CN101344472A - 网织红细胞检测试剂和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种网织红细胞检测试剂，其含有式(I)的荧光染料。本发明还涉及式(I)的荧光染料用于制备网织红细胞检测试剂的用途以及检测网织红细胞的方法。

Description

网织红细胞检测试剂和检测方法

技术领域

本发明涉及血液分析领域，更具体地讲涉及网织红细胞检测试剂和检测方法。

背景技术

网织红细胞(reticulocyte)是从骨髓释放到外周血的成熟红细胞的前体细胞，同成熟红细胞相比，其细胞内仍残存少量的RNA(嗜碱性物质)。越是幼稚的网织红细胞，其细胞内的RNA含量就越高，越接近成熟的网织红细胞，其细胞内的RNA含量则越少。

血液中网织红细胞的检测在检验医学领域具有重要意义。测定网织红细胞的基本原理就是让某种染料与细胞内RNA结合，再通过显微镜镜检或采用流式细胞术(FCM)等方法检测被染色的网织红细胞。根据网织红细胞内RNA含量的多少，将网织红细胞分成不同的成熟度。

目前，国内大多数医院仍采用煌焦油蓝乙醇溶液、煌焦油蓝盐水溶液或新亚甲蓝溶液进行染色、涂片，油镜下直接目测计数1000个红细胞中网织红细胞数。这样的手工镜检操作繁琐，不仅需要较长时间的染色孵育，不能有效地计算出网织红成熟指数，并且由于操作者间的个人辨别差异以及计数量少等因素，网织红细胞计数也产生较大的误差。

仪器分析(如使用自动血液分析仪、流式细胞分析仪等)具有几个优势：所计数的细胞量大而减少了统计误差，测量速度快而可测定大量血液样本，重复性好而增加可信性。目前，一般采用碱性色素对网织红细胞内的RNA着色，然后进行识别和计数。一般有两种方法-非荧光标记法和荧光标记法。

非荧光方式一般采用两种试剂组合，一种为使红细胞变为等体积的球形化试剂，另一种是诸如噁嗪750(Oxazine 750)之类的对网织红细胞进行选择性染色的染料(美国专利5,284,711、5,633,167、5,350,695、5,438,003、5,360,739)。仪器通过测定光吸收的增加来辨别网织红细胞与成熟红细胞，光的吸收量与胞内存在的RNA量成比例，而仪器中的激光散射用于检测细胞体积和血红蛋白浓度。

荧光标记方式是采用RNA特异性染色的荧光性碱性色素来标记网织红细胞内RNA，用流式细胞术测定细胞的前向散射光强度及荧光强度。流式细胞术使用激光照射鞘流液中的血流细胞，由于红细胞呈盘状结构，这样从不同侧面照射和收集发射光时，散射光强度和红细胞内的荧光染料所产生的荧光强度则产生随机差异。为消除这种差异，一般采用球形化试剂将红细胞系、血小板等溶涨成等体积的球形，以尽量消除由于红细胞形状带来的检测误差。通常，采用前向散射光强度-荧光强度来分析网织红细胞试剂处理的血液样本。前向散射光强度反映了细胞的大小情况，根据细胞大小可以分辨红细胞、白细胞、血小板。荧光强度则反映细胞内结合的荧光染料量的关系，可以根据荧光强度分辨网织红细胞和成熟红细胞。因为白细胞内含有大量的核酸物质，其着色的荧光染料量大大高于网织红细胞，所以通过荧光强度也可以有效地分辨网织红细胞与白细胞。由于红细胞只有背景荧光，因而可通过设定一定的“阈值”来界定网织红细胞。由于网织红细胞成熟程度的不同，细胞内的RNA含量也不同，而成熟度越高的网织红细胞，其RNA含量则越低。这样可以根据网织红细胞内被荧光标记的RNA的多少将网织红细胞分成高荧光率(HFR)、中荧光率(MRF)、低荧光率(LFR)三部分。越是幼稚的网织红细胞则显示出越强的荧光，而成熟的红细胞极少或没有荧光。由于成熟度不同的网织红细胞内的RNA含量不同，导致标记上的荧光染料量有差异，而显示出荧光强度的差异。通过对荧光强度的规定，可以计算出网织红细胞的成熟指数。与非荧光方式相比，荧光染料标记的优势是灵敏度高，试剂使用量少。

