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CN101275168B - 核苷酸序列阵列和使用该阵列的方法 - Google Patents

核苷酸序列阵列和使用该阵列的方法 Download PDF

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CN101275168B CN 200810095172 CN200810095172A CN101275168B CN 101275168 B CN101275168 B CN 101275168B CN 200810095172 CN200810095172 CN 200810095172 CN 200810095172 A CN200810095172 A CN 200810095172A CN 101275168 B CN101275168 B CN 101275168B
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Abstract

本发明公开了一种用于在微生物样品中快速和同时鉴定某些基因存在的核苷酸序列阵列，所述基因编码具有生物技术中的相关活性的蛋白，和使用该阵列鉴定上述基因的方法。具体的，鉴定的是编码涉及生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性和移动性、铁氧化、氮代谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原的蛋白的基因。在所有需要评价微生物群落质量的情况下，该核苷酸序列阵列是一种有效的生物技术工具。

Description

核苷酸序列阵列和使用该阵列的方法
发明领域 
本发明公开了一种用于在微生物样品中快速和同时鉴定某些基因存在的核苷酸序列阵列，所述基因编码生物技术中过程相关活性的蛋白，和使用该阵列鉴定上述基因的方法。具体来说，鉴定的是编码涉及生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性和移动性、铁氧化、氮长谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原的蛋白的基因。当需要评价微生物群落的质量时，这种核苷酸序列的阵列是一种有效的生物技术工具。 
发明背景信息 
生物技术通常是指在产生或者改造用于特定用途的产物或者过程中利用生物系统(例如复杂微生物群落)、活的生物(微生物、动物或者植物)或者它们的衍生物(代谢产物，蛋白，核酸)的任何技术应用。在本发明中，我们专注于使用微生物的生物技术，特别是生物采矿和微生物生物除污。 
已经实施增强原来存在于待处理的底物中的微生物群落的增殖(例如生物采矿情况下存在于矿石中或者生物除污情况下存在于被污染的土壤或者水中的群落的增殖)的许多微生物生物技术过程。在这些情况下具有能评价存在群落的代谢特点性的工具将非常有用，例如，可判断利用存在的群落是否能实现我们感兴趣的过程，或者我们是否应该接种其他适当的菌株。 
直到现在，最常用的评价微生物群落的方法是通过各种技术方法，例如选择性培养、荧光原位杂交(FISH)，与特异标记物例如检测探针偶联，聚合酶链式反应(PCR)以及宏和微DNA阵列鉴定存在的物种。在上述技术中，所有涉及分子生物学的技术，即FISH、检测探针、PCR以及宏和微DNA阵列都基于未知样品的DNA与已知序列的杂交，所述已知序列对需要栓测或者鉴定的微生物而言具有特异性，例如某个种或者属的微生物。 
当前方法的问题在于这些微生物群落中可能存在许多类型的不同微生物， 因此需要进行许多测试来确定它们的组成，然后将这些获得的数据与每个已鉴定的分类群的性质关联起来，最终确定样品中是否存在感兴趣的功能。如果存在先前没有描述过的微生物，即使该微生物的代谢活性是已知的，且对过程也是很重要，这种关联也不能被实现。因此需要一种用于直接评价和控制微生物群落代谢特性，而不是用于鉴定其由什么微生物组成的方法。 
本发明的方法通过建立用于在微生物样品中检测和鉴定编码基因的核苷酸序列阵列和使用该阵列的方法解决了这个技术问题，所述基因编码在生物技术中相关活性的蛋白。 
将方法的焦点从待测群落的分类转变到该群落中具有相关活性蛋白的鉴定时，我们直接专注于生物过程的本质：最终实现这些过程的代谢功能。例如，每次生物浸取过程中寻找钩端螺菌属(Leptospirillum spp.)的存在实质上真正寻找的是铁氧化，与一些生物过程相关的每种微生物都是如此。 
我们设计的新方法能对生物技术过程的操作者的需要作出正确回应：该群落氧化铁吗？它氧化硫吗？它固定CO2吗？它固定氮吗？使用现有技术的方法回答相同的问题，操作者首先应了解存在哪一物种，然后他或者她必须将该信息与这些物种中的每一种的特性进行关联。 
