CN101348512B

CN101348512B - 一种抗肿瘤的腺病毒制剂

Info

Publication number: CN101348512B
Application number: CN2007100440961A
Authority: CN
Inventors: 韩志强
Original assignee: ZHENGZHOU VIRI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZHENGZHOU VIRI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2007-07-20
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2027-07-20
Also published as: CN101348512A

Abstract

本发明公开了一种可通过抑制PDX-1表达而抑制肿瘤的siRNA以及基于所述siRNA序列设计的重组腺病毒。本发明还提供了含有所述腺病毒的药物组合物。本发明所述的重组腺病毒具有产生滴度高、不整合到宿主基因组、安全性高的优点。

Description

一种抗肿瘤的腺病毒制剂

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域；更特别的，本发明涉及一种新的可用于肿瘤治疗的制剂。

背景技术

恶性肿瘤是一类严重危害人类健康的重大疾病，目前药物治疗的主要障碍是缺少肿瘤治疗的特异靶标和有效的体内药物载体，即很多抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时也殃及正常细胞；有些特异的生物大分子抗肿瘤制剂，譬如反义核酸和siRNA等缺乏有效的体内释放载体。因此，发展生物大分子抗肿瘤药物，最关键的是发现肿瘤特异的靶标和发展有效的药物载体。

胰十二指肠同源盒基因-1(Pancreas duodenum homeobox-1，PDX-1)是一种转录因子，对胚胎时期的胰腺发育和维持正常β细胞功能起着至关重要的作用。既往的研究认为，除胰岛β细胞、δ细胞和散在的十二指肠外分泌细胞外，机体其它组织均无PDX-1表达。然而，最近的研究发现，人体的多种肿瘤组织，如胰腺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌中也出现有PDX-1的表达。然而，PDX-1在人肿瘤细胞中表达的确切机制和实际性意义尚不清楚。

RNA干扰(RNAi)是近年来发展起来的一项新的有效的基因阻断技术，不仅是研究基因功能和疾病机制的有效手段，同时具有临床治疗和发展基因特异的siRNA药物的广阔前景。目前化学合成的siRNA或质粒胞内释放多采用阳离子脂质体转染的方法，用阳离子脂质体在体外转染是成功的，而在生物体内却由于其转导效率低及与剂量相关的毒副作用限制了它的体内应用。病毒被认为是体内外较非病毒载体高效的转基因载体，然而，大多数病毒在用于体内转染时存在安全性的问题。

现有技术中，对于PDX-1在肿瘤发生和发展中的作用仍然是未知的，因此，本领域需要进一步研究PDX-1参与肿瘤发生与发展的机制，并且需要开发出新的针对肿瘤靶标的有效药物，从而为肿瘤的治疗提供新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗肿瘤的腺病毒制剂。

在本发明的第一方面，提供一种可抑制PDX-1表达的构建物，所述的构建物具有以下式I结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，Seq_正向为可与PDX-1基因上任一区域基本互补且与PDX-1基因以外的人基因均不互补的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本互补的核苷酸序列，或者，

Seq_反向为可与PDX-1基因上任一区域基本互补且与PDX-1基因以外的人基因均不互补的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_反向基本互补的核苷酸序列，

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

　　　　式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键。

在另一优选例中，Seq_正向具有14-30个核苷酸；Seq_反向具有14-30个核苷酸；更优选的，Seq_正向具有16-25个核苷酸；Seq_反向具有16-25个核苷酸；进一步优选的，Seq_正向具有18-22个核苷酸；Seq_反向具有18-22个核苷酸。

在另一优选例中，X具有4-20个核苷酸，优选的具有5-15个核苷酸，更优选的具有6-9个核苷酸。

在另一优选例中，所述的Seq_正向或Seq_反向选自下组：

(a)具有SEQ ID No：3所示的核苷酸序列或其互补序列；

(b)具有SEQ ID No：4所示的核苷酸序列或其互补序列；

(c)具有SEQ ID No：5所示的核苷酸序列或其互补序列；或

(d)具有SEQ ID No：6所示的核苷酸序列或其互补序列。

在本发明的第二方面，提供一种重组载体，所述的载体中含有所述的构建物。

在本发明的第三方面，提供一种重组的腺病毒，所述的腺病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有所述的构建物。

在另一优选例中，所述的腺病毒可感染肿瘤细胞，在细胞内生成可抑制PDX-1的siRNA。

在另一优选例中，所述的重组表达盒从5’至3’依次含有以下元件：

RNA聚合酶III启动子；

所述的构建物；和

终止子。

在另一优选例中，所述的RNA聚合酶III启动子选自(但不限于)：U6启动子，H1启动子；更优选的，所述的RNA聚合酶III启动子是U6启动子(如人源U6启动子(hU6))。

在另一优选例中，在RNA聚合酶III启动子与所述的构建物之间还包括一多克隆位点。优选的，所述的多克隆位点是BamHI酶切位点。

在另一优选例中，所述的构建物与所述的PolIII终止子之间还包括一多克隆位点。优选的，所述的多克隆位点是HindIII酶切位点。

在另一优选例中，所述的终止子是PolyT终止子；例如，所述的终止子序列为TTTTTT。

在另一优选例中，所述的腺病毒为Ad5型腺病毒。更优选的，所述Ad5型腺病毒为复制缺陷型病毒，缺失与病毒复制相关的基因E1或E3。进一步优选的，所述的Ad5型腺病毒缺失与病毒复制相关的基因E1，必须由宿主细胞(如293细胞)提供E1蛋白，才能复制出具有感染能力的病毒。

在本发明的第四方面，提供所述的腺病毒的用途，用于制备治疗PDX-1基因高表达相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述的PDX-1基因高表达相关疾病是肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自：

鳞状细胞癌；基底细胞癌；移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤；胆管细胞癌；肝细胞腺瘤；肝细胞癌；肾细胞癌；黑色素瘤；纤维肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；软骨肉瘤；脑脊膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。

