CN101297828A - 毛裂蜂斗菜提取物在制备防治心脑血管疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，是一种毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物在制备防治心脑血管疾病药物中的新用途。生物活性试验结果表明，其可明显降低局部性脑缺血大鼠脑坏死百分率，改善缺血大鼠的行为学评分；能使缺血再灌注损伤大鼠明显减轻脑水肿及脑梗死体积，提示毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物对脑缺血损伤具有明显保护作用。其还可以显著性降低ISO所致的J点位移和血浆中LDH水平；能明显缩小冠脉结扎引起的大鼠心肌缺血心肌梗塞范围，降低心肌缺血大鼠血浆中LDH水平。鉴于毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物在防治心、脑缺血性疾病方面具有良好的效果，因此可用于制备防治包括冠心病、脑供血不足、脑梗塞(中风)、心肌梗塞等心脑血管疾病的药物。

Description

毛裂蜂斗菜提取物在制备防治心脑血管疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是毛裂蜂斗菜提取物及其所含蜂斗菜内酯类化合物用于制备防治心脑血管疾病药物的新用途。

背景技术

毛裂蜂斗菜Petasites tricholobus Franch.属菊科蜂斗菜属植物，其根茎在民间用于解毒祛瘀，外敷治跌打损伤、骨折蛇伤等。为开发利用该植物，本发明人对该植物进行了较系统的化学成分及药理研究，曾对毛裂蜂斗菜中的四个蜂斗菜内酯新化合物以及蜂斗菜内酯类化合物用于治疗可能与组胺和/或白三烯有关疾病的用途申请了专利(专利公开号：CN1844114)，对毛裂蜂斗菜根茎提取物及其制备方法以及该提取物用于制备治疗和预防肿瘤疾病药物的用途也申请了专利(专利申请号：200710038961.1)。但到目前为止，尚未见有关毛裂蜂斗菜提取物及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物有心脑血管药理活性的报道。

发明内容

本发明的目的是为毛裂蜂斗菜提取物及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物提供一种用于制备防治心脑血管疾病药物的新用途。

经动物实验表明，本发明所制备的毛裂蜂斗菜提取物及其所含蜂斗菜内酯类化合物具有心脑血管药理活性，因而可以用于制备防治包括冠心病、脑供血不足、脑梗塞(中风)、心肌梗塞等心脑血管疾病的药物。

本发明毛裂蜂斗菜提取物及其所含的活性物质蜂斗菜内酯类化合物的制备方法如下：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用20-95％的含水乙醇按常规热提、冷浸或渗漉提取，得提取液，提取液减压浓缩，浓缩后离心或过滤，取上清液或过滤液；

(2)纯化

将上述上清液或过滤液通过聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质，再用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水低级醇洗脱，收集洗脱液，所说的低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇；

(3)浓缩、干燥

按常规将洗脱液减压浓缩、干燥，即得毛裂蜂斗菜提取物。

(详见专利申请号：200710038961.1)。

(4)毛裂蜂斗菜提取物中所含蜂斗菜内酯类化合物的分离纯化：

将上述制得的毛裂蜂斗菜提取物溶于水制成混悬液，用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯萃取部分，经减压浓缩，得到乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物进行反复硅胶柱层析，最终获得了43个蜂斗菜内酯类化合物。

本发明毛裂蜂斗菜提取物所含蜂斗菜内酯类化合物均含有蜂斗菜内酯母环，它们的化学结构通式为：

其中R₁、R₂分别代表：

R₁：-H，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝CHSCH₃或cis-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，cis-OCOCH＝CHSOCH₃或(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃或(S)-trans-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOCH₂CH(CH₃)₂，-OCOCH(CH₃)₂，-OCOCH(CH₃)CH₂CH₃，-OH，-OCOC(＝CH₂)CH(OH)(CH₃)；

R₂：-H，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝CHSCH₃或cis-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH₃，-OCOCH₃，cis-OCOCH＝CHSOCH₃或(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃或(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃或(S)-trans-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOCH₂CH(CH₃)₂，-OCOC(CH₃)CHCH₃，-OCOCH(CH₃)₂，-OH；

[注：基团中(R)表示右旋，(S)表示左旋，trans表示顺式，cis表示反式。]

