CN101324501A - 生物培养基中细胞在线原位计数的方法和系统 - Google Patents

Abstract

生物培养基中细胞在线原位计数方法，包括下述步骤：以在预先确定的测量频率范围内变化的不同频率，多次测量所述培养基的电容或多次测量所述培养基的电导；从所述电容测量中提取由所述培养基中β－分布引起的介电常数变化的信息；以及处理作为频率函数的介电常数变量的信息的变化，以提供关于所述培养基细胞计数的信息。

Description

生物培养基中细胞在线原位计数的方法和系统

1发明介绍

本发明涉及生物培养基中细胞在线原位计数的方法。它也涉及实施该方法的细胞计数系统。

制药和生物技术产业在生物反应器中用重组的动物细胞产生治疗上关注的分子。在有效测量反应的最佳和良好性能中，生物量是最重要的参数。目前生物量的测量对描述生物培养方法的特征是必不可少的，在整个细胞培养过程中都要测量该生物量参数。

参照测量是将细胞用胎盘兰染色后，通过显微镜对细胞计数。将细胞事先与染料(胎盘兰)接触，只有允许染料透过的细胞被视为死细胞。因此计数活细胞(未着色)、死细胞(胎盘兰染色)、总数以及由此推算出活细胞占细胞总数的比例(或活力)是可能的。

许多供应商提供该方法和合并有图像处理的显微镜，以实现这些不同的计数。这些解决方案差不多是自动化的，但测量是由反应器的取样完成的。

其他离线方法(取样)用于补充该参照，例如PCV(细胞压积)、通过“库尔特计数仪”的计数、通过流式细胞仪的计数、干重的测量、DNA量的分析等等。

在生物培养物中，参数的在线原位测量比取样测量提供了非常显著的优势：实时测量、自动化测量、任选地采用调节环路测量、没有与取样相关的污染风险。

因此许多供应商提供用于生物培养物的在线原位生物体传感器。这些生物体传感器采用光学或电容方法。

光学方法包括光吸收或衰减的测量，更普遍被称为浊度。培养基的浊度与悬液中的生物量相关。测量的光信号与悬液中粒子的数量或总细胞的数目(活着的和死亡的)相关。

某些生物体传感器使用反向散射测量，其中测量的光信号与悬液中粒子的数量和大小相关。该信号提供生物总量(活的和死的)的信息。

也可使用原位显微镜技术，该技术中所有细胞(活着的和死亡的)被直接计数得到总细胞的数目。

在线测量技术中，电容测量技术是最有效和最有吸引力的方法，因为获得的信号只与活着的生物体有关。事实上，只有活细胞是活跃的、可分裂的或产生目标治疗分子，这些细胞是需要首先测量的。该技术提供了对活细胞数量和大小都敏感的测量。

然而，正如上面描述的离线参照测量一样，在线测量不能既测量细胞的数量(独立于细胞大小的变化)，同时又能测量细胞的大小。

2发明主题

本发明的主题是提出在传感器中实施的测量生物培养物中生物体的在线原位计数方法，所述传感器能够测量活细胞的数目和大小、总细胞数及活细胞占细胞总数的百分比、或活力。

3现有技术

已有的研究成果(Pethig and Kell 1987；Foster and Schwan 1989；Markx andDavey 1999)对揭示生物培养物电容测量的基础理论提供了有用的参考。

在悬液细胞培养基的介电常数测量中，特别参考介电常数和激发频率的关系。

细胞培养基中电容测量首先包括应用0.1-20MHZ的多个激发频率，以及测量在每一频率的介电常数。获得的频谱包含三种类型的重叠信息：

-由于细胞的β-分布的介电常数

-由于电极极化的介电常数

-电子的寄生介电常数

由靠近电极表面的双层离子积聚产生的介电常数的下降被称为电极极化。介电常数的下降是由细胞膜的极化引起的。介电常数的下降称为β-分布，参考图1。

β-分布本身可由三个参数来描述：

-β-分布振幅，Δε

-特征频率fc，

-Cole-Cole系数α。

由β-分布产生的介电常数包含悬浮细胞的信息，例如：细胞数、平均半径、细胞的膜容量Cm、以及细胞质的传导性，这是本领域技术人员所熟知的。

为了提取电容测量的细胞信息，最常用的方法包括两步处理：

-校正：在测得的介电常数频谱中去除电极极化和电子寄生介电常数，以获得β-分布的频谱。

-从校正的β-分布中提取细胞的半径和数目。

这两步中存在几个方法变量：

对于第一步：

-基于β-分布对总介电常数贡献小(通常＜500kHz)的低频区介电常数的测量校正极化。[Cannizzaro 2003，Asami 1995]。这些方法基于在低频率时β-分布不变的假设。对大细胞而言，这种假设不再有效，该方法引入了校正误差。

