CN101273062A

CN101273062A - 抗25-羟基维生素d的抗体

Info

Publication number: CN101273062A
Application number: CNA2006800354512A
Authority: CN
Inventors: E·休伯; J·贝克; W·克劳斯; A·基里亚特索利斯; R·沃格尔; N·霍恩
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2005-09-29
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2008-09-24
Also published as: EP1931711B1; US20080317764A1; CA2624124A1; WO2007039193A1; EP1931711A1; ES2323900T3; JP2009509992A; DE602006006200D1; ATE427965T1

Abstract

本发明涉及抗25－羟基维生素D抗体的生产方法，根据本发明生产出的抗体以及用这些抗体检测25－羟基维生素D的方法。

Description

抗25-羟基维生素D的抗体

背景技术

本发明涉及生产抗25-羟基维生素D的抗体的方法，根据本发明的方法生产出的抗体以及用其检测2-羟基维生素D的方法。

术语“维生素”中暗示了充足的维生素D供给是生命攸关的。维生素D的匮乏会导致例如佝偻病或骨质疏松症等严重疾病。虽然在上个世纪初，维生素D仍然被看作是一个单独的物质，在过去30年中，维生素D体系已经发展为一个复杂和多样的维生素D代谢物系统。现在已知的维生素D代谢产物已经超过40种(Zercrkh，J.E.，Ann.Clin.Biochem.41(2004)272-281)。

人体只能通过太阳光照射在皮肤上时，由紫外线作用产生维生素D₃或钙化醇。在皮肤中产生的维生素D₃与所谓维生素D结合蛋白相结合并被运送到肝脏，在那里通过25-羟基化作用转化为25-羟基维生素D₃。除了以上被提及的皮肤和肝脏两个器官外，现今大量的其他组织也被证实参与了维生素D的代谢(查阅Schmidt-Gayk，H.等，(eds.)，“Calcium regulating hormones，vitamin D metabolites and cyclicAMP(可调节激素、维生素D代谢物和环腺苷酸的钙)”，SpringerVerlag，Heidelberg(1990)，pp.24-27)。在总量上来说，25-羟基维生素D，确切地说是25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃是人体内储存维生素D的主要形式。当需要时，这些前体可在肾脏中被转化为生物体内活性的1α，25-二羟基维生素D，即所谓的激素D。生物体内活性的维生素D不仅调节钙摄取，其中有自肠和骨矿化作用中的钙摄取，它还影响着其他大量的代谢途径，如胰岛素系统。

测量维生素水平本身对于测定病人的维生素D状况并没有什么帮助，因为维生素D(维生素D₂和维生素D₃)的浓度会根据食物的吸收大幅波动。另外循环中的(24小时)维生素D的生物半衰期相对较短，这也是它不能作为测定病人维生素D状况合适参数的另一原因。这同样也适用于生理学活性形式的维生素D(1，25-二羟基维生素D)上。相比于25-羟基维生素D，这些生物活性形式的浓度也相对较小及波动极大。综上所述，对于综合分析病人总的维生素D状况，量化25-羟基维生素D是一种适当的手段。

由于25-羟基维生素D高度的临床价值，文献中提及了大量的多少有些可靠性的测定25-羟基维生素D的方法。

例如在Haddad，J.G.等，J.Clin.Endocrinol.Metab.33(1971)992-995和Eisman，J.A.等，Anal.Biochem.80(1977)298-305中描述了利用高效液相色谱法(HPLC)来测定血液样品中25-羟基维生素D的浓度。

测定25-羟基维生素D的其他途径之一利用例如存在于牛奶中的维生素D结合蛋白。Holick，M.F.和Ray，R.(US 5,981,779)和DeLuca等.(EP 0 583 945)中描述了一种维生素D检测法，该方法基于利用维生素D结合蛋白与羟基维生素D和二羟基维生素D结合，并通过一种竞争性测试程序来测定他们的浓度。然而，这种方法的首要条件是被测定的维生素D代谢物必须是从原血液或血清样品中有机萃取分离出的形式，以及必须经过如层析柱等的纯化。

Armbruster，F.P.等(WO 99/67211)中讲授了需要通过乙醇沉淀法制备血清或血浆的样品来进行维生素D测定。在这个方法中，蛋白质沉淀物通过离心被移除，剩下包含可溶性维生素D代谢物的乙醇上清液。这些可以通过竞争性结合分析法测定。