在各种情况下，我们设计用于鉴定编码基因的DNA片段，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白，所述片段符合一个重要条件：所述片段的特异性必须唯一对应靶基因。另一方面，已经尽可能寻找了对各靶基因特异和直向同源(orthologically)的保守区域。这基于以下思想：不仅检测已被测序的基因，还检测那些虽然未被描述但却与各靶基因同源的基因。这种检索的结果对应于特定区域内特定分类群中某种基因或者功能特异的片段。 
利用这些设计的DNA片段，我们开发出能够鉴定微生物样品中这些基因存在的DNA片段阵列，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白。 
DNA阵列的明确定义是由Schena和其同事提出的：“允许同时分析复杂DNA样品的微观和系统核酸排列”(Schena M.，Heller，R.A.，Theriault，P.，Konrad，K.，Lachenmeier，E.and Davis，R.W.Trends Biotechnol.16，301-306，1998)。 
根据印记的DNA斑点的直径，存在两种类型的阵列，宏阵列(300微米或者更大)，和微阵列(小于100微米)。前者可以在实验室手工制备，无需借助特 殊装置就可以看到斑点。后者需要自动化印记系统(通常是机器人印刷平台)以及专业化的采集和图像处理装置。 
在本发明中，DNA片段阵列包括印记在平展表面，例如一层玻璃、硅酮或者尼龙上的有序的系列斑点，其中每个斑点包含大量拷贝的DNA片段，所述DNA片段是已知的，并特异针对生物过程中感兴趣的某种基因。 
使用DNA片段阵列的检测方法包括阵列的“斑点”组与来自待测样品的标记DNA提取物的同时杂交。通常，使被标记和在指定情况下断裂的样品DNA经历变性阶段，在该阶段中，利用例如加热的方式使双链DNA分离。当温度降低时，因为物理-化学特性，DNA倾向于和与其最精确互补的序列杂交。当该DNA接触阵列时，如果样品DNA和斑点所含的DNA片段之间存在重合，样品的标记DNA拷贝最有可能保持与该斑点的特异连接。这源于阵列斑点中包含更高的互补DNA拷贝数。在杂交阵列的图像采集和处理阶段，这种标记允许检测待测样品中存在的微生物。 
可以利用任何已知的标记技术进行DNA标记，其中最常见的是荧光或者放射性标记。 
阵列和它们的使用是已知的，我们在现有技术中发现了检测样品中微生物存在的阵列实例，但它们没有专注于基因的检测，其中所述基因编码生物技术中的相关活性蛋白。 
现在有各种公开的制备DNA片段阵列的方案，以及提供这种阵列制备服务的实验室。因此，阵列特异性和有效性只取决于基因的选择和所用DNA片段的设计，因为制备中支持物、DNA片段结合支持物的方法、支持物上斑点的空间分布等等都会变化，而这取决于委托阵列制备的公司或者实验室本身所采用的方案(Ye等人，Journal of Microbiological Methods 47(2001)257-272)。 
发明简述 
本发明公开了一种用于在微生物样品中快速和同时鉴定某些基因存在的核苷酸序列阵列和使用该阵列鉴定所述基因的方法，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白。 
我们设计了长100或者更少氮化碱基的DNA片段，使鉴定基因的存在成为可能，所述基因编码涉及生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性和移动性、铁氧化、氮代谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原的蛋白。所有设计的片段对 编码与感兴趣的功能相关的特定蛋白的基因都是特异的，因此我们说它们对某些代谢功能是特异的。在一些情况下，设计寡核苷酸所基于的基因只对一个种是特异的，因此，所述寡核苷酸对功能和种都是特异的。在其他的一致区域下，发现感兴趣的基因是直向同源保守的。在这些情况下，在上述直向同源物中设计寡核苷酸，因此所述寡核苷酸对所讨论的功能和分类群是特异的。 
当阵列中存在这些DNA片段的至少一种时，就能够评价微生物群落的代谢特性。优选提供了包含数种设计的DNA片段的阵列，所述阵列使同时和一步鉴定数种或者全部基因的存在成为可能，所述基因编码涉及生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性、氮代谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原的蛋白。 
当涉及特定代谢功能的微生物群落的质量需要评价和控制时，该方法是生物技术中的有效工具。 
附图简述 
图1对应于生物采矿样品1与本发明微阵列杂交的结果。本发明的片段对应于表2所述片段的子片段。表1中详细描述了微阵列各位置的内容，表3概括了杂交的阳性或者阴性结果。 
结果显示基因的存在，所述基因编码涉及下列功能的蛋白：硫化化合物的代谢、CO2固定、铁氧化、氮固定，以及涉及能量代谢关键酶。样品似乎不含鉴定的关于趋化性和生物膜形成的基因。阳性对照显示杂交信号，而阴性对照仍未被标记。 
