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CN101273060A - 通过靶向肿瘤坏死因子受体的前配体装配域(plad)来缓解炎性关节炎 - Google Patents

通过靶向肿瘤坏死因子受体的前配体装配域(plad)来缓解炎性关节炎 Download PDF

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CN101273060A
CN101273060A CNA2006800298419A CN200680029841A CN101273060A CN 101273060 A CN101273060 A CN 101273060A CN A2006800298419 A CNA2006800298419 A CN A2006800298419A CN 200680029841 A CN200680029841 A CN 200680029841A CN 101273060 A CN101273060 A CN 101273060A
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CNA2006800298419A
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M·莱纳多
G-M·邓
F·K-M·陈
L·郑
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Government of the United States of America
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Abstract

本发明提供了一种包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种包括一种前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽，其中所述PLAD选自：TNF－R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO－1)的PLAD、TRAIL受体的PLAD、LT/βR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、OX40的PLAD和DR4的PLAD。TNF－R、p60、p80、Fas、TRAIL受体、LT/βR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、TROY、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4－1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2全部为TNF受体超家族或TNF样受体家族的成员。本发明还提供了TNF受体超家族其它成员的PLAD。本发明的多肽可被用于抑制TNF受体超家族成员的寡聚化。这些多肽也可被用于抑制TNF受体超家族成员的配体结合。本发明还提供了一种包括TNF受体寡聚化抑制剂的组合物。本发明进一步提供了缺少PLAD的TNF受体超家族成员。

Description

通过靶向肿瘤坏死因子受体的前配体装配域(PLAD)来缓解炎性关节炎
本申请要求以2005年6月24日提交的美国临时申请No.60/694,015和2005年9月16日提交的美国临时申请No.60/717,589为优先权基础，其全文通过引用的方式纳入本说明书。
技术领域
本发明提供了TNF受体(TNFR)超家族成员的胞外区保守结构域在介导受体寡聚物的特异性非配体依赖性装配方面的新功能。
背景技术
TNFR超家族成员通常含有胞外区的1至6个富含半胱氨酸的结构域(CRD)、单个的跨膜结构域和大小可变的胞质内结构域。该受体家族的成员通常可结合到由结构、功能和序列相似性所定义的TNF细胞因子家族的配体上。这些受体以其活性配体结合态(liganded state)形成三聚体，且一些成员含有被称为死亡结构域的胞质结构域。
根据本发明，这些受体的胞外区可通过新的自缔合或同型缔合功能来进一步表征，所述功能由含有至少1个富含半胱氨酸的结构域的前配体受体装配域(PLAD)所介导。更具体地说，TNFR超家族成员，包括TRAIL受体1、CD40、60kDa的TNFR和80kDa的TNFR，表现出了这种同型缔合功能。包括Fas、LTβR、CD40、CD30、CD27、HVEM、RANK、OX40和DR4在内的其它的TNFR超家族成员含有该PLAD。所述PLAD是配体结合和受体功能所必需的。因此，TNFR超家族成员似乎是通过不同的预形成的复合体而不是通过配体诱导的单个受体亚基的交联来传递信号的。因此，PLAD可被药物制剂靶向以阻断这些预形成的复合体的形成并因此阻断受体功能。
已经确定许多微生物都进化出了对抗针对它们的免疫应答的有效策略(79)。更具体地说，一些病毒和细菌会表达用于调节或直接阻断免疫效应分子作用的细胞蛋白同源物，包括细胞因子和趋化因子(80)。已经鉴定了一些较大DNA病毒的TNF受体样受体(vTNFR)的病毒同源物，所述较大DNA病毒包括一些痘病毒和人巨细胞病毒。PLAD介导的vTNFR自缔合或与TNF家族受体的异源缔合是否存在或其任何作用尚未得到阐明。
两种主要的关节炎为类风湿性关节炎(RA)和脓毒性关节炎(SA)。RA是一种伴随有慢性关节炎症和进行性骨破坏的常见的人自身免疫性疾病(48)。尽管尚未完全了解RA的病因和发病机制，但是疾病进展中涉及细胞因子例如TNF-α、IL-1、IL-6和NF-κB配体的受体激活物(RANKL)(56-60)。核因子-κB(NF-κB)是这些细胞因子的关键性调节物(56-60)。TNF-α在RA的发病机制中起重要作用，其拮抗剂例如依那西普(也称为Enbrel)、TNFR II免疫球蛋白Fc融合蛋白和英夫利昔单抗(也称为Remicade)、抗TNF-α单克隆抗体可以改善RA的临床过程(48)。SA是一种由细菌感染诱发的快速进行性和高度破坏性的关节疾病，其中TNF-α也起到了重要作用(49)。由TNF-α(59)、脂多糖(LPS)、CpG-DNA(50、61)和胶原(62)诱发的实验性关节炎小鼠模型已被用来测试新的治疗方法。这些试剂能诱发滑膜炎、血管翳形成、骨和软骨破坏以及在人RA和SA中观察到的其它特征。
根据本发明，体外和体内数据表明TNFR PLAD蛋白能够有效地抑制TNF-α以及它在实验性炎性关节炎中的作用后果。
发明内容
本发明提供了一种包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供了一种包括前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽，其中所述PLAD选自：TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL受体的PLAD、LTβR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、OX40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcR1的PLAD和DcR2的PLAD。TNF-R、p60TNFR、p80TNFR、Fas、TRAIL受体、LTβR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、NGFR、Troy、EDAR、XEDAR、DcR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、OPG、DRS、DcR1和DcR2全是TNF受体超家族(在本文中也称为TNF受体样受体家族)的成员。本发明还提供了TNF受体超家族其它成员的PLAD以及本领域技术人员能够如何对它进行鉴定的方法。
本发明的多肽可被用来抑制PLAD的自缔合以及TNF受体超家族成员的寡聚化。这些多肽也可被用来抑制配体与TNF受体超家族成员的结合。
本发明还提供了一种包括TNF受体寡聚反应抑制剂的组合物。本发明进一步提供了缺少PLAD的TNF受体超家族成员。
附图说明