-Bordi[Bordi 2001]提出确定该类型电极极化贡献的总方法：C_p＝P×f^-pp，其中P指极化的振幅，f指频率，并且1＜pp≤2。该方法不依赖于与测得频率范围有关的β-分布形成的任何假设，且使通过等效电路的非线性拟合确定P和pp成为可能。Bordi使用的模型是包括介电常数测量中三个贡献的复合模型：

-由于细胞的β-分布产生的贡献

-由于电极极化产生的贡献，以及

-由于电子噪音产生的贡献。

该方法需要同时得到测量的介电常数的实部(电导)和复部(电容)。Bordi使用的频率范围极为广泛(几个kHz到几百个MHz)。这个频率范围远超出目前在工业生物培养应用中使用的频率范围。而且，该范围需要使用顶级实验室的全阻抗仪，其价格和非工业特征在工业生物培养应用中是受限制的。

对于第二步，有三种方法：

一种方法包括直接从电容频谱中提取细胞数目和半径。该方法依赖于诸如主要成分分析(PCA)、以及偏最小二乘法(PLS)[Cannizzaro 2003]的统计学方法。

这种方法直接用于校正的或总的介电常数频谱，但将电容测量的细胞直径依赖的高度非线性特征考虑在内对该方法而言是困难的。实施这些统计方法是费力的，因为它需要所谓“校准”步骤的生物培养物的预先步骤，其中电容测量与细胞数目及半径的离线测量是可比的。

必须获得校准培养物以使所有范围的细胞半径和能被测量的细胞数范围被该校准培养物完全包括。该校准培养物是特异性针对一种细胞类型、以及特定培养条件的。这两个因素的一个发生变化，就需要新的校准。这是推广该方法及使其应用于工业的主要障碍。

这类方法暗示需要与细胞类型一样多的校准，其作为一种在线计数的工业方法是难于实施的。

另一种方法包括通过拟合提取参数。Cole/Cole型实验式模型用于描述β-分布。然后，通过非线性拟合提取描述β-分布的三个参数：Δε、fc和α。该拟合用于低频型极化校正后的数据[Yardley&al 2000]。实施该拟合是特别关键的步骤，因为由Cole/Cole参数相关模型的非线性和不稳定特征导致估计参数是不准确的。通常该拟合通过遗传算法、神经网络[Nicholson 1996]、“模拟退火”处理[Lising 1996]或Levenberg-Marquardt[Davey 1992，Davey 1993]型来完成。

由于这些顺序串联，极化校正误差引起参数Δε、fc和α的误差，特别是在测量大细胞大小时。这些方法应用于大范围生物培养时，没有一种是完全可靠的。

这些参数经过计算可用于估计细胞的数目和大小。该计算是基于所谓的Pauly-Schwan的球形细胞分布模型，下面会给出其详细资料。最经常的是，为了估计细胞的大小和数目，细胞的膜容量Cm和细胞质的电导率必须是已知的参数。这些参数可由电旋转型离线测量来估计[Archner，1999]。

另外一种方法已由[Asami 1995]提出，该方法使用代数公式，使得用预先确定的激发频率测量的电导和电容来评估特征频率fc成为可能。这种方法的缺点是该测定依赖于应用频率(2阶依赖)，这就需要使用的全阻抗仪的频率校准，而且根据Asimi的推荐，应用的频率必须与fc接近。