图2对应于第二生物采矿样品与本发明微阵列杂交的结果。使用的微阵列与样品1使用的相同，其内容描述于表1中。该实例中使用的片段包含在表2描述的序列中，表4概括了杂交的阳性或者阴性结果。 
结果显示基因的存在，所述基因编码涉及所有被鉴定功能的蛋白-因此它似乎是混合培养物。与先前样品不同，我们观察到涉及细胞移动和趋化性以及生物膜形成的基因的高度表现。阳性对照显示杂交信号，而阴性对照仍未被标记。 
发明详述 
本发明提供一种用于在微生物样品中快速和同时鉴定基因存在的阵列和使用该阵列的方法，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白，所述阵列可用于工商业的各个领域。例如，评价生物过程底物(例如生物采矿过程矿石； 生物除污过程被污染的土壤或者水，或者生物技术应用中的任何其他物质中)存在的野生微生物群落。第二方面是其允许控制涉及生物技术处理的微生物群落。 
为了满足这些生物技术工商业的需要，我们设计了长100或者更少氢化碱基的基因特异性DNA片段，所述基因编码涉及生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性和移动性、铁氧化、氮代谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原的蛋白。这些分布在DNA阵列中的片段，使鉴定样品中这些基因的存在成为可能，所述样品来自野生的或已涉及生物技术处理的微生物群落。 
所有设计的片段对基因都是特异的，所述基因编码涉及感兴趣的功能的特异蛋白，因此我们说它们对某些代谢功能是特异的，具体是对下列功能：生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性和移动性、铁氧化、氮代谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原是。 
在一些情况下，设计寡核苷酸所基于的基因只对一个种是特异的，因此，所述寡核苷酸对功能和种都是特异的。在其他情况下，发现感兴趣的基因在某定属的不同物种中是直向同源保守的。在这些情况下，在上述直向同源间的一致区域设计寡核苷酸，因此所述寡核苷酸对所讨论的功能和分类群是特异的。 
为了更好地理解我们如何开发这种方法，我们将简单的描述采用的步骤： 
首先，我们确定了我们想要检测的生物技术中感兴趣的功能，以及这些功能的关键基因。 
Figure S2008100951726D00052
其次，选择具有涉及感兴趣功能的基因的微生物，所述微生物应符合两个基本条件，一方面具有任意感兴趣的功能，另一方面，已被完全或者部分测序。 
Figure S2008100951726D00053
再次，产生参考序列的列表，所述序列编码公知微生物，例如大肠杆菌(E.coli)中感兴趣的蛋白或者功能，并检查所述已知基因和感兴趣的基因组之间的同源性。在发现同源性的情况下，限定“同源”区对应于感兴趣微生物中的感兴趣基因。 
Figure S2008100951726D00054
通过这种方法获得包含各种感兴趣微生物中的各种感兴趣基因序列的起始数据库。很显然，不是所有感兴趣的基因都存在于所有感兴趣的微生物(这是已知的微生物/已测序的基因组)中。 
Figure S2008100951726D00055
起始数据库中包含的基因序列与感兴趣微生物的所有基因进行比较，只 选择对感兴趣基因特异的区域，换句话说，该区域与具有其他功能的基因不显示同源性。通过采用输入了这些限制杂件的检索算法实现这种选择。 
这样选择的特异区域按高度相似性进行归类，所述的高度相似性能理解为所设计寡核苷酸的最终长度的大约80％的一致性，其目的是检测可能的一致区域(consensus region)。 
Figure S2008100951726D00062
考虑到寡核苷酸的物理-化学变量(GC组成水平，杂交温度，可能的二级结构)，这些特异区域被确认为用于检测的区域。符合这些条件的区域被认为是寡核苷酸候选物。 
Figure S2008100951726D00063
寡核苷酸候选物与所有已知基因序列比较同源性，从比较中排除具有明显同源性的感兴趣的基因，其中所述寡核苷酸是基于所述基因设计的。 
我们选取特异的寡核苷酸用于检测感兴趣的功能。 
如前面所指出，第一步是选择感兴趣的功能。我们在DNA阵列中选择了存在于微生物群落中的且在生物技术中有用的8个代谢动能：生物膜形成、CO2固定、能量代谢、趋化性和移动性、铁氧化、氮代谢、硫同化和硫化化合物的氧化/还原。它们的重要性对通晓该技术的任何技术人员来说都是显而易见的。 
这些功能中的一些给我们提供了关于任意微生物群落的一般和相关信息，例如，能量代谢和群落是否能够或者不能固定CO2或者氮与建立群落所需养料相关。了解群落的生物膜形成能力，或者能够在群落中移动的微生物的存在，对于建立我们想要实现的生物技术过程的培养条件同样是重要的。另一方面，铁氧化、硫同化和硫化化合物的氧化/还原过程在非常重要的特定生物技术处理，例如生物采矿和生物除污中也是非常重要的过程。 
