端上进行重组改造，或者在dAb或其他抗体多肽中特异的溶剂可接近位置处的残基可以用半胱氨酸或赖氨酸置换。

可以将根据本发明的dAb与能够增加其体内半衰期的一种或多种分子连接。这些分子可以通过连接体连接至dAb，从而它们不干扰/在空间上阻碍抗原结合位点。备选地，可以将它们连接至恒定区。通常，此类分子是体内天然存在并且抵抗经由内源性机制的降解或去除的多肽。增加半衰期的分子可以选自下列：

(a)来自细胞外基质的蛋白质，例如，胶原，层粘连蛋白，整联蛋白和纤连蛋白；

(b)在血液中发现的蛋白质，例如纤维蛋白，α-2巨球蛋白，血清白蛋白，纤维蛋白原A，纤维蛋白原B，血清淀粉样蛋白A，庚珠蛋白(heptaglobin)，蛋白质，泛蛋白，子宫球蛋白(uteroglobulin)，β-2微球蛋白，纤溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂；

(c)免疫血清蛋白，例如IgE，IgG，IgM；

(d)转运蛋白，例如视黄醇结合蛋白，α-1微球蛋白；

(e)防卫素，例如β-防卫素1，嗜中性粒细胞防卫素1、2和3；

(f)在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，例如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运体；

(g)转铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白(参见US5977307)；脑毛细管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体，胰岛素样生长因子2(IGF2)受体，胰岛素受体；

(h)定位于肾的蛋白质，例如多囊蛋白，IV型胶原，有机阴离子运载体K1，Heymann′s抗原；

(i)定位于肝的蛋白质，例如乙醇脱氢酶，G250；

(j)凝血因子X；

(k)α-1抗胰蛋白酶；

(1)HNF1α；

(m)定位于肺的蛋白质，例如分泌组分(结合IgA)；

(n)定位于心脏的蛋白质，例如HSP 27；

(o)定位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白；

(p)骨特异性蛋白质，例如骨形态发生蛋白(BMPs)，例如BMP-2、-4、-5、-6、-7(也称为成骨蛋白(OP-1))和-8(OP-2)；

(q)肿瘤特异性蛋白质，例如人滋养层抗原，赫赛汀(herceptin)受体，雌激素受体，组织蛋白酶例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)；

(r)疾病特异性蛋白质，例如仅在活化的T-细胞上表达的抗原：包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)；护骨蛋白配体(OPGL)，参见Nature402，304-309，1999；OX40(TNF受体家族的成员，在活化的T细胞上表达，以及为已知在产生人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)的细胞中特异性地上调的唯一共刺激T细胞分子——参见J.Immunol.2000 Jul 1；16561：263-70)；金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇，人截瘫蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠类ftsH；血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-α(TGF-α)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(P1GF)，中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)，CXXXC趋化分子(fractalkine)；

(s)应激蛋白质(热休克蛋白)；

(t)参与Fc转运的蛋白质；和

(u)针对内源蛋白质例如血清白蛋白的抗体、片段或衍生物。

在本发明的一个进一步的实施方案中，根据第一方面dAb可以是多聚化的，如例如异或同二聚体，异或同三聚体，异或同四聚体，或更高次的异或同多聚体。多聚化可以增加抗原结合的强度，其中结合的强度与多个结合位点的结合亲和力总和有关。

因此，本发明提供了根据第一方面的结构域抗体，其中所述结构域抗体与至少一个其他结构域抗体连接。每个dAb可以与相同或不同的抗原结合。

dAb多聚体可以进一步包含一个或多个dAbs，所述dAbs是经连接的并且其中每个dAb与不同的抗原结合，多特异性配体，包括所谓的“双重特异性配体”。例如，双重特异性配体可以包含一对V_H结构域或一对V_L结构域。此类双重特异性配体在Domantis Ltd的WO2004/003019(PCT/GB2003/002804)中描述。

“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的例子包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种及其组合。在许多情况下，优选地将是在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。药学上可接受的物质例如湿润剂或少量的辅助物质例如湿润或乳化剂、防腐剂或缓冲质。

所述组合物可以是各种形式，包括液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如的可注射和可输注的溶液)，分散液或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体或栓剂。优选地，所述组合物是用于免疫接种的可注射溶液的形式。施用可以是静脉内、皮下、腹膜内、肌内、经皮、鞘内和动脉内。