荧光染料吖啶橙(acridine orange)(美国专利5,075,556、5,360,739、5,411,891、4,336,029等)、金胺O(Auramine O)(美国专利4,985,174)、噻唑黄(thiazole orange)(美国专利4,957,870)等荧光染料已经用于基于流式细胞术的网织红细胞计数和成熟度分析。这类荧光染料的缺陷是需要使用He-Ne等价格较高的激光器激发，而且生物自身的自发荧光也在这个范围之内，产生一定的干扰。

红色半导体激光器作为一种廉价的光源日益普及，此外细胞本身在红外区域的几乎没有自发荧光，因此红光激发的荧光染料显示出优势，并且被用于标记血液中网织红细胞，在用红色半导体激光激发后，进行识别和计数。

早期应用红光激发的荧光染料标记网织红细胞并不成功，例如，美国专利US 4,957,870描述一种红光激发荧光染料-噻唑蓝(ThiazoleBlue)，其需要接近30分钟的孵育时间。

美国专利US 5,563,070应用红光激发的荧光染料TO-PRO-3标记网织红细胞，其荧光染料用量大并且血液样本和染料一起也要孵育30分钟才能标记网织红细胞内的RNA。由于染料用量大成本高，而且血液样本准备时间长，不能满足临床分析中血液样本量大、成本低、分析快速的需求。只有能够快速进入红细胞内，并对RNA进行着色的荧光染料才能满足临床检测对大量血液样本检测的速度需求。

美国专利US 5,994,138披露了用变性剂和离子载体联合红光激发荧光染料标记网织红细胞的方法。

美国专利US 5,411,891和US 5,360,739阐述了染料和网织红细胞RNA的特异性结合常数，指出染料的渗透速度等由于染料的不同而有所不同，因此不可能预测何种染料可以快速穿过红细胞膜而染色网织红细胞。

US 5,821,127、CN 1172953A和CN 1154966A描述了用于网织红细胞自动化分析的荧光染料。然而这些荧光染料对红细胞有显著的非特异性结合，不仅结合RNA，也结合细胞内其他颗粒，比如线粒体，核糖体等，造成荧光背景高的缺陷，因此需要用多价阴离子来抑制染料对红细胞的非特异性结合。

US 2002/03758公开了用于标记网织红细胞、有核红细胞的荧光染料，但其通常需要孵育长达1分钟。

目前各类分析网织红细胞的试剂基本都含有能够使红细胞等体积的球形化试剂，或使用甜菜碱衍生物，或使用糖苷类物质。这类球形化试剂属于表面活性剂类，容易在稀释和搅动中产生气泡，形成仪器噪声，从而产生一定的误差。

另外，现有的染色方法大都采用表面活性剂(阳离子或阴离子表面活性剂)处理血液样本，目的是破坏细胞膜表面结构，使染料快速进入细胞。

本领域仍然需要新的应用红光激发荧光染料快速标记网织红细胞的网织红细胞检测试剂和方法，尤其是能够克服现有技术中存在的缺陷的试剂和方法。

本发明通过应用一种可与细胞RNA结合的红光激发荧光染料，解决了上述问题。

发明内容

本发明一方面涉及网织红细胞检测试剂，其包含式(I)的荧光染料：

在一个实施方案中，网织红细胞检测试剂包含式(I)荧光染料和缓冲剂，任选含有渗透压调节剂和/或球形化试剂和/或促染剂，优选渗透压维持在150-380mOsm/kg，更优选160-300mOsm/kg，最优选230-260mOsm/kg。