在本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物包含：

有效量的所述的腺病毒；和

与所述腺病毒相容的载体。

在另一优选例中，所述的腺病毒在药物组合物中的含量为10³-10²⁰pfu/ml；优选的为10⁶-10¹⁵pfu/ml；更优选的为10¹⁰-10¹¹pfu/ml。

在本发明的第六方面，提供一种治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予肿瘤患者有效量的所述的腺病毒。

另一方面，本发明还提供一种抑制肿瘤细胞的方法，包括：用抗PDX-1试剂接触肿瘤细胞，所述的抗PDX-1抑制PDX-1活性，从而抑制肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的抗PDX-1试剂抑制PDX-1的表达。

在另一优选例中，所述的抗PDX-1试剂为一双链RNA复合物，它通过RNA干扰抑制PDX-1基因的表达。

在另一优选例中，所述的双链RNA复合物包括大约28-60核苷酸，一有义链和一反义链，有义链和反义链都由14-30核苷酸组成，并且反义链至少有大约12-26核苷酸与有义链互补，同时有义链至少有大约12-26核苷酸与反义链互补。

在另一优选例中，双链RNA复合物中，反义链与有义链通过一连接物相连。

在另一优选例中，所述连接物选自：寡核苷酸，多聚核苷酸或非核苷酸。

在另一优选例中，所述的PDX-1选自：抗体，适体，配体或抑制化合物。

在另一优选例中，所述的正义链或反义链与选自SEQ ID No:3，SEQ ID No:4，SEQ ID No:5，或SEQ ID No:6的核酸实质上互补。

在另一优选例中，所述的抗PDX-1试剂选自：反义寡核苷酸或核酶。

另一方面，本发明还提供一种抑制肿瘤细胞PDX-1表达的方法，包括：将肿瘤细胞与用有效量的可与编码PDX-1的RNA的特定区域互补的抗PDX-1试剂接触，所述的抗PDX-1试剂与编码PDX-1的特定RNA分子杂交，并在肿瘤细胞中阻滞PDX-1基因的表达。

在另一优选例中，作为双链RNA的复合物的抗PDX-1试剂以RNA干扰的方式阻滞PDX-1基因的表达。

另一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包括所述的抗PDX-1试剂以及药学上可接受的载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了各种细胞中PDX-1mRNA的表达情况，所述细胞包括PANC-1，UKPAN，BxBc3，MiaPaCa2，MCF-7，SK-BR-3，AU565，MDA-MB-231，H23，H460，H520，T24，Um-UC-3和AG5229-hT。

图2显示了使用PDX-1siRNA651(图中简称651)处理MiaPaCa-2胰腺癌细胞，收获细胞并使用免疫印迹分析细胞内PDX-1的表达的情况，以未处理的细胞(-)作为对照。图2B是免疫印迹结果，图2A是量化结果。

图3显示了流式细胞术分析由PDX-1siRNA引起的表达抑制导致癌细胞系的凋亡情况。

图4显示了RT-PCR分析PDX-1siRNA590转染的MiaPaCa2细胞的PDX-1表达的量化结果。

图5显示了倒置显微镜下PDX-1siRNA处理的肿瘤细胞的凋亡。其中，左列为对照siRNA处理后的情况，右列为PDX-1siRNA590处理后的情况。

图6显示了本发明所用的pRNAi-shuttle质粒的图谱，该质粒中含有hU6启动子，BamHI酶切位点、HindIII酶切位点和终止子(TTTTTT)等。图中所标记的各位点名称之后的数字代表该位点处于载体中的位置，如BamHI1025表示BamHI酶切位点起始于载体序列的第1025位。

图7显示了pAd/BLOCK-iT^TM-DEST载体(购自美国Invitrogen公司)的图谱。

图8显示了重组腺病毒表达载体的构建与克隆的基本流程。

图9显示了利用PDX-1shRNA腺病毒制剂感染MiaPaCa2细胞、SKOV3细胞、Panc-1细胞后，细胞的凋亡情况，同时以表达无意义的shRNA((-)siControl)的腺病毒作为阴性对照。其中，A为MiaPaCa2感染第7日的情况(从左至右分别为空白对照孔，阴性对照孔，阳性感染孔)；B为SKOV3感染第10日的情况(从左至右分别为空白对照孔，阴性对照孔，阳性感染孔)；C为Panc-1感染第10的情况(从左至右分别为空白对照孔，阴性对照孔，阳性感染孔)。

图10显示了显微镜观察利用PDX-1shRNA腺病毒制剂感染MiaPaCa2细胞、Panc-1细胞、SKOV3细胞后的细胞凋亡情况，同时以表达无意义的shRNA((-)siControl)的腺病毒作为阴性对照。其中，A为MiaPaCa2细胞感染后第7日阴性组(左)与阳性感染组(右)的情况；B为Panc-1细胞感染后第10日阴性组(左)与阳性感染组(右)的情况；C为SKOV3细胞感染后第10日阴性组(左)与阳性感染组(右)的情况。

图11显示了显微镜观察利用PDX-1shRNA腺病毒制剂感染SMMC7721人肝癌细胞、435s人乳腺癌细胞、SGC7901人胃癌细胞后的细胞凋亡情况，同时以表达无意义的shRNA((-)siControl)的腺病毒作为阴性对照。其中，A为SMMC7721细胞感染后第10日阴性组(左)与阳性感染组(右)的情况；B为435s细胞感染后第10日阴性组(左)与阳性感染组(右)的情况；C为SGC7901细胞感染后第10日阴性组(左)与阳性感染组(右)的情况。

图12显示了采用590腺病毒制剂和表达shRNA((-)siControl)的腺病毒分别感染乳腺癌MDA-MB-435S细胞(A)，前列腺癌pc-3细胞(B)，乳腺癌MDA-MB-231细胞(C)，肺癌A549细胞(D)，宫颈癌hela细胞(E)，肝癌7721细胞(F)后，倒置显微镜下观察590腺病毒制剂组细胞的生长抑制情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示PDX-1是对于肿瘤发生和发展起重要作用的因子，阻断其基因表达或抑制其蛋白活性可达到抗肿瘤的作用。本发明人还基于PDX-1基因序列，找到了对于抑制PDX-1mRNA转录有用的作用靶点。本发明还提供一种具有通过抑制PDX-1表达、从而抑制肿瘤生长的小干扰RNA(siRNA)。本发明还提供了一种基于该小干扰RNA而设计的抗肿瘤的腺病毒制剂，所述腺病毒制剂产生滴度高、不整合到宿主基因组、安全性高。在此基础上完成了本发明。