而且，这种方法需要培养起点(t＝0)的校准。这是假设膜容量和细胞内的电导在发酵过程中不改变。

4发明内容

本发明的目的是在工业可利用性和考虑极化误差方面矫正由现有技术计数方法造成的缺陷。

使用生物培养基中细胞的在线原位的计数方法实现该目的，所述方法包括下面的步骤：

-以在预先确定的测量频率内变化的不同频率多次测量所述培养基电容或多次测量所述培养基电导，

-从所述电容测量中提取由所述培养基的β-分布引起的介电常数变化的信息，以及

-处理所述的介电常数变化的信息，以提供关于所述培养基的细胞计数的信息。

所述方法基于通过几个频率的介电测定和电导测定使得估计细胞平均大小和细胞计数成为可能的方法。

与统计方法不同，本发明的计数方法相当于以意料之外的方式将Cole/Cole型实验式模型与Pauly-Schwan型模型结合描述球形细胞的分布。

本发明的主要优势在于它在所有环境的测量条件下，对所有类型生物细胞测量的精确度和可靠性。与Bordi方法不同，电子和极化相关的系统误差经受预处理，随后该预处理简化β-分布参数的解析。

在有利的版本中，本发明的计数方法还包括称为校准培养物的所述细胞培养物的预先校准步骤，该校准步骤包括：

-(i)以预先确定的频率，至少一次多个测量所述校准培养物的介电常数。

-(ii)处理所述介电常数的测量，以计算确定计数信息的因子。

因此本发明方法的另一优势在于该实施方法不需要预先知道细胞膜容量Cm和其胞质电导率。而对每一类型的培养，它使用仅需要校准培养物几个特定点(在下面描述的优选实施方案中是一个到三个)的自校准程序。该自校准包括这些点与独立测量的细胞大小和数目的相关性。

在本发明的计数活细胞方法框架内，获得称为校准培养物的预先培养物。测量预先培养物中多个频率下几个介电常数频谱(在优选实施方案中是一个到三个)和吸光率以确定：

-因子k₁或常数(a、b、c)，其使得用临界频率fc测量来确定后续培养物中的半径成为可能，

-因子k₂或常数(d、e、f)，其使得用Δε或Δσ以及临界频率fc测量来确定后续培养物中细胞数目成为可能，

-因子K′，其使得用吸光率的测量来确定后续培养物中总细胞数目成为可能。

后续培养物中的细胞总数和活细胞数目的测量将用于确定细胞活力。

常数k₁、k₂或a、b、c、d、e、f对应于下面描述的两个优选实施方案。

完成活细胞数目和大小的评估需要两步：

1.确定β-分布的参数：电容分布振幅Δε或电导分布振幅Δσ；特征频率fc，以及可选的Cole-Cole系数α。

2.从这些参数中评估活细胞的大小和数目

依照本发明的另一方面，提出生物培养基中细胞在线原位计数系统，依照本发明的方法实施，该系统包括：

-以在预先确定的测量频率范围内变化的不同频率，测量所述培养基电容的装置，

-从所述电容测量中提取由于所述培养基中的β-分布引起的介电常数变化的信息的装置，以及

-处理所述介电常数变化的信息的装置，以提供所述培养基中计数细胞的信息。

本发明的计数系统还有利地包括实施称为校准培养物的所述细胞培养物校准的装置，其包括：

-(i)以预先确定的频率实施所述校准培养的介电常数测量的装置，

-(ii)处理所述介电常数测量的装置，以计算确定计数信息的因子。

5.本发明的详细说明

在审查非限定性实施方案的详细描述和附图时，本发明的其他优势和特征将会变得明显，其中：

-附图1以作为频率函数的介电常数和电导率变化的形式显示已知的β-分布现象；

-附图2是本发明计数细胞系统的方框图；

-图3显示本发明计数细胞方法的步骤；

-图4显示了作为时间函数的培养基中活细胞数和总细胞数及介电常数的变化；

-图5显示了作为时间函数的培养基中活细胞数和总细胞数及介电常数变量的变化；

-图6显示作为时间函数的活细胞和总细胞的各自数目变化及吸光率的变化；以及

-图7显示作为时间函数的培养基中细胞平均半径的变化。

现在描述在实施本发明计数方法过程中进行的不同阶段的参数测定。

5.1描述来自Cole/Cole参数的活细胞数评估

依照第一个Pauly-Schwan方程式：

$\mathrm{\Δ\ϵ}=\frac{9\×r\×P\×C_M}{4}---\left(1\right)$

细胞数目的增加或细胞大小的改变影响生物量和介电常数信号的振幅，其中

Δε：介电常数(F m^-1)，β-分布的振幅

r：细胞半径(m)

P：细胞的体积分数(生物量)

$P=\frac{4}{3}\×\mathrm{\π}\×r^3\×\mathrm{Nv}---\left(2\right)$

Nv：活细胞的密度(m^-3)