另外，EP 0 753 743讲授了利用高碘酸盐将蛋白质从血液或血清样品中分离出来。在这个案例中，用高碘酸盐处理样品，测定样品的无蛋白上清液中维生素D化合物。在某些商业检测中，推荐了利用乙腈作为从血清或血浆样品中萃取的介质(例如，DioSorin的放射免疫测定或者“Immundiagnostik”公司的维生素D检测)。

近年来计划发布大量不同的释放试剂，原则上均适合用来从样品中的结合蛋白上释放维生素D化合物。然而，这种释放或分离应该在相对温和的条件下进行，从而可以在结合测试中可直接使用已被释放试剂处理过的样品。(参见例如WO 02/57797和US2004/0132104)。尽管近年来巨大的成果，所有现有维生素D的检测方法都有一些缺点，如样品制备费人力，标准化的匮乏，测试程序之间缺乏一致性或掺加(spiked)维生素D收率低。(特别见Zerwekh，J.E.，supra)。

特别是在先技术中没有提及能生产出测定25-羟基维生素D的可靠方法。因此本发明的目的是找到一种能生产出适合用来做25-羟基维生素D测定的抗体的可靠方法。下面描述的方法，既有生产抗体的方法，也包括用这些抗体测定维生素D的方法和试剂盒。

发明概述

本发明涉及生产能抗25-羟基维生素D的抗体的方法，包含以下步骤：

a)将含25-羟基维生素D₃或25-羟基维生素D₂作为半抗原的缀合物，免疫接种到一种实验用动物体内，

b)分离上述实验用动物的血清或血浆，以及

c)通过免疫吸附到分别包含25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃的互补基质上，从而将血清或血浆中的抗体提纯出来。

此外，本发明涉及的抗25-羟基维生素D₃的抗体可与10％至1000％的数量级的25-羟基维生素D₂交叉反应。

本申请还描述了如何利用本发明生产出的抗体在自动化测试中检测25-羟基维生素D。

另外，公开了一种可用来检测25-羟基维生素D的测试盒，包括测试程序中所需试剂组合物以及本发明中所包含的抗25-羟基维生素D的抗体。

发明详述

b)分离上述实验用动物的血清或血浆，以及

如无另外声明，根据下列结构式I和II，术语“维生素D”应理解为包括维生素D₂和维生素D₃两种形式。

式I

式II

依照类固醇命名法标明了结构式I和II中维生素D的各个位置。25-羟基维生素D表示结构式I和II中C-25位置被羟基化的维生素D代谢物，即25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃。如上所述，25-羟基维生素D₂和25羟基维生素D₃是诊断学上显著相关的维生素D形式。

提到维生素D的活性形式1，25-二羟基维生素D(所谓的激素D)，是由结构式I和II中C-1和C-25位置被羟基化形成的。

另外所知的维生素D代谢物有24-二羟基维生素D₂、25-二羟基维生素D₂、24-二羟基维生素D₃和25-二羟基维生素D₃。

所有已知的维生素D代谢物本身都不能产生免疫反应。将维生素D代谢组分化学活化以及使它们与载体分子或报告基团结合并不是件容易的事情。因此，为了使免疫成功，必备条件是制备一种如包含25-羟基维生素D作为半抗原的缀合物。这里术语半抗原被本领域技术人员看作是一种本身不产生免疫性的物质，但是经过与一种较大载体分子结合后，表现出抗原性从而可以促使针对其的抗体产生。本领域技术人员知道能产生半抗原缀合物的适宜载体材料。通常用来作为载体材料的有牛血清白蛋白、β-半乳糖苷酶或者所谓的匙孔

血蓝蛋白(KLH)。

KLH被证实尤其适合在本发明所提供的方法中作载体。因此，25-羟基维生素D与KLH的缀合物优选的用于免疫。

如式I和II中所示，该结构的各位置原则上都适合用于活化和与载体材料偶合。例如现已证实经25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃的3位偶合有利于与25-羟基维生素D以合适方式相结合的抗体的产生。因此在优选实施方式中，依据本发明中用于免疫的缀合物，均包含经主链的3位偶合的25-羟基维生素D₃或25-羟基维生素D₂(比较式I和II)。