如本发明所用，“肿瘤”一词包含了广泛的含义，包括但不限于：鳞状细胞癌；基底细胞癌；移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤；胆管细胞癌；肝细胞腺瘤；肝细胞癌；肾细胞癌；黑色素瘤；纤维肉瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；畸胎瘤；血管肉瘤；Kaposi肉瘤；淋巴管肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；成骨肉瘤；软骨肉瘤；脑[脊]膜瘤；非霍奇金淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；白血病。

如本文所用，术语“RNA干扰(RNA interference，RNAi)”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，其也被称为RNA干预或者RNA干涉。RNA干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默，它是体内抵御外在感染的重要保护机制之一。简要地说，RNA干扰包含一个由小型干扰RNA(siRNA)所激发的机制，造成靶mRNA的降解。

如本文所用，术语“小干扰RNA(smal l interfering RNA，siRNA)”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。

如本文所用，术语“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”是指能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。

如本文所用，术语“互补”指的是核苷酸之间的碱基配对，特别指核苷酸之间的氢键结合，胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过2个氢键与腺嘌呤结合，胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过3个氢键结合。总体来讲，一条核酸含有一对与另一特定的核苷酸序列拥有“互补百分率”的核苷酸序列。例如，一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列可能有80％，90％或100％的互补性，提示这个核苷酸序列的10个核苷酸中有8个，9个，或10个与另一个特定的核苷酸序列互补。两条互补的核苷酸序列含有一个正义链(sense)和一个反义链(antisense)。术语“基本互补”或“基本上互补”指的是一条核苷酸序列对于另一条特定的核苷酸序列有至少80％，较佳的90％，更佳的95％，最佳的100％的互补性。

PDX-1

胰十二指肠同源盒基因-1(Pancreas duodenum homeobox-1，PDX-1)是一种转录因子。尽管已有研究发现人体的多种肿瘤细胞中有PDX-1的表达，但现有技术对PDX-1人肿瘤细胞中表达的确切机制尚不清楚。

本发明人的研究首次发现，PDX-1在许多肿瘤细胞中高表达，而在正常细胞(除胰岛β细胞，δ细胞和散在的十二指肠外分泌细胞外)中无明显表达。进一步的，本发明人通过干扰PDX-1的表达来研究PDX-1在肿瘤细胞中的作用，从而证实了PDX-1是肿瘤发生和发展的重要性因子，抑制PDX-1的表达，可诱导肿瘤细胞的凋亡。因此可见，PDX-1是一种促进细胞增殖的去分化因子或是一种抗凋亡因子，其在肿瘤细胞中高表达是导致肿瘤发生和发展的关键所在。关于上述研究还可参见美国临时专利申请号为60/889,808的专利申请。

由于PDX-1在正常细胞中没有明显的表达，因此其可以作为一种良好的特异性抗肿瘤靶标，也就是减少或阻断PDX-1的表达在抗肿瘤的同时，对正常细胞的没有明显影响。

PDX-1的蛋白序列及其核苷酸序列是本领域人员所已知的。PDX-1的蛋白序列与SEQ ID NO：2所示的序列基本上相同或完全相同；一种编码PDX-1蛋白的核苷酸序列例如可与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同或完全相同。

抑制PDX-1的siRNA

基于抑制PDX-1的表达可诱导肿瘤细胞的凋亡的特点，可针对PDX-1来设计siRNA序列，从而用于抑制细胞内PDX-1的表达。

本发明人经过长期研究，根据PDX-1的序列，在该序列上找到了若干个对于抑制PDX-1mRNA转录有用的靶点，所述靶点的序列分别是：

5’AGTTCCTATTCAACAAGTA3’(SEQ ID No：3)，即人PDX-1核苷酸序列第590-608位。

5’TTCCTATTCAACAAGTACA3’(SEQ ID No：4)，即人PDX-1核苷酸序列第592-610位。

5’CTTGACCGAGAGACACATC3’(SEQ ID No：5)，即人PDX-1核苷酸序列第651-669位。

5’TGACCGAGAGACACATCAA3’(SEQ ID No：6)，即人PDX-1核苷酸序列第653-671位。

在筛选siRNA靶序列时，还需进行比对分析，从而排除任何与PDX-1以外的任何人类基因同源的靶序列，找出最佳的有效片段。任何经辨认属于非特异性的靶序列被排除在本发明之外。靶序列与核酸数据库中其它序列对比可通过目前已知的多种比较方法进行。一种常用的比较方法如BLAST(Basic LocalAl ignment Search Tool，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)分析。

经过本发明人大量的分析和比较，靶序列SEQ ID No：14、SEQ ID No：15、SEQ ID No：16和SEQ ID No：17与编码人类PDX-1的核酸SEQ ID No：1的部分区域完全相同，与其它的人类核酸序列没有显著的同源性。并且经验证，针对SEQ ID NO：14-17任一所示的核苷酸序列设计的siRNA具有良好的干扰PDX-1表达的效果。

基于上述靶点本发明提供了抑制肿瘤的siRNA，所述的siRNA可特异性地干扰PDX-1基因的转录。所述的siRNA为以人PDX-1基因序列为模板，根据siRNA设计原则获得的siRNA。