图1A示出了缺少配体时的TNFR寡聚物。用DTSSP(7)交联经TNFα处理过或未经TNFα处理过的H9T细胞淋巴瘤。如图所示，在非还原(泳道1-4、9-12)性或还原(泳道5-8、13-16)性条件下，对全细胞溶胞产物进行电泳，并针对p60或p80TNFR进行印迹。括号标明了三聚体(T)和单体(M)的位置。圆圈标明了与抗-p80抗体交叉反应的非特异性蛋白。所述结果代表了三次独立的实验。
图1B说明了特异性的p60 TNFR自缔合。用p60ΔCD-GFP-HA(泳道1-3)或pEGFP-N1(泳道4-6)，并且用pcDNA3(泳道1、4)或p60ΔCD-HA(泳道2、5)或HVEMΔCD-HA(泳道3、6)转染293T细胞。如图所示，用抗-GFP抗体进行免疫沉淀(GFP IP在上面的2个图中)并用抗-HA抗体(HA WB）或抗-GFP抗体(GFP WB)进行印迹。上图和中图分别示出了沉淀的p60ΔCD-GFP-HA(或GFP)和p60ΔCD-HA。下图示出了细胞溶胞产物中的p60ΔCD-HA和HVEMΔCD-HA蛋白。结果代表了五次实验。
图1C说明了特异性的p80自缔合和前配体装配域(PLAD)的定义。用图上方所示的质粒转染293T细胞。用仅识别全长p80的C末端特异性抗-p80抗体(p80 IP)进行免疫沉淀(上图和中图)。溶胞产物中截短的p80或p60蛋白的表达在下图中示出。用抗-HA抗体(上图和下图)和C末端特异性抗-p80抗体(中图)进行蛋白质印迹。空心圆圈代表糖基化和非糖基化形式的p80。实心圆圈表示Ig重链。
图1D说明了PLAD足以满足受体自缔合。用p80ΔCD-GFP-HA(泳道1-5)和每条泳道上方所示的质粒一起转染293T细胞。用抗-GFP抗体进行免疫沉淀并且用抗-HA抗体进行蛋白质印迹。共沉淀的DCD蛋白以及它们在总细胞溶胞产物中的表达分别在中图和下图中示出。上图示出了沉淀的p60ΔCD-GFP-HA蛋白。
图1E说明了PLAD是TNFα结合所必需的。直方图示出了在用所示构建体转染过的293T细胞中转染后受体的表达(通过抗-HA染色)以及它们与TNFα的结合(25)。x-轴表示荧光强度，y-轴表示细胞数量。所示数量为与用载体转染的对照相比的阳性群的百分数。
图2A说明了置换PLAD中的残基可防止自缔合。用所示质粒转染293T细胞。用抗-GFP抗体按照图1中的方法进行免疫沉淀。用抗-HA抗体进行蛋白质印迹。上图和中图分别出示了沉淀的p60ΔCD-GFP-HA(空心圆圈)和p60ΔCD-HA突变蛋白(括号)。下图示出了细胞溶胞产物中p60ΔCD-HA突变体(括号)和HVEMΔCD-HA(实心圆圈)的表达。
图2B说明了通过荧光共振能量转移(FRET)所证明的p60和p80 TNFR的同型自缔合。用所示的CFP(上图)和YFP(下图)质粒对转染的293T细胞的流式细胞分析的直方图。虚线表示单独用CFP转染的对照，实线表示不使用TNFα的FRET而粗线表示使用TNFα的FRET。x-轴和y-轴分别表示FRET荧光强度和细胞数量。在CFP阳性群中分析FRET，在所述CFP阳性群中所有细胞也都是YFP阳性的。FRET被定义为由CFP所激发的YFP的荧光发射。该结果代表了四次独立的实验。
图3A示出了TNFR超家族典型成员的CRD1(p60的CRD1(SEQ ID NO：22)、p80的CRD1(SEQ ID NO：23)、LTβR的CRD1(SEQ ID NO：24)、CD40的CRD1(SEQID NO：25)、HVEM的CRD1(SEQ ID NO：26)和CD30的CRD1(SEQ ID NO：27))的序列比对。该图示出了高度保守的半胱氨酸位置，所述位置用于二硫键并且界定了能赋予TNFR超家族成员资格的富含半胱氨酸的结构域。
图3B说明了TNFR超家族其它成员中的受体自缔合。用DR4ΔCD-GFP-HA(泳道1-4)或CD4ΔCD-GFP-HA(泳道5、6)与p80ΔCD-HA(泳道1、6)、p60ΔCD-HA(泳道2)、HVEMΔCD-HA(泳道3)、DR4ΔCD-HA(泳道4)或CD40ΔCD-HA(泳道5)一起转染293T细胞。分别用抗-GFP和抗-HA抗体进行免疫沉淀和蛋白质印迹。上图示出了免疫复合体中的沉淀蛋白，下图示出了细胞溶胞产物中的DCD蛋白表达。实心圆圈表示GFP融合蛋白，箭头表示免疫复合体中的DCD蛋白。
图3C示出了通过FRET证明的DR4和CD40的特异性受体缔合的流式细胞分析。按图2B中的方法使用所示的CFP(上部)和YFP(下部)质粒对进行转染。虚线表示单独用CFP时的本底FRET，粗线表示同时存在CFP融合蛋白和YFP融合蛋白时的FRET。对于每个组来说，x-轴为FRET强度，y-轴为细胞数量。
图3D示出了两种基于预缔合三聚体复合体的TNFR信号传导模型。对于预装配链重排模型(左)，椭圆形代表CRD(按从膜远端向膜近端的方向将CRD编号为1-4)，斑点方框表示胞质结构域。该受体是从垂直于质膜的角度观察的。罗马数字代表三聚体复合体中的链。对于该三聚体簇模型(右)，灰色符号表示细胞表面上预装配的TNFR三聚体，带圆圈的三角代表三聚的TNFα。数字1-3代表预装配三聚体复合体中的受体的三条链。该受体是按向下俯视质膜的角度观察的。
图4A示出了在没有配体结合的情况下，病原性Fas突变会导致显性干涉。野生型(WT)、Pt 2(del 52-96)和Pt 6(A241D)Fas分子的表面表达和结合特征。左侧栏示出了通过针对每个受体蛋白N-末端存在的AU-1表位标签染色时，转染到293T细胞后24小时的表面表达。中间栏示出了用10μg/ml抗-Fas拮抗抗体APO-1(Kamiya)染色的同样的细胞。右侧栏示出了设计用于通过修饰的亮氨酸拉链来三聚化并且用抗-亮氨酸拉链mAb(FasL染料)通过染色来显影的FasL的结合。抗体结合用藻红蛋白缀合的抗-小鼠抗体来显影。括号(bracket)表示与未转染的对照相比时，对染色呈强阳性的细胞的百分数。在每幅图中，粗线和细线分别代表转染的和未转染的细胞制品的信号。所有的直方图都代表了以4个十进制刻度间隔(4 decade)对数荧光刻度(X轴)相对细胞计数(Y轴)作图的10,000次事件。在使用Flowjo软件(Treestar software)的FACScalibur流式细胞仪上收集数据。
图4B示出了与WT Fas共转染的突变体Fas分子导致的显性抑制。将10μg所示的表达载体或单独的pCI载体电穿孔到不含如先前所述(15)的人Fas的BW细胞中，用5μg pEGFP-N1(Clontech)标记转染了GFP的细胞。24小时后，加入所示量的抗-Fas mAb APO-1和1/20体积的可溶性蛋白A(Sigma)以使凋亡诱导最大化。通过用流式细胞术计算GFP-阳性的活细胞并计算细胞消亡来量化凋亡(15)。
图4C说明了Fas分子的自缔合。将编码HA-标记的Fas的表达载体与野生型(WT)Fas和EC突变体Pt 2 Fas(del 52-96)共转染，所述HA-标记的Fas的C-末端死亡结构域被绿色荧光蛋白(HAFas 1-210：GFP)所代替。对照细胞用WT Fas和TNF受体家族成员疱疹病毒侵入介质(HVEM或HveA)的HA-标记的胞质截短型共转染，所述胞质截短型融合了GFP(HA HVEMΔCD：GFP)。按实施例中所述，裂解细胞溶胞产物，用抗-GFP进行免疫沉淀并且进行电泳。用抗FasC-末端的多克隆抗血清(C20，Santa Cruz biotechnology)(抗-Fas CT)探测沉淀蛋白的印迹以显示与GFP标记的蛋白共沉淀的全长Fas分子。也可以用抗-HA-HRP(Roche Molecular Biochemicals)和抗-Fas C20通过蛋白质印迹(WB)检测细胞溶胞产物以测定这些蛋白的总量。空心圆圈表示免疫沉淀物种的IgG重链，实心圆圈表示WT Fas，箭头表示截短的Pt 2Fas蛋白。一些用抗-FasC20印迹的泳道中的上方条带表示糖基化的Fas。
图5A示出了缺乏PLAD或配体结合的Fas突变体的表达和功能。利用N-末端Fas突变体的APO-1和FasL的结合。如图1A中所示(除了用抗-HA代替抗-AU1)，用C-末端截短的HA标记的TNFR2(TNFR2)对所示的HA标记的Fas突变体、R86S Fas突变体和对照转染物进行染色以显示细胞表面每种突变体的总表达。
图5B示出了Fas胞外结构域的相互作用依赖于该蛋白N-末端区域中的结构域。在泳道1-4中，用不含死亡结构域的AU-1标记的Fas 1-210和所示的HA-标记的Fas突变体或对照TNF2蛋白(HA TNFR2ΔCD)共转染293T细胞。溶胞产物用抗-AU1免疫沉淀并且用抗-HA探测以显示共沉淀的蛋白。已经证明使用了抗Fas N-末端的抗体(WB抗-FasN)的对照印迹可被用来测定溶胞产物中AU-1 Fas 1-210蛋白的量。该结果代表了三次独立的转染。泳道5-7示出了用与图1C中所用的同样的步骤，利用HAFas1-210：GFP进行的WT Fas和FasR86S突变体的共沉淀。空心圆圈表示免疫沉淀抗体的Ig重链，实心圆圈示出免疫沉淀的Fas的位置。