C_M：每单位表面积的膜容量

该结果就是当体积分数P(生物量)保持不变时，较高的细胞半径r有增加Δε振幅的效应。

特征频率fc由第二个Pauly-Schwan方程式定义：

$f_c=\frac{1}{2\×\mathrm{\π}\×r\×C_M\×(\frac{1}{{\mathrm{\σ}}_c}+\frac{1}{2{\mathrm{\σ}}_m})}$ (3)

其中σ_c：细胞质的传导率

σ_m：培养基的传导率

因此该临界频率fc是细胞大小(r)、细胞状态以及细胞膜C_M特性的函数。

β-分布是由每个单独细胞产生的所有小β-分布的总和。Cole-Cole参数α表示在临界频率fc时小β-分布的分布状态。

两个Pauly-Schwan方程式描述了作为四个细胞参数：r、Nv、σ_M、σ_C的函数的两个β-分布参数。

在经常遇到的生物培养条件下，可以假设两个假定：

-膜容量Cm是温度和培养基电导率的已知函数，

-细胞内电导率σi是温度和培养基电导率的已知函数。

C_M＝g(T，σ_m)     (4)

σ_c＝h(T，σ_m)    (5)

将这两个方程式(4)和(5)与第二个Pauly-Schwan方程式(3)合并，得到下式：

$r=\frac{1}{2\mathrm{\π}}\×\frac{1}{g(T,{\mathrm{\σ}}_m)}\×\frac{2{\mathrm{\σ}}_{m}h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}{2{\mathrm{\σ}}_m+h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}\×\frac{1}{\mathrm{fc}}---\left(6\right)$

方程式(6)可以重新写成如下的简化形式：

$r=k_1(T,{\mathrm{\σ}}_m)\×\frac{1}{\mathrm{fc}},---\left(7\right)$

其中 $k_1(T,{\mathrm{\σ}}_m)=\frac{1}{2\mathrm{\π}}\×\frac{1}{g(T,{\mathrm{\σ}}_m)}\×\frac{2{\mathrm{\σ}}_{m}h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}{2{\mathrm{\σ}}_m+h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}.---(7.a)$

将第一个Pauly-Schwan方程式(1)、体积分数方程式(2)与两个方程式(4)和(5)合并，就得出了活细胞的数目：

$N_V=\frac{{16\mathrm{\π}}^3}{3}g{(T,{\mathrm{\σ}}_m)}^3{\left(\frac{2{\mathrm{\σ}}_m+h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}{2{\mathrm{\σ}}_{m}h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}\right)}^4\×(\mathrm{\Δ\ϵ}\×f_c^4)---\left(8\right)$

方程式(8)可以重新写成如下的简化形式：

$N_V=k_2(T,{\mathrm{\σ}}_m)\×(\mathrm{\Δ\ϵ}\×f_c^4)---\left(9\right)$

其中 $k_2(T,{\mathrm{\σ}}_m)=\frac{{16\mathrm{\π}}^3}{3}g{(T,{\mathrm{\σ}}_m)}^3{\left(\frac{2{\mathrm{\σ}}_m+h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}{2{\mathrm{\σ}}_{m}h(T,{\mathrm{\σ}}_m)}\right)}^4.---(9.a)$

活细胞的数目也被表示为电导差值Δσ和频率fc的函数。事实上，既然Δσ＝2π*fc*Δε，(9)，Nv可以如下的不同方式计算：

$N_V=\frac{1}{2\mathrm{\π}}\×k_2(T,{\mathrm{\σ}}_m)\×(\mathrm{\Δ\σ}\×f_c^3)---\left(10\right)$

通过预先准备的培养物和活细胞数目对策相关性(例如上面引用的参考方法)确定函数k1和k2后，Δε和fc或Δσ和fc的确定可直接和在线测量活细胞的数目，这一点通过合并方程式(7)和(9)、或(7)和(10)被建立。

基于该目的，函数k1和k2只可被限定为n进制函数κ_i的加权和。

$k_1(T,{\mathrm{\σ}}_m)=\underset{i=1,...n}{\mathrm{\Σ}}{c}_i\×{\mathrm{\κ}}_i(T,\mathrm{\σ})---\left(11\right)$

$k_2(T,{\mathrm{\σ}}_m)=\underset{i=1,...n}{\mathrm{\Σ}}{d}_i\×{\mathrm{\κ}}_i(T,\mathrm{\σ})---\left(12\right)$

