CN101289495A - 含硒五肽化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种含硒五肽化合物，具有Arg－Gly－Sec－Arg－Asn的氨基酸序列。本发明含硒五肽化合物的谷胱甘肽过氧化物酶活性高、稳定性好、具有多种药物活性，可克服天然酶用作药物产生的免疫原性大，过膜困难，不稳定等缺点，本发明含硒五肽化合物能有效地清除人体内的自由基，可用于预防和治疗心脑血管疾病、肝脏损伤、风湿与类风湿性疾病、糖尿病、白内障、肿瘤等由自由基紊乱诱发的疾病，可在制备治疗因自由基紊乱诱发的疾病的药物中的应用。本发明含硒五肽化合物的制备工艺简单，产率高，可扩大生产，具有医药上应用潜力。

Description

含硒五肽化合物及其应用

技术领域

本发明属于人工酶领域，特别涉及含硒五肽(RGURN)化合物，及该含硒五肽化合物模拟谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)在制备药物中的应用。

背景技术

在分子水平上模拟酶活性部位的微环境，吸收酶中对催化起主导作用的因素，设计和合成较天然酶简单的蛋白分子或非蛋白分子，即设计人工模拟酶是当今自然科学领域中的前沿课题之一。人工酶分子具有与天然酶媲美的催化功能，而且稳定性又大大提高，在化工、酶学、医药学等领域具有广阔的应用前景。为此，美国和欧洲国家都把对酶的人工模拟列入未来研究的发展规划。

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内重要的含硒酶。它具有优良的抗氧化性质，对治疗和预防白内障、克山病、心血管病、炎症及癌症等疾病具有很大潜力。但由于该酶不稳定，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应等缺点，极大限制了该酶在医药学方面的开发和应用。对GPX的人工模拟可克服天然酶的上述弱点，并引起科学工作者的广泛重视。Ebselen是人工模拟的GPX的突出代表，其催化机制及生物学活性已被详细研究过。动物实验表明，Ebselen具有广谱抗炎活性，对糖尿病、肿瘤、心血管疾病均有疗效。但作为药物，Ebselen最大缺点是活性低、水溶性差。目前含硒模拟酶，通常采用对甲基苯磺酰氟为羟基活化试剂，引入催化基团Sec，这种制备模拟酶的方法增加了合成步骤，使副产物增加，合成效率下降，生产成本变大。

发明内容

本发明的目的是提供一种全新的含硒五肽化合物，具有以下结构式：

该含硒五肽化合物的氨基酸序列为Arg-Gly-Sec-Arg-Asn。

本发明含硒五肽化合物(简称RGURN)中的催化基团硒代半胱氨酸(Sec)通过化学法直接合成，不需要用对甲基苯磺酰氟活化羟基，使操作简化，降低了成本，而且提供的含硒五肽克服了Ebselen的弱点，解决其水溶性差，并展示出较高的GPX活力。

将本发明的含硒五肽化合物，通过常规技术与可药用载体或辅料制备药物组合，这种药物组合可以采用多种制剂形式，可以是液体制剂、注射剂、颗粒剂、片剂、栓剂、软膏剂、气雾剂、眼用制剂、缓释控释制剂、靶向制剂等。

本发明另一个目的是提供全新的含硒五肽化合物在制备治疗因自由基紊乱诱发的疾病的药物中的应用。

本发明研究发现，该含硒五肽化合物(RGURN)具有多种药物活性，可以用来治疗多种疾病。

通过利用各种药理模型对本发明进行了测试，发现含硒五肽化合物(RGURN)可以用于治疗心脑血管疾病、肝脏损伤、糖尿病、白内障、风湿与类风湿性疾病、肿瘤等自由基紊乱诱发的疾病。