图5C说明了缺少自缔合结构域的Fas分子无法诱导凋亡。用10μg用于所示Fas分子的表达载体转染BW5147鼠胸腺瘤细胞。用500μg/ml可溶性APO-1诱导凋亡并按图1B中的方法进行定量。
图5D示出了无配体结合的R86S Fas突变体对凋亡的诱导和抑制作用。用10μg的每种Fas表达载体和5μg的GFP质粒转染BW细胞。按图2C中的方法进行凋亡诱导和定量，除了用APO-1来诱导用空心条表示的样品中的凋亡并且向用实心条表示的样品中加入5％v/v的FasL上清。
图6A示出了Fas分子间的荧光共振能量转移。点图示出了所示共转染子中CFP、YFP和FRET信号之间的关系。构建CFP和YFP融合蛋白并转染到293T细胞中，在FACS vantage细胞仪上进行分析。数字为具有FRET信号的CFP或YFP阳性细胞的百分数(右上象限)。
图6B为全长和N-末端缺失的Fas受体之间FRET信号的比较。FRET信号的直方图是在对CFP荧光设门的细胞中产生的。所有的转染子的YFP荧光都是相当的。粗线为共转染细胞的信号，细线为每一对中单独转染CFP构建体的信号。
图6C示出了通过在单个细胞上进行YFP的显微光漂白确定的所示CFP和YFP对的FRET效率(4-7个细胞区域的5次读数)。该数字代表了每个质粒对的平均E％和标准误。
图7A说明了内源Fas受体链的预缔合。将1×107个H9淋巴瘤细胞用交联剂DTSSP处理(Pierce，4℃下用10mM处理30分钟，然后用10mM pH8的Tris-Cl终止15分钟)和/或在所示条件下用1μg的拮抗抗体APO-1或FasL刺激15分钟。对于抗-Fas免疫印迹，在电泳之前用N-聚糖酶-F(Roche MolecularBiochemicals)处理细胞溶胞产物，并用抗-Fas C末端mAb B10(Santa CruzBiotechnology)和抗-小鼠IgG1-HRP(Southern Biotechnology)探测。
图7B，在用所示试剂处理后，将细胞裂解、免疫沉淀并按照先前所述(11)进行FADD和半胱天冬酶-8印迹。用箭头标出了两种半胱天冬酶-8酶原同种型(p54/52)和p11半胱天冬酶亚基蛋白酶解后半胱天冬酶-8的切割产物(p43/41)的位置。
图7C示出了PARP的切割。在37℃下将(A)和(B)中所用的细胞等分试样另外培养4小时并且用抗-PARP mAb(Research Diagnostics Inc)对细胞溶胞产物进行印迹。上方的条带为115kD全长PARP，下方条带为标志物85kD的半胱天冬酶切割片段。该结果代表了每种条件下至少三次独立的实验。
图8A说明了显性干涉依赖于PLAD的N-末端。对选定的来自NIH所研究家族的ALPS患者(Pt)Fas突变进行比对。符号“X”表示点突变的位置。如图，示出了通过共沉淀测试的与野生型Fas缔合的能力(SA)和共转染研究中Fas诱导的凋亡的显性抑制作用(DI)。示出了患者#1和#20的编码显性负性PLAD的序列，所述PLAD含有由突变编码的多肽。从信号肽后的第一个氨基酸开始编号。斜体字母表示由移码突变引入的额外的氨基酸。
图8B示出了无PLAD时没有显性干涉。Fas-敏感性Jurkat T淋巴瘤细胞用10μg所示构建体和2.5μg GFP报告质粒转染。转染后18小时，连续6个小时加入所示量的Apo-1并通过用膜联蛋白V-PE(Pharmingen)染色来对凋亡进行定量。百分数是膜联蛋白V染色阳性GFP(+)细胞的百分比。这些结果代表了三次独立的转染。
图9示出了用于确定p80嵌合受体或截短形式存在情况的免疫沉淀分析。用所示质粒转染293T细胞并收集细胞以便用抗-p80 COOH-末端特异性抗体进行免疫共沉淀。使用抗-HA抗体通过蛋白质印迹分析法分析免疫沉淀物以确定p80嵌合受体或截短的存在情况(上图)。下图示出了全细胞溶胞产物中HA-标记蛋白的表达。
图10示出了重组细菌PLAD蛋白的表达。(a)PLAD如何帮助受体三聚体装配以及配体结合反应性的模型。可溶性PLAD蛋白可以与单个的受体链缔合、防止三聚受体装配并从而阻断配体-诱导的信号传导。(b)纯化的GST、P60PLAD-GST(P60)和P80 PLAD-GST(P80)的凝胶电泳。左侧示出了分子量标记，其大小以千道尔顿为单位。(c)使用抗P60 PLAD(上图)或P80 PLAD(下图)的单克隆抗体(MAb)的蛋白质印迹分析。示出了P60 PLAD(左图)或P80 PLAD(右图)在最初的凝胶电泳中所使用的以μg蛋白为单位的滴定。
图11示出了PLAD蛋白在TNF-α诱导的细胞死亡中的作用。(a)用培养基、人TNF-α(hTNF)(2ng)、TNF-α(2ng)+P60 PLAD(P60)(40μg)处理L929细胞后，利用流式细胞术评估的细胞死亡。插图示出了相差显微照片。右下角给出了被设门的活细胞的百分数。Y轴为碘化丙啶(PI)染色，X轴为FSC(前向角散射分布)。死亡细胞表现出增多的PI染色和减少的FSC。(b)小鼠TNF-α(mTNF)(2ng)或hTNF(2ng)以及不同剂量的PLAD P60(P60)蛋白诱导的细胞消亡。(c)mTNF(2ng)或hTNF(2ng)以及不同剂量的PLAD CD40(CD40)蛋白诱导的L929细胞的消亡。(d)在存在或不存在P60 PLAD(P60)、P80 PLAD(P80)和GST的情况下，用TNF-α或抗-Fas处理12小时后，42.3 Jurkat细胞的消亡。TNF-α(3ng)、P60L(低；4.5μg)、P60H(高；15μg)、P80L(低；4.5μg)、P80H(高；15μg)、GST(15μg)、抗-Fas(10ng)。(e)通过在存在或不存在P60 PLAD(100μg)、依那西普(25μg)、英夫利昔单抗(20μg)的情况下，用m TNF-α(4ng)处理的底物转化的光密度(OD)来测量L929细胞中的半胱天冬酶-8活性。
图12示出了P60和P80 PLAD蛋白对关节炎的作用，所述关节炎是由在BALB/c小鼠的关节内注射TNF-α以及在C3H/HeJ小鼠的关节内注射细菌CpGDNA来诱发的。(a)膝关节HE染色组织切片的代表性显微照片，示出了：PBS；45ng TNF-α；P60 PLAD(100μg)和45ng TNF-α；P80 PLAD(100μg)和45ngTNF-α；CpG DNA(1nM)；CpG DNA(1mM)和P60 PLAD(100μg)。箭头表示炎症的集中灶区。标记为：C(软骨)、JC(关节腔)、ST(滑膜组织)、B(骨)，且该箭头指向滑膜组织的被覆层。(b、c)如图所示，单独用TNF-α(TNF)或者用TNF-α加P60 PLAD蛋白(P60)或者用TNF-α加P80 PLAD蛋白(P80)处理的实验组(n＝5)的滑膜炎、血管翳、骨和软骨侵蚀的定量组织分析。(d)每个实验组(n＝5)的滑膜炎、血管翳、骨和软骨组织侵蚀的定量组织分析。这些分析要重复至少两次。单独的CpG DNA(CpG)、CpG DNA加P60 PLAD(P60)。数值为平均值±标准差(s.d.)，**为与对照组相比处理组的P＜0.01。关节内接种后3天处死小鼠以便进行组织病理学检查。结果代表了三次实验。
图13示出了P60和P80 PLAD蛋白对DBA/1J小鼠体内CIA的作用。盲法实验(a-f)。(a)用PBS或P60 PLAD处理的CIA小鼠的足爪照片。(b)用PBS处理的初次免疫后75天或腹腔内注射P60 PLAD蛋白4周(每周三次，每次100μg)的CIA关节的HE染色切片。(c)用PBS(n＝13只小鼠)(方块)、P60 PLAD蛋白(P60)(n＝12只小鼠)(菱形)和P80 PLAD蛋白(P80)(n＝13只小鼠)(椭圆)处理的CIA小鼠中关节炎的严重度、足爪厚度的测量以及体重。(d)PBS、P60和P80处理组中关节炎的发病率。(e)对按所示方法处理4周的CIA关节切片中滑膜炎、血管翳、骨和软骨侵蚀的评估。(f)血清中IL-1和IL-6水平。*＝与对照PBS组相比P＜0.05。(g)腹膜内注射两周PBS(n＝10只小鼠)(方块)、P60PLAD蛋白(P60)(n＝10只小鼠)(菱形)和依那西普(n＝10只小鼠)(椭圆)后CIA小鼠体内关节炎的严重度。*＝与对照PBS组相比P＜0.05。(h)在所建立的CIA中P60 PLAD蛋白的作用。腹膜内注射两周PBS(n＝9只小鼠)(方块)、P60 PLAD蛋白(P60，每隔一日400μg)(n＝10只小鼠)(菱形)后所建立的CIA小鼠的关节炎严重度。*＝与对照PBS组相比P＜0.05。
