CN101302196A - 多卤代吖啶酮类化合物荧光探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多卤代吖啶酮类化合物作为pH荧光探针在缓冲溶液中对氢离子高选择性识别的应用。该类化合物激发波长在260～280nm，发射波长≥400nm，且具有水溶性从而扩大其适用范围。该类化合物具有量子产率高(pH＝1，Φ≥0.7)、荧光稳定等特性。并且随着pH的变化，在酸性和碱性的一定pH范围其荧光强度的比值与pH的变化呈线性相关，据此，可实现比率法测定酸性或碱性范围内的pH变化。该类化合物可对两个极端范围的pH(强酸和强碱)产生高灵敏度、高选择性的荧光响应。是一种适于测定极端pH(＜3pH＜8和11＜pH＜15)的荧光探针。

Description

多卤代吖啶酮类化合物荧光探针及其应用

技术领域

本发明涉及多卤代吖啶酮类化合物作为pH荧光探针在缓冲溶液中对氢离子高选择性识别的应用。

背景技术

化学反应的进行或完成，细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关(Fuh，M.R.S.；Burgess，L.W.；Hirschfeld，T.；et al.Analyst，1987，112，1159；Khramtsov，V.V.；Grigor’Ev，I.A.；Foster，M.A.；Lurie，D.J.；et al.Cell Mol.Biol.2000，46，1361)，pH值的精确测量对化学生物学研究十分重要。而荧光法测定pH不但灵敏度高，而且可实时检测细胞内pH的动态分布和区域变化，引起了人们的关注(Srivastava，A.Krishnamoorthy，G.Anal.Biochem.1997，249，140)。

吖啶酮类化合物结构含有大π键共轭结构，分子两端同时连有吸电子基团(C＝0)和推电子基团(N-R₂)，因而容易发生分子内的电子转移，使分子具有较强的荧光发射功能。吖啶酮类化合物具有高的光稳定性(Bahr.N.；Tierney，E.，Reymond.，J.L.Tetrahedron Lett，1997，38：1489-1492；Rothman，J.H.，Still，W.C.Bioorg Med ChemLett，1999，9：509-512.)、化学稳定性、荧光发射波长适中、荧光量子产率高、有大的斯托克斯(Stokes)位移等良好特性，近年来开始被用于多种荧光分子探针的合成。但目前报道的荧光类化合物包括吖啶酮类化合物作为荧光探针使用仅局限于较窄的pH范围，发展适于测定极端pH(如pH＜5或pH＞9)的荧光探针，将会促进有关特殊生物体系的生物学研究(Su，M.；Liu，Y.；Ma，H.；et aJ.Chem.Commun.2001，960；Lin，H.；Herman，P.；Kang，J.S.；et al.Anal.Biochem.2001，294，118)。

到目前为止，苯环上多卤代的吖啶酮衍生物的合成仅有我课题组申请了中国发明专利(申请号：200810058228.0)。该类化合物激发波长在260～280nm，发射波长≥400nm，且具有水溶性从而扩大其适用范围。该类化合物具有量子产率特高(pH＝1，Φ≥0.7)、荧光稳定等特性，并且随着pH的变化，该类化合物有着不同的解离形式，其中只有阳离子形式和中性分子有较强的荧光发射。在酸性和碱性的一定pH范围其荧光强度的比值与pH的变化呈线性相关，据此，可实现比率法测定酸性或碱性范围内的pH变化。因而对多卤代吖啶酮荧光性质作为pH荧光探针的应用研究具有重要意义。本专利的目的是将结构简单的多卤代吖啶酮化合物作为PH荧光探针方面的应用。该类化合物可对两个极端范围的pH(强酸和强碱)产生高灵敏度、高选择性的荧光响应。这种适于测定极端pH的荧光探针，对促进有关特殊生物体系的生物学研究具有重要的意义。

应用内容

一系列多卤代吖啶酮类化合物，结构如式(I)应用于pH荧光探针。

式(I)中，X₁，X₂，Y＝氟、氯；R＝烷基、芳基；R’＝烷基、芳基；

在式(I)中，R及R’均优选为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、甲胺基、二甲胺基、二乙胺基、乙胺基、丙胺基、异丙胺基、正丁胺基、异丁胺基、叔丁胺基、甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、取代的吡啶基、吲哚基、咪唑基、萘基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、金刚烷基、苯甲基、苯乙基或苯丙基。