作为本发明的一部分工作所做的一系列实验中，尝试将一个用25-羟基维生素D₃免疫原免疫吸附到一个25-羟基维生素D₃基质上所产生的抗体提纯，并且用到相应的测试中去。虽然这些实验并没有成功，但是令人惊讶地发现，通过免疫吸附到25-羟基维生素D₂基质上可以从同样的血清中获得适合的抗体。现已证实这种方法是可靠的，并且重现性良好。因此本发明的方法包含了一种可将抗25-羟基维生素Dx(这里x＝2或3)的抗体利用免疫吸附到一个包含25-羟基维生素D的各自互补形式的缀合物的基质上进行提纯的步骤。在这个意义上，25-羟基维生素D₃与25-羟基维生素D₂互补，反过来25-羟基维生素D₂也与25-羟基维生素D₃互补。这说明当用25-羟基维生素D₃免疫时，进行与25-羟基维生素D₂的免疫吸附；当用25-羟基维生素D₂免疫时，进行与25-羟基维生素D₃的免疫吸附。

此外，已证实利用维生素D主链上同一位置进行化学偶合是有利的，不论是在用作免疫作用的25-羟基维生素D缀合物中还是在用作免疫吸附的基质中。在免疫作用中25-羟基维生素D₃缀合物优选地结合在25-羟基维生素D₃的3位上，同样的，25-羟基维生素D₂也优选地结合在基质的3位上。

逆向程序也可行，即，利用25-羟基维生素D₂缀合物免疫，利用偶合25-羟基维生素D₃的基质免疫吸附。本发明中另外一个优选实施方案中，25-羟基维生素D₂缀合物用作免疫原缀合物，将用这种免疫原产生的抗体免疫吸附到25-羟基维生素D₃基质上去。

EAH-琼脂糖凝胶(Sepharose)被证明尤其适合作免疫吸附的基质材料。在一个优选实施方案中，由免疫作用在血清或血浆中产生抗25-羟基维生素D₃或者25-羟基维生素D₂的抗体，通过利用包含25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃的基质进行免疫吸附进而提纯。EAH-琼脂糖凝胶是一种优选的柱填料。

运用之前描述的详细程序，即用25-羟基维生素D₃缀合物进行免疫，利用25-羟基维生素D₂缀合物进行免疫吸附，可能重复生产出能够与25-羟基维生素D₂和25-羟基维生素D₃两种25-羟基维生素D形式均能反应的抗体。这种方法所获得的抗体的交叉反应的数量级为10％至1000％之间。因此在本发明的一种优选实施方案中，涉及例如抗25-羟基维生素D₃的抗体，与25-羟基维生素D₂有10％至1000％的交叉反应。与互补的25-羟基维生素D形式优选有20％至500％范围内的交叉反应。交叉反应的范围是在一种利用本发明生产的抗体所做的免疫学测试法中测定的。如果用相同分析物浓度的25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃时，在用25-羟基维生素D₃绘制的校准曲线上仅读出了十分之一的25-羟基维生素D₃，则抗作为半抗原的25-羟基维生素D₃产生的抗体对25-羟基维生素D₂的交叉反应性为10％。

用本发明方法所获得的抗25-羟基维生素D的抗体被证实适用于25-羟基维生素D的自动化测试。因此本发明优选涉及在检测25-羟基维生素D的免疫学测试中抗25-羟基维生素D的抗体的用途。25-羟基维生素D的测试优选是完全自动化的。本发明生产出的抗体尤其优选地用于可在罗氏诊断公司出品的自动化Elecsys

分析仪中进行的一种测试中。

根据本发明的讲授，可以令本领域技术人员将包含所有需要用来做25-羟基维生素D检测的组件组合成一个测试盒。优选的25-羟基维生素D测试盒的特征在于，这种测试盒包含了抗25-羟基维生素D且可以识别出两种25-羟基维生素D形式的抗体，即，与每种互补形式的25-羟基维生素D有10％至1000％的交叉反应。

优选作为竞争性免疫测定进行测试，其中本发明生产的抗25-羟基维生素D的抗体被优选用作检测试剂。在这种竞争性测试中，加入一定量的25-羟基维生素D“胞壁抗原”与样品中的25-羟基维生素D竞争检测抗体的结合位点。样品中的25-羟基维生素D越多，检测信号越少。