图14示出了关节炎关节中TNFR的表达、PLAD蛋白对TNF-α结合的抑制以及NF-κB的活化。(a)用PBS或P60 PLAD处理75天后处死的患有CIA的DBA/1J小鼠的关节炎关节中TNFR1和TNFR2的免疫组织化学。褐色表示表达TNFR的细胞。(b)在用50ng生物素化的人TNF-α(Bt-TNF-α)和不同剂量的P60 PLAD蛋白预处理染色后，进行流式细胞术。曲线代表了单独的Bt-TNF-α、Bt-TNF-α加3μg P60 PLAD、Bt-TNF-α加15μg P60 PLAD、Bt-TNF-α加30μg P60 PLAD、人TNF-α或阴性对照。(c)用所示的依那西普(1μg)、P60(1μg)或P80(1μg)PLAD蛋白(测试蛋白)免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-α的凝胶电泳。使用抗TNF-α抗体进行的蛋白质印迹。(d)在存在(+)或不存在(-)P60 PLAD蛋白的情况下，使用NF-κB(左箭头)或OCT1(右箭头)的放射性标记寡核苷酸探针，对从经TNF-α处理的A3 Jurkat细胞制得的核提取物进行的电泳迁移率变动检测。在存在或不存在P60(100μg)或P80(100μg)PLAD蛋白的情况下，在体外用mTNF-α(2ng)处理从TNFR1(e)或TNFR2(f)敲除(-/-)小鼠脾脏分离的单核细胞之后，对这些细胞中的NF-κB p65核易位进行的定量分析。*＝与对照组相比P＜0.05；**＝与对照组相比P＜0.01。在每个遗传背景中P60和P80处理组之间的差异都是显著性差异(P＜0.01)。
图15示出了P60PLAD蛋白可抑制破骨细胞生成以及RANK和RANK配体(RANKL)的表达。(a)胶原初次免疫并用PBS或P60 PLAD蛋白处理75天后处死的DBA/1J小鼠的关节炎关节中降钙素受体的免疫组织化学的代表性显微照片。浅色阴影箭头标明了阳性染色(在原始彩色切片中为褐色)。(b)PLAD蛋白在体外的TNF-α诱导的破骨细胞生成中的作用。用M-CSF和小鼠TNF-α(10μg)、小鼠TNF-α(10μg)加32μg P60 PLAD或PBS培养的骨髓巨噬细胞(BMM)中TRAP-阳性破骨细胞的显微照片。浅色阴影箭头标明了耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)阳性破骨细胞。对用所示不同剂量的P60 PLAD蛋白处理7天后，BMM培养物的每个孔中的TRAP-阳性细胞的定量，用显微镜测定。(c)用胶原初次免疫然后用PBS、P60 PLAD蛋白处理75天后处死的DBA/1J小鼠的关节炎关节中，RANK和RANKL染色的免疫组织化学的显微照片。深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示阳性染色细胞。
图16示出了标准的单字母代码形式的人PLAD-GST融合蛋白的氨基酸序列。(a)所示粗体和下划线(氨基酸残基230-282)为P60 PLAD肽序列(SEQ IDNO：59)。(b)所示粗体和下划线(氨基酸残基230-274)为P80 PLAD 肽序列(SEQID NO：60)。这两部分中以纯文本形式给出的是GST蛋白序列。
图17示出了P60 PLAD蛋白对L929细胞中TNF-α诱导的细胞死亡的作用。用下列试剂处理了19个小时的细胞的相差显微照片：(a)单独的培养基；(b)人TNF-α(2ng)；(c)P60 PLAD(3μg)+hTNF-α(2ng)；(d)P60 PLAD(30μg)+hTNF-α(2ng)；(e)英夫利昔单抗(1μg)+hTNF-α(2ng)；(f)依那西普(1μg)+hTNF-α(2ng)；(g)P80 PLAD(30μg)+hTNF-α(2ng)。400倍放大；(h)在存在或不存在P60 PLAD(50μg)、依那西普(1μg)和英夫利昔单抗(1μg)的情况下，由hTNF(2ng)诱导的L929细胞的消亡。
图18示出了GST蛋白和P80 PLAD蛋白对炎性关节炎的作用。(a)单独用TNF-α(45ng)(TNF)或TNF-α(45ng)加GST蛋白(GST，100μg)处理的BALB/c小鼠实验组(n＝5)中滑膜炎、血管翳以及骨和软骨组织的定量组织分析；(b)在C3H/HeJ小鼠中单独使用CpG DNA(1nM)(CpG)或CpG DNA(1nM)加P80 PLAD蛋白(P80，100μg)。数值为平均值±标准差。在关节内接种后3天将小鼠处死以便进行组织病理学检查。结果代表了三次实验。(c)H&E染色切片的显微照片，示出了进行了为期4周的P80 PLAD蛋白(100μg)的腹膜内注射的初次免疫后75天的CIA关节的炎症和破坏。200倍放大。(d)用P80 PLAD蛋白处理4周的DBA/1J小鼠的CIA中滑膜炎、血管翳以及骨和软骨侵蚀的定量组织分析。与对照组相比P＞0.05。
图19示出了免疫组织化学的显微照片。(a)6个月时处死的TNF-α转基因小鼠关节炎关节中的TNFR1和TNFR2。TNFR1图中的箭头标出了表明受体表达的深色染色部分(在原始彩色切片中为褐色)。TNFR2图中的箭头标明了软骨深部的软骨细胞的高TNFR2表达。(b)6个月大时处死的TNF-α转基因小鼠的关节炎关节中的以及对照C57BL/6小鼠的健康关节中的降钙素受体。(c)6个月大时处死的TNF-α转基因小鼠的关节炎关节中以及正常对照C57BL/6小鼠的健康关节中的RANK和RANKL染色。深色(在原始彩色切片中为褐色)染色表示阳性组织化学反应。300倍放大。
图20示出了P60PLAD蛋白的免疫原性和半衰期。(a)基于从用胶原初次免疫然后用PBS、P60或P80 PLAD蛋白处理后75天处死的DBA/1小鼠血清中纯化的PLAD蛋白，与标准曲线相比的抗-PLAD P60抗体水平。GST+是指加入GST以便从血清中去除GST抗体。(b)P60 PLAD蛋白的半衰期。(c)P80 PLAD蛋白的半衰期。
图21示出了PLAD蛋白可抑制TNF-α诱导的IkBα降解。蛋白质印迹示出了在存在或不存在P60(10、50、100μg)或P80(10、50、100μg)的情况下，在体外用mTNF-α(2ng)处理从TNFR1或TNFR2敲除(-/-)小鼠脾脏分离出的单核细胞5分钟(b)、15分钟(a)或者在存在或不存在GST(10、50、100μg)的情况下，用mTNF-α(2ng)处理这些细胞1小时(c)后，这些细胞中的IkBα降解。
图22示出了用不同量的依那西普和P60 PLAD蛋白来免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-α的凝胶电泳。(a)所示的依那西普(10μg)或P60 PLAD蛋白(100μg)(测试蛋白)。(b)所示的依那西普(0.1、1、10μg)或P60 PLAD蛋白(0.1、1、10μg)(测试蛋白)。箭头标明了TNF蛋白在凝胶上的位置。用抗TNF-α抗体(Ab)进行蛋白质印迹。
图23示出了TNFR1晶体结构(PDB ID：1NCF)中二聚化的PLAD部分。深灰部分和浅灰部分表示PLAD二聚体的单个肽链。圆圈中标出了每个肽中His-34的镜像(mirror)咪唑环。这些双组氨酸在链间袋中互相固定。
图24示出了与依那西普混合的P80 PLAD蛋白的免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)。
图25示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的MMP表达。注：左图中深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示MMP表达。
图26示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的iNOS表达。注：左图中深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示iNOS表达。
具体实施方式
参照下文中关于本发明优选实施方案和其中所含实施例的详细描述，并参照附图和关于它们的在上文和下文中的描述，可以更容易地理解本发明。