其次，确定设计寡核苷酸所基于的感兴趣的微生物，所述寡核苷酸包括在微阵列中。选择时考虑到两个相关方面：首先，微生物具有至少一种感兴趣的功能，其次，它们的基因组被完全或者部分测序。考虑到这些因素，选择菌株，所述菌株具有Biosigma：Wenelen(DSM 16786)和Licanantay(DSM 17318)的性质，具有一种或多种所述代谢功能，并且具有已测序的基因组。还包括具有铁和硫化化合物氧化功能的氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)ATCC 23270种。两种公开序列用于类鼻疽假单胞菌(Burkholderia pseudomallei)种：类鼻疽假单胞菌1710b和类鼻疽假单胞菌K96243。选择脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)用于硫化-氧化 活性，并使用公开的脱硫脱硫弧菌G20系列；还包括脱氮硫杆菌(Thiobacillusdenitrificans)ATCC 25259，其功能是硫化化合物氧化。还包括生物采矿微生物Ferroplasma，钩端螺旋菌属(Leptospirillum)，硫化叶菌属(Sulfolobus)和热原体属(Thermoplasma)，其中公开的序列对应于下列微生物：Ferroplasmaacidarmanus，Ferroplasma sp.(II)，Leptospirillum sp.(II)，Leptospirillumsp.(III)，嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)DSM639，硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)，超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)，嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)和火山热原体(Thermoplasmavolcanium)。 
一旦明确感兴趣的功能和我们将要研究的微生物是什么，我们就能决定采用什么基因来鉴定所述功能的存在。下面列出了各种感兴趣的功能和选择用来代表它们的基因的简述。 
感兴趣功能的描述 
铁氧化。Fe+2到Fe+3的铁氧化是生物浸取过程进展的根本步骤，因为产生的铁(III)是强氧化剂，能够氧化存在的硫化物或者任何需要氧化的化合物，从而向溶液中释放感兴趣的金属。 
为了鉴定“铁氧化”功能的存在，基于氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidan)选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
rus，cyc1，cyc2，cycA y cycA2 
感兴趣微生物(已知微生物/已测序的基因组)中所有这些基因序列的定义都可获得，因此无需使用参考序列。 
生物膜形成。形成生物膜或者粉土的能力对于任何细菌群落的增殖都是很重要的，因为它确保粘附在支持物上的生物量的持久性。 
为了鉴定“生物膜形成”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
galE，galU，rfbA，rfbB，rfbC，rfbD，epsD，gdh，manB，manC，pgm，uppS，wza，wzc 
不能获得关于感兴趣微生物中这些基因的信息，所以需要根据参考基因寻找所述基因和感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定这些基因的“可能”存在。在大部分情况下，大肠杆菌的基因被用作除基因epsD外的其他基因的参 考，乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)用作epsD的参考。 
CO2固定。CO2固定在微生物生物技术处理中是重要的，因为它允许评价群落是否是自养的，而这会赋予该处理经济优势，因为无需向群落中添加碳化底物。 
为了鉴定“CO2固定”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
cbbL1，cbbL2，cbbM，cbbS1，cbbS2，cbbArchea，ppc，prk 
现在只能获得关于感兴趣微生物的这些基因中的一些，即cbbL1，cbbL2，cbbM，cbbS1 y cbbS2的信息。在其他情况下，根据参考基因进行工作，寻找这些参考基因与感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定这些基因的“可能”存在。Methanosarcina acetivorans被用作古细菌(Archaeas)的基因cbb的参考，大肠杆菌的基因被用作基因ppc的参考，聚球菌(Synechococcus)的基因被用作基因prk的参考。 