所述的siRNA可以被制备成一种包含正义链和反义链的双链核酸，在其中正义链和反义链基本上互补，且每一条正义链或反义链包含14-30个核苷酸。互补的正义链和反义链随意地包含1-2个核苷酸悬突在一条或两条链上的3’末端。作为一种优选方式，所述的siRNA包含正义链和反义链，每条链有21-23个核苷酸，其中2个核苷酸悬突在每条链的3’末端，而剩余的19-21个核苷酸100％互补。如上所述，siRNA复合物的进一步细节在Engelke，D.R.，RNAInterference(RNAi)：Nuts and Bolts of RNAi Technology，DNA Press LLC，Eagleville，PA，2003一书中有描述。有关siRNA长度和成分的额外描述在Elbashir，S.M.等的Genes and Devel.，15：188-200，2001；and O’Toole，A.S.et al.，RNA，11：512-516，2005一书中可找到。

本发明对siRNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于：化学合成法，体外转录法、Rnase III(如Silencer siRNA Construction Kit，Ambion公司)或Dicer酶消化dsRNA法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的siRNA的序列以后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的siRNA。例如，在本发明的一种优选例中，所述的siRNA是化学合成的。

siRNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链，其它情况下不连接。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

此外，s iRNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链s iRNA。在Engelke，D.R.写的RNA Interference(RNAi)：Nuts and Bolts of RNAiTechnology一书中，特别是第5和第6章，DNA Press LLC，Eagleville，PA，2003可以读到制备siRNA的合成和重组方法。

作为本发明的优选方式，一种双链“短发夹”RNA复合物(称作“shRNA”或“发夹siRNA”)包含一条反义链和一条正义链，通过一个间隔序列相连。shRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。shRNA有互补结构区，在杂交条件下形成“发夹”构象，在其中互补的正义链和反义链相连接，例如，通过一个1-20个核苷酸的核苷酸序列连接。总体来讲，每一个互补的正义链和反义链有大约14-30个核苷酸。

如上述，shRNA可以由编码需要的转录物的双链DNA模板来表达。编码需要的转录物的双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。

“构建物”及“表达盒”在这里是指重组DNA分子，它包含预期的核酸编码序列，这个序列编码一个siRNA或shRNA；这个DNA分子还包含转录在体外或体内可操作的连接编码序列所必需的或预期的适合的调控元件。“调控元件”在这里指的是可一定程度上控制核酸序列表达的核苷酸序列。可作为典范的调控元件包括增强子，内核糖体进入位点(IRES)，复制起点，多腺苷酸化信号，启动子，转录终止序列，以及上游调节区，这些调控元件有助于核酸的复制、转录、转录后修饰等。

重组腺病毒

在获得的可有效抑制PDX-1表达的siRNA后，需要通过特定的方法来将所述的siRNA特异性递送到肿瘤细胞内或者使所述的siRNA在肿瘤细胞内被生成，从而使肿瘤细胞与所述的siRNA接触。这种特异性递送可通过多种不同的递送方法来完成，例如直接在局部部位注射所述的siRNA。然而，研究递送方法的同时还需要考虑对于人体的安全性问题。

本发明人在研究中找到了一种特别有效的递送方法，以腺病毒作为载体，将所述的siRNA或shRNA递送到靶细胞中。以腺病毒作为递送载体的优点如下：首先，大多数的肿瘤都是上皮细胞来源的，而腺病毒具有嗜上皮细胞性，因此采用腺病毒具有很好的选择性；其次，腺病毒产生的滴度高，腺病毒DNA不整合到靶细胞基因组，对于人体有良好的安全性；再次，腺病毒的理化性质稳定，易于制备、纯化、浓缩。

腺病毒(Ad)是一种无包膜的病毒，双链DNA长约36Kb，基因组由九个区组成，四个表达较早(E1-E4)称作早区，五个表达较晚(L1-L5)称作晚区，表达受细胞转录因子和E1区控制，E2区主要调节DNA复制，E3区基因产物与病毒逃避宿主免疫系统的清除有关，而E4区的产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达和转录本拼接等活动。目前已发现100余种腺病毒血清型，基因治疗常用的人的2型(Ad2型)及5型(Ad5型)腺病毒，在DNA序列上有95％的同源性。作为本发明的优选方式，采用复制缺陷型Ad5，缺失与病毒复制相关的基因E1，必须由宿主细胞(如293细胞)提供E1蛋白，才能复制出具有感染能力的病毒。

腺病毒可通过受体介导的细胞内摄途径进入细胞，核内体酸化后破裂，胞浆内病毒DNA于溶酶体降解之前释出，然后进入细胞核而变成附着体状态。

本发明提供一种重组的腺病毒，所述的腺病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有如式I结构的构建物：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，Seq_正向、Seq_反向、X的定义同前所述。

在重组表达盒中，除了所述构建物以外，还包括与所述构建物操作性相连的其它元件，包括但不限于：启动子、终止子等。作为本发明的优选方式，在所述构建物的5’端连接有RNA聚合物III启动子，在所述构建物的3’端连接有PolIII终止子。

在进入到细胞内后，所述的构建物在RNA聚合酶III启动子(如U6)的作用下，形成式II所示的二级结构：

式II。

式II的二级结构在细胞内被诸如Dicer酶加工后，形成可抑制PDX-1转录的siRNA。

优选的，所述的Seq_正向或Seq_反向选自下组(或与选自下组的序列互补)：(a)具有SEQ ID No:3所示的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID No:4所示的核苷酸序列；(c)具有SEQ ID No:5所示的核苷酸序列；或(d)具有SEQ ID No:6所示的核苷酸序列。

此外，还可以使重组的腺病毒表达靶向元件或与靶向元件相结合，靶向元件例如可以是增强所述重组腺病毒穿越细胞膜屏障的。例如蛋白质，肽类，抗体，抗原结合抗体片段，激素，抗原，半抗原，碳水化物结合部分如凝集素，酶，酶底物，受体，受体配体，运载体的底物等，以及其它能够与结合配偶体分子特异性相互作用的分子。更特别的，增强腺病毒到细胞内特定位置的递送作用的靶向元件可以是不同的细胞器定位信号，例如核定位信号。或者，靶向元件可与靶细胞的标记物发生相互作用。例如，特定的肿瘤表达可预示肿瘤细胞级别的肿瘤标记物。