根据上下文，说明书和权利要求中所用的“一”可以表示一个(种)或多个(种)。因此，例如，提及“一种核酸”时是指使用了至少一种核酸。
多肽
本发明提供了一种包括前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种由前配体装配域的氨基酸序列组成的多肽。本发明的PLAD可以是TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTβR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、OX40的PLAD、DR4的PLAD或TNFR超家族成员的任何其它PLAD结构域。由于PLAD结构域在TNFR超家族成员中是高度保守的，本领域技术人员可以通过在可利用的数据库中搜索表征所述PLAD结构域的保守基序来鉴定任何TNF受体的PLAD结构域。TNF受体样受体中这些区域的鉴定是通过本文提供的示例性PLAD序列以及将它们与该家族其它成员公开序列进行比较来以常规手段完成的(例如，参见图3)。此外，本领域技术人员也应该能够通过进行功能测定(例如实施例中所提供的功能测定)来鉴定PLAD。在一个实施方案中，所述功能性PLAD不是Fas/CD59的PLAD(83)。在另一个实施方案中，所述功能性PLAD不是Fas/CD59受体氨基末端的49个氨基酸(83)。
本文所提供的PLAD可以仅包括成熟的TNF受体样受体N-末端的38个氨基酸。成熟的TNF受体样受体是不含信号序列的TNF受体样受体。序列表中公开了PLAD的实例，该序列表包括含有其信号序列的TNF受体样受体实例的氨基酸序列。参照表1中列出的这些TNF受体样受体的GenBank登记号可以找到各个受体的信号序列残基。因此，所给的序列中公开了成熟TNF受体样受体及其对应PLAD的序列。表3提供了关于本文所公开的TNF受体样受体和受体配体的附加信息。它还提供了关于分离的PLAD以及含有本文所公开的分离的PLAD的多肽的用途的信息。所述PLAD可被用来研究干扰TNFR超家族受体介导的信号传导途径的意义。例如，如果经由TNFR超家族受体的信号传导是已知的或被证明与疾病途径相关，则通过本发明的多肽抑制受体的前配体装配可以治疗获预防该疾病。例如，可被治疗的疾病包括癌症、心脏病和炎性疾病。PLAD的修饰也会改变配体/受体相互作用的亲和力，这可被用于体外研究，例如测量配体和受体的结合、受体信号等。荧光标记的PLAD蛋白也可被用作通过流式细胞术或荧光显微术来确定细胞表面上特异性TNFR相对表达时的试剂。
本发明还提供了含有分离的PLAD的38至125个氨基酸的多肽。例如，所述肽可以是含有分离的PLAD的50至125个氨基酸的多肽。在一个进一步的实例中，所述多肽可以包括子序列R1-TNF受体样受体PLAD-R2，其中R1和R2是任选的，当存在时它们可以是H、酰基、NH2、氨基酸或肽。当存在时，R1和/或R2可以是任何氨基酸。当R1和/或R2是肽时，该肽的长度是可变的。例如，R1和/或R2的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个氨基酸，只要含有分离的TNF样PLAD的整个肽不超过125个氨基酸残基，而且其长度可以是38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个氨基酸。R1和R2也可以是TNF受体样受体的序列，所述序列一般位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD的侧面，其中所述含有TNF样受体PLAD的多肽并不是TNF受体样受体的整个胞外结构域。
本发明进一步提供了任何大小的多肽，包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列，其中所述多肽为R1-TNF受体样受体PLAD-R2，其中R1或R2包括不位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD侧面的氨基酸序列。R1或R2(但并非两者同时)可以是TNF受体样受体的全部或部分序列，所述序列通常位于天然存在的TNF受体样受体中TNF样PLAD的侧面。例如，PLAD可以来自TNF受体样受体且R1或R2可以是不存在于所述TNF受体样受体中或任何其它TNF受体样受体中的氨基酸序列，所述多肽的TNF样PLAD来自于所述TNF受体样受体。R1或R2可以是任何的氨基酸序列，只要R1-TNF样PLAD-R2不是天然存在的全长TNF受体样受体。在另一个实例中，PLAD可以来自TNF受体样受体且R1或R2或两者，如果存在的话，可以是来自另一个TNF受体样受体的肽序列。因此，本领域技术人员可以将一个TNF受体样受体的PLAD与来自一个不同的TNF受体样受体的R1或R2序列结合起来以获得这种多肽。由于已知的TNF受体样受体的序列是可公开获得的，所以本发明的多肽的R1和R2的结构很多，但也是已知的并被本文所考虑。或者，R1或R2可以是不与任何TNF受体样受体序列相关的肽序列。在一个实施方案中，所述含有分离的PLAD的多肽不是美国专利5,633,145(Feldman et al.)中所公开的成熟(不含信号序列)TNF1受体的124个氨基酸的序列。
含有上述子序列的多肽的实例包括R1-成熟p60的第1-38、1-39、1-40、1-41、1-42、1-43、1-44、1-45、1-46、1-47、1-48、1-49、1-50、1-51、1-52、1-53或1-54位氨基酸-R2(例如SEQ ID NO：1)；R1-成熟p80的第10-48、10-49、10-50、10-51、10-52、10-53或10-54位氨基酸-R2(SEQ ID NO：2)；R1-成熟Fas的第1-38、1-39、1-40、1-41、1-42或1-43位氨基酸-R2(SEQ IDNO：3)；R1-成熟Fas的第1-38、1-39、1-40、1-41、1-42、1-43、1-44、1-45、1-46、1-47、1-48、1-49、1-50、1-51、1-52、1-53、1-54、1-55、1-56、1-57、1-58、1-59、1-60、1-61、1-62、1-63、1-64、1-65或1-66位氨基酸-R2(SEQ ID NO：4)；R1-成熟LtβR的第13-50位氨基酸-R2(SEQ ID NO：5)；R1-成熟CD40的第6-39位氨基酸-R2(SEQ ID NO：6)；R1-成熟CD30的第11-49、11-50或11-51位氨基酸-R2(SEQ ID NO：7)；R1-成熟CD27的第7-42位氨基酸-R2(SEQ ID NO：8)，R1-成熟HVEM的第6-37位氨基酸-R2(SEQ ID NO：9)；R1-成熟OX40的第3-36位氨基酸-R2(SEQ ID NO：10)以及R1-成熟DR4的第109-138位氨基酸-R2(SEQ ID NO：11)。
成熟p60(TNFR1)多肽起始于被表示为SEQ ID NO：12的全长p60编码序列的第30位。因此，本发明提供了一种含有成熟p60蛋白的第1-54位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的30-83位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-53位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-82位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的1-52位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-81位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-51位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-80位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-50位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-79位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-49位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-78位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-48位氨基酸的多肽(SEQID