趋化性和移动性。微生物移动性源于鞭毛的存在；在指定情况下，移动源于对培基中代谢产物浓度的应答，这被称为趋化性。了解了微生物群落是否具有趋化性和移动性的性质以后，就有可能以更好的方式为待开发的生物技术处理建立培养条件。 
为了鉴定“趋化性和移动性”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
flhA，flhB，fliF，fliG，fligM，fliN，motA，motB 
不能获得关于感兴趣的微生物的任意这些基因的信息，所以根据参考基因进行工作，寻找这些参考基因与感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定所述基因的“可能”存在。在每一种情况下，大肠杆菌的基因被用作参考。 
氮代谢。关于氮化化合物的代谢，存在两种被认为重要的过程。它们中的一种是氮固定，其基本组成是固氮酶。另一种是硝酸还原酶参与的氮化化合物的降解。 
为了鉴定“氮代谢”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
nifK，narH，nirA 
不能获得关于感兴趣微生物的这些基因的信息，所以根据参考基因进行工作，寻找这些参考基因与感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定这些基因的“可能”存在。大肠杆菌的基因被用作narH的参考；棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)被用作nifK的参考，聚球菌(Synechococcus)被用作nirA的参考。 
硫同化。硫同化是一种将环境中的硫固定为有机硫以用于细胞代谢的过程。该过程的两种主要终产物是必需氨基酸半胱氨酸和甲硫氨酸。 
为了鉴定“硫同化”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
cysl，cysJ 
不能获得关于感兴趣微生物的这些基因的信息，所以根据参考基因进行工作，寻找这些参考基因与感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定所述基因的“可能”存在。大肠杆菌的基因被用作基因cysl和cysJ的参考。 
硫化化合物的氧化/还原。与生物浸取高度相关的过程是硫化合物的氧化。例如，嗜酸菌(acidithiobacillus)属的微生物能够利用氧作为电子受体，催化被还原的硫化合物(例如硫化物，元素硫，硫磺酸盐(thionate)，等等)的氧化，产生终产物硫酸，并还原例如亚硫酸盐和硫代硫酸盐等种类为中间产物，这使矿石中与硫化物结合的金属的溶解成为可能。 
为了鉴定“硫化化合物的氧化/还原”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
doxA，doxD，doxDA1，doxDA2，dsrA，dsrB，dsrC，dsrE，dsrF，dsrK，dsrL，dsrM，dsrN，dsrO，dsrP，dsrS，soxB 
只获得了感兴趣微生物的doxDA1，doxDA2基因的信息。在其他情况下，根据参考基因进行工作，寻找这些参考基因与感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定这些基因的“可能”存在。Acidarmanus Ambivalens被用作基因doxA，doxD的参考，脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的基因被用作基因soxB的参考，Allochromatium vinosum的基因被用作所有dsr基因的参考。 
能量代谢。 
为了鉴定“能量代谢”功能的存在，选择下列编码该过程相关蛋白的基因： 
pfk，korA，korB，idh，pdhA，pdhB，pdhC，gltA，accA，accB，aaC，accD 
只获得了感兴趣微生物的pdhC基因的信息。在其他情况下，根据参考基因进行工作，寻找这些参考基因与感兴趣微生物基因组之间的同源性，以确定这些基因的“可能”存在。大肠杆菌的基因被用作基因pfk，idh，gltA，accA，accB，aaC和accD的参考。Methanocaldococcus jannaschii被用作基因korA和korB 的参考，结核分歧杆菌(Mycobacterium tuberculosis)被用作基因pdhA和pdhB的参考。 
公开的用于在微生物样品中检测和鉴定基因的核苷酸序列阵列，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白，包括附着于其表面的下列DNA片段中的一种、数种或者所有代表： 
a.至少一种特异鉴定编码生物膜形成相关蛋白的基因的DNA片段； 