另外已经被证实以胞壁抗原的形式出现在竞争性测试中的25-羟基维生素D的形式与用于免疫吸附的形式相一致是有利的。如果其中一种免疫用包含25-羟基维生素D₃的免疫原，则在25-羟基维生素D₂基质上进行免疫吸附，而25-羟基维生素D₂的衍生物优选作为胞壁抗原用于测试中。胞壁抗原的修饰位置优选与免疫原以及用在免疫吸附的基质上的25-羟基维生素D的环位置相同。

本发明的另一种优选实施方案涉及一种免疫学检测25-羟基维生素D的方法，此方法中用到的多克隆抗体是用25-羟基维生素D缀合物免疫，并免疫吸附于互补的25-羟基维生素D缀合物上获得的，其中在一个竞争性测试中，互补于免疫原的25-羟基维生素D衍生物被用作胞壁抗原。

下列实施例及附图进一步阐明了本发明。本发明的准确保护范围限定于本发明所附的权利要求书中。

附图简述

图1：25-羟基维生素D₃免疫原的合成图解。

维生素D₃经式II主链上3位被激活，并与作为载体的匙孔

血蓝蛋白(KLH)偶合。

图2，25-羟基维生素D₂免疫吸附剂的合成图解。

维生素D₂经式I主链上3位被激活，并与基质材料EAH-琼脂糖凝胶偶合。

图3，生物素酰化的维生素D₂的合成图解。

图示了可用作胞壁抗原的25-羟基维生素D₂的合成步骤。

图4：用在先技术的抗体做免疫测定。

25-羟基维生素D的含量是通过免疫测定法和HPLC法对总共32个样品的分析来确定。免疫测定的数值标示在Y轴上而HPLC的数值标示在了X轴上。

图5：高效液相色谱法(HPLC)和LC-MS-MS的比较。

25-羟基维生素D的含量是通过液相层析串联质谱仪LC-MS-MS和高效液相色谱法(HPLC)对总共66个样品的分析所确定的。LC-MS-MS的数值标示在Y轴上而HPLC的数值标示在了X轴上。

图6：本发明中的抗体所做的免疫测定与LC-MS-MS的比较。

25-羟基维生素D的含量是通过HPLC法和基于本发明中抗体所做的免疫测定对总共66个样品的分析所确定的。免疫测定的数值标示在了Y轴上而HPLC的数值标示在了X轴上。

实施例1

25-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯-KLH的合成

这个合成中，化学活化25-羟基维生素D₃的3位，并与作为免疫原支持物的KLH耦合。这个合成经过25-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯和25-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯等中间步骤，均被图解在图一中。

1.125-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯的制备

取10mg(25μmol)25-羟基维生素D₃(Sigma-Aldrich，No.H-4014)溶解在1ml无水吡啶中，将其与125mg(1.25mmol)的琥珀酸酐在室温下暗室搅拌4天。将反应混合物吸收入10ml的乙酸乙酯中，分别用2×10ml的水，0.1M盐酸洗涤，随后再次用水洗涤。用约1g无水硫酸钠干燥有机相，过滤并真空除去溶剂。用高真空干燥剩余固体。获得10.5mg(产率：84％)的无色固体。

1.225-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备

取10.0mg(20μmol)的25-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯溶解于7ml的无水二氯甲烷中，并与2.76mg(24μmol)的N-羟基琥珀酰亚胺和3.72mg(24μmol)的N(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基-碳二亚胺(EDC)一起混合。在氩气下搅拌过夜，用10ml的水洗涤有机相两次，用约1g无水硫酸钠干燥并过滤。用真空除去溶剂，剩下的反应产物在高真空中干燥3小时。获得11.3mg(产率：94％)无需进一步提纯并可用于缀合的N-羟基琥珀酰亚胺酯。

1.325-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯-KLH的合成

取150mg的匙孔

血蓝蛋白(KLH；Sigma-Aldrich No.H 8283)溶解在25ml 0.1M的pH 8.0磷酸钾缓冲液中，加入含有11.3mg的N-羟基琥珀酰亚胺酯的2ml DMSO溶液。在室温下过夜搅拌，随后产物用凝胶柱法纯化(AcA 202，柱体体积0.5L；0.1M的pH 7.0的磷酸钾缓冲液)。用紫外吸收光谱法(λ＝256nm)检测并收集含缀合蛋白的流分。加入10％的甘油并将这种灰乳白色的溶液用于免疫。