NO：12的第30-77位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-47位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-76位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-46位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-75位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-45位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-74位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-44位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-73位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-43位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-72位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-42位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-71位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-41位氨基酸的多肽(SEQID NO：12的第30-70位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-40位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-69位氨基酸)、一种含有成熟p60蛋白的第1-39位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：12的第30-68位氨基酸)以及其它含有成熟p60蛋白的保持了PLAD活性的第1-54位氨基酸片段的多肽。
成熟p80(TNFR2)多肽起始于被表示为SEQ ID NO：13的全长p80编码序列的第23位。因此，本发明提供了一种含有成熟p80蛋白的第10-54位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：13的第32-76位氨基酸)、一种含有成熟p80蛋白的第10-53位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：13的第32-75位氨基酸)、一种含有成熟p80蛋白的第10-52位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：13的第32-74位氨基酸)、一种含有成熟p80蛋白的第10-51位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：13的第32-73位氨基酸)、一种含有成熟p80蛋白的第10-50位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：13的第32-72位氨基酸)以及其它含有成熟p80蛋白的保持了PLAD活性的第10-54位氨基酸片段的多肽。
成熟Fas受体多肽起始于被表示为SEQ ID NO：14的全长Fas编码序列的第17位。因此，本发明提供了一种含有成熟Fas蛋白的第1-43位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-59位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-42位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-58位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的1-41位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-57位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-40位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-56位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-39位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-55位氨基酸)以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-43位氨基酸片段的多肽。
本发明还提供了一种含有成熟Fas蛋白的第1-66位氨基酸的多肽(SEQ IDNO：14的第17-82位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-65位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-81位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-64位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-80位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-63位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-79位氨基酸)、一种含有成熟Fas蛋白的第1-62位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：14的第17-78位氨基酸)以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-66位氨基酸片段的多肽。
本发明还提供了一种含有被表示为SEQ ID NO：15的全长LTβR蛋白的第43-80位氨基酸的多肽以及其它含有SEQ ID NO：15的保持了PLAD活性的第43-80位氨基酸片段的多肽。
本发明还提供了一种含有被表示为SEQ ID NO：16的全长CD40蛋白的26-59位氨基酸的多肽以及其它含有SEQ ID NO：16的保持了PLAD活性的第26-59位氨基酸片段的多肽。
成熟CD30多肽起始于被表示为SEQ ID NO：17的全长CD30编码序列的第19位。因此，本发明提供了一种含有成熟CD30蛋白的第11-51位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：17的29-69位氨基酸)、一种含有成熟CD30蛋白的第11-50位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：17的29-68位氨基酸)、一种含有成熟CD30蛋白的第11-49位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：17的第29-67位氨基酸)、一种含有成熟CD30蛋白的第11-48位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：17的第29-66位氨基酸)、一种含有成熟CD30蛋白的11-47位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：17的第29-65位氨基酸)以及其它含有成熟CD30蛋白的保持了PLAD活性的第11-51位氨基酸片段的多肽。
本发明还提供了一种含有被表示为SEQ ID NO：18的全长CD27蛋白的第27-62位氨基酸的多肽以及其它含有SEQ ID NO：18的保持了PLAD活性的第27-62位氨基酸片段的多肽。