本发明对毛裂蜂斗菜提取物及其所含的部分蜂斗菜内酯类化合物进行了药理和药效试验，所说部分蜂斗菜内酯类化合物的名称及其化学结构见表1。

表1蜂斗菜内酯类化合物母环上各R基团

编号	化合物名称	R1	R2
				1	蜂斗菜内酯	H	H
2	蜂斗菜内酯Ia	OCOC(CH3)＝CHCH3	OCOCH＝C(CH3)2
				3	蜂斗菜内酯IIa	OCOCH＝C(CH3)2	OCOCH＝C(CH3)2
4	蜂斗菜内酯IIIa	OCOCH＝CHSCH3	OCOC(CH3)＝CHCH3
				5	蜂斗菜内酯IVa	OCOCH＝CHSCH3	OCOCH＝C(CH3)2
6	蜂斗菜内酯-Va	OCOCH＝CHSCH3	OCOCH(CH3)2
				7	蜂斗菜内酯-B	OCOC(CH3)＝CHCH3	OCOCH3
8	蜂斗菜内酯-D	OCOC(CH3)＝CHCH3	OCOCH3
				9	Homofukinolide	OCOC(CH3)＝CHCH3	OCOC(CH3)＝CHCH3
10	蜂斗菜内酯-Db	(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH3	-OCOCH3
				11	蜂斗菜内酯-Dc	(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH3	-OCOCH3
12	蜂斗菜内酯-Dd	-OCOCH3	cis-OCOCH＝CHSCH3
				13	蜂斗菜内酯-De	-OCOCH3	(S)-trans-OCOCH＝CHSOCH3
14	蜂斗菜内酯-Df	OCOCH＝CHSOCH3	-OCOCH3
				15	蜂斗菜内酯-Dg	-OCOCH3	(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH3
16	蜂斗菜内酯-Dh	-OCOCH3	(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH3
				17	蜂斗菜内酯-Fa	-OCOC(CH3)CHCH3	-OCOCH2CH(CH3)2
18	蜂斗菜内酯-Fb	-OCOCH2CH(CH3)2	-OCOC(CH3)＝CHCH3
				19	蜂斗菜内酯-I	H	-OCOCH(CH3)2
20	蜂斗菜内酯-J	H	-OCOCH2CH(CH3)2
				21	蜂斗菜内酯-K	-OCOCH(CH3)2	-OCOC(CH3)CHCH3
22	蜂斗菜内酯-L	-OCOCH3	-OCOCH3
				23	蜂斗菜内酯-M	-OCOCH(CH3)CH2CH3	-OCOCH(CH3)2
24	蜂斗菜内酯-Na	-OCOCH2CH(CH3)2	-OCOCH(CH3)2
				25	蜂斗菜内酯-Nb	-OCOCH(CH3)2	-OCOCH2CH(CH3)2
26	蜂斗菜内酯-O	-OCOCH(CH3)CH2CH3	-OCOCH2CH(CH3)2
				27	蜂斗菜内酯-P	-OCOCH(CH3)CH2CH3	-OCOC(CH3)CHCH3
28	蜂斗菜内酯-Q	-OCOCH2CH(CH3)2	-OCOCH2CH(CH3)2

29	蜂斗菜内酯-R	-OH	OCOC(CH3)＝CHCH3
				30	蜂斗菜内酯-S	H	-OH
31	蜂斗菜内酯-T	(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH3	-OCOCH2CH(CH3)2
				32	蜂斗菜内酯-Ua	-OH	-OCOCH(CH3)2
33	蜂斗菜内酯-Ub	-OCOCH(CH3)2	-OH
				34	蜂斗菜内酯-V	-OCOCH2CH(CH3)2	-OH
35	蜂斗菜内酯-W	-OCOC(＝CH2)CH(OH)(CH3)	-OCOCH3
				36	蜂斗菜内酯-X	-OCOCH3	-OH
37	蜂斗菜内酯-Ya	-OCOCH(CH3)2	cis-OCOCH＝CHSOCH3
				38	蜂斗菜内酯-Yb	cis-OCOCH＝CHSOCH3	-OH
39	蜂斗菜内酯-Za	-OCOCH(CH3)2	-OCOCH＝C(CH3)2
				40	蜂斗菜内酯-Zb	-OCOCH＝C(CH3)2	-OCOCH(CH3)2
41	蜂斗菜内酯-III	-OH	-OH
				42	蜂斗菜内酯-G	-OCOCH3	-OCOCH2CH(CH3)2
43	蜂斗菜内酯-H	-OCOCH(CH3)2	-OCOCH(CH3)2
				44	蜂斗菜内酯-Uc	H	-OCOCH(CH3)2

其中6号化合物蜂斗菜内酯-Va为新化合物。对蜂斗菜内酯-Va的鉴定如下：

无色针晶，熔点：124-126℃，由HR-EIMS高分辨质谱得出分子量459.1814[M+Na]⁺(计算值：459.1817)，确定化合物的分子式为C₂₃H₃₂O₆S。计算其不饱和度为8。

IR(KBr，cm^-1)：1776，1165，1046示有γ内酯环；1721，1696，1211示有酯键；3086，1570，927，799示有双键，且1570，927示有末端双键。

¹³C-NMR(CDCl₃，δ，ppm)和DEPT数据显示，该化合物中含有5个CH₃，5个CH₂，7个CH和6个季碳。分子中含有3个羰基C(δ177.4，175.84，165.7)，两个双键(δ152.7，148.1，112.5和108.2)，化学位移在70.43处，包含有两个碳信号，一个为CH，一个为CH₂。根据化合物的不饱和度，可以推测分子中除含有3个羰基，2个双键，1个γ内酯环外，可能还含有两个环状结构。