通常，治疗组合物必须是无菌的并且在制造和储存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合于高药物浓度的有序结构。无菌可注射溶液可以通过下列方式来制备：在具有一种上面所列的成分或其组合的合适溶剂中以所需的量掺入活性化合物(即dAb)，随后过滤灭菌。

所述组合物还可以配制为用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。溶液的适当的流动性可以通过例如使用包衣剂如卵磷脂和/或表面活性剂来维持。

在某些实施方案中，活性化合物可以用载体来制备，所述载体将保护化合物不被快速释放，例如受控释放制剂，包括植入物，透皮贴剂和微胶囊化的递送系统。可以使用相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯或聚乳酸。

所述组合物还可以配制用于口服施用。在这个实施方案中，dAb可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。

所述组合物还可以配制用于直肠施用。

还可以将补充的活性化合物掺入至所述组合物中。结构域抗体可以与一种或多种另外的治疗剂例如抗炎化合物、可溶性TNF-α受体或抑制人TNF-α产生的化学试剂，或者结合其他靶标例如细胞因子或细胞表面分子的抗体一起共配制和/或共施用。备选地，它可以与可溶性免疫化学试剂例如蛋白A、C、G或L一起共施用。

有效量可以包括治疗有效量或预防有效量的本发明的dAb。治疗有效量是指以必需的剂量和时间段，对于取得所希望的治疗结果而言有效的量。预防有效量是指以必需的剂量和时间段，对于取得所希望的预防结果而言有效的量。

在一个优选的实施方案中，将组合物施用给哺乳动物，优选地人类或灵长类。

例如，根据本发明的抗人TNF-α dAb可以用于检测例如生物样品如血清或血浆中的人TNF-α，其中使用常规的免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学。可以通过竞争免疫测定法在生物学流体中测定根据本发明的抗人TNF-α dAb，其中使用用可检测物质标记的重组人TNF-α标准和未标记的抗人TNF-α抗体。

根据本发明的抗人TNF-α dAb还可用于检测来自除人类以外的其他物种例如黑猩猩、狨、恒河猴、小鼠、猪的TNF-α。

根据本发明的抗人TNF-α dAb还可用于其中希望抑制TNF-α活性的细胞培养应用。

特征在于人TNF-α活性的病症意欲包括这样的疾病和其他病症，即其中在患有所述病症的受试者中TNF-α的存在已显示负责或被怀疑负责所述病症的病理生理学，或者已显示是或被怀疑是促成所述病症恶化的因素。优选地，特征在于人TNF-α活性的病症选自炎症，炎性疾病，脓毒症，包括败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症和中毒性休克综合征；自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎以及肾病综合征；感染性疾病，包括由于感染和感染后继发的恶病质所引起的发热和肌痛；移植物抗宿主病；肿瘤生长或转移；肺部病症，包括成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺结节病、肺纤维化和矽肺；炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎；心脏病症；炎症性骨病，肝炎，凝血障碍，烧伤，再灌注损伤，瘢痕瘤形成，和瘢痕组织形成。

在本说明书自始至终，单词“包含”或者变化形式“包括”或“含有”应当理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。

本说明书中提及的所有出版物通过提及而合并入本文。本说明书中包括的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅用于提供本发明的背景的目的。它不应被视为承认任何或所有这些内容构成现有技术基础的一部分或者是在与本发明相关的领域中的公知常识，就好像它在本申请的每项权利要求的优先权日前存在于澳大利亚或其他地方。

为了能够更清楚地理解本发明的本质，现在将参考下述非限制性实施例来描述其优选形式。

实施例1

材料和方法

新世界灵长类VL基因的分离

狨(毛狨属(Callithrix)，种未知)和枭猴(夜猴(Aotustrivirgatus))基因组DNA分别以目录编号85011419和90110510获自欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。狨DNA来源于细胞系B95-8，而枭猴DNA来自细胞系OMK 637-69。

基于人Vκ前导序列和重组信号序列(RSS)的简并引物得自Walter和Tomlinson，Antibody Engineering：A Practical Approach(1996)。用于扩增种系Vκ DNA的引物如下：

引物VK1BL

AATCKCAGGTKCCAGATG(SEQ ID No：11)

引物VK1BL35a

GTTYRGGTKKGTAACACT(SEQ ID No：12)

引物VK1BL35b

ATGMCTTGTWACACTGTG(SEQ ID NO：13)。

采用引物对VK1BL x VK1BL35a或VK1BL x VK1BL35b，使用Taq聚合酶来进行基因组PCR(30个循环)。在经克隆的序列和所使用的2套引物之间存在重叠。