通过将(7)和(9)、或(7)和(10)给出的结果与由线性回归方法得到的离线测量至少n结果相联系，用校准培养物确定系数c_i和d_i。

一旦完成校准，即一旦确定系数c_i和d_i，就可用公式(7)、(9)、(11)、(12)、或者公式(7)、(10)、(11)、(12)通过培养基中电容测量、温度和电导原位估计活细胞的数目和大小。

如果细胞的膜容量Cm和细胞质的电导率σ_c已知，在原位测量中用方程式(7.a)和(9.a)代替(11)、(12)，就不需要参照培养物。

Cole/Cole参数α可选地提供细胞大小围绕由(7)估计的均值分布的定性信息。使用实验式使得α与平均半径r和大小分布的标准偏差联系起来成为可能。

现在描述校准步骤的优选实施方案。

1.在一个实施方案中，可从对多数培养物而言，两函数k₁和k₂不完全依赖于培养基的温度和电导率这一实验证实的事实出发。通过线性函数类型能非常近似的得到这两个函数：

k₁(T，σ_m)＝a+b×T+c×σ_m

和k₂(T，σ_m)＝d+e×T+f×σ_m。

由在经验层面(T，σ_m)的三次参照培养物实验的最小值、以及随后通过实施与活细胞数目对策的关联(例如上文引用的参照方法)确定系数a、b、c、d、e、f。

2.在对应于函数k₁和k₂较不准确、但更适于校准的计算的另一实施方案中，培养基的温度和电导率的变化可被忽略的生物培养应用中的常数k₁和k₂接近k₁和k₂：

k₁(T，σ_m)＝k₁和k₂(T，σ_m)＝k₂

参照培养基的单次测量足以描述常数k₁和k₂的特征，并将其与活细胞数目的对策联系起来(例如上文引用的参照方法)。在本优选实施方案的情形下，温度和电导测量不是必须的。

5.2测量谱中Cole/Cole参数确定的说明

为确定活细胞计数必需的β-分布参数提出两个可选的方法：

通过拟合方法确定参数α、fc、Δε

分两步完成该确定：

-通过减法校正电子的寄生介电常数和电极的系统极化；依照该方法通过减法校正电子的寄生电导。

-校正由电极剩余极化产生的介电常数，以及通过拟合确定Cole/Cole参数本身。

首先，如下式减去由电子产生的介电常数和电导：

ε^corr(f，σ_m)＝ε^mes(f，σ_m)-ε^cal(f，σ_m)    (13)

σ^corr(f)＝σ^mes(f)-σ^cal(f)    (14)。

在无细胞培养基中用探针测量介电常数ε^cal(f)和电导σ^cal(f)，低频时的电导σ_m与有细胞培养基测量过程中是一致的。与[Bordi 2001]不同，该校正使得在测量的介电常数中消除由于电子产生的寄生介电常数成为可能。

随后多个频率{f}下测量的校正介电常数通过Cole/Cole模型拟合，其随着任意的极化期增加：

$\mathrm{\ϵ}\left(f\right)=\mathrm{\Δ\ϵ}\×\frac{1+{\mathrm{rf}}^{1-\mathrm{\α}}\sin (\mathrm{\α\π}/2)}{1+{\mathrm{rf}}^{2(1-\mathrm{\α})}+2\×{\mathrm{rf}}^{1-\mathrm{\α}}\sin (\mathrm{\α\π}/2)}+{\mathrm{\ϵ}}_h+\mathrm{\ΔP}\×f^{-\mathrm{pp}}---(15.a)$

$\mathrm{\σ}\left(f\right)=\mathrm{\Δ\σ}\×\frac{r{f}^{2-\mathrm{\α}}\cos (\mathrm{\α\π}/2)}{1+{\mathrm{rf}}^{2(1-\mathrm{\α})}+2{\mathrm{rf}}^{1-\mathrm{\α}}\sin (\mathrm{\α\π}/2)}+{\mathrm{\σ}}_1---(15.b)$