在另一个实施方案中，网织红细胞检测试剂包含以下两种溶液：

(1)荧光染料储存液，含有式(I)荧光染料，其中荧光染料任选溶于有机溶剂中；和

(2)稀释液，含有缓冲剂，任选含有渗透压调节剂和/或球形化试剂和/或促染剂。

优选稀释液的渗透压维持在150-380mOsm/kg，更优选160-300mOsm/kg，最优选230-260mOsm/kg。

在一个实施方案中，在网织红细胞检测试剂中不含促染剂。

本发明的另一方面涉及式(I)荧光染料在网织红细胞检测试剂制备中的应用。

本发明的再一方面涉及检测网织红细胞的方法，其包括将本发明的网织红细胞检测试剂与血液样品混合和孵育，优选短暂孵育。

附图描述

图1是实施例1检测1号血液样本的前向散射光强度-侧向荧光强度的散点图；

图2是实施例1检测血液样本2号的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图3是实施例1检测3号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图4是实施例2检测1号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图5是实施例2检测2号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图6是实施例2检测3号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图7是实施例3检测1号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图

图8是实施例3检测2号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图9是实施例3检测3号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的散点图；

图10是实施例3检测3号血液样本的前向散射光强度-荧光强度的线性放大散点图。

具体实施方式

本文所述的“网织红细胞检测”包括从血液样本中分辨出网织红细胞以及确定网织红细胞的成熟度。

本发明所采用的荧光染料为能够与RNA结合的菁类阳离子荧光染料，该荧光染料能够快速进入细胞内，不需要阳离子表面活性剂破坏细胞表面，而且该荧光染料能够被红色半导体激光器等提供红色区域激光的器件发出的红色激光所激发。该荧光染料虽然早在1945年就已为人所知(Journal of the American Chemical Socitey(1945)67，18889-93)，但迄今尚未见到有关其在网织红细胞检测中的应用。

式(I)荧光染料可通过以下合成路径来合成，也可参见(Journal ofthe American Chemical Socitey(1945)67，18889-93)。

本发明的荧光染料储存在有机溶剂体系中，可以保持不聚集。一般可选择乙醇、二甲亚砜、乙二醇、甲醇等作为储存液的溶剂，也可以溶解在其它非水溶剂中。本发明的荧光染料储存液可以由荧光染料、作为溶剂的乙二醇和5-10％(体积)的作为稀释剂的甲醇组成。荧光染料的使用浓度一般为0.02-0.05mg/ml，优选0.03-0.04mg/ml。

本发明的荧光染料储存液可以含有或不含非离子表面活性剂作为分散剂。非离子表面活性剂的作用是使荧光染料保持一定的溶解度，不产生聚集颗粒，防止染料聚集。非离子表面活性剂例如为聚氧乙烯乙二醇(POE)、聚丙烯乙二醇(POP)、聚氧乙烯乙二醇-聚丙烯乙二醇(POE-POP)、Brij系列非离子表面活性剂。优选Brij35、Brij56等为荧光染料的分散剂，使用浓度为0.02％-2％(体积)。本发明的荧光染料储存液即使不含非离子表面活性剂也可保持不聚集。

本发明的稀释液含有缓冲体系，维持一定的酸碱度和渗透压。使用缓冲剂可使pH保持一定，由此可稳定对血液样本的染色效果。缓冲剂的使用浓度通常在0.01mM-200mM之间。关于缓冲剂的种类，只要是通常使用的，并无特别限定，例如可以是适当使用浓度的羧酸盐类、磷酸盐类、柠檬酸盐类和有机缓冲剂等。本发明稀释液的合适pH因荧光染料的使用浓度不同而有所不同，一般在pH 5.0-11.0范围，理想的pH在8.5-9.5之间。若pH过低，则红细胞容易脆化而溶血，使得测定网织红细胞的准确率下降。若pH过高，则红细胞容易与阳离子荧光染料结合，非特异性结合增加，而使得网织红细胞测定的假阳性增高。