将PCR产物克隆入Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒(目录号K4500-01)中，并用M13正向引物和pUC反向引物进行测序。从正和反方向对序列进行确认。为了进一步确认关键序列没有发生PCR错误，对于狨序列重复两次PCR和克隆过程。核苷酸(SEQ ID No：14-24和SEQ ID No：36-41)和氨基酸(SEQ ID No：25-35和SEQ ID No：42-47)在图2中给出。狨序列1、2和3得到了确认。序列4、5、6、7和8只在初始PCR中进行了查看。序列9、10和11只在重复(即第二次)PCR和克隆中进行了查看。

合成寡核苷酸并克隆入接纳体序列中

四个CDR序列，即来自枭猴序列1(SEQ ID No：42)的YAATKLQS(SEQ ID No：1)、来自枭猴序列2(SEQ ID No：43)的YEASSLQS(SEQ ID No：2)、来自狨序列1(SEQ ID No：25)的YEASKLQS(SEQID No：3)和来自狨序列2(SEQ ID No：26)的YSASNLET(SEQ ID NO：4)，选自所指明的图2中所示的氨基酸序列。发现枭猴序列5，YYASSLQS(SEQ ID No：48)，与秘鲁夜猴(Aotus nancymaae)(Ma’s夜猴)的cNDA序列GI6176295相同，而所有其他序列是独特的。

在该表达载体(Domantis拥有专利权的载体)中的接纳体可变区(抗-TNF的结构域抗体)序列依次用KpnI和SanDI进行消化(25μg)，KpnI和SanDI切除大部分的FR2以及CDR2，如限制性消化图谱上所示的。然后，凝胶纯化该载体以除去被切除的野生型FR2和CDR2序列。

通过下述方式来进行寡核苷酸的退火：将寡核苷酸对(500pmol的在图4A和4B中所示的每种)在95℃下温育5分钟，接着在65℃下温育5分钟，然后让其在热台(hot block)上慢慢达到室温。然后，在dNTP存在下在Klenow反应中补满重叠部分。

亲和力成熟

通过构建14个分开的文库来对嫁接了狨CDR的dAb化合物145(SEQ ID No：7)进行亲和力成熟，其中每一个文库在单个氨基酸残基处具有SEQ ID No：7的序列多样化。所选的残基在下面用阴影显示。DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQ

L

WYQQKPGK

PKLLIYSASNLETGVPSRFSG

GSGT

FTLTISSL

PEDFATYYCQQP

TFGQGTKVEIKR

所述选择基于已知在成熟的人Ig储库中多样化的CDR1和CDR3中的残基，以及被观察到在相关dAb中进行诱变后产生功能性蛋白质的构架残基。对于每个所选的残基，以NKK简并性设计互补的正向和反向PCR引物对，并且进行两个初始PCR反应，其中每个PCR反应采用单诱变引物和侧翼引物。在进行清理之后，将两个PCR产物退火，随后使用单独的侧翼引物进行扩增(通过PCR的重叠延伸来进行剪接；Lowman H.L.& Clackson T.(编辑)，Phage Display：A practicalapproach，Oxford University Press，Oxford，UK)。使用固相TNF通过ELIZA对克隆进行初次筛选，并对阳性克隆进行测序。从最好的克隆中纯化出dAb蛋白质，并就在受体结合测定法和L929细胞毒性测定法中的效力进行评价。发现化合物100(SEQ ID No：9)和123(SEQID No：8)具有相对于亲本dAb即化合物145(SEQ ID No：7)而言改善的TNF中和作用。

化合物100(SEQ ID No：9)和123(SEQ ID No：8)的增强亲和力的置换的组合产生了这样的抗-TNF dAb(化合物196；SEQ ID No：10)，其在L929细胞毒性测定法中具有进一步改善的效力。