其中 $\mathrm{rf}:=\frac{f}{\mathrm{fc}}$

要确定的五个参数是：

α：Cole/Cole参数，

Δε：介电常数分布的振幅，

fc：特征频率，

ΔP：剩余极化的振幅，

ε_h：基线，当频率趋向无穷大时电容的极限。

另外两个参数是：

Δσ：电导分布的振幅，

σ₁：基线，低频电导

pp是所谓极化能力的常量。该常数值(包括1至2之间)对每个探针是特异的(特别依赖于电极形状和孔隙率)，其特征是只针对一次性探针。

通过试图将模型(15.a)和校正数据(13)之间的加权“最小平方”差的函数最小化，在处理器内进行拟合计算：

$J(\mathrm{\α},\mathrm{\Δ\ϵ},f_c,\mathrm{\ΔP},{\mathrm{\ϵ}}_h)=\underset{f}{\mathrm{\Σ}}w\left(f\right)\×{({\mathrm{\ϵ}}^{\mathrm{corr}}\left(f\right)-\mathrm{\ϵ}\left(f\right))}^2$

引入权重系数w(f)，作为激发频率的函数，以补偿电子噪音行为的差异。

在该方法的优选实施方案中，使用带有预处理的有限存储基于Quasi-Newton、Broyden-Fletcher-Goldfarb-Shanno(BFGS)型算法的变量的算法用于最小化J。

出于限定所述参数在它们的有效范围内：1＜α≤2、Δε≥0、fc＞0的目的，本发明框架内引入的变量是对标准BFGS算法的修正。

依照生物培养物的类型，可在该算法中加入涉及Cole/Cole模型参数的其他限制，以使其更为稳定。

在该方法的另一个变化中，将依照Cole/Cole分布模型(15.b)的介电常数实部与(15.a)中的虚部结合，以形成复合介电常数模型用于拟合。

基于校正的电导和电容测量(13)和(14)拟合该模型。将Δσ和σ₁加入拟合参数的列表。该组合增加了确定Cole/Cole参数的精确度。

通过代数方法确定参数α、fc、Δσ

PLS型或线性回归的统计方法存在如下缺陷：(i)为描述β-分布，需要应用大频率范围，以及(ii)使用计算量大的算法。这使整合进电子芯片的任务变得困难。

代数方法有极易置入完整电路的优势，因为在计算能力方面及频率使用方面它要求不是很高。它不使用线性回归，不需要测量频率的最小数。

由细胞行为物理模型的代数解析确定参数α、fc、Δσ。

本领域的现状促使使用电容光谱学确定特征参数α、fc、Δσ。目前，电导也受到该分布的影响。

该方法包括将电导和电容的β分布模型合并，以用代数方法确定特征参数α、fc、Δσ。

该方法优选地从α＝0时的简化的Pauly和Schwan公式开始：

$\mathrm{\ϵ}\left(f\right)={\mathrm{\ϵ}}_h+\frac{\mathrm{\Δ\ϵ}}{1+{\left(\frac{f}{\mathrm{fc}}\right)}^2}---\left(16\right)$

$\mathrm{\σ}\left(f\right)={\mathrm{\σ}}_1+\frac{\mathrm{\Δ\σ}{\left(\frac{f}{\mathrm{fc}}\right)}^2}{1+{\left(\frac{f}{\mathrm{fc}}\right)}^2}---\left(17\right)$

Δσ＝2π*fc*Δε    (18)

因此通过合并公式(16)、(17)和(18)得到特征频率fc

$\mathrm{fc}=\frac{1}{2\mathrm{\π}}*\frac{\mathrm{\σ}\left(f1\right)-\mathrm{\σ}\left(f2\right)}{\mathrm{\ϵ}\left(f1\right)-\mathrm{\ϵ}\left(f2\right)}---\left(19\right)$

其中只有最少的两个频率，因此确定频率fc是可能的。

方程式(16)、(17)和(18)的合并结果并不仅限于这种形式，可被修正到使用几个频率。

同样显而易见的是，相对于所有其他已知的方法，fc的这种确定方法独立于悬浮培养基的所有其他参数：半径r、膜容量Cm、细胞内电导率、生物量P、培养基的电导率。

特征频率fc的确定也独立于选择的频率。结果就是，与只使用电容光谱学的方法不同，应用的频率f1和f2的精确度并不重要。该方法有随使用的阻抗计的频率校正分布的优势。

而且，计算特征频率fc的相应数学关系非常容易在完整的电路中执行。

现在描述确定电导Δσ变化的实用模型。从使用方程式(17)开始，以不同的方式由代数方法获得该变化。

$\mathrm{\Δ\σ}=(\mathrm{\σ}\left(f\right)-\mathrm{\σl})({\left(\frac{\mathrm{fc}}{f}\right)}^2+1)$