本专利将多卤代吖啶酮类化合物(I)应用于pH荧光探针

其代表化合物如下：

(I-A)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为H，R’为H；

(I-B)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为H，R’为Cl；

(I-C)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为H，R’为CH₃；

(I-D)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为H，R’为H；

(I-E)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为H，R’为Cl；

(I-F)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为H，R’为CH₃；

(I-G)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为H，R’为H；

(I-H)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为H，R’为Cl；

(I-I)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为H，R’为CH₃；

(I-J)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Me，R’为H；

(I-K)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Et，R’为H；

(I-L)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Me，R’为Cl；

(I-M)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Et，R’为Cl；

(I-N)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Me，R’为H；

(I-O)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Et，R’为H；

(I-P)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Me，R’为Cl；

(I-Q)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Et，R’为Cl；

(I-R)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为Me，R’为H；

(I-S)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为n-Bu，R’为Cl。

本专利对结构简单的式(I)多卤代吖啶酮化合物荧光性质应用于PH荧光探针方面。

附图说明

图1为化合物IG在不同溶剂中的荧光发射光谱图；

图2为化合物IA的荧光发射光谱图和pH——最大荧光发射峰变化趋势图；

图3为化合物ID的荧光发射光谱图和pH——最大荧光发射峰变化趋势图；

图4为化合物IG的荧光发射光谱图和pH——最大荧光发射峰变化趋势图；

图5为化合物IE的荧光发射光谱图和pH——最大荧光发射峰变化趋势图；

图6为化合物IH的荧光发射光谱图和pH——最大荧光发射峰变化趋势图。

图7为化合物ID的量子产率的测定。

具体实施方式

实施例1

化合物IG在不同溶剂中的荧光光谱：IG在不同溶剂DMF、DCM、DMSO、乙醇和乙腈中的荧光光谱，结果发现，随着溶剂极性的增大，荧光光谱发生红移，表明IG的发射态具有分子内电荷转移特征(见附图1)。

实施例2

化合物IA在EtOH/H₂O＝1/1(v/v)体系中pH值对其影响：化合物IA在4.6＜pH＜7.0，荧光强度呈现快速下降趋势。而当pH＞7.0以后，荧光强度随碱性增加没有明显的改变，这表明该化合物适宜4.6＜pH＜7.0之间的良好指示作用，十分适宜于pH荧光传感探针(见附图2)；当0.7＜pH＜5.6范围内，随着溶液pH值的增加，荧光强度逐渐降低，但峰位置不随溶液pH值的变化而变化，表明溶液中发光物种并未改变(仍为两种形态：中性分子及酸式盐)，但456nm处的荧光强度在逐渐减弱，而481nm处的荧光强度却在增强，说明化合物IA存在着如下电离平衡：

实施例3

化合物ID在EtOH/H₂O＝1/1(v/v)体系中pH值对其影响：化合物ID在2.9＜PH＜8.0，荧光强度呈现快速下降趋势。而当pH＞8.0以后，荧光强度随碱性增加没有明显的改变，这表明该化合物适宜2.9＜pH＜8.0之间的良好指示作用，适宜于pH荧光传感探针(见附图3)；当0.3＜pH＜5.8范围内，随着溶液pH值的增加，荧光强度逐渐降低，但峰位置不随溶液pH值的变化而变化，表明溶液中发光物种并未改变(仍为两种形态：中性分子及酸式盐)，但441nm处的荧光强度在快速减弱，而463nm处的荧光强度减弱缓慢即出现了由左高右低的双峰向左低右高转化，说明化合物ID与IDH⁺存在着电离平衡。当pH＝5.8时，左峰基本消失，说明化合物以单一型体ID存在。当pH值增大到pH＞6.8时，在493nm处出现一新荧光发射峰，此时，仍为左高右低的双峰，随着pH值的增大，出现了由左高右低的双峰向左低右高转化，说明ID与ID^-存在着电离衡。当pH＞11.8时，左峰完全消失，说明此时以ID^-存在。电离平衡表示如下。当10.5＜pH＜14.1，荧光强度呈现快速下降趋势，这表明该化合物同样在10.5＜pH＜14.1之间的良好指示作用(见附图3)，适宜于强碱条件下pH荧光传感探针。