结果

抗-TNF dAb克隆在受体结合测定法(RBA)和细胞毒性测定法中的效力

如下实施抗-TNF dAb抑制TNF与其受体结合以及中和TNF介导的L929细胞的细胞毒性的能力：

受体结合测定法

就抑制TNF与重组TNF受体1(p55)结合的能力来对在14个所选位置处多样化的dAb进行测试。简而言之，将Maxisorp平板与30mg/ml抗人Fc小鼠单克隆抗体(Zymed，San Francisco，USA)一起温育过夜。在与100ng/ml的TNF受体1Fc融合蛋白(R&D Systems，Minneapolis，USA)一起温育之前，用含0.05％ Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤孔，并随后用在PBS中的1％BSA进行封闭。将每种dAb与TNF混合，后者已按10ng/ml的终浓度加入经洗涤的孔中。通过下述方式来检测TNF结合：使用0.2mg/ml生物素化的抗-TNF抗体(HyCult biotechnology，Uben，Nether lands)，随后为1：500稀释的标记有辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白(AmershamBiosciences，UK)，和随后与TMB底物(KPL，Gaithersburg，USA)一起温育。通过加入HCl来终止反应，并于450nm处读取吸光度。抗-TNF dAb活性导致TNF结合的降低，并因而导致与仅TNF对照相比而言吸光度的降低(图5)。

L929细胞毒性测定法

还就在小鼠L929成纤维细胞上中和TNF的细胞毒活性的能力，对通过微型文库多样化方法(minilibrary diversification approach)鉴定的抗-TNF dAb进行测试，包括化合物100(SEQ ID No：9)和123(SEQ ID No：8)(Evans，T.(2000)Molecular Biotechnology 15，243-248)。简而言之，将铺在微量滴定板中的L929细胞与抗-TNF dAb、100pg/ml TNF和1mg/ml放线菌素D(Sigma，Poole，UK)一起温育过夜。细胞生存力通过下列方式来测量：与[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(Promega，Madison，USA)一起进行温育，随后在490nm处读取吸光度。抗-TNFdAb活性导致TNF细胞毒性的降低，并因而导致与仅TNF对照相比而言吸光度的增加。与亲本dAb化合物145(SEQ ID No：7)相比较的这些结果呈现在图6中。

本领域技术人员将会意识到，可以对如具体实施方案中所示的本发明进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，这些实施方案在所有方面被视为举例说明性的而非限制性的。

序列表

Claims

1.与人TNF-α结合的重组结构域抗体(dAb)，所述dAb包含免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，其中所述可变结构域包含至少一个具有来源于新世界灵长类的序列的互补决定区(CDR)，其中所述CDR选自YAATKLQS(SEQ ID No：1)、YEASSLQS(SEQ ID No：2)、YEASKLQS(SEQ ID No：3)和YSASNLET(SEQ ID No：4)。

2.权利要求1的重组dAb，其中所述CDR为CDR2。

3.权利要求1或权利要求2的重组dAb，其中所述dAb具有选自下列的序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：7)；

DIQMTQSPSSLSΛSVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：8)；

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：9)；

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSΛS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：10)；

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKPPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：50)；

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTK

VEIKR(SEQ ID No：51)；和

DIQMTQS PSSLSAS VGDRVTITCRASQSIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：52)。

4.权利要求3的重组dAb，其中所述dAb具有下列序列：

DIQMTQSPSSLSΛSVGDRVTITCRASQAIDSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSAS

NLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLLPEDFATYYCQQVVWRPFTFGQGTKV

EIKR(SEQ ID No：10)。

5.权利要求1至4中任一项的重组dAb，其中修饰CDR1和/或CDR3以改善抗原结合。

6.权利要求1至5中任一项的重组dAb，其中所述dAb在人中具有低免疫原性。

7.编码权利要求1至6中任一项的dAb的分离的核酸分子。

8.药物组合物，其包含有效量的权利要求1至6的重组结构域抗体(dAb)，以及药学上可接受的载体或稀释剂。

9.用于检测样品中的人TNF-α的方法，其包括将样品与有效量的权利要求1至6中任一项的重组dAb进行接触，和测定结合的dAb的量。

10.权利要求9的方法，其中所述样品为生物样品。

11.用于在人受试者中治疗特征在于人TNF-α活性的病症的方法，其包括给所述受试者施用有效量的权利要求8的药物组合物。

12.权利要求11的方法，其中所述特征在于人TNF-α活性的病症选自炎症，炎性疾病，脓毒症，包括败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症和中毒性休克综合征；自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、骨关节炎和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎以及肾病综合征；感染性疾病，包括由于感染和感染后继发的恶病质所引起的发热和肌痛；移植物抗宿主病；肿瘤生长或转移；肺部病症，包括成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺结节病、肺纤维化和矽肺；炎症性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎；心脏病症；炎症性骨病，肝炎，凝血障碍，烧伤，再灌注损伤，瘢痕瘤形成，和瘢痕组织形成。