本发明还提供了一种含有被表示为SEQ ID NO：19的全长HVEM蛋白的第42-75位氨基酸的多肽以及其它包含含有SEQ ID NO：19的保持了PLAD活性的42-75位氨基酸的多肽片段的多肽。
成熟OX40多肽起始于被表示为SEQ ID NO：20的全长OX40编码序列的第29位。因此，本发明提供了一种含有成熟OX40蛋白的第3-36位氨基酸的多肽(sEQ ID NO：20的第31-64位氨基酸)、一种含有成熟OX40蛋白的3-35位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：20的第31-63位氨基酸)、一种含有成熟OX40蛋白的3-34位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：20的第31-62位氨基酸)、一种含有成熟0X40蛋白的3-33位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：20的第31-61位氨基酸)、一种含有成熟CD30蛋白的第3-32位氨基酸的多肽(SEQ ID NO：20的第31-60位氨基酸)以及其它包含含有成熟OX40蛋白的保持了PLAD活性的第3-36位氨基酸的多肽片段的多肽。
本发明还提供了一种含有被表示为SEQ ID NO：21的全长DR4蛋白的第132-170位氨基酸的多肽以及其它包含含有SEQ ID NO：21的保持了PLAD活性的第132-170位氨基酸的多肽片段的多肽。
表1列举了含有本发明的PLAD的TNF受体样受体的实例。根据表1中列出GenBank登记号可以找到这些受体的核苷酸和多肽序列。根据表1中列出GenBank登记号所示出的核苷酸序列、多肽序列以及任何信息(例如信号序列和成熟蛋白残基数)的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。例如，根据GenBank登记号M75866可以找到p60的核苷酸序列、多肽序列和附加信息(例如信号序列和成熟蛋白残基数)。根据GenBank登记号M75866所示的这些p60序列和附加信息的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。类似地，根据GenBank登记号M32315可以找到针对p80所示出的核苷酸序列、多肽序列和附加信息(例如信号序列和成熟蛋白残基数)。根据GenBank登记号M32315所示出的这些p80序列和附加信息全部通过引用的方式纳入本说明书。通过访问表1中列出的GenBank登记号，本领域技术人员可以访问到其中列出的附加GenBank登记号以获得与信号序列和成熟蛋白序列相关的附加信息。例如，当访问GenBank登记号M75866时，本领域技术人员可以访问到表示p60的信号序列和成熟蛋白序列信息的GenBank登记号AAA61201。该信息也可通过直接访问GenBank登记号AAA51201(p60)、GenBank登记号AAA59929(p80)、GenBank登记号AAA63174(Fas)、GenBank登记号AAA36757(LTBR)、GenBank登记号CAA43045(CD40)、GenBank登记号AAA51947(CD30)、GenBank登记号AAA58411(CD27)、GenBank登记号AAB58354、GenBank登记号CAA53576(OX40)、GenBank登记号AAC51226(DR4)找到，该信息通过引用的方式纳入本说明书。
表1还提供了TNF样受体的Locus Link登记号。现在Locus Link登记号等同于在美国国立医学图书馆的美国国家生物技术信息中心可以访问到的Entrez Gene识别号(Gene ID号)。例如，本领域技术人员可以通过访问EntrezGene数据库中的Locus Link号7132(现在为Entrez Gene中的Gene ID7132)获得关于p60的附加信息，包括核苷酸和蛋白序列。类似地，本领域技术人员可以通过访问Entrez Gene数据库中的Locus Link号7133(现在为EntrezGene中的Gene ID7133)获得关于p80的附加信息，包括核苷酸和蛋白序列。因此，本领域技术人员通过访问表1中所列的任何TNF样受体在Entrez Gene中的相应Locus Link(Gene ID)号可以很容易地获得与它们相关的信息。所有相据表1中列出的Locus Link(Gene ID)号提供的信息的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。
提供了含有vTNFR蛋白PLAD结构域的分离的氨基酸序列的多肽(SEQ IDNO：28-39)。可以使用蛋白-蛋白BLAST数据库的用于TNFR1和TNFR2 PLAD序列的同源搜索来鉴定其它vTNFR PLAD。也包括每种vTNFR及其修饰蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：44-55)。还提供了可被本领域技术人员用来对其他vTNFR PLAD多肽进行鉴定、生产和功能测试的方法等。
vTNFR PLAD结构域可以中断宿主TNFR的自缔合和/或随后的配体结合以抑制抗病毒免疫和/或保护感染的细胞免遭TNF介导的细胞死亡。M-T2蛋白--一种由粘液瘤病毒编码的TNF受体样蛋白--可以保护粘液瘤感染的T细胞免遭TNF诱导的死亡并且不依赖其胞外TNF结合能力(82)。由于针对与宿主TNFR PLAD结构域结合的较高亲和力的进化选择，vTNFR PLAD序列可以用作比P60或P80 PLAD本身更有效的TNF诱导作用抑制剂。在这点上，分离的病毒PLAD蛋白代表了用于阻断与类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病相关的TNF-相关发病的临床应用的改良试剂。
应该理解的是，例如本文所述的这些技术，可被用于鉴定其它的微生物蛋白，所述蛋白与本文所述其它TNF受体样受体(例如Fas)中存在的PLAD结构域具有同源性。例如公开了含有与所述Fas PLAD结构域(SEQ ID NO.41-43，56-58)同源的序列的微生物多肽的三个实例。
本文所用的“PLAD的分离的氨基酸序列”是指基本上不含在自然界中通常与所述氨基酸序列相关的天然存在的物质的序列。本发明的多肽可以包括具有PLAD活性的PLAD结构域或其片段的整个氨基酸序列。本发明的多肽或其片段可通过从细胞中分离和纯化所述多肽来获得，其中这些多肽可天然产生或通过表达编码PLAD的外源核酸来产生。PLAD的片段可以通过肽的化学合成、通过PLAD或含有PLAD的多肽的蛋白水解切割以及通过用编码目的部分的核酸合成来获得。所述PLAD可以包括保守性置换，其中天然存在的氨基酸被具有类似性质的氨基酸所置换。这类保守性置换不会改变该多肽的功能。通过产生各种氨基酸置换并且在说明书中所述的结合测定中使用本领域普通技术人员可利用的技术对它们进行测试可以找到能增强结合和有效性的突变。
因此，应该理解的是，如果需要，可以在编码本发明多肽的核酸和/或本发明多肽的氨基酸序列中进行修饰和改变并且仍获得具有类似的或所需的特征的多肽。这类改变可以存在于天然分离物中或者可以利用定点突变来通过合成手段引入，其方法(如错配聚合酶链式反应(PCR))在本领域中是已知的。
例如，多肽中的某些氨基酸可以被其它氨基酸置换，同时没有明显的功能活性损失。因此，应该考虑到可以在所述PLAD的氨基酸序列(或其基础核酸序列)中制造各种改变，同时没有明显的生物效用或活性损失并且这些效用或活性还可能增加。例如，p60 TNFR天然序列中的Q24A突变、D49R突变和K19E突变不会有损PLAD的自缔合。