pH＝5.8时，主要以ID存在    pH＞11.8时，主要以ID^-存在

实施例4

化合物IE在EtOH/H₂O＝1/1(v/v)体系中pH值对其影响：化合物IE在0.9＜PH＜8.2，荧光强度呈现快速下降趋势。而当pH＞8.2以后，荧光强度随碱性增加没有明显的改变，这表明该化合物适宜0.9＜pH＜8.2之间的良好指示作用，适宜于pH荧光传感探针(见附图4)；当0.9＜pH＜4.4范围内，随着溶液pH值的增加，荧光强度呈下降气势，但峰位置不随溶液pH值的变化而变化，表明溶液中发光物种并未改变(仍为两种形态：中性分子及酸式盐)，但449nm处的荧光强度在快速减弱，而471nm处的荧光强度减弱缓慢即出现了由左高右低的双峰向左低右高转化，说明化合物IE与IEH⁺存在着电离平衡。当pH＝4.4时，左峰基本消失，说明化合物以单一型体IE存在。当pH值增大到pH＞5.9时，在497nm处出现一新荧光发射峰，此时，两峰高度相当，随着pH值的增大，双峰出现左低右高，说明IE与IE^-存在着电离衡。当pH＞11.9时，左峰完全消失，说明此时以IE^-存在。电离平衡表示如下。当11.9＜pH＜15.0，荧光强度呈现快速下降趋势，这表明该化合物同样在11.9＜pH＜15.0之间的良好指示作用(见附图4)，适宜于强碱条件下pH荧光传感探针。

4.4＜pH＜4.7时，以IE存在     pH＞11.9时，以IE^-存在

0.9＜pH＜4.4时，IE与IEH⁺同时存在  5.9＜pH＜11.9时，IE与IE^-同时存在

实施例5

化合物IG在EtOH/H₂O＝1/1(v/v)体系中pH值对其影响：化合物IG在5.2＜pH＜7.3，荧光强度呈现快速下降趋势。而当7.3＜pH＜11.7时，荧光强度随碱性增加没有明显的改变，这表明该化合物适宜5.2＜pH＜7.3之间的良好指示作用，适宜于pH荧光传感探针(见附图5)；当0.2＜pH＜5.2范围内，随着溶液pH值的增加，荧光强度呈下降气势，但峰位置不随溶液pH值的变化而变化，表明溶液中发光物种并未改变(仍为两种形态：中性分子及酸式盐)，但441nm处的荧光强度在快速减弱，而463nm处的荧光强度减弱缓慢，说明化合物IG与IGH⁺存在着电离平衡。当pH＝5.7时，左峰基本消失，说明化合物以单一型体IG存在。当pH值增大到pH＞6.6时，在487nm处出现一新荧光发射峰，此时，两峰高度相当，随着pH值的增大，双峰出现左低右高，说明IG与IG^-存在着电离衡。当pH＞13.0时，左峰基本消失，说明此时以IG^-存在。电离平衡表示如下。当11.8＜pH＜14.6，荧光强度呈现快速下降趋势，这表明该化合物同样在11.7＜pH＜14.6之间的良好指示作用(见附图5)，适宜于强碱条件下pH荧光传感探针。

5.7＜pH＜6.6时，以IG存在          pH＞13.0时，以IG^-存在

0.2＜pH＜5.2时，IG与IGH⁺同时存在   6.6＜pH＜13.0时，IG与IG^-同时存在

实施例6

化合物IH在EtOH/H₂O＝1/1(v/v)体系中pH值对其影响：化合物IH在2.8＜pH＜4.4，荧光强度呈现快速下降趋势。而当4.4＜pH＜11.3时，荧光强度随碱性增加没有明显的改变，这表明该化合物适宜2.8＜pH＜4.4之间的良好指示作用，适宜于pH荧光传感探针(见附图6)；当2.8＜pH＜4.4范围内，随着溶液pH值的增加，荧光强度呈下降气势，但峰位置不随溶液pH值的变化而变化，表明溶液中发光物种并未改变(仍为两种形态：中性分子及酸式盐)，但448nm处的荧光强度在快速减弱，而471nm处的荧光强度减弱缓慢，说明化合物IH与IHH⁺存在着电离平衡。当pH＝4.4时，左峰基本消失，说明化合物以单一型体IH存在。当pH值增大到pH＞5.5时，在492nm处出现一新荧光发射峰，此时，两峰高度相当，随着pH值的增大，双峰出现左低右高，说明IH与IH^-存在着电离衡。当pH＞13.6时，左峰基本消失，说明此时以IH^-存在。电离平衡表示如下。当11.7＜pH＜14.6，荧光强度呈现快速下降趋势，这表明该化合物同样在11.7＜pH＜14.6之间的良好指示作用(见附图6)，适宜于强碱条件下pH荧光传感探针。