实施例2

生产和分离抗25-羟基维生素D₃的抗体。

2.1免疫作用

在绵羊体内产生抗体。由实例一中获得的25-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯-KLH的缀合物用于免疫。免疫剂量为每只动物0.1mg。第一次在完全弗氏佐剂下进行免疫。接下来每间隔4个星期，在不完全弗氏佐剂下进行免疫，需时10个月。每次免疫间隔中间收集免疫血清。

2.2多克隆绵羊抗体的纯化

在Aerosil(1.5％)的帮助下，用25-羟基维生素D₃-3-半琥珀酸酯-KLH缀合物从免疫的绵羊血清中移除含脂质的成分。随后用硫酸铵(1.7M)沉淀出免疫球蛋白。沉淀物在包含50mM NaCl的15mM磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中透析，并用DEAE-琼脂糖基质层析提纯。从层析柱流穿液(flow-through)获得IgG流分(＝PAB<25-羟基维生素D₃>S-IgG(DE))。

2.3利用亲和层析法纯化25-羟基维生素D特异性抗体。

制备了一种包含了作为特异性决定子的缀合的25-羟基维生素D₂且可用作免疫层析纯化多克隆抗体的免疫吸附剂。这种免疫吸附剂由以下步骤获得：

a)羟基维生素D₃-3-2’-氰乙基醚的合成

在氩气条件下，在内有温度计的一个25ml三颈圆底烧瓶中，将20.6mg(50μmol)的25-羟基维生素D₂(Fluka No.17937)溶解于10ml干燥乙腈。将1.5ml叔丁醇/乙腈(9∶1)加入溶液中，并冰浴冷却到6℃。随后加入820μl的丙烯腈溶液(86μl的丙烯腈溶于1.0ml的乙腈中)并在6℃下搅拌15分钟。然后加入205μl的氢化钾溶液(25mg KH溶于0.5ml叔丁醇/乙腈(9∶1)中)。产生短暂的絮凝后得到清澈溶液。继续在6℃下搅拌反应溶液45分钟随后在4℃下搅拌60分钟。

接着，反应溶液用10ml的甲基叔丁基醚稀释并用10ml的水洗涤两遍。用约1g无水硫酸钠干燥有机相，通过G3玻璃过滤器过滤后再用旋转脱水器脱水。最后用高真空干燥，得到质量约55mg清澈的粘性剩余物。

b)羟基维生素D₂-3-3’-氨基丙基醚的合成

将上面所获得的全部腈溶解于15ml的二乙醚中，并在搅拌下与7.5mg氢化锂在7.5ml二乙醚中的悬浮液混合。在室温下搅拌反应混合物一个小时，然后加入38.4mg的氢化铝锂在6.6ml的二乙醚中的悬浮液，得到一个极度浑浊的混合物。室温下继续搅拌反应混合物一个小时，然后冰浴反应混合物冷却到0-5℃并小心地加入35ml的水。最后加入6.6ml的10M氢氧化钾溶液使混合物具强碱性。

每次用65ml的甲基叔丁基醚萃取三次，并用约5g无水硫酸钠干燥合并的有机相，过滤，在室温下用旋转脱水器脱水。剩余物用油泵干燥直至质量恒定。粗制的产物溶解于5ml DMSO和3.0ml的乙腈中并用制备性HPLC法进行纯化。

洗脱剂A＝Millipore水+0.1％的三氟醋酸；

洗脱剂B＝95％的乙腈+5％的Millipore水+0.1％的TFA；

梯度：100分钟内从50％的B到100％的B。

流速：30ml/分钟

温度：室温下

柱体尺寸：半径＝5.0cm；长度＝25cm；

柱体填料：Vydac C18/300

/15-20μm

检测波长：226nm

将分析HPLC(Vydac C18/300/5μm；4.6×250mm)测得的产物含量高于85％的流分收集到一个圆底烧瓶中并且冻干。最后获得13.7mg(产率：58％)的无色冻干粉。

c)合成羟基维生素D₂-3-3’-N-(半环庚基)氨基丙基醚-N-羟基琥珀酰亚胺酯

11.7mg(25μmol)的氨基衍生物溶解于5ml新鲜蒸馏的DMF并且加入92mg(250μmol)的软木酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯。加入3.5μl的三乙胺并在氩气下搅拌过夜。粗制产品通过制备性HPLC法(条件如上所述)纯化，经过冻干处理后获得10.1mg(产率：56％)的N-羟基琥珀酰亚胺酯。