如果与Δσ相比，σ1是可忽略的，可以使用单一的测量频率。

更为常见的情形是，使用最少两个频率，通过代数法确定Δσ。

现在描述在本发明计数方法的框架内确定细胞活力的实用模型。

如上文描述的，光吸收或衰减的测量(更普遍称为浊度)与悬液中的生物量相关。测量的光信号与悬液粒子量或总细胞数(活的和死的)相关。

吸光率＝K′*Nt

其中Nt＝总细胞数

用预先培养确定K′和确定总细胞数对策的相关性(例如上文引用的参考方法)后，吸光率的确定是总细胞数的直接在线测量。

通过下面的公式确定细胞活力：

Nv*100/Nt＝细胞活力

用后续培养中总细胞数和活细胞数的测量来确定细胞活力。

参考上面提及的附图，现在描述本发明计数方法的实施例，同时还有实施该方法的计数系统。

参考图2，计数细胞的系统S包括：

-浸入发酵槽2内部的细胞悬液中的电容电极1装置，

-电子调控器3，包括例如浮桥，以期产生可变激发频率及产生电容信号，

-处理器5，用于从随着频率函数变化的电容信号中提取有关培养基β-分布的信息、特别是临界频率fc、介电常数变量Δε，以提供活细胞数的在线测量及可选的这些细胞的平均半径，

-光学单元4，用来测量培养基的吸光率。

参考图3，在实践中，以软件的形式实施本发明计数方法，处理诸如电容和吸光率的物理变量。运行该软件处理随频率函数变化的吸光率和电容测量值，以产生培养基中β-分布的特征参数。

图4-7显示了实验结果。

当然，本发明并不限于刚刚描述过的实例。对这些实例所做的众多修正都不超出本发明的范围。

因而电容和(或)电导信号来源于装有频率扫描仪和连接浸入生物培养基的传感器的任一类型的阻抗测量装置(阻抗测量)。

术语“阻抗测量”包括：

-基于要被测量样本的V/I比率确定的各种测量阻抗的方法，其中一些在由Hewlett Packard出版的书籍“Impedance Measurement Handbook(阻抗测量手册)”中描述过。

-诸如技术人员在采用本申请名称的文件WO0179828中公开的零点法，

-共振方法，以及更为普遍的，

-使确定传感器浸入的生物培养基的电导和电容成为可能的任何方法。

参考文献

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[2]David J.Nicholson，Douglas B.Kell，Christopher L.Davey，Deconvolution ofthe dielectric spectra of microbial cell suspensions using multivariate calibration andartificial neural networks(用多变量校准和人工神经网络实现微生物细胞悬液的介电谱反褶积)，Bioelectrochemistry and Bioenergetics 39(1996)185-193.

[3]C.L Davey，H.M.Davey and D.B.Kell(1992)On the dielectric properties ofcell suspensions at high volume fractions(关于高体积分数细胞悬液的介电性能).Bioelectrochemistry and Bioenergetics 28 pp：319-330.

[4]Christopher L.Davey，Gerard H.Mark and Douglas B.Kell.(1993).On thedielectric method ofmonitoring cellular Viability(关于监测细胞活力的介电方法).Pure & App/.Chern.，Vol.65，NO.9，pp.：1921-1926.1993.

[5]Steffen Archer，Hywel Morgan，and Frazer J.Rixon，Electrorotation Studies ofBaby Hamster Kidney Fibroblasts Infected with Herpes Simplex Virus Type 1(1型单纯疱疹病毒感染幼仓鼠肾成纤维细胞的电旋转研究)，Biophysical JournalVolume 76May 19992833-2842.

[6]Christopher Cannizzaro，Raphael Gu¨gerli，Ian Marison，Urs von Stockar，On-Line Biomass Monitoring of CHO Perfusion Culture With Scanning DielectricSpectroscopy(用扫描介电波谱技术在线监测CHO灌注培养生物量)，24September 2003 in Wiley InterScience(www.interscience.wiley.com).

[7]Koji Asami，Takeshi Yonezawa，Dielectric analysis of yeast cell growth(酵母细胞生长的介电分析)，Biochimica and Biophysica Acta 1245(1995)99-105.