评估腺病毒将siRNA或shRNA引入细胞的有效量的效能的适合方法是已知的，包括测定PDX-1蛋白和/或PDX-1编码mRNA的以下方法中的一种或多种：RT-PCR，RNA印迹，免疫印迹，免疫沉淀作用以及ELISA(酶联免疫吸附测定)。此外还包括：对接触所述抑制制剂后诱导细胞凋亡进行测定，例如对特异性凋亡指示物测定包括基因组DNA碎片，细胞锚定蛋白标记，或活化Caspase-3水平测定。

作为本发明的优选方式，本发明人构建了pdx-1siRNA克隆载体“pRNAi-shuttle”，并与pAd/BLOCK-iT^TM-DEST载体(购于美国Invitrogen公司)实施LR重组反应，最终制备了PDX-1shRNA重组腺病毒载体。体外抗肿瘤筛选实验证明其具有广泛和近乎100％的高效抗肿瘤作用，表明可能为有效的体内药物载体。

作为本发明的优选方式，所述的腺病毒为Ad5型腺病毒。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括有效量的所述重组腺病毒以及与所述腺病毒相容的载体。所述与腺病毒相容的载体需在本质上对于人和/或动物无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质，并在本质上与腺病毒制剂、任何所用到的靶向元件以及其它成分无作用。

所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

所述“与腺病毒相容的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。

本发明所述的重组腺病毒的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的siRNA的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的重组腺病毒制剂每天以约10³-10¹⁵pfu/kg(优选的为10⁴-10¹²pfu/kg；进一步优选的为10⁵-10¹⁰pfu/kg)动物体重的剂量给予，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于：静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予、肿瘤内给予等；优选的，所述给药方式是非肠道给予的。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示PDX-1是一种在肿瘤的发生和发展中发挥重要作用的关键性因子，而在非肿瘤的细胞中则无明显表达，其可作为一种新的肿瘤治疗的靶标。

(2)首次揭示可高效和特异地抑制PDX-1表达的siRNA片段，并采用RNA干扰技术验证了PDX-1在肿瘤的发生和发展中的重要作用。

(3)提供一种良好的抑肿瘤制剂，以腺病毒作为将所述siRNA或shRNA递送到细胞内的载体。由于大多数的肿瘤都是上皮细胞来源的，而腺病毒具有嗜上皮细胞性，因此具有很好的选择性；并且，腺病毒产生的滴度高，不整合宿主基因组，对于人体的安全性高；此外，腺病毒的理化性质稳定，易于制备、纯化、浓缩。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1人有效PDX-1 siRNA片段的设计、合成

1.靶序列的确定

人PDX-1 siRNA靶点是由Dharmacon siDesign工具(美国Dharmacon公司)设计的，基于的序列是人PDX-1mRNA序列(GenBank登录号为NM_000209)。选出带有30-50％GC含量的几个候选的人PDX-1 siRNA靶点，并用NCBIBLAST检索任何与人PDX-1以外的其他基因序列互补的PDX-1 siRNA，排除与人PDX-1以外的其他基因序列互补的PDX-1 siRNA靶点。

经过反复的试验和筛选，结果确定4个针对人PDX-1的siRNA靶序列，分别如下：

5’AGTTCCTATTCAACAAGTA3’(SEQID No：3)，即对应于核苷酸序列SEQID No：1的第590-608位。人PDX-1核苷酸序列见SEQID No：1，编码的人PDX-1蛋白序列见SEQ ID No：2。

5’TTCCTATTCAACAAGTACA3’(SEQID No：4)，即对应于核苷酸序列SEQ ID No：1的第592-610位。

5’CTTGACCGAGAGACACATC3’(SEQ ID No：5)，即对应于核苷酸序列SEQ ID No：1的第651-669位。

5’TGACCGAGAGACACATCAA3’(SEQ ID No：6)，即对应于核苷酸序列SEQ IDNo：1的第653-671位。

以Dharmacon提供的(-)siControl(靶序列是ACTACCGTTGTATAGGTG(SEQ IDNo：7))作为阴性对照，该序列已被证实与小鼠，大鼠以及人基因组均缺乏序列同源性。

2.siRNA的合成

根据上述获得的靶位点的序列，来合成siRNA。各siRNA均可通过常规方法合成：

5’AGUUCCUAUUCAACAAGUAUU3’(SEQ ID No：14，PDX-1 siRNA590)；

5’UUCCUAUUCAACAAGUACAUU3’(SEQ ID No：15，PDX-1 siRNA592)；

5’CUUGACCGAGAGACACAUCUU3’(SEQID No：16，PDX-1 siRNA651)；

5’UGACCGAGAGACACAUCAAUU3’(SEQ ID No：17，PDX-1 siRNA653)。

并且，阴性对照(-)siControl对应的siRNA为：

5’ACUACCGUUGUAUAGGUGUU3’(SEQID No：18)。

实施例2Western印迹

将对数生长期的细胞用RIPA裂解缓冲液裂解(由20mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，1mM EDTA和带有蛋白抑制因子的混合物的1％NP-40组成)。在溶胞产物中的蛋白浓聚物用BSA蛋白测定试剂盒测定(购自Pierce，Rockford，IL)。每个样本的50mg蛋白溶解物用5×加样缓冲液(由0.25MTris-HCl，pH6.8，50％甘油，5％SDS，％52-β-巯基乙醇，和2.5％溴酚蓝)混合。这些样品在98℃下被孵育5分钟，在冰上孵育5分钟，后在室温下在一小离心机上以最大速度离心。蛋白质在10％SDS/聚丙烯酰胺凝胶溶解并转移到PVDF膜上。膜在含有5％脱脂奶粉的TBST(由10mM Tris-HCL，pH7.5，150mMNaCl，和0.1％Tween20组成)中阻滞1小时。被阻滞的膜由在TBST/5％脱脂奶粉中稀释的第一抗体探测两个小时。接着，膜用TBST中洗涤后在由辣根过氧化物酶标记的第二抗体孵育1小时。之后膜用TBST洗涤4次，抗体用化学发光试剂来检测，如Amersham的ECL Western blotting试剂。