b.至少一种特异鉴定编码CO2固定相关蛋白的基因的DNA片段； 
c.至少一种特异鉴定编码能量代谢相关蛋白的基因的DNA片段； 
d.至少一种特异鉴定编码趋化性和移动性相关蛋白的基因的DNA片段； 
e.至少一种特异鉴定编码铁氧化相关蛋白的基因的DNA片段； 
f.至少一种特异鉴定编码氮代谢相关蛋白的基因的DNA片段； 
g.至少一种特异鉴定编码硫同化相关蛋白的基因的DNA片段； 
h.至少一种特异鉴定编码硫化化合物氧化/还原相关蛋白的基因的DNA片段； 
其中每种DNA片段都存在数百个拷贝，形成同源组分的斑点，立体分布于支持物表面。 
对于每一种这些上述基因我们设计长80到100个特异氮化碱基，优选100个特异氮化碱基的片段，这些片段在序列表中公开。 
我们一共设计了232个DNA片段用于鉴定基因，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白，所有片段长100个核苷酸。设计的232个DNA片段的序列包括在序列表中。 
在设计的232个序列中，序列号1到86是对生物膜形成功能特异的。 
序列87到101是对CO2固定功能特异的。 
序列102到156是对能量代谢功能特异的。 
序列157到192是对趋化性和移动性功能特异的。 
序列号193到197是对铁氧化功能特异的。 
序列号198到203是对氮代谢功能特异的。 
序列号204到210是对硫同化功能特异的。 
和序列211到232是对硫化化合物氧化功能特异的。 
设计的片段可以被印在阵列中，其可以是完整的或者包括它的更长片段， 或者与片段中包括的任意子片段部分相似的片段，或者所有上述选项的反向互补序列。可以方便的印50到70个核苷酸的子片段。 
需要牢记本发明包括的阵列是至少一种包含在序列号1到232的DNA片段的阵列，而不管该片段是完整的；所述片段存在于更大的区域且代表超过20％的该更大区域(就像PCR产物)；还是部分的，作为包含于如此处公开的每个片段中的子片段之一，或者所有上述选项的反向互补序列。 
上述方面非常重要，因为核苷酸序列的特异性与其反向互补序列相同。这种特性，即特异性是设计DNA片段中最难达到的。尽管通晓该技术的人员利用现有技术中已有的一系列工具，能够区分热力学稳定和不稳定的寡核苷酸，但仍有可能出现互补序列的稳定性不适合在阵列中使用的情况。本发明片段号1到232的所有反向互补序列均被认为属于本发明的范围，即不管所述片段是完整的；所述片段存在于更大的区域且代表超过20％的该更大区域、(就像PCR产物)；还是部分的，作为包含于如此处公开的每个片段中的子片段之一。 
对于阵列优先包括至少一种片段或者每种感兴趣的片段的子片段。还有可能制备包含所有公开的DNA片段或者子片段的阵列，或者在指定情况下，只包含其中一种的阵列。所有这些选项，以及所有可能的中间组合，均包含在本发明的范围内。 
本发明阵列的有效性取决于待印记片段的特异性和稳定性。这些特性持续在所设计片段中所含的各子片段中。这意味着如果使用核苷酸1到100，或者42到92或者15到65或者任意其他可能的选择，特异性是相同的。每种选择均对应子片段，并包括在本发明的范围内。 
还有可能通过合成或者作为PCR产物获得包含测翼为其他寡核苷酸的本发明片段或者子片段的DNA片段。包含当前公开片段的更大区域也包括在本发明的范围内，其中所述更大区域的特异性是本发明设计和公开的片段或子片段给予的。 
为了实现本发明的阵列，每种选择的片段或者子片段必须被合成数百个拷贝，在阵列合适的支持物上，例如玻璃、硅酮、尼龙或者本领域现有的任意其他物质上印记(如同源斑点)。 
在讨论本发明的背景信息时我们指出，DNA片段合成和阵列制备技术是已知的，它们均可用于制备本发明的阵列。 
除了针对编码生物技术中的相关活性蛋白的基因的这些特异DNA片段之外，可以很方便的在每个阵列中包括阴性和阳性对照。阴性对照应该对应从来不会在生物技术内容物中发现的核苷酸序列。阳性对照应该对应总在问题样品中存在的核苷酸序列。 
对于本领域的专家，显而易见的是本发明的232个设计的DNA片段在阵列中使用，和在基于未知DNA与特异片段杂交的其他分子生物学技术中使用时，都能够鉴定编码具有生物技术中的相关活性蛋白的基因。在这些分子生物学技术中，我们可以提及例如检测探针，FISH，PCR和测序。 
在任何分子生物学技术中利用本发明公开的232个DNA片段，均被认为是本公开的明显应用，属于本发明的范围，而不管所述片段是完整的；所述片段存在于更大的区域且代表超过20％的该更大的区域，(就像PCR产物)；还是部分的，作为包含于如此处公开的每个片段中的子片段之一；或者所有上述选项的反向互补序列。 
阵列的用途 
为了利用本发明的阵列在微生物样品中检测和鉴定某些基因的存在，所述基因编码生物技术中的相关活性的蛋白，首先需要分离我们感兴趣进行评价的样品DNA。还有可能利用cDNA，其中唯一的区别是在这种情况下第一阶段分离的是样品RNA。在本领域中，从环境样品或培养物中提取DNA和RNA的不同方式是已知的，可以依据每种情况下样品的特定性质使用它们中的任意一种。 