本发明的有益之处是：

1、设计合理，制备方法简单，合成步骤少，产率高，可扩大生产。

2、五肽RGURN以硒代半胱氨酸为催化基团。

3、本发明制备的五肽RGURN GPX活力高，为世界上知名的小分子GPX模拟物PZ51的11倍。

4、五肽RGURN作为药物可克服天然GPX不稳定，活性低、水溶性差，来源有限，分子量大会引起人体免疫反应，不易过膜等缺点。

5、最佳pH值五肽RGURN稳定。

6、它具有优良的抗氧化性，对治疗和预防白内障、心血管病、炎症及癌症等具有非常大的应用潜力。

综上所述，本发明所述的RGURN制备工艺简单，产率高，可大量生产，且五肽RGURN GPX活性高、稳定性好、能有效治疗白内障。同时可克服天然酶用作药物产生的免疫原性大，过膜困难，不稳定等缺点。因此，在医药上具有巨大的应用潜力。

附图说明

图1为RGURN的结构表征。

图2为RGURN的最适pH和温度。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明进行简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。

实施例1本发明含硒五肽化合物的制备

1、RGURN的制备过程：

1)利用β-氯-丙氨酸和Na₂Se₂合成出硒代半胱氨酸(Sec)；2)硒代半胱氨酸和PMB-Cl及Fmoc-O-succinimide反应生成硒代半胱氨酸衍生物；3)利用Fmoc固相多肽合成法直接合成了五肽。

(1)硒代半胱氨酸的制备

将β-氯-丙氨酸溶液滴加到Na₂Se₂溶液中，在2h以上滴加完毕，通入N2气。用胶布封闭胶塞的针孔，置于摇床上反应10～16h，打开胶塞室温下搅拌，加入盐酸羟胺还原剩余的未反应的Na₂Se₂。过滤反应液，然后暴露在空气中搅拌，再过滤一次，滤液用NaOH调pH值6～6.5之间，溶液立即有大量亮黄色沉淀产生，继续搅拌，放置4℃过夜过滤，收集黄色沉淀(Sec)，置于真空干燥箱中干燥。

(2)硒代半胱氨酸衍生物的合成

称量Sec加入圆底烧瓶中，再用NaOH悬浮，悬浮液在冰浴中，用N₂保护，将NaBH₄分批加入悬浮液中，搅拌，至黄色消失，然后继续冰浴，NaOH与PMB-Cl一起滴加，2h后，滴加完毕，继续搅拌，滴加HCl调pH值至6左右，有白色沉淀产生，过滤，收集白色针状结晶，即H-Sec(PMB)-OH。

H-Sec(PMB)-OH溶于水中悬浮，加入三乙胺将Fmoc-O-succinimide，溶解于乙腈中，制备的溶液滴加到H-Sec(PMB)-OH混悬液中，滴加完毕后，再加入三乙胺，另加乙腈至沉淀完全溶解，室温下搅拌1h，终止反应向反应物中加入HCl酸化，然后用乙酸乙酯萃取乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁，将溶液减压浓缩至最小体积，然后向溶液中滴加正己烷，有白色沉淀产生，放置4℃沉降，过滤收集白色沉淀，即Fmoc-Sec(PMB)-OH

(3)RGURN的合成

树脂肽的合成

①将0.1mmol树脂与4ml DMF加入柱反应器中，25℃振摇30min，溶胀后抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

②加入4ml脱保护试剂，25℃振摇30min，脱下树脂上的Fmoc保护基，抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

③向柱反应器中加入0.3mmol Fmoc-氨基酸、0.3mmol BOP、0.3mmol HOBT、0.45mmol NMM，再加入4ml DMF，避光25℃振摇反应1.5h，抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

④重复步骤2，脱去N-末端的Fmoc保护基，然后进入连接下一个氨基酸的循环，至加完最后一个氨基酸。

⑤加完最后一个氨基酸后，脱去N-末端的Fmoc保护基，抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

⑥将得到的连接有肽的树脂用无水甲醇洗5次，每次振摇2min，每次抽干，最后放置无水氯化钙的真空干燥箱中室温抽真空干燥

⑦合成后的处理

第一次切割：脱侧链保护基及从树脂上裂解肽：向抽干后的反应器中加入4ml裂解溶液，25℃振荡，

过滤除去树脂，滤液用氮气吹去大部分TFA，浓缩液逐滴滴入40ml乙醚/石油醚，振荡，树脂加入4ml裂解溶液复切割，一并滴入乙醚/石油醚中。-20℃放置，离心，小心倒去上清，重复一次沉淀，真空干燥过夜。