采用的一抗为兔多克隆anti-PDX-1抗体，其与从小鼠、大鼠及人中获得的PDX-1可反应，购自Chemicon(目录编号AB3243)。

实施例3定量PCR

利用常规的技术来提取细胞中的全部RNA，如用RNEASY试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)。用常规技术来合成cDNA，如用High Capacity cDNA Archivekit(Bi osyst ems，Fost er City，CA)。使用如下引物：5’-AGCCGGAGGAGAACAAGC-3’(SEQ ID No：8)和5’-TTCAACATGACAGCCAGCTC-3’(SEQ ID No：9)。扩增条件为95℃，10分钟，之后在一个Mx3000P热循环仪(Stratagene，La Jolla，CA)中进行40次30sec95℃/60sec60℃。测量GAPDH在同样扩增条件下的表达作为内部对照。

实施例4通过测定Annexin V来确认凋亡

大约5×10⁵细胞被放在60mm直径的培养皿中并培养一个晚上。细胞接着不被处理，或用对照或抗PDX-1的s iRNA转染。72或96小时后，细胞被胰酶酶解，用1×结合缓冲液洗涤，然后用荧光标记的Annexin V在黑暗中孵育15分钟。

然后，细胞迅速的用流式细胞仪分析。Annexin V摄取的程度与PDX-1的表达的抑制诱导的凋亡程度成比例。

实施例5人肿瘤细胞的PDX-1mRNA水平的测定

人肿瘤细胞的PDX-1表达水平以PDX-1mRNA水平来呈现。人肿瘤细胞mRNA水平可由定量PCR来量化。许多人肿瘤细胞被评价，包括PANC-1，UKPAN(UK-PAN1)，BxBc3，MiaPaCa2，MCF-7，SK-BR-3，AU565，MDA-MB-231，H23，H460，H520，T24，Um-UC-3和AG5229-hT(均购自ATCC)。这些细胞相对于人正常组织(不包括胰腺beta和delta细胞)都过量表达PDX-1mRNA。结果见图1。

总RNA通过常规技术从细胞中制备(RNAEASY，Qiagen，Valencia，CA)并合成cDNA(High Capacity cDNA Archive kit，Applied Biosystems，Foster City，CA)。人PDX-1mRNA通过使用Brilliant SYBR Green检测试剂(Stratagene，La Jolla，CA)，使用引物5’-AGCCGGAGGAGAACAAGC-3’(SEQID No：10)和5’-TTCAACATGACAGCCAGCTC-3’(SEQID No：11)。扩增条件为95℃，10分钟，之后在一个Mx3000P热循环仪(Stratagene，La Jolla，CA)中进行40次30sec95℃/60sec60℃。以GAPDH在同样的扩增条件下的表达作为内部对照。(Assays onDemand^TM，Appl ied Biosystems，Foster City，CA)。PDX1mRNA的水平依据一个正常人成纤维细胞系，AG5229-hT中PDX-1表达的水平来进行标准化。

选择不同的肿瘤细胞株来呈现不同组织来源的肿瘤的PDX-1表达情况：胰腺癌(Pancl，BxBC3，UKPAN，MiaPaCa-2)，乳腺癌(MCF-7，SK-BR-3，AU565，MDA-MB-231)，肺癌(H23，H460，H520)以及膀胱癌。所有这些细胞株都能够在裸鼠体内形成异种嫁接肿瘤，从而进一步的在体内进行研究。

实施例6 siRNA对PDX-1表达的抑制

使用前述合成的siRNA来阻止PDX-1表达和诱导培养的细胞凋亡。大约5×10⁵MiaPaCa-2胰腺癌细胞被放在60mm直径的培养皿中并在标准条件下培养过夜。接着细胞用SEQ ID No：16的siRNA(PDX-1siRNA651)或SEQ ID No：18的siControl siRNA孵育。未处理的细胞被用作附加对照组。72-96小时后，收获细胞并使用免疫印迹分析PDX-1表达。

图2显示了通过上述步骤获得的免疫印迹结果，显示PDX-1siRNA651(简称651)显著了抑制PDX-1表达。细胞放置为：5×10⁵细胞/60mm板。在过夜孵育之后细胞使用Dharmafect 2 siRNA转染制剂转染，为达到100nM的最终浓度，每板使用200μl的2uM siRNA。72小时后收获细胞，并通过免疫杂交来测定PDX-1蛋白的表达。以肌动蛋白(actin)的表达作为参照。

实施例7由PDX-1siRNA诱导的多种肿瘤细胞凋亡以及使用流式细胞术测定Annexin V的结合

采用乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌相关的细胞株(MCF-7、T-47D(购自ATCC)、SK-BR-3、MiaPaCa-2、SK-OV-3、PC3(购自ATCC))以及使用端粒酶永生化的人胚胎成纤维细胞(BJ)。细胞被放置为5x10⁵细胞/60mm板。在一夜的孵育之后使用Dharmafect 2 siRNA转染制剂转染，为达到100nM的最终浓度，每板使用200μl的2uM siRNA。在转染后72小时收获细胞，在黑暗环境中用FITC-标记的Annexin V孵育15分钟，然后进行流式细胞术分析。上述每种细胞株以及胰腺癌细胞(MiaPaCa-2)均被制备成未转染、siControl以及PDX-1siRNA590(siPDX-1-590；SEQ ID No：14)组。

结果显示在图3中，上述各种肿瘤细胞由于高表达PDX-1，siRNA干扰PDX-1表达后细胞广泛凋亡；只有成纤维细胞(BJ)显示对PDX-1的抑制抵抗。

实施例8直接观察siRNA处理的细胞的死亡

使用合成si RNA来抑制PDX-1的表达并诱导细胞凋亡。大约5×10⁵的UKPAN-1，PANC-1，MiaPaCa-2或LN-CaP(人前列腺癌细胞)被放置在60mm直径的培养皿中并在标准条件下培养一夜。使用Dharmafect siRNA转染试剂，用SEQ ID No：14的2μM siRNA600μL或SEQ ID No：18的siControl转染细胞。最终的siRNA浓度为100nM。未处理的细胞培养株用作附加的对照。