d)合成羟基维生素D₂免疫吸附剂

在一个G3玻璃过滤器上用200ml 0.5M的氯化钠溶液洗涤20ml的EAH琼脂糖凝胶(Amersham Biosciences，No.17-0569-03)。用200ml 0.03M的磷酸钾缓冲液(pH 7.1)平衡。通过玻璃过滤器排掉多余的液体后，将悬浮液加进200ml的相同缓冲液中，并加入溶解了1.7mg(2.3μmol)N-羟基琥珀酰亚胺酯的10ml DMSO。在室温下用混合器搅动反应混合物过夜。将混合物再次转移到一个G3玻璃过滤器中排干并用500ml 0.05M的磷酸钾缓冲液/0.15M的氯化钠(pH 7.0)洗涤。完全排出后，重悬于25ml的相同缓冲液并加入0.15ml浓度为25％的叠氮化钠保存备用。

e)纯化抗体

10ml d)中的亲和基质被填入柱体内，并用包含50mM磷酸钾和150mM NaCl的缓冲液(pH 7.5)(PBS)平衡。将3.6g的PAB<25-羟基维生素D₃>S-IgG(DE)加载进柱体中。分别用PBS缓冲液和包含0.05％Tween

20和30mM氯化钠的0.5M NaCl溶液洗涤柱体。用3mM HCl溶液将特异性结合的免疫球蛋白从亲和基质上分离下来。用1mM的乙酸乙酯透析HCl洗脱液，随后将其冻干。将冻干粉溶解于PBS中，并用Superdex 200

层析移除聚集体，由此方法得到的免疫吸附的多克隆抗体将被用在接下来的步骤里。用1M的丙酸再生免疫亲和基质并保存在含有0.9％叠氮化钠的PBS溶液中。

实施例3

检测25-羟基维生素D的测定

商业测定根据制造商的使用说明进行使用。文献中记述了通过HPLC法(测试25(OH)维生素D₃，来自“Immundiagnostik”公司，Bensheim，订单号.KC 3400)或LC-MS-MS法(Vogeser，M.等，Clin.Chem.50(2004)1415-1417)来完成25-羟基维生素D的测定。

在依照本发明生产出的抗体的基础上，成分的制备以及一种新免疫学测试的通用程序描述如下：

3.1合成羟基维生素D₂-3-3’-N-(半环庚基)氨基丙基醚-生物素-(β-Ala)-Glu-Glu-Lys(ε)缀合物(＝Ag-Bi)

将13.7mg(25μmol)的羟基维生素D₂-3-3’-氨丙基醚溶解于3.5ml DMSO溶液中，并混入28.7mg(30μmol)的生物素-(β-Ala)-Glu-Glu-Lys(ε)-半辛二酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(RocheApplied Science，No.11866656)和12.5μl的三乙胺，在室温下搅拌过夜。反应溶液用4.5ml的DMSO溶液稀释，并以0.45μm的微过滤Millipore器滤出，随后用制备性HPLC法提纯(条件见实例2.3b)。收集分析性HPLC检测出的产物含量超过85％的流分并将其冻干。最后获得9.8mg(产率：30％)的已纯化生物素缀合物。

3.2用亲和层析法提纯钌化的可抗25-羟基维生素D的多克隆抗体(＝PAB-Ru)

按照实施例2.3e)的方法将亲和纯化的抗体转移到100mM的磷酸钾缓冲液中(pH 8.5)并将蛋白浓度调至1mg/ml。钌化试剂(钌(II)三(联吡啶)-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解于DMSO中，并以摩尔比为7.5∶1的比例加到抗体溶液中。反应持续60分钟后，加入L-赖氨酸使反应停止，多余的标记试剂在Sephadex G25上用凝胶渗透层析法分离出去。

3.3免疫测定的检测过程。

利用罗氏诊断公司的Elecsys系统测量样品。25μl的样品与30μl的释放试剂混合，同时或先后加入15μl的钌化检测抗体并且温育9分钟。接下来，加入生物素酰化的胞壁抗原(50μl)并通过加入释放试剂(50μl)保持pH值在一定的期望范围内。继续温育9分钟后，加入包被了链霉亲和素(SA)(30μl)的可磁化聚苯乙烯颗粒，再经过9分钟温育后，结合的钌化抗体的量按照常规测定。