第二次切割：将第一次切割的沉淀溶于4ml DMSO/TFA，室温下反应，反应液滴入冷乙醚中，-20℃放置，离心，小心倒去上清，再用适量的乙醚洗涤沉淀，离心，真空干燥过夜。

⑧用C18反相HPLC分析和纯化：A液为0.1％TFA水溶液；B液为70％乙腈，0.1％TFA。梯度洗脱时B液从30％升到70％。分析用10μm，4.6×150mm C18反相柱，流速为1ml/min，时间为25min；采用双波长监测，波长为214nm和385nm；收集主要组份冻干保存，分子量用LC/MS/MS质谱仪测定。

实施例2RGURN的结构表征

参见图1，RGURN的质谱分析：据同位素峰计算，五肽的实测值与理论值相吻合。

RGURN的GPX的性质

(1)RGURN的GPX活力

当RGURN在37℃，pH7.0，以H₂O₂和GSH作为底物，底物浓度在2μmol/L到100μmol/L的条件下(参见表1)测得RGURN的活力为6-14U/μmol。

表1

(2)RGURN的最适pH和温度

参见图2，用50mM磷酸盐和碳酸盐配制pH6-11范围的一系列缓冲液(含1mM EDTA，1mM NaN₃)，控制其他条件不变，只改变缓冲液的pH值，测定RGURN活力。控制其他条件不变，只改变反应温度，测定RGURN活力。由pH曲线可知，RGURN在pH6.5～pH8.0之间保持较好的活力，其最适pH为7.3。由温度曲线可以看到，RGURN在35.0～50.0℃之间保持很好的活力，其最适温度为43.2℃。

(3)RGURN的稳定性

实验表明，RGURN具有很好的稳定性，该肽在pH 7.0，50m mol/L PBS溶液中保存半年活力保持92％，而酶干粉的活力在半年内保持不变。

实施例3RGURN的制备过程：

利用β-氯-丙氨酸和Na₂Se₂合成出硒代半胱氨酸(Sec)；2)利用硒代半胱氨酸和PMB-Cl及Fmoc-O-succinimide反应生成硒代半胱氨酸衍生物；3)利用Fmoc固相多肽合成法直接合成含硒五肽化合物。

(1)硒代半胱氨酸的制备

将β-氯-丙氨酸溶液滴加到Na₂Se₂溶液中，在2h以上滴加完毕，通入N₂气。用胶布封闭胶塞的针孔，置于摇床上反应10～16h，打开胶塞室温下搅拌，加入盐酸羟胺还原剩余的未反应的Na₂Se₂。过滤反应液，然后暴露在空气中搅拌，过滤，滤液用NaOH调pH值6～6.5之间，溶液立即有大量亮黄色沉淀产生，继续搅拌，放置4℃过夜过滤，收集黄色沉淀(Sec)，置于真空干燥箱中干燥。

(2)硒代半胱氨酸衍生物的合成

称量Sec加入圆底烧瓶中，再用NaOH悬浮，悬浮液在冰浴中，用N₂保护，将NaBH₄分批加入悬浮液中，搅拌，至黄色消失，然后继续冰浴，NaOH与PMB-Cl一起滴加，2h后，滴加完毕，继续搅拌，滴加HCl调pH值至6左右，有白色沉淀产生，过滤，收集白色针状结晶，即H-Sec(PMB)-OH。

H-Sec(PMB)-OH溶于水中悬浮，加入三乙胺将Fmoc-O-succinimide，溶解于乙腈中，制备的溶液滴加到H-Sec(PMB)-OH混悬液中，滴加完毕后，再加入三乙胺，另加乙腈至沉淀完全溶解，室温下搅拌1h，终止反应向反应物中加入HCl酸化，然后用乙酸乙酯萃取乙酸乙酯层用无水硫酸镁干燥过夜。过滤除去硫酸镁，将溶液减压浓缩至最小体积，然后向溶液中滴加正己烷，有白色沉淀产生，放置4℃沉降，过滤收集白色沉淀，即Fmoc-Sec(PMB)-OH

(3)RGURN的合成

①将0.1mmol树脂与4ml DMF加入柱反应器中，25℃振摇30min，溶胀后抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