对使用合成siRNA来抑制PDX-1表达的细胞培养进行显微镜检查和直接目测，发现细胞几乎完全死亡。相反的，与对照siRNA孵育的细胞以及未处理的细胞却没有或仅有少量死亡。如果把siRNA转染的当天作为第一天，在第四天(siRNA转染后72小时)左右开始出现最初的细胞死亡。在第六天几乎100％的细胞死亡。

实施例9RT-PCR分析PDX-1siRNA590转染的MiaPaCa2细胞PDX-1的表达

前述合成的siRNA被用来阻止培养细胞的PDX-1表达。大约5×10⁵MiaPaCa2细胞被放在60mm直径的培养皿中并在标准条件下培养一夜。细胞接着被SEQ ID No：14的PDX-1siRNA或SEQ ID No：18的对照siRNA孵育转染。在转染后24，48以及96小时细胞溶解，总RNA被分离，并使用定量RT-PCR分析所述的PDX-1siRNA降低PDX-1mRNA水平的有效性，结果如图4所示，在第2天和第4天，PDX-1mRNA水平有统计学意义的下降。

实施例10观察PDX-1siRNA处理的肿瘤细胞的凋亡

前述合成的siRNA被用来阻止培养细胞的PDX-1表达并诱导细胞凋亡。约5×10⁵UK-PAN1胰腺癌细胞、LN-CAP前列腺癌细胞或非癌细胞3T3被放在60mm的直径的培养皿中并在标准条件下培养一夜。接下来使用PDX-1siRNA590(SEQ ID No：14)或对照siRNA(SEQ ID No：18)对细胞进行转染。未处理的细胞用作进一步的对照。

结果如图5A-C所示，胰腺癌细胞和前列腺癌细胞被所述PDX-1siRNA(见图中右列)杀死，但不受对照siRNA(见图中左列)的损害，非癌细胞几乎不受PDX-1siRNA的影响。

实施例11重组穿梭质粒的构建

1.pRNAi-shuttle-shRNA的构建

分别以实施例1中4个靶点序列为正义链(Seq_正向)，以其互补链为反义链(Seq_反向)，分别在正、反义链之间加入反向互补序列Loop(TTCAAGAGA)，形成5’-Seq_正向-Loop-Seq_反向-3’的结构，并且分别在正义链5’端引入BamHI酶切位点，在反义链3’端引入RNA pol III终止子(polyT终止子，TTTTTT)和HindIII酶切位点，从而形成用于表达人PDX-1shRNA的寡核苷酸模板(DNA oligo)。

上述的模板双链经退火后杂交，形成shRNA结构，以BamHI和HindIII酶切后克隆入载体pRNAi-shuttle(见图6和图13，原始质粒购自美国Invitrogen公司，采用常规方法加入了hU6(人源U6)启动子，BamHI和HindIII酶切位点)的BamHI和HindIII酶切位点内(在hU6启动子和PolIII终止子之间)，获得含有目的基因的克隆载体。根据PDX-1靶基因位点的不同，制备的克隆载体分别被命名为pRNAi-shuttle-shRNA590、pRNAi-shuttle-shRNA592、pRNAi-shuttle-shRNA651、pRNAi-shuttle-shRNA653、pRNAi-shuttle-shRNA(-)siControl。

2.重组腺病毒表达载体的构建与克隆

重组腺病毒表达载体的构建与克隆的基本流程见图8。

将前述构建的含有目的基因的克隆载体pRNAi-shuttle-shRNA590、pRNAi-shuttle-shRNA592、pRNAi-shuttle-shRNA651、pRNAi-shuttle-shRNA653、pRNAi-shuttle-shRNA(-)siControl，分别与pAd/BLOCK-iT^TM-DEST载体(见图7，购自Invitrogen公司)进行LR重组反应，获得携带相应shRNA的重组载体。

将所获得的重组载体转化入大肠杆菌Top10(购自美国Invitrogen公司)，氨苄青霉素阳性LB平板上筛选阳性克隆。从获得的阳性克隆中抽提重组腺病毒表达载体。

然后进行PCR鉴定，用于鉴定的引物为：

正向：5’GGAACCAATTCAGTCGACGAATTC3’(SEQ ID No:12)；

反向：5’GCTGGGTCTAGACCAAGCTTTTCC3’(SEQ ID No:13)；

经PCR和测序鉴定，获得了正确的重组腺病毒表达载体。

3.重组PDX-1shRNA腺病毒的产生及滴度的测定

1)将重组腺病毒表达载体用PacI酶切，采用常规的DNA纯化试剂盒利用酚氯仿提取法纯化消化过的质粒DNA，并抽提纯化质粒。

2)采用Lipofectamine^TM2000将消化后的载体转染293A细胞(购自ATCC)；直到80％CPE(细胞病变效应)出现时(一般在转染后10-13天)收获含病毒的细胞和培养液，反复冻融后离心获得病毒原液。

3)通过病毒原液感染293A细胞进行病毒扩增，收获病毒原液后采用高速离心法浓缩纯化病毒，并采用QuickTiter^TM腺病毒滴度测定试剂盒(购于美国Cell Biolabs公司)测定滴度。

利用Lipofectamine^TM2000转染293A细胞得到重组PDX-1shRNA腺病毒，通过病毒原液感染293A细胞进行病毒扩增，扩增病毒滴度经测定可达1×10^8-9噬菌体形成单位(plaque-forming units，pfu)/ml，再经常规的高速离心方法可纯化至1×10^10-11pfu/ml。分别获得表达shRNA590、shRNA592、shRNA651、shRNA653的腺病毒，以及对照携带shRNA((-)siControl)的腺病毒。