第二阶段，所有样品的DNA或者RNA必须转换为短的标记DNA片段，所述片段适合与阵列斑点中印记的片段杂交。如果样品DNA已经被分离，它必须被片断化和标记。当不利用样品的RNA时，片断化不是必需的，只需进行标记步骤以获得标记的cDNA。一种能够片断化和标记DNA的技术是用DNA的6核苷酸投机分束器(aleatory splitters)标记。利用本领域现有的任何技术，例如放射性、生物素、荧光或者其他标记，使用被标记的或者对易于标记的核苷酸进行标记。如果使用宏阵列，标记优选使用放射性标记、32P，如果使用微阵列，将用荧光标记，例如，利用Cy5或者Cy3。 
所描述的用于制备阵列的DNA或者cDNA的方法不限于本发明，可以使用任何现有技术中已有的DNA或者cDNA制备方法，这不表示阵列的使用能够脱离本发明的范围。 
一旦DNA被制备，它被置于DNA变性阶段。在阵列上放置等分的DNA混合物，该变性的DNA然后在阵列上孵育、让阵列在40到70℃的温度范围内杂交至少一个小时，优选过夜杂交。 
杂交后，仔细洗涤阵列。通常在温和的温度下，例如35-50℃，优选40-45℃，利用软化溶液(softening solutions)进行洗涤。 
一旦阵列被洗涤，它优选方便地通过离心被干燥，例如，在Falcon管或者一些类似物中，短时间和中等速度(200-3000xg每1到5分钟)离心。 
最后，需要显现哪个斑点显示标记。各标记斑点的位置指示基因的存在，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白，且DNA片段是基于所述基因设计的。 
需要检查对应于阴性对照的斑点仍未被标记，因为如果存在与这些DNA片段的杂交，它表明该反应是非特异的，所获结果必须被弃除，因为它们可能包含假阳性。 
对应阳性对照的斑点同样应该被标记，因为当没有与该DNA片段的杂交发生时，它表明反应中存在干扰，因此没有信号的斑点可能对应假阴性。 
根据上述内容，确定微生物群落中某些基因的存在将被简化为本发明阵列中标记斑点的读取，所述基因编码具有生物技术中相关活性的蛋白。 
实施例 
实施例1：检测和鉴定某些基因存在的微阵列，所述基因编码具有生物技术中的相关活性的蛋白。 
制备具有本发明23个不同DNA片段的微阵列，所述微阵列鉴定编码具有生物技术中相关活性蛋白的基因，其中这些活性与下述功能相关：硫同化，CO2 固定，铁氧化，氮代谢，能量代谢，趋化性和移动性，和生物膜形成。 
微阵列中还包括两个阳性对照和两个阴性对照。该微阵列各位置的内容详述于下表1。 
表1 
  功能   微阵列中的位置
  硫同化   A1-A3
  CO2固定   A4-A6
  铁氧化   A7-A9
  氮代谢   B2-B4
  能量代谢   B5-B7
  趋化性和移动性   B8，C1-C3
  生物膜形成   C4-C7
  阴性对照   B9，C8
  阳性对照   B1，C9
所有印记的片段都为60个核苷酸。所选的本发明DNA片段对应于表2所示片段的60个寡核苷酸的子片段，所述片段在序列表中定义。 
表2 
  功能   微阵列中的位置   序列号
  硫同化   A1-A3   208-210
  CO2固定   A4-A6   92-94
  铁氧化   A7-A9   193-195
  氮代谢   B2-B4   201-203
  能量代谢   B5-B7   113-115
  趋化性和移动性   B8，C1-C3   167-170
  生物膜形成   C4-C7   2-5
  阴性对照   B9，C8  
  阳性对照   B1，C9  
委托提供这项服务的专业公司制备微阵列。 
实施例2：微阵列用于检测和鉴定基因的用途，所述基因编码具有生物技术中的相关活性的蛋白。 
实施例1所获微阵列用于确定两个生物浸取堆积废液样品，即样品1(S1) 和样品2(S2)中微生物群落的组成。 
利用常规DNA提取方法提取S1和S2中的总DNA。 
从样品提取2μl DNA，置于Eppendorf管中。在每种情况下遵循下列方法： 
添加36μl ddH2O和3.3mL商品化6核苷酸(六聚体)投机分束器(aleatorysplitters)。煮沸5分钟，然后置于冰中。 
添加2μl核苷酸混合物，其中核苷酸dUTP用荧光团Cy标记。显示红色荧光的Cy5用于S1，而显示绿色荧光的Cy3用于S2。此后，添加4μl Klenow型聚合酶和5μl适于聚合酶的缓冲溶液(根据供货商)；在37℃孵育4小时。 
用5μl AEDT 0.5M pH8终止反应。使用离子交换柱回收标记的DNA。真空干燥包含DNA的洗脱液。 
添加100μl Tris pH 7缓冲溶液作为碱性成分，重悬DNA，并置于100℃下1.5分钟以使DNA变性。在微阵列上55℃下振荡整夜完成杂交。 