本发明稀释液的合适渗透压范围一般为150-380mOsm/kg，优选160-300mOsm/kg，更优选230-260mOsm/kg。也可以通过渗透压调节剂来调节渗透压。渗透压调节剂可以使用有机酸的碱金属盐、碱土金属盐、葡萄糖、甘露醇等糖类。本发明所使用的荧光染料可以快速穿透细胞膜而进入细胞内，因此无论是采用低渗透压(见实施例)还是等渗条件(结果未显示)皆可获得良好的效果。

由于网织红细胞是否球形化对荧光染料产生荧光强度只有细微的影响，所以即使不采用球形化试剂，即使网织红细胞未球形化，仍能通过一定的算法而实现网织红细胞的准确计数。也就是说，在使用本发明试剂检测网织红细胞时，无论是否采用表面活性剂等使红细胞等体积化以及无论是否使网织红细胞球形化，都能实现对网织红细胞的准确计数。

考虑到在实际的血液分析中可能会同时进行其它成分的测定，因此本发明的稀释液也可含有球形化试剂。球形化试剂一般为两性表面活性剂，如烷基甜菜碱类、磺基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱。优选烷基甜菜碱，例如椰油酰胺丙基甜菜碱。其通常以引起红细胞系、血小板系细胞等体积球化的有效剂量使用，使用浓度范围例如为5-2000mg/L。

由于本发明所采用的荧光染料能够快速进入细胞，所以所述试剂可以含有或不含用于破坏细胞膜结构的阳离子表面活性剂-促染剂，例如十二烷基三甲基溴化铵。促染剂以其通常的使用浓度来使用。

本发明的试剂中还可含有防腐剂，以便有效地控制试剂中微生物的生长。防腐剂例如为体外诊断试剂常用的防腐剂，如supelco公司的ProClin200，也可使用2-吡啶基硫代-1-氧化钠或beta-苯乙醇等防腐剂。其使用浓度一般为0.01％-0.10％(重量)。

本发明的方法中，所测定的血液样本可以是全血，也可以是成分血。用流式技术测定网织红细胞时，首先将上述网织红细胞检测试剂与血液样本混合，形成测定试样。血液样本为经过抗凝剂处理的静脉血、末梢血或骨髓液等。血液样本与本发明试剂的总体积应保证有足够的细胞浓度通过仪器的测量池。用本发明的网织红细胞检测试剂稀释血液样本。网织红细胞检测试剂与测定试样的比例为250∶1-1000∶1，优选250∶1-500∶1。可以先用稀释液稀释血液样本，然后加入荧光染料储存液，得到测试用试样。也可以将稀释液与荧光染料储存液混合后，再与血液样本混合。孵育温度优选25-50℃，更优选35-45℃。虽然实施例中所使用的孵育温度为42℃，但使用38℃和40℃的孵育温度，也可获得相似的结果(结果未显示)。反应时间将因试剂中所含荧光染料浓度的不同而有所差异，优选10秒-1分钟，更优选20秒-40秒，最优选30秒。

本发明中的荧光染料受到红色区域激光的激发后将发出强烈的红色荧光。激发光源可以是红色二极管激光器、He-Ne激光器等能够发射红色区域激光的激光器。

可以利用荧光强度或者利用荧光强度与散射光强度来识别成熟红细胞、网织红细胞、白细胞；可以利用散射光强度或散射光强度与荧光强度来辨别血小板与红细胞系细胞。

随后将测定用试样导入具有红色波长光源的流体测量仪的流动室中进行测量。本发明采用红色半导体激光器发射的红色区域激光为检测的光源，以使用红色波长的光源。所用的光源只要能够发出所用染料的激发波长附近的红色波长的光(例如600-680nm左右的光)，则没有特殊的限制，例如可以使用He-Ne激光器、红色区域的半导体激光器等。

用上述的红色波长光源在鞘流中流动的细胞上照射红色波长的光，然后测定由细胞发出的荧光。荧光强度为反映血液样本的靶点中荧光染料量的参数。荧光测定也可与散射光测定相结合。此时的散射光既可以是前向高散射光(6-20°)也可以是前方低角度散射光(1-5°)。散射光为反映细胞大小信息的参数。将各细胞分类计数，算出细胞数及细胞比率。