实施例12重组PDX-1shRNA腺病毒制剂

所述的重组PDX-1shRNA腺病毒制剂的配制如表1。

表1

实施例13重组PDX-1shRNA腺病毒体外抗肿瘤效应观察

采用含10％胎牛血清的DMEM培养液，按常规细胞培养法于5％二氧化碳培养箱中培养人胰腺癌Panc-1细胞和MiaPaca-2细胞，采用含10％胎牛血清的1640培养液培养人卵巢癌SKOV3细胞，人肝癌SMMC7721细胞，人乳腺癌MDA-MB-435s细胞和人胃癌SGC7901细胞(人卵巢癌SKOV3细胞、人胰腺癌MiaPaca-2、Panc-1细胞购自中科院上海细胞库；人肝癌SMMC7721细胞、人胃癌SGC7901细胞购自中科院北京细胞中心；人乳腺癌高转移MDA-MB-435s细胞购自郑州大学。细胞培养所需高糖DMEM培养液，高糖1640培养液，非必需氨基酸，L-谷氨酰胺，双抗(细胞培养用青霉素-链霉素)均购自Invitrogen公司)。

将上述培养的细胞分别进行如下处理：

A)利用590腺病毒制剂分别感染上述6种细胞，同时以等量的表达无意义的shRNA((-)siControl)的腺病毒制剂作为阴性对照，感染后观察细胞凋亡情况，结果见图9，图10和图11。

在图9中，空白对照孔、阴性对照组由于肿瘤细胞生长旺盛，培养基颜色呈酸性改变(呈浅黄色)，而PDX-1基因阻断组(阳性感染孔)因PDX-1基因阻断导致细胞凋亡，因而培养基颜色呈正常培养基颜色(呈浅红色)。

图10和图11显微镜观察显示：当给予相同滴度病毒感染后，阴性对照组细胞生长旺盛，铺满平板。而PDX-1基因阻断组(阳性感染组)肿瘤细胞大部分或近乎全部凋亡。

上述体外实验结果显示，阳性组的肿瘤细胞近乎100％调亡，而对阴性组和空白组的肿瘤细胞影响很小。

B)RT-PCR和Western Blot分析PDX-1的表达阻断效应。

此外，发明人还培养乳腺癌MDA-MB-435S细胞，前列腺癌pc-3细胞，乳腺癌MDA-MB-231细胞，肺癌A549细胞，宫颈癌hela细胞，肝癌7721细胞，比较观察采用590腺病毒制剂和shRNA((-)siControl)腺病毒处理后细胞的变化。结果见图12。由图12可见，对照shRNA((-)siControl)腺病毒处理组对于乳腺癌MDA-MB-435S细胞，前列腺癌pc-3细胞，乳腺癌MDA-MB-231细胞，肺癌A549细胞，宫颈癌hela细胞，肝癌7721细胞的生长无明显抑制，而590腺病毒制剂处理组可显著抑制乳腺癌MDA-MB-435S细胞，前列腺癌pc-3细胞，乳腺癌MDA-MB-231细胞，肺癌A549细胞，宫颈癌hela细胞，肝癌7721细胞的生长。

实施例14重组PDX-1shRNA腺病毒体内抗肿瘤效应观察

6周龄雌性裸鼠，购自河南省动物实验中心。5×10⁶个人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2、卵巢癌细胞系SKOV3于PBS中在右侧肋腹(flanking)皮下注射给裸鼠。肿瘤在数周内可达100-500mm³，表示模型建立成功。

将荷瘤鼠随机分三组，第一组为治疗组，第二组为病毒对照组，第三组为PBS对照组，于肿瘤接种部位内分别注0.1ml的1×10⁹pfu590腺病毒制剂、0.1ml的1×10⁹pfu651腺病毒制剂、1×10⁹pfu shRNA((-)siControl)的腺病毒和PBS，测量肿瘤体积，计算抑瘤率以及相关机制研究。

结果发现，在注射590腺病毒制剂和651腺病毒制剂后，治疗组小鼠的肿瘤体积显著减小，且对于小鼠未见有毒性影响；而病毒(-)siControl对照组以及PBS对照组小鼠的肿瘤体积非但没有减小，还有一定的增加。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>郑州威瑞生物技术有限公司

<120>一种抗肿瘤的腺病毒制剂

<130>056423

<160>18

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>1527

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapies)

<400>1

<210>2

<211>283

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapies)

<400>2

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapies)

<400>3

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapies)

<400>4

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapies)

<400>5

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapies)

<400>6

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>10

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>mi sc_feature

<223>引物

<400>11

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>12

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

<210>14

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>14

<210>15

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>15

<210>16

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>16

<210>17

<211>21

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>17

<210>18

<211>20

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰RNA

<400>18

Claims

1.一种可抑制PDX-1表达的构建物，其特征在于，所述的构建物具有以下式I结构：

Seq_正向-X-Seq_反向式I，

式I中，Seq_正向为可与PDX-1基因上任一区域互补且与PDX-1基因以外的人基因均不互补的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向互补的核苷酸序列，或者，

Seq_反向为可与PDX-1基因上任一区域互补且与PDX-1基因以外的人基因均不互补的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_反向互补的核苷酸序列，X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补，

式I所示的结构在转入细胞后，形成式II所示的二级结构：

式II，

式II中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的氢键；

并且，所述的Seq_正向或Seq_反向选自下组：

(a)SEQ ID No：3所示的核苷酸序列或其互补序列；

(b)SEQ ID No：4所示的核苷酸序列或其互补序列；

(c)SEQ ID No：5所示的核苷酸序列或其互补序列；或

(d)SEQ ID No：6所示的核苷酸序列或其互补序列。

2.一种重组载体，其特征在于，所述的载体中含有权利要求1所述的构建物；所述的重组载体是重组腺病毒表达载体。

3.一种重组的腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有权利要求1所述的构建物。

4.如权利要求3所述的腺病毒，其特征在于，所述的重组表达盒从5’至3’依次含有以下元件：

RNA聚合酶III启动子；

权利要求1所述的构建物；和

终止子。

5.权利要求3所述的腺病毒的用途，其特征在于，用于制备治疗PDX-1基因高表达相关疾病的药物。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的PDX-1基因高表达相关疾病是肿瘤。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自：

8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包含：

有效量的权利要求3所述的腺病毒；和

与所述腺病毒相容的载体。