¹H-NMR(CDCl₃，δ，ppm)显示有5个甲基信号：0.93(3H，d，J＝7.0Hz)，1.146(3H，s)，1.18(3H，d，J＝6.5Hz)，1.20(3H，d，J＝7.5Hz)和2.41(3H，s)。其中2.41可能是连S的甲基。另显示有2个双键H的信号：5.21(H，s)和5.23(H，s)。

根据HMQC，对该化合物的碳氢作了进一步归属，推断该化合物的母核结构为：蜂斗菜内酯类骨架。除去母核结构中的C、H信号外，分子中还有2个取代基。在HMBC中看出，双键C与C＝O、含硫甲基存在相关，碳信号为δ112.52，152.59，165.73，19.26。因此推断化合物中含有-OCOCH(CH₃)₂和-OCOCH＝CHSCH₃，两个碎片取代于母环结构上。在HMBC谱中可以看到δ175.84(C-1’)的碳信号与δ5.785(H-9)的氢信号存在远程相关，证明-OCOCH(CH₃)₂位于C-9.位，因此C-1位上为-OCOCH＝CHSCH₃。

通过分析NOESY谱，确定了两个取代基的立体结构，因H-1，H-10和H-15间存在NOE，推定C-1上的取代在α位；H-9和H-4间的NOE则提示C-9取代基处于β位。

综上所述，可确定该化合物为新化合物，其结构式如下：

该化合物的理化和波谱数据：

无色针晶(MeOH)，mp 124-126℃；[α]_D ¹⁰-213.0(C 0.0115，EtOAc)；HR-MS显示分子式为：C₂₃H₃₂O₆S，m/z 459.1814[M+Na]⁺(calcd.459.1817)；

UV(MeOH)λmax(203，234，289nm)；IR V_max ^KBrcm^-1：1776，1165，1046(γ-内酯)，1721，1696，1211(酯)，3086，1570，927，799(双健)；¹H(500MHz)和¹³C NMR(DEPT)(125MHz)，数据见表2。

表2 ¹H NMR(500MHz)，¹³C NMR(125MHz)和HMBC数据(CDCl₃，δppm)

经药理和药效学动物实验，表明毛裂蜂斗菜提取物及其蜂斗菜内酯类化合物均具有心脑血管药理活性，特别是蜂斗菜内酯-Ia，蜂斗菜内酯-IIa，蜂斗菜内酯-IIIa，蜂斗菜内酯-IVa，蜂斗菜内酯-Va，Homofukinolide，蜂斗菜内酯-B，蜂斗菜内酯-D，蜂斗菜内酯-G，蜂斗菜内酯-H，蜂斗菜内酯-Fa，蜂斗菜内酯-P，蜂斗菜内酯-R，蜂斗菜内酯-W等，都取得了良好效果，因而可以用于制备防治包括冠心病、脑供血不足、脑梗塞(中风)、心肌梗塞等心脑血管疾病的药物。

具体实施方式

现结合实施例和生物活性试验，对本发明作详细描述。此仅作为说明本发明之用，不能用作对本发明保护范围的限制。

实验用毛裂蜂斗菜Petasites tricholobus Franch.和蜂斗菜Petasites japonicus(Sieb etZucc)分别采集于四川成都郊区及浙江湖州市郊区。

实施例1.制备毛裂蜂斗菜提取物

本发明毛裂蜂斗菜提取物的制备方法步骤如下：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎10kg粉碎后，用90％的含水乙醇50L按常规方法渗漉得提取液，提取液减压浓缩后离心，取上清液备用；

(2)纯化

将上述上清液进行聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水和50％的含水乙醇淋洗除去杂质后，用80L 80％的含水醇洗脱，收集洗脱液。

(3)浓缩、干燥

将洗脱液按常规减压浓缩，干燥，即得毛裂蜂斗菜提取物。

实施例2.制备毛裂蜂斗菜提取物所含的部分蜂斗菜内酯类化合物

取实施例1制备的毛裂蜂斗菜提取物20g，溶于石油醚，按常规进行硅胶柱层析，以石油醚-丙酮50-5∶1层析，依次得Homofukinolide(7.9mg)、蜂斗菜内酯-Ia(29mg)、蜂斗菜内酯-IIa(65mg)、蜂斗菜内酯-B(1.6g)、蜂斗菜内酯-IIIa(2.8g)、蜂斗菜内酯-IVa(2.9g)、蜂斗菜内酯-Va(50mg)、蜂斗菜内酯-D(2.6g)，其中蜂斗菜内酯-Va为新化合物。这些化合物的化学结构见表1，它们是蜂斗菜内酯类化合物，经HPLC测定分析，其中蜂斗菜内酯-D、蜂斗菜内酯-B、蜂斗菜内酯-IVa和蜂斗菜内酯-IIIa4个化合物的含量之和占总提取物的50％以上，所以毛裂蜂斗菜提取物的主要成分是蜂斗菜内酯类化合物。经多次实验检测，蜂斗菜内酯-D、蜂斗菜内酯-B、蜂斗菜内酯-IVa和蜂斗菜内酯-IIIa的含量之比依次为：0.1-5∶0.1-5∶1-9∶1-9。