本发明的网织红细胞检测试剂不仅可应用于流式细胞仪检测网织红细胞，还可以采用半导体激光器等廉价设备作为光源的血液细胞分析仪或单独的网织红细胞分析仪分析血液样本中的网织红细胞，包括网织红细胞计数和测定网织红细胞的成熟度。

本发明的试剂也可使用流式细胞技术来分析血液样本中有核红细胞，异常淋巴细胞、幼稚细胞。本发明的试剂也应用于血液细胞分析仪中进行白细胞分类，以及有核红细胞、异常淋巴细胞、幼稚细胞的识别。

实施例1：

配制如下组成的网织红细胞测定用试剂。

荧光染料储存液：

式(I)荧光染料       3mg

乙二醇              90ml

甲醇                10ml

稀释液：

NaH₂PO₄.H₂O         53.8mg

Na₂HPO₄.7H₂O        163.4mg

椰油酰胺丙基甜菜碱  100mg

精致水              1L

(调整pH为8.8)

将1毫升的稀释液试剂与经过抗凝剂处理的4微升血液混匀，并立即加入20微升荧光染料储存液，在42℃下的孵育池中混匀孵育30秒，形成测定用试样，测定前向散射光强及侧向荧光强度。1号血液样本的网织红细胞经手工镜检(煌焦油蓝染色法；叶应妩等，《全国临床检验操作规程(M)》第2版，南京，东南大学出版社，1997，14-15)为1.84％，用本发明试剂通过血液分析仪分析的结果为1.90％，得到如图3所示的散射图。2号血液样本的网织红细胞经手工镜检为4.15％，用本发明试剂分析结果为4.20％，得到如图4所示的散点图。3号血液样本的网织红细胞经手工镜检6.07％，用本发明试剂分析结果为6.10％，得到如图5所示散点图。

说明用本发明试剂分析具有良好的线性关系，并与镜检一致。

实施例2：

配制如下组成的网织红细胞测定用试剂。

荧光染料储存液：

式(I)荧光染料           3mg

乙二醇：                90ml

甲醇                    10ml

稀释液：

NaH₂PO₄.H₂O             53.8mg

Na₂HPO₄.7H₂O            163.4mg

椰油酰胺丙基甜菜碱      100mg

十二烷基三甲基溴化铵    1mg

精致水                  1L

(调整pH为8.8)

用1毫升的稀释液试剂混匀经过抗凝剂处理的4微升血液，并立即加入20微升荧光染料储存液，在42℃下的孵育池中混匀孵育20秒，形成测定用试样，测定前向散射光强及侧向荧光强度。1号血液样本的网织红细胞经手工镜检为1.84％，用本发明试剂分析结果为1.95％，得到如图4所示的散射图。2号血液样本的网织红细胞经手工镜检为4.15％，用本发明试剂分析结果为4.27％，得到如图5所示的散点图。3号血液样本的网织红细胞经手工镜检6.07％，用本发明试剂分析结果为6.15％，得到如图6所示散点图。

本实施例与实施例1不同之处是添加了阳离子表面活性剂作为促然剂，破坏细胞膜而使荧光染料快速进入细胞。

实施例3：

配制如下组成的网织红细胞测定用试剂。

荧光染料储存液：

式(I)荧光染料       3mg

乙二醇              90ml

甲醇                10ml

稀释液：

NaH₂PO₄.H₂O   53.8mg

Na₂HPO₄.7H₂O  163.4mg

精致水        1L

(调整pH为8.8)