4.4＜pH＜5.5时，以IH存在          pH＞13.6时，以IH^-存在

0.8＜pH＜4.4时，IH与IHH⁺同时存在   5.5＜pH＜13.6时，IH与IH^-同时存在

实施例7

化合物IA量子产率的测定：选用1μg/mL硫酸奎宁的0.1mol/L H₂SO₄溶液作为标准物(Φ_fstd＝0.55)，采用慈云祥等提出的荧光量子产率简化测量方法[慈云祥，贾欣.分析化学，1986，14：616-617.]。待测溶液也选用0.1mol/L H₂S_O4做为溶剂，利用式(1)计算吖啶酮衍生物在0.1mol/L H₂SO₄溶液中的荧光量子产率(Φ_f)：

${\mathrm{\Φ}}_{\mathrm{fx}}=\frac{{n_X}^2\×F_X\×{\mathrm{\Φ}}_{\mathrm{fstd}}}{{n_{\mathrm{std}}}^2\×F_{\mathrm{std}}}=\frac{F_X\×{\mathrm{\Φ}}_{\mathrm{fstd}}}{F_{\mathrm{std}}}=0.55F_X/F_{\mathrm{std}}---\left(1\right)$

上式中Φ_fstd为标准物硫酸奎宁的Φ_f，n_std和n_x分别为硫酸奎宁溶液和待测溶液的折光率(标准物、待测溶液均用0.1mol/L H₂SO₄做为溶剂，故n_std＝n_x)；F_std和F_x分别为标准溶液和待测溶液的荧光峰高，实验测得化合物IA的量子产率Φ_fIA＝0.70。

实施例8

化合物ID量子产率的测定：用化合物ID代替化合物IA按实施例6的方法测得化合物ID的量子产率为Φ_fID＝0.98(见附图7)。

实施例9

化合物IE量子产率的测定：用化合物IE代替化合物IA按实施例6的方法测得化合物ID的量子产率为Φ_fIE＝0.81。

实施例10

化合物IG量子产率的测定：用化合物IG代替化合物IA按实施例6的方法测得化合物ID的量子产率为Φ_fIG＝0.70。

实施例11

化合物IH量子产率的测定：用化合物IH代替化合物IA按实施例6的方法测得化合物ID的量子产率为Φ_fIH＝0.92。

Claims (5)

1、一系列多卤代吖啶酮类化合物，结构如式(I)应用于pH荧光探针。

式(I)中，X₁，X₂，Y＝氟、氯；R＝烷基、芳基；R’＝烷基、芳基。

2、应用于pH荧光探针的多卤代吖啶酮类化合物其特征在于结构通式为：

其代表化合物如下：

(I-A)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为H，R’为H；

(I-B)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为H，R’为Cl；

(I-C)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为H，R’为CH₃；

(I-D)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为H，R’为H；

(I-E)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为H，R’为Cl；

(I-F)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为H，R’为CH₃；

(I-G)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为H，R’为H；

(I-H)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为H，R’为Cl；

(I-I)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为H，R’为CH₃；

(I-J)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Me，R’为H；

(I-K)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Et，R’为H；

(I-L)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Me，R’为Cl；

(I-M)当X₁为Cl，X₂为Cl时，Y为Cl，R为Et，R’为Cl；

(I-N)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Me，R’为H；

(I-O)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Et，R’为H；

(I-P)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Me，R’为Cl；

(I-Q)当X₁为F，X₂为F时，Y为Cl，R为Et，R’为Cl；

(I-R)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为Me，R’为H；

(I-S)当X₁为F，X₂为F时，Y为F，R为n-Bu，R’为Cl。

3、权利要求1所述的式(I)化合物应用于pH荧光探针，其特征在于用式(I)结构的多卤代吖啶酮类化合物在不同缓冲溶液中进行氢离子选择性识别即进行氢离子浓度探测。

4、根椐权利要求3所述的应用方法，其特征在于对(I)式化合物在0.1＜pH＜15之间进行荧光检测，并根据荧光强度的改变与氢离子浓度的关系进行相关得到pH-荧光强度图。

5、根椐权利要求1所述的式(I)化合物进行量子产率的测定。

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