实施例3.用毛裂蜂斗菜制备蜂斗菜内酯类化合物

毛裂蜂斗菜的干燥叶35Kg，用乙醇回流提取三次，乙醇用量分别为175L、70L、35L，提取时间分别为2小时、1小时、半小时。提取液减压浓缩后加水溶解，制成混悬液，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分别得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物利用硅胶柱层析(层析硅胶200-300目，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂)，以正己烷-乙酸乙酯(8∶1-1∶1)梯度洗脱，根据薄层层析监测结果，将洗脱液合并为十三份。将第四份进行硅胶柱层析，以正己烷∶乙酸乙酯为20∶1洗脱，洗脱液浓缩后继续进行硅胶层析，用正己烷-乙酸乙酯之比为50∶1洗脱，依次得Homofukinolide(26.9mg)，蜂斗菜内酯-Ia(65mg)，蜂斗菜内酯-IIa(186.3mg)，蜂斗菜内酯-Fa(96.2mg)，蜂斗菜内酯-Fb(36.9mg)，蜂斗菜内酯-I(24.6mg)，蜂斗菜内酯-J(18.3mg)，蜂斗菜内酯-K(27.7mg)，蜂斗菜内酯-M(23.4mg)，蜂斗菜内酯-Na(13.0mg)，蜂斗菜内酯-Nb(34.8mg)，蜂斗菜内酯-O(21.7mg)，蜂斗菜内酯-P(32.9mg)和蜂斗菜内酯-Q(11.0mg)。将第五份经硅胶层析，正己烷-乙酸乙酯之比为10∶1洗脱，得蜂斗菜内酯-De(4.2mg)，蜂斗菜内酯-Df(1.9mg)，蜂斗菜内酯-Dg(29.0mg)，蜂斗菜内酯-Dh(4.2mg)，蜂斗菜内酯-G(536.1mg)，蜂斗菜内酯-H(843.2mg)，蜂斗菜内酯-B(3.1g)，蜂斗菜内酯-IIIa(6.2g)，蜂斗菜内酯-R(36.9mg)，蜂斗菜内酯-S(23.7mg)，蜂斗菜内酯-T(15.8mg)，蜂斗菜内酯-Ua(15.6mg)，蜂斗菜内酯-Ub(17.0mg)，蜂斗菜内酯-V(14.2mg)，蜂斗菜内酯-III(52.3mg)，蜂斗菜内酯-W(35.5mg)，蜂斗菜内酯-X(38.7mg)，蜂斗菜内酯-Ya(11.0mg)，蜂斗菜内酯-Yb(11.0mg)，蜂斗菜内酯-Za(11.3mg)，蜂斗菜内酯-Zb(11.1mg)。将第八部份经反复结晶过滤得蜂斗菜内酯-IVa(4.8g)，蜂斗菜内酯-Va(50mg)。将第九部分经硅胶层析分离，得到蜂斗菜内酯-Uc(1.1g)。将第十三份进行硅胶层析分离，以正己烷-乙酸乙酯之比为5∶1洗脱，得蜂斗菜内酯-D(5.6g)，蜂斗菜内酯-Db(60.0mg)，蜂斗菜内酯-Dc(25.0mg)，蜂斗菜内酯-Dd(15.4mg)，蜂斗菜内酯-L(10.8mg)。

实施例4.用蜂斗菜制备蜂斗菜内酯类化合物

蜂斗菜的干燥根茎5Kg，用甲醇回流提取三次，甲醇用量分别为25L、10L、5L，提取时间分别为2小时、1小时、半小时。提取液减压浓缩后加水溶解，制成混悬液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取物。将石油醚萃物利用硅胶柱层析(层析硅胶200-300目，山东烟台芝罘黄务硅胶开发试验厂)，以正己烷-乙酸乙酯(20∶1-1∶1)梯度洗脱，依次得Homofukinolide(6.9mg)，蜂斗菜内酯-Ia(5mg)，蜂斗菜内酯-IIa(6.3mg)，蜂斗菜内酯-Fa(6.2mg)，蜂斗菜内酯-Fb(26.9mg)，蜂斗菜内酯-I(14.3mg)，蜂斗菜内酯-J(7.2mg)，蜂斗菜内酯-K(17.3mg)，蜂斗菜内酯-M(13.5mg)，蜂斗菜内酯-Na(7.0mg)，蜂斗菜内酯-B(600.6mg)。将乙酸乙酯萃取物，用氯仿∶甲醇之比为40∶3洗脱，依次得蜂斗菜内酯-Nb(24.9mg)，蜂斗菜内酯-O(11.7mg)，蜂斗菜内酯-P(12.9mg)，蜂斗菜内酯-Q(11.0mg)。再用用氯仿∶甲醇之比为20∶3洗脱，依次得蜂斗菜内酯-O(21.7mg)，蜂斗菜内酯-Uc(31.24mg)，蜂斗菜内酯-D(300.6mg)，蜂斗菜内酯-Db(10.0mg)，蜂斗菜内酯-Dc(15.0mg)，蜂斗菜内酯-Dd(5.4mg)，蜂斗菜内酯-L(2.8mg)。