将1毫升的稀释液试剂与经过抗凝剂处理的4微升血液混匀，并立即加入20微升荧光染料储存液，在42℃下的孵育池中混匀孵育30秒，形成测定用试样，测定前向散射光强及侧向荧光强度。1号血液样本的网织红细胞经手工镜检为1.84％，用本发明试剂分析结果为1.95％，得到如图7所示的散射图。2号血液样本的网织红细胞经手工镜检为4.15％，用本发明试剂分析结果为4.27％，得到如图8所示的散点图。3号血液样本的网织红细胞经手工镜检6.07％，用本发明试剂分析结果为6.15％，得到如图9所示散点图，对图9之散点图的荧光强度做线性放大，可以获得白细胞的荧光强度，其荧光强度明显高于网织红的荧光强度，如图10所示。

本实施例与实施例1和实施例2的不同之处在于稀释液不同，本实施例不含有任何表面活性剂成分。

讨论：

本发明所采用的技术路线与US 5,821,127和US 2002/03758大体相同，都是采用阳离子类的红光激发荧光染料与网织红细胞内残留的RNA结合，通过红色激光激发而获得网织红细胞的计数分析，但所使用的荧光染料不同。US 5,821,127的网织红测定试剂的核心染料是聚次甲基兰，对红细胞有非特异性染色，荧光背景较高，需要采用试剂组分或软件算法来消除背景荧光带来的影响；该试剂体系需要阳离子表面活性剂和两性表面活性剂，促进染料进入和红细胞球形化。US 2002/03758公开的测定网织红细胞用于流式细胞分析仪分析网织红细胞和有核红细胞，虽然可以在任意环境温度下进行荧光标记，但标记时间随着环境温度的不同而有所改变，并且不利于用于血液分析仪中的规范标记，造成一定的误差。此外，其孵育时间也略长。

本发明所提供的检测血液样本中网织红细胞的试剂应用了一种不同的红光激发荧光染料，这种荧光染料可快速进入细胞而标记RNA，因此能满足临床检测对大量血液样本检测的速度需求。此外，本发明的网织红细胞试剂可采用规范的孵育温度、使用浓度和作用时间进行测定。试剂作用于血液样本后检测的重复性好，非特异性荧光背景低，能够广泛应用于血液细胞分析仪中，尤其是可以不必使用任何表面活性剂，避免了混匀血液样本与试剂时所产生的气泡而造成假阳性的结果。另外，由以上实施例中可见，使用本发明的网织红细胞进行检测与手工镜检对照，其一致性较好。

Claims (10)

1.网织红细胞检测试剂，其包含式(I)的荧光染料

2.权利要求1的网织红细胞检测试剂，其包含式(I)荧光染料和缓冲剂，任选含有渗透压调节剂和/或球形化试剂和/或促染剂，优选渗透压维持在150-380mOsm/kg，更优选160-300mOsm/kg，最优选230-260mOsm/kg。

3.权利要求1的网织红细胞检测试剂，其包含以下两种溶液：

(1)荧光染料储存液，含有式(I)荧光染料，其中荧光染料任选溶于有机溶剂中；和

(2)稀释液，含有缓冲剂，任选含有渗透压调节剂和/或球形化试剂和/或促染剂。

4.权利要求3的网织红细胞检测试剂，其中稀释液的渗透压维持在150-380mOsm/kg，更优选160-300mOsm/kg，最优选230-260mOsm/kg。

5.权利要求3或4的网织红细胞检测试剂，其中荧光染料储存液包含选自以下的溶剂：乙醇、二甲亚砜、乙二醇和甲醇；荧光染料储存液优选由所述荧光染料、乙二醇和甲醇组成。

6.权利要求1-5中任一项的网织红细胞检测试剂，其不含促染剂。

7.式(I)的荧光染料用于制备网织红细胞检测试剂的用途

8.式(I)的荧光染料用于制备权利要求2-6中任一项的网织红细胞检测试剂的用途。

9.检测网织红细胞的方法，包括将权利要求1-6中任一项的网织红细胞检测试剂与血液样品混合和孵育，用激发光激发荧光染料，然后测定荧光强度。

10.权利要求9的方法，其中首先将稀释液与血液样品混合，然后加入荧光染料储存液。

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