包含钌化<25-OH-维生素D>抗体缀合物的溶液中含有：

20mM 磷酸缓冲液，pH 6.5

0.1％ oxypyrion

0.1％ MIT(N-甲基异噻唑酮-HCl)

10％ DMSO(二甲基亚砜)

1％ EtOH(乙醇)

0.1％表面麻醉剂

1％兔子免疫球蛋白G(DET)

2.0μg/ml PAB-Ru(见实例3.2)

释放试剂包含：

220mM 醋酸盐缓冲剂，pH 4.0

0.1％ oxypyrion

0.1％ MIT

10％ DMSO

1％ EtOH

0.1％表面麻醉剂

0.2％兔子免疫球蛋白G

含有生物素酰化的胞壁抗原的溶液包含：

20mM 磷酸缓冲剂，pH 6.5

0.1％ oxypyrion

10％ DMSO

1％ EtOH

0.1％表面麻醉剂

0.2％兔子免疫球蛋白G

0.18μg/ml Ag-Bi(见实施例3.1)

含有包被了SA的乳胶颗粒的悬浮液包含：

0.72mg/ml 具有470ng/ml结合能力的包被了链霉亲和素(SA)的可磁化聚苯乙烯颗粒

实施例4

实验结果与讨论

4.1利用被作为免疫原和免疫吸附剂的25-羟基维生素D₃所获得的抗体

在许多(失败的)实验中所使用的抗体是利用在先技术方法制造出来的，如用25-羟基维生素D₃进行免疫及对其免疫吸附。图4中显示了一个不适合用来作为25-羟基维生素D的可靠性检测的抗体的实例。图4中清楚的表明了用这些抗体的免疫测定所测得的25-羟基维生素D数值与参考方法(HPLC)之间没有相关性。

4.2比较HPLC和LC-MS-MS

如在Vogeser，M.等，Clin.Chem.50(2004)1415-1417中所描述，利用LC-MS-MS法检测维生素D的代谢物被越来越多的作为测定维生素D代谢物的参考方法。因此，研究了是否早先HPLC参考方法的结果可与较新的LC-MS-MS参考方法的结果相比较。可以从图5看出，两种参考方法均有可比性。利用线性回归确定了相关系数为0.94。

4.3利用根据本发明生产的抗25-羟基维生素D的抗体作免疫测定

应用新免疫学测试和LC-MS-MS法总共比较了66个样品中关于25-羟基维生素D的含量。由图6可以看出，由两种测定所得的结果非常相关。由线性回归获得相关系数为0.85。结果令人惊讶，因为这两种分析方法是基于完全不同的原理。

因此检测25-羟基维生素D的测试，可以用根据本发明生产的抗体来建立起一种可靠的25-羟基维生素D的测定方法。

Claims

1.一种生产抗25-羟基维生素D的抗体的方法，包含以下步骤：

a)用含25-羟基维生素D₃或25-羟基维生素D₂作为半抗原的缀合物，免疫接种到实验用动物体内，

b)分离上述实验用动物的血清或血浆，以及

c)通过免疫吸附到分别包含25-羟基维生素D₂或25-羟基维生素D₃的互补的基质上，从而将血清或血浆中的抗体提纯出来。

2.权利要求1中的方法，其特征在于25-羟基维生素D₃缀合物的键通过25-羟基维生素D₃的3位。

3.权利要求1中的方法，其特征在于25-羟基维生素D₂缀合物的键通过25-羟基维生素D₂的3位。

4.权利要求2中的方法，其特征在于25-羟基维生素D₂通过25-羟基维生素D₂的3位与免疫吸附中所用的基质连接。

5.权利要求3中的方法，其特征在于25-羟基维生素D₃通过25-羟基维生素D₃的3位与免疫吸附中所用的基质连接。

6.一种抗25-羟基维生素D₃的抗体，所述抗体与25-羟基维生素D₂有10％至1000％的交叉反应。

7.一种抗25-羟基维生素D₃的抗体，所述抗体与25-羟基维生素D₂有20％至500％的交叉反应。

8.权利要求6或7的抗体在测定25-羟基维生素D₃的测试中的用途。

9.一种测定25-羟基维生素D₃的测试盒，其特征在于所述测试盒包含权利要求6或7的抗体。