生物活性试验

一、毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用

1、试验材料

1.1、实验仪器

SW-30射频双极凝固器(上海市检测技术所检测仪器厂生产)，307-6台式牙钻车(上海齿科医械厂生产)，SXP-1B手术显微镜(上海医用光学仪器厂生产)，恒温水浴。

1.2、供试样品：

实施例1制备的毛裂蜂斗菜提取物，蜂斗菜内酯类化合物用表2中的编号表示，即化合物4、5、7、8。

2、试验动物

品系：Wistar大鼠

性别：雄性

体重：260～290克

来源：中科院上海动物中心(下同)

3、试验方法

(1)配制溶液：以食用花生油为溶剂，配制毛裂蜂斗菜提取物溶液，尼莫通注射液(德国拜耳公司生产)作为阳性对照药。

(2)制备脑缺血模型：取健康雄性Wistar大鼠，共80只，随机平均分成8组：阴性对照组、毛裂蜂斗菜提取物低、高剂量组，内酯类化合物4、5、7、8组和阳性对照组。按Tamura的方法(Tumura A，et al：J Cereb Blood Flow and Metab，1981，1：53)制备脑缺血模型。

(3)给药：第1组为阴性对照组(腹腔注射等体积溶剂)，第2、3组为毛裂蜂斗菜提取物低、高剂量组，给药剂量分别为每公斤体重10mg、30mg(以下用mg/kg表示)第4、5、6、7组内酯类化合物4、5、7、8组，第8组为阳性对照组，尼莫通给药剂量为2mg/kg。给药时间为缺血后立即腹腔注射，给药体积为1ml。

(4)评分和测重：于术后24小时进行行为学评分，评分采用单盲法；在大鼠右侧大脑中动脉阻断24小时，断头取脑，在显微镜下进一步确证右侧大脑中动脉已在嗅束与大脑下静脉之间烧断且脑实质无损害者，将其进行切片染色，分别称坏死区及大脑右半球重量，计算坏死百分率。

4、统计学处理

所有的数据均用X±SD表示，统计学分析用t检验(详见金丕焕主编：医用统计方法学，上海医科大学出版社，1993年2月第1版，第36～40页)。

5、实验结果见表3

表3毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对脑缺血大鼠的组织学和行为学影响

与阴性对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

从表3可以看出，与阴性对照组相比，毛裂蜂斗菜提取物高剂量组及蜂斗菜内酯类化合物4、5、7、8均能明显改善局部性脑缺血大鼠的神经行为学缺陷(P＜0.05)，甚至优于尼莫通组；毛裂蜂斗菜提取物低、高剂量组及化合物4、5、7、8均能减少局部性脑缺血大鼠的脑梗死重量(P＜0.01)，接近甚至优于尼莫通组。

本实验结果表明，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物于缺血后立即腹腔注射给药，能明显改善局部性脑缺血大鼠的神经行为学缺陷，减少局部性脑缺血大鼠的脑梗死重量；本发明毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对急性局部性脑缺血能发挥很好的治疗作用。

二、毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用

1、试验材料

(1)激光多普勒血流测定仪(瑞典Perimed公司生产的Periflux4001型)、SXP-1B手术显微镜(上海医用光学仪器厂)，SW-30射频双极电凝器(上海市检测技术所检测仪器厂生产)。

试验样品同上。

(2)阳性对照：尼莫通注射液(德国拜耳公司生产)。

(3)2、试验动物

品系：SD大鼠

性别：雄性

体重：230～270克

3、试验方法：

以食用花生油为溶剂，配制毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物溶液，尼莫通为阳性对照药。

取雄性SD大鼠共90只，随机分成9组，每组10只，第1组为假手术组，第2组为阴性对照组，亦即溶剂组，注射等量溶剂，第3、4组为毛裂蜂斗菜提取物低、高剂量组，给药剂量分别为10mg/kg、30mg/Kg，第5、6、7、8组为蜂斗菜内酯类化合物4、5、7、8，给药剂量均为15mg/kg，第9组为尼莫通组，给药剂量2mg/kg。给药时间为缺血后立即腹腔注射，给药体积为1ml。

参照Longa EZ报道的线栓模型制备脑缺血再灌注损伤模型(Longa EZ，et al：Reversable middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，1989，20：84)。缺血2小时再灌注24小时后进行行为学评分，断头取脑，TTC染色，留取样本进行脑梗塞体积测定(详见张均田主编：现代药理实验方法学，第1241页，北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998年10月第1版)。