②加入4ml脱保护试剂，25℃振摇30min，脱下树脂上的Fmoc保护基，抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

③向柱反应器中加入0.3mmol Fmoc-氨基酸、0.3mmol BOP、0.3mmolHOBT、0.45mmol NMM，再加入4ml DMF，避光25℃振摇反应1.5h，抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

④重复步骤2，脱去N-末端的Fmoc保护基，然后进入连接下一个氨基酸的循环，至加完最后一个氨基酸。

⑤加完最后一个氨基酸后，脱去N-末端的Fmoc保护基，抽干，DMF洗6次，每次振摇3min，抽干。

⑥将得到的连接有肽的树脂用无水甲醇洗5次，每次振摇2min，每次抽干，最后放置无水氯化钙的真空干燥箱中室温抽真空干燥

⑦合成后的处理

第一次切割：脱侧链保护基及从树脂上裂解肽：向抽干后的反应器中加入4ml裂解溶液，25℃振荡，过滤除去树脂，滤液用氮气吹去大部分TFA，浓缩液逐滴滴入40ml乙醚/石油醚，振荡，树脂加入4ml裂解溶液复切割，一并滴入乙醚/石油醚中。-20℃放置，离心，小心倒去上清，重复一次沉淀，真空干燥过夜。

第二次切割：将第一次切割的沉淀溶于4ml DMSO/TFA，室温下反应，反应液滴入冷乙醚中，-20℃放置，离心，小心倒去上清，再用适量的乙醚洗涤沉淀，离心，真空干燥过夜。

⑧用C18反相HPLC分析和纯化：A液为0.1％TFA水溶液；B液为70％乙腈，0.1％TFA。梯度洗脱时B液从30％升到70％。分析用10μm，4.6×150mm C18反相柱，流速为1ml/min，时间为25min；采用双波长监测，波长为214nm和385nm；收集主要组份冻干保存，分子量用LC/MS/MS质谱仪测定。

实施例4治疗心肌缺血药物

将100只SD雄性大鼠随机等分为5组：空白组，模型组，RGURN高、中、低剂量组，RGURN高、中、低剂量组分别给予RGURN 500mg/kg体重、200mg/kg体重和50mg/kg。大鼠腹腔注射垂体后叶素致急性心肌缺血作为动物实验模型，观察心电图变化.用放射免疫法测定大鼠血浆降钙素基因相关肽(CGRP)和减少内皮素(ET)含量.结果显示CGRP，ET血浆含量在各组间有显著差异，其中模型组血浆CGRP，ET含量(分别为58.48±5.00和120.08±5.72)均高于空白组(分别为50.60±6.53和51.49±5.47)(P＜0.05＝，RGURN高、中、低剂量组CGRP血浆含量(分别为63.30±4.10，70.27±5.39，75.86±4.01)均高与模型组(P＜0.05＝.RGURN高、中、低剂量组ET血浆含量(分别为101.40±6.10.81.50±5.15，64.14±4.82)均低于模型组(P＜0.05).表明RGURN对缺血心肌的保护作用是通过促进CGRP的释放，减少ET的含量而实现的.

实施例5治疗酒精性肝损伤

小鼠92只随即分为正常组20只，模型组24只，五肽RGURN大、小剂量组各24只，各组小鼠于实验环境中用普通饲料喂养3天。禁食12小时后，大、小剂量组分别给予五肽500mg/kg体重和100mg/kg体重，正常组和模型组以等体积的生理盐水灌胃。1小时后，除正常组外，各观察给予56度的白酒16ml/kg体积，正常组灌胃等体积的10％葡萄糖溶液。给白酒6小时后，断头处死小鼠，取出肝脏，在冰浴下制备20％的肝匀浆，测定肝LPO和肝GSH。实验动物一次大量饮酒后，肝脏LPO含量明显升高，而预先给予五肽(大、小剂量组)可使肝脏LPO含量下降。说明五肽可以抑制酒精引起的肝脏脂质过氧化反应。小鼠灌胃白酒后，肝脏GSH含量明显下降，五肽两个剂量组肝脏GSH含量显著高于模型组，表明五肽可阻止酒精所致的肝脏GSH耗竭。