[8]F.Bordi，C.Cametti，T.Gili，Reduction of the contribution of electrodepolarization effects in the radiowave electric measurements of highly conductivebiological cell suspensions(电极极化效应在高导电生物细胞悬液的无线电波电测量中的贡献降低).Bioelectrochemistry 54(2001)，53-61.

Claims (21)

1.生物培养基中在线原位细胞计数的方法，包括下列步骤：

-以在预先确定的测量频率范围内变化的不同频率，多次测量所述培养基的电容或多次测量所述培养基的电导，

-从所述电容测量中提取由所述培养基的β-分布引起的介电常数变化的信息，以及

-处理所述的介电常数变化的信息，以提供关于所述培养基中细胞计数的信息。

2.如权利要求1所述的方法，其中还包括称为校准培养物的所述细胞的培养物的预先校准步骤，所述校准步骤包括：

-(i)以预先确定的频率对所述校准培养物的介电常数进行至少一次多个测量，

-(ii)处理所述介电常数的测量值，以计算确定计数信息的因子。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述预先校准步骤还包括所述介电常数测量与离线测量之间的相关性的运算，使得校准培养物生物体总量的测量能够作为参照使用。

4.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述提取由β-分布引起介电常数变化的信息的步骤包括从如下三个参数中的至少一个确定所述β-分布的描述参数：介电常数变量Δε、电导变量Δσ、临界频率fc和参数α。

5.如前述任一权利要求或权利要求2所述的方法，其中所述预先校准步骤旨在确定对应于所述培养基中细胞的半径r和所述β-分布的临界频率fc的乘积的函数k。

6.如权利要求5所述的方法，其中还包括从所述临界频率fc的确定中提供所述培养基中细胞的平均半径的在线测量的步骤。

7.如权利要求6所述的方法，其中还包括从所述在线确定的细胞平均半径中确定所述培养基中活细胞的数目。

8.如权利要求6所述的方法，其中还包括直接离线测量所述平均半径的步骤、以及所述直接测量和所述从临界频率fc在线确定中获得的所述平均半径的在线间接测量之间的相关性的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中通过显微镜法完成所述平均半径的直接离线测量。

10.如前述任一权利要求所述的方法，其中还包括依照如下公式确定活细胞数或生物量：

Nv＝K*Δε*fc⁴。

11.如前述任一权利要求所述的方法，其中还包括依照如下公式确定活细胞数或生物量：

Nv＝K*Δσ*fc³/2π。

12.如权利要求10、11和2中任一权利要求所述的方法，其中安排所述预先校准步骤以确定所述函数K。

13.如前述任一权利要求或权利要求3所述的方法，其中安排能够测量所述校准培养物中生物体总量的光学测量以提供光学信号，例如

吸光率＝K′*Nt

其中Nt＝总细胞数。

14.如权利要求13所述的方法，其中安排所述校准步骤以确定所述系数K′。

15.如权利要求14所述的方法，其中还包括所述总细胞数Nt的直接在线测量，所述测量从能够测量所述被测生物体总量的光学信号和在所述预先培养步骤中确定的所述系数K′开始。

16.如权利要求15所述的方法，其中还包括依照如下公式提供细胞活力的信息：

Nv*100/Nt＝细胞活力。

17.如前述任一权利要求所述的方法，其中所述测量频率的范围为0.1-20MHz。

18.实施如前述任一权利要求所述方法的生物培养基中细胞的在线原位计数的系统，包括：

-以在预先确定的测量频率范围内变化的不同频率测量所述培养基电容的装置，

-从所述电容测量中提取由所述培养基的β-分布引起的介电常数变化信息的装置，以及

-处理所述介电常数变化信息的装置，以提供所述培养基中细胞计数信息。

19.如权利要求18所述的系统，其中还包括完成所谓校准培养物的所述细胞培养物的校准的装置，包括：

-(i)以预先确定的频率完成所述校准培养物的介电常数测量的装置，以及

-(ii)处理所述安排的介电常数测量以计算确定计数信息因子的装置。

20.如权利要求18或19所述的系统，其中还包括

实现培养基中细胞平均半径的直接离线测量的装置，以及

实现所述直接测量与从在线测定所述培养基临界频率fc获得的所述平均半径的间接在线测量之间的相关性的装置。

21.如权利要求20所述的系统，其中还包括作为直接离线测量所述平均半径的装置的显微镜设备。

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