4、所有数据均采用X±SD表示，统计学分析采用t检验。

5、实验结果见表4：

表4毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用(n＝10，X±SD)

^*P＜0.05，^**P＜0.01与溶剂组比较

从表4可以看出，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物可显著降低大鼠行为评分，缩小脑梗死面积，减轻缺血侧脑半球水肿程度。表明毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有较强保护作用。

三、毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对异丙肾上腺素(ISO)所至大鼠心肌缺血治疗作用

1、供试样品：同上。

2、其他药品：水合氯醛：中国医药(集团)上海化学试剂公司，AR，批号：20030227，用双蒸水配成12％的溶液；异丙肾上腺素：临用前用生理盐水配成8mg/ml的溶液；乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(南京建成生物工程研究所，批号：20060311)。

3、试验动物：SD大鼠(上海斯莱克实验动物责任有限公司)，雌性，180-220克，动物饲养于正压净化通风动物房内，室温25±2℃，自由进食与饮水。

4、仪器：ECG-6511型心电图机(日本NIHON-KOHDEN生产)。

5、剂量设置：毛裂蜂斗菜提取物采用10、30mg/kg 2个剂量，蜂斗菜内酯类化合物均为15mg/kg。

6、实验方法

健康雌性SD大鼠64只，随机均分为8组，分别为空白对照组、模型对照组和毛裂蜂斗菜提取物低、高2个剂量组，蜂斗菜内酯类化合物4、5、7、8组。空白对照组和模型对照组分别预先腹腔注射生理盐水(与给药组等容量)，提取物各剂量组分别腹腔注射给药，每日1次，体积为2ml/kg体重，连续给药三天。模型对照组、毛裂蜂斗菜提取物以及蜂斗菜内酯类化合物组第二天和第三天给药0.5h后皮下注射给予ISO(0.15ml/100g体重)，正常对照组给予等容量的生理盐水，分别记录最后一次给受试药物前及第2次注射ISO后30min的心电图(标准II导联)，测量J点值，计算注射ISO后各组大鼠J点位移的绝对值。大鼠腹主动脉采血，肝素抗凝后离心分离血浆，分光光度法测定血浆中LDH活性单位。各给药组统计结果和模型组比较进行t检验。乳酸脱氢酶计算公式如下：

7、实验结果

各组对ISO致大鼠心肌缺血II导联心电图J点位移变化见表5。各组对ISO致大鼠心肌缺血LDH活性单位变化见表6。

表5、毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对ISO所致大鼠心肌缺血J点位移的影响(n＝8，x±SD)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型对照组比较

^△p＜0.05，^△△p＜0.01，与空白对照组比较

表6、毛裂蜂斗菜提取物对ISO大鼠LDH活性单位的影响(x±SD，n＝8)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型对照组比较

^△p＜0.05，^△△p＜0.01，与空白对照组比较

实验结果表明，在大鼠皮下注射ISO后，模型组动物出现J点位移增大，血浆中LDH活力单位增加的显著性心肌缺血改变，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物腹腔注射给药可以显著性降低J点位移和血浆中LDH水平，与阴性组相比，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物组均呈现抗心肌缺血作用，且毛裂蜂斗菜提取物组呈现剂量依赖性。

由此可见，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对ISO引起的大鼠心肌缺血有显著的抑制作用，并可减轻缺血心肌的损伤，因此对心肌缺血有明显保护作用。

四、毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对大鼠冠状动脉结扎所致急性心肌缺血的保护作用

1、供试样品：将毛裂蜂斗菜提取物用0.5％的西黄蓍胶配制成混悬液。

2、药品：对照样品：普萘洛尔(上海辛帕斯制药有限公司)，加入0.5％西黄蓍胶溶液配成含量为2mg/ml混悬液。其他药品：水合氯醛：中国医药(集团)上海化学试剂公司，A，用双蒸水配成12％的溶液；氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)(上海前进化学试剂厂生产)，用前用生理盐水配制成0.1％的新鲜溶液。乳酸脱氢酶(LDH)测试盒(南京建成生物工程研究所)。

3、试验动物：SD大鼠(上海斯莱克实验动物责任有限公司)，雌雄各半，体重190-210克，动物饲养于正压净化通风动物房内，室温25±2℃，自由进食与饮水。

4、仪器：ECG-6511型心电图机(日本NIHON-KOHDEN生产)；722型数显分光光度计，上海第三分析仪器厂生产。

5、剂量设置：毛裂蜂斗菜提取物低、高2个剂量组，剂量分别为20、40mg/kg，蜂斗菜内酯类化合物4、5、7、8四个组剂量均为20mg/kg，阳性对照药为β受体拮抗剂普萘洛尔，剂量为5mg/kg。