实施例6五肽治疗白内障的效果

取32只患先天性白内障的大鼠，分两组：治疗组和对照组，每组16只。治疗组每天滴眼0.33U五肽RGURN，15天后，14只鼠眼的白内障消逝，另两只鼠眼的白内障也有很大程度的减轻。对照组每天用同样量的生理盐水滴眼，15天后，白内障程度没有减轻。经15天试验后的大鼠，反应灵敏、健康状况良好。由此可见，五肽RGURN可有效治疗白内障。

实施例7治疗糖尿病(对肾上腺素引起小鼠血糖升高的影响)

取小鼠120只随机分为正常组，肾上腺素对照组及肾上腺素加试药组，给药组分别五肽500mg/kg体重和100mg/kg体重，连续4天，末次给药1小时后，除正常组对照组外，给肾上腺素0。3mg/kg，30分钟后取血测血糖。

表2

于正常组比较P＜0.01，于模型组比较P＜0.05，结果表明肾上腺素引起的血糖明显升高，五肽RGURN 100mg/kg，500mg/kg连续给药4天均能显著对抗有肾上腺素引起的小鼠血糖升高。结果见表2。

实施例8五肽RGURN对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

从60只ICR小鼠中随机抽取50只接种H22肿瘤细胞，次日按性别、体重随机分为5组，每组10只，分组情况如下：

五肽RGURN高剂量组：配制为1.6mmol/L，给药剂量为16μmol/kg；

五肽RGURN中剂量组：配制为0.4mmol/L，给药剂量为4μmol/kg；

五肽RGURN低剂量组：配制为0.1mmol/L，给药剂量为1μmol/kg；

阳性对照药：环磷酰胺(CTX)：给药剂量为20mg/kg；

肿瘤对照组：给予生理盐水。

正常对照组：剩余10只未接种肿瘤的小鼠作为正常对照组，给予生理盐水。

上述药物均腹腔注射给药，每日早9:00给药1次，给药量均为10mL/kg，连续给药10日。

连续给药10天后，CTX可明显抑制H22荷瘤小鼠的体内肿瘤的生长，其瘤重与肿瘤对照组比较，差异性显著(P＜0.001)，肿瘤抑制率达60.94％；16μmol/kg、4μmol/kg剂量的5P可明显抑制肿瘤的生长，与肿瘤对照组比较，差异性显著(P＜0.001，P＜0.05)，肿瘤抑制率分别为46.00％和34.86％。结果参见表3。

表3

实施例9五肽RGURN对类风湿性关节炎的作用(对大鼠佐剂性关节继发病变的预防作用)

大鼠60只，随机分3组，每组20只。分别在给予佐剂注射后7天开始给药，剂量与原发病变相同，每天1次，连续一周。观察左后足(佐剂注射对侧)的肿胀度、前肢关节红肿度、耳部红斑及尾部结节等出现情况。全身病变按五级评分法：0无红肿；1小趾关节稍肿；2趾关节和足跎关节肿胀；3踝关节以下足肿胀；4包括踝关节在内全部足肿胀。结果参见表4。

表4

五肽RGURN 100～500mg/kg对大鼠佐剂性关节继发病变具有明显预防作用，能够使左后足的关节肿胀明显减轻，而且大鼠前肢红肿、耳部红斑及尾部结节等全身病损均比对照组明显减轻。

Claims (10)

1.一种含硒五肽化合物，其特征是具有以下结构式：

该含硒五肽化合物的氨基酸序列为Arg-Gly-Sec-Arg-Asn。

2.根据权利要求1所述的含硒五肽化合物在制备治疗因自由基紊乱诱发的疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的心脑血管疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的肝脏损伤疾病的药物中的应用。

5.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的肝脏损伤疾病的药物中的应用。

6.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的糖尿病的药物中的应用。

7.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的白内障疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的风湿与类风湿性疾病的药物中的应用。

9.根据权利要求2所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：在制备治疗因自由基紊乱诱发的肿瘤疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求1所述的含硒五肽化合物的应用，其特征是：所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、栓剂、软膏剂、气雾剂、眼用制剂、缓释控释制剂、靶向制剂。

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