第二天早晨，每个微阵列在45℃用2×SSC，0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)洗涤两次；在42℃用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤一次，在42℃用0.2×SSC洗涤一次。(对于500 SSC 20×，87.6g NaCl，50g柠檬酸钠(2H2O)，调整到pH 7.0)。 
每个阵列置于盛有miliQ水的盒中15分钟，然后在Falcon管或者一些类似物中以1.100rpm离心干燥一分钟。 
最后有可能观察到微阵列的结果，图1显示S1结果，图2显示S2结果。 
在表3中，指示了微阵列中不同片段的位置，并概述了图1显示的与获自S1的DNA杂交的结果。所有阳性对照均显示杂交，阴性对照仍未被标记。 
表3，样品1s(1) 
  功能   微阵列中的位置   结果
  硫同化   A1  A2  A3   -  -  +
  CO2固定   A4  A5  A6   +  +  +
  铁氧化   A7  A8  A9   +  -  +
  氮代谢   B2  B3  B4   +  -  -
  能量代谢   B5  B6  B7   +  -  -
  趋化性和移动性   B8  C1   C2  C3   -  -   -  -
  生物膜形成   C4  C5   C6  C7   -  -   -  -
  阴性对照   B9   C8   -   -
  阳性对照   B1   C9   +   +
标记：(+)：阳性；(-)：阴性。 
结果显示基因的存在，所述基因编码涉及硫同化、CO2固定、铁氧化和氮固定功能的蛋白，以及涉及能量代谢的关键蛋白。该样品似乎不含评定的涉及趋化性和生物膜形成的基因。 
在表4中，再次显示微阵列中不同片段的位置，并概述图2显示的与获自S2的DNA杂交的结果。所有阳性对照均显示杂交，阴性对照仍未被标记。 
表4，样品2s(2) 
  功能   微阵列中的位置   结果
  硫同化   A1  A2  A3   +  +  -
  CO2固定   A4  A5  A6   -  +  +
  铁氧化   A7  A8  A9   +  +  -
  氮代谢   B2  B3  B4   +  +  +
  能量代谢   B5  B6  B7   +  +  -
  趋化性和移动性   B8  C1   C2  C3   +  +   +  +
  生物膜形成   C4  C5   C6  C7   +  +   +  +
  阴性对照   B9   C8   -   -
  阳性对照   B1   C9   +   +
标记：(+)：阳性；(-)：阴性。 
结果显示基因的存在，所述基因编码涉及所有评价功能的蛋白。很显然这是混合培养物的例子。与先前样品不同，我们观察到细胞的细胞移动和趋化性以及生物膜形成的高度表现。 
本实施例是为了说明特征，不应被认为是对本发明范围的限制，本发明的范围在附属权利要求中限定。 
                        序列表 
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Claims (4)

1.用于在微生物样品中检测和鉴定编码蛋白的基因的核苷酸序列阵列，其特征在于该阵列包括
由序列号25或其反向互补序列，或序列号25的50到70个核苷酸的子片段或其反向互补序列组成的至少一种DNA片段，其特异性结合生物膜形成基因；和
附着于阵列表面的至少一种DNA片段，其中所述DNA片段选自下列序列或其50到70个核苷酸的子片段：
a.序列号1到86和它们的反向互补序列，特异于生物膜形成基因；
b.序列号87到101和它们的反向互补序列，特异于CO2固定基因；
c.序列号102到156和它们的反向互补序列，特异于能量代谢基因；
d.序列号157到192和它们的反向互补序列，特异于趋化性和移动性基因；
e.序列号193到197和它们的反向互补序列，特异于铁氧化基因；
f.序列号198到203和它们的反向互补序列，特异于氮代谢基因；
g.序列号204到210和它们的反向互补序列，特异于硫同化基因；或
h.序列号211到232和它们的反向互补序列，特异于硫化化合物氧化/还原基因；
其中每种DNA片段都存在数百个拷贝，形成同源组分的斑点，并立体分布于阵列表面。
2.如权利要求1所述的阵列，其特征在于所述DNA片段由50-70个核苷酸组成。
3.在微生物样品中检测编码蛋白的基因的方法，其特征在于包括：
a.在权利要求1所述的阵列上孵育获自微生物样品的核酸样品，
b.孵育后，洗涤阵列以除去未杂交的标记DNA片段，和
c.对阵列斑点进行显影。
4.在微生物样品中鉴定编码蛋白的基因的方法，其特征在于包括：
a.从微生物样品提取核酸；和/或利用被标记的或者易于标记的核苷酸，对核酸样品进行片段化和标记核酸样品；
b.在权利要求1所述的阵列上孵育获自微生物样品的核酸样品；
c.孵育后，洗涤阵列以除去未杂交的标记DNA片段，和
d.对阵列斑点进行显影。
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