6、实验方法

取体重200g左右的健康SD大鼠80只，雌雄各半，随机均分成8组：模型对照组(生理盐水10ml/kg)，普萘洛尔组(5mg/kg)，毛裂蜂斗菜提取物低、高剂量组，蜂斗菜内酯类化合物4、5、7、8组。所有样品经灌胃给药，每天1次，连续2天。

于末次给药后1h，腹腔注射12％水合氯醛3ml/kg进行麻醉，记录正常心电图，胸部去毛、消毒，沿左锁骨中线纵行切开皮肤约2cm，在第4或第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏，在右侧圆锥与左心耳之间冠状静脉处结扎左冠状动脉后，把心脏放回胸腔，充分排出胸腔内空气，缝合关闭胸腔，呼吸机辅助呼吸，频率20次/分，潮气量5ml。于结扎后即刻，1h，24h，48h分别描记一段心电图，并于24h、48h分别灌胃给药。

在冠脉结扎50h后，大鼠再次麻醉，腹主动脉采血，肝素抗凝，3000转离心10min后采血浆，测定LDH，并于取血后迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。沿冠状沟切除心房，留下心室，称重，顺房室沟从心尖到心基部平行将心室肌横切成厚约0.1cm的心肌片4片，用生理盐水冲洗干净，将心肌片放在0.1％的N-BT溶液中，在37℃水浴条件下染色15min，染色后立即用水冲洗去多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被N-BT溶液染成蓝色。剪去梗死心肌，称湿重，以梗死区湿重占全心湿重的百分比表示心肌梗死范围。各给药组统计结果和模型组比较进行t检验。

7、试验结果

本发明提取物对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血LDH活性单位变化的影响见表7，对冠状动脉结扎致大鼠心肌缺血范围的影响见表8。

表7、毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血模型LDH活性的影响(x±SD，n＝10，U/L)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型对照组比较

表8、毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对冠状动脉结扎致大鼠急性心肌缺血模型缺血范围的影响(x±S，n＝10，％)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型对照组比较

实验结果表明，大鼠行冠状动脉结扎术后J点位移迅速升高并且在结扎后1小时达到高峰，结扎50小时后模型组动物血浆中LDH活性有非常显著性上升，心肌缺血面积也显著增加。毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物能显著降低LDH活性(P＜0.01)和心肌梗塞范围(P＜0.01)。

由此可见，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物灌胃给药对冠脉结扎引起的大鼠心肌缺血有明显的保护作用，能显著降低心肌缺血引起的组织坏死，对缺血组织有明显的保护作用。

五.毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对体外缺氧-复氧导致的大鼠大脑皮层神经细胞损伤的保护作用

1.试验材料：

受试化合物名称：毛裂蜂斗菜提取物，蜂斗菜内酯Ia(2)，蜂斗菜内酯IIa(3)，蜂斗菜内酯IIIa(4)，蜂斗菜内酯IVa(5)，蜂斗菜内酯-Va(6)，蜂斗菜内酯B(7)，蜂斗菜内酯D(8)，Homofukinolide(9)

2试剂：N-乙酰半胱氨酸，H₂O₂，黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶，Fe²⁺/抗坏血酸，MTT溶液，酸化异丙醇，Hank′s平衡盐溶液(HBSS液)，MEM培养基等

实验动物：Wistar胎鼠(妊娠期17-18天，Charles River Japan，神奈川，日本)

4实验器材：培养箱(Thermo Forma公司)，酶联免疫监测仪

2.试验方法：

剂量设置：毛裂蜂斗菜提取物为150μg/mL，蜂斗菜内酯类化合物为100μg/mL皮层神经元的原代培养：无菌条件下取Wistar胎鼠(妊娠期17-18天，Charles River Japan，神奈川，日本)的皮层组织，培养8-10天。

缺氧-复氧模型的建立：

缺氧组：取培养8-10天的大鼠皮层神经细胞，对照组吸去原有培养液，换成Hank′s平衡盐溶液(HBSS，10mM羟乙基哌嗪乙磺酸，pH 7.3)，放入37℃、5％ CO2、95％ N2，相对湿度100％的厌氧培养系统(Thermo Forma公司)中培养2h后取出，置37℃，5％ CO2，95％N2，相对湿度100％培养箱内继续培养24h。

化合物2-9组：于缺氧处理前30min加入化合物2-9(溶于HBSS液中，浓度分别为25，50，100μg/mL)，其余处理同缺氧组。

阳性药物组：于缺氧处理前30min加入N-乙酰半胱氨酸(溶于HBSS中，浓度为2000μg/mL)，其余处理同缺氧组。

细胞活力分析：MTT方法是最经典的细胞活力检测方法。皮层细胞接种于96孔培养板，每孔200μL，3000-10000个/孔。置37℃、5％ CO₂、饱和湿度条件下温箱培养24h。培养24h后，每孔加MTT溶液(5mg/mL，Sigma)20μL，37℃孵育3小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加酸化异丙醇助溶，震荡10分钟，使结晶物充分溶解。选择540nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(Abs)。

细胞活力(％)＝100×(Abs_{损伤+给药}-Abs_损伤)/(Abs_对照-Abs_损伤)

乳酸脱氢酶(LDH)分析：在缺氧-复氧实验中，细胞损伤可以通过LDH释放百分率来进行量化。经过24h的复氧之后，测定LDH活性。细胞层内剩余的LDH以0.1M磷酸缓冲盐(含0.5％聚乙二醇辛基苯基醚)溶解并进行测定。测定培养液和细胞层中的LDH活性，以培养液中LDH活性单位占培养液加细胞层中LDH总活性单位的百分比作为LDH释放的百分率，并以此评价细胞损伤程度。这些数值然后转化为占含氧量正常细胞组LDH活性(100％)的百分比。

实验结果见表9。

表9毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对缺氧-复氧造成的受损神经元的细胞活力及LDH释放百分率的影响

^**)P＜0.01与损伤组比较

从实验结果可以看出，蜂斗菜内酯类化合物对体外缺氧-复氧造成的神经元损伤有明显的保护作用，能明显提高受损神经元的细胞活力，减少乳酸脱氢酶(LDH)释放。

上述生物活性试验结果表明，毛裂蜂斗菜提取物以及蜂斗菜内酯类化合物可明显降低局部性脑脑缺血大鼠脑坏死百分率，改善缺血大鼠的行为学评分；能使缺血再灌注损伤大鼠明显减轻脑水肿及脑梗死体积，提示毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物对脑缺血损伤具有明显保护作用。另外，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物可以显著性降低ISO所致的J点位移和血浆中LDH水平；能明显缩小冠脉结扎引起的大鼠心肌缺血心肌梗塞范围，降低心肌缺血大鼠血浆中LDH水平。生物活性试验还表明，毛裂蜂斗菜提取物及蜂斗菜内酯类化合物缺氧-复氧所致的神经元损伤有明显保护作用。

鉴于毛裂蜂斗菜提取物及其所含的蜂斗菜内酯类化合物在防治心、脑缺血性疾病方面具有良好的效果，因此可用于制备治疗和预防心脑血管疾病的药物。

Claims (4)

1.毛裂蜂斗菜提取物在制备防治心脑血管疾病药物中的应用，毛裂蜂斗菜提取物的制备方法如下：

(1)提取

毛裂蜂斗菜根茎粉碎后，用20-95％的含水乙醇按常规热提、冷浸或渗漉提取，得提取液，提取液减压浓缩，浓缩后离心或过滤，取上清液或过滤液；

(2)纯化

将上述上清液或过滤液通过聚苯乙烯型多孔性吸附树脂吸附，用水-50％的含水低级醇淋洗除去杂质，再用上样生药质量的4-12倍量体积的60-95％的含水低级醇洗脱，收集洗脱液，所说的低级醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇；

(3)浓缩、干燥

按常规将洗脱液减压浓缩、干燥，即得毛裂蜂斗菜提取物。

2.权利要求1所说毛裂蜂斗菜提取物所含的蜂斗菜内酯类化合物在制备防治心脑血管疾病药物中的应用，所说蜂斗菜内酯类化合物化学结构通式如下：

其中R₁、R₂分别代表：

R₁：-H，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-trans-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOCH₂CH(CH₃)₂，-OCOCH(CH₃)₂，-OCOCH(CH₃)CH₂CH₃，-OH，(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOC(＝CH₂)CH(OH)(CH₃)，cis-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOCH＝C(CH₃)₂，cis-OCOCH＝CHSCH₃；

R₂：-H，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH＝CHSCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH＝C(CH₃)₂，-OCOCH₃，-OCOC(CH₃)＝CHCH₃，-OCOCH₃，cis-OCOCH＝CHSCH₃，(S)-trans-OCOCH＝CHSOCH₃，(R)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，(S)-cis-OCOCH＝CHSOCH₃，-OCOCH₂CH(CH₃)₂，-OCOC(CH₃)CHCH₃，-OCOCH(CH₃)₂，-OH，cis-OCOCH＝CHSOCH₃。

3.按权利要求2所说毛裂蜂斗菜提取物所含的蜂斗菜内酯类化合物在制备防治心脑血管疾病药物中的应用，其特征在于所说蜂斗菜内酯类化合物为：蜂斗菜内酯-Ia，蜂斗菜内酯-IIa，蜂斗菜内酯-IIIa，蜂斗菜内酯-IVa，蜂斗菜内酯-Va，Homofukinolide，蜂斗菜内酯-B，蜂斗菜内酯-D，蜂斗菜内酯-G，蜂斗菜内酯-H，蜂斗菜内酯-Fa，蜂斗菜内酯-P，蜂斗菜内酯-R和蜂斗菜内酯-W。

4.权利要求2所说毛裂蜂斗菜提取物所含蜂斗菜内酯类化合物中的一种化合物，其特征在于化学结构通式中的R₁为-OCOCH＝CHSCH₃，R₂为-OCOCH(CH₃)₂。