这些多肽也可以用本领域熟知的许多方法中的任何方法来获得。一种产生多肽的方法是利用蛋白质化学技术来将两种肽或多肽连接起来。例如，可以通过Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学，利用现在可获得的实验室仪器来化学合成肽或多肽(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)。本领域技术人员可以很容易地认识到可以通过标准的化学反应来合成相当于特定蛋白的肽或多肽。例如，可以一种合成肽或多肽并且不将它从其合成树脂上切下来，同时可以合成一种杂合肽的另一片段并随后将它从所述树脂上切下来，从而暴露出该另一个片段上被功能性封闭的末端基团。利用肽缩合反应，可以分别通过这些两片段的羧基和氨基末端的肽键将它们共价连接起来形成较大的多肽(Grant，ASynthetic Peptides：A User Guide，W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1992)和Bodansky and Trost，Ed.，Principles ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag Inc.，N.Y.(1993))。或者，如上所述，可以在体内独立地合成所述肽或多肽。一旦分离，则可以通过类似的肽缩合反应将这些独立的肽或多肽连接起来形成较大的蛋白。
例如，克隆的或合成的肽区段的酶促连接可使得能够将相对短的肽片段连接起来以产生较大的肽片段、多肽或全蛋白结构域(Abrahmsen et al.Biochemistry，30：4151(1991))。或者，可以利用合成肽的天然化学连接来通过合成方法由较短的肽片段构建较大的肽或多肽。该方法由两步化学反应组成(Dawson et al.A Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation，Science，266：776-779(1994))。第一步是无保护的合成肽-％-硫酯与另一种含氨基末端Cys残基的无保护肽区段进行化学选择反应以产生作为初始共价产物的硫酯连接性中间产物。在不改变反应条件的情况下，该中间产物经历了自发的快速分子内反应从而在连接位置形成天然肽键。这种天然化学连接方法在蛋白分子全合成过程中的应用可通过人白细胞介素8(IL-8)的制备来说明(Clark-Lewis et al.FEBS Lett.，307：97(1987)，Clark-Lewis et al.J.Biol.Chem.，269：16075(1994)，Clark-Lewis et al.Biochemistry，30：3128(1991)，和Rajarathnam et al.Biochemistry，29：1689(1994))。
或者，无保护的肽区段可以是化学连接的，其中由于化学连接而在所述肽区段之间形成的键是非天然键(非肽键)(Schnolzer et al.Science，256：221(1992))。这种技术已经被用来合成蛋白结构域的类似物以及大量具有完全生物活性的相对较纯的蛋白(deLisle Milton et al.ATechniques inProtein Chemistry IV，Academic Press，New York，pp.257-267(1992))。
本发明还提供了用于所公开多肽的肽模拟物。“肽模拟物”被定义为包括化合物或有机分子或任何其它肽模拟物，其结构是基于或衍生自蛋白的结合区域。例如，人们可以建立预测化学结构的模型以模拟结合区域(如PLAD)的结构，。可以使用标准方法来进行这种建模。或者，也可以以和所述肽大致相同的方式来从组合化学文库中选择肽模拟物(Ostresh，J.M.et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1994 Nov 8；91(23)：11138-42；Dorner，B.et al.，BioorgMed Chem 1996 May；4(5)：709-15；Eichler，J.et al.，Med Res Rev 1995Nov；15(6)：481-96；Blondelle，S.E.et al.Biochem J 1996 Jan 1；313(Pt1)：141-7；Perez-Paya，E.et al.，J Biol Chem 1996 Feb23；271(8)：4120-6)。也可以利用功能测定来选择肽模拟物。
本发明的多肽可与另一部分例如核酸、蛋白、肽、配体、糖部分、病毒蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体或脂质体相连接。此外，也可以将两个或多个含PLAD的多肽彼此相连接。例如，可以制备含有两个或多个不同PLAD的双功能或多功能多肽以使得所述多肽能够调节多种TNF受体样受体的活性。所述多肽也可以含有两个或多个源自相同TNF受体样受体的PLAD以增加这种多肽对特定TNF受体样受体的亲合力。
含PLAD的融合构建体
本文公开了含PLAD的融合蛋白和编码它们的核酸。所述融合蛋白可以包括本文所公开的连接了融合标签的TNF受体样受体PLAD。所述功能分子可以是抗体或其靶向部分或其它融合标签。由于PLAD是在细胞表面上的，所以所述含PLAD的融合蛋白可以包括将PLAD靶向于表达PLAD的细胞的细胞表面的组成部分。例如，非TNF受体样标志物的配体的标志物结合部分可以与PLAD融合，所述标志物位于指定的靶细胞的表面。所述PLAD可以与各种载体蛋白例如免疫球蛋白或其它血清、可溶的和/或稳定的蛋白融合。所述融合标签可以是GST或其它有助于所述融合蛋白纯化的分子。含PLAD的融合蛋白可以包括有助于重组表达的PLAD分泌的信号序列。
也可以将编码包括PLAD或由PLAD组成的多肽的核酸与其它核酸功能性地连接以编码免疫粘合素。对本发明来说，术语“免疫粘合素”被定义为包括任何由核酸编码的多肽，其中编码非免疫球蛋白分子(例如PLAD)的核酸的至少一部分与编码免疫球蛋白重链多肽(例如IgG)的核酸的至少一部分偶联。IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgE的Fc区也可被用来构建免疫粘合素。在一个具体的实例中，所述融合蛋白包括与Ig Fc区部分--特别是Ig γ4的Fc区部分--融合的PLAD，。所述偶联是通过一种确保所述核酸片段能进行功能性转录和翻译并提供从其中分别获得的信息的方式来实现的。
可以通过在各种哺乳动物宿主细胞以及杆状病毒感染的细胞中的瞬时或稳定转染来表达PLAD多肽融合蛋白。所表达的融合蛋白可以根据标准方法来纯化。与抗体类似，IgG免疫粘合素可以通过一步蛋白A或蛋白G亲和色谱从被分泌了该免疫粘合素的培养基中纯化出来。
转基因
提供了编码PLAD的转基因。“转基因”是指被被人为地插入到细胞中并成为该细胞及其子代细胞基因组的一部分的核酸序列。对于所述细胞来说，该转基因可以是(但不一定是)部分或完全异源的(例如，来自不同的物种)。术语“转基因”宽泛地指被导入到动物基因组中的任何核酸，包括但不限于含有通常可能不存在于所述基因组中的序列的基因或DNA、在给定基因组中存在但通常不会被转录和翻译(表达)的基因或者人们希望导入到所述基因组中的任何其它基因或DNA。这可包括可能通常存在于非转基因基因组中但是人们希望改变其表达或者是人们希望以改变或变体形式导入的基因。转基因可以包括一种或多种转录调控序列和可能是所选定的核酸的最佳表达所需的任何其它核酸，例如内含子。转基因可以只有两个核苷酸长，但是优选地至少约50、100、150、200、250、300、350、400或500个核苷酸长或甚至更长。转基因可以是编码或非编码序列或者其组合。转基因通常包括能够在适当条件下促使一种或多种转基因表达的调控元件。
抗体
本发明还提供了与TNF受体样受体的PLAD特异性结合的抗体。例如，本发明的抗体可以是与TNF受体的PLAD特异性结合的抗体、与FAS的PLAD特异性结合的抗体或与DR4的PLAD特异性结合的抗体，仅举这些为例。所述抗体(多克隆或单克隆)可以是指本文所提供的何所考虑到的任何多肽，天然存在的和重组的多肽及其免疫源片段。所述抗体可被用于例如诊断、治疗或疫苗接种等技术或方法中。也考虑到了抗-个体基因型抗体和亲和力成熟抗体。
可以通过许多熟知的方法来制备抗体(例如，参见Harlow and Lane，″Antibodies；A Laboratory Manual″Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，(1988))。简言之，以足以引出免疫应答的量和间隔将纯化的抗原注射到动物体内。抗体可以是直接纯化的或者脾细胞可以是从动物体内获得的。然后可以将所述细胞与无限增殖细胞系融合并且筛选抗体分泌。所述抗体可用来筛选可分泌该抗原的细胞的核酸克隆文库。然后对这些阳性克隆进行测序(例如，参见Kelly et al.Bio/Technology，10：163-167(1992)；Bebbington et al.Bio/Technology，10：169-175(1992))。本发明也考虑了人源化抗体和嵌合抗体。可以通过熟知的方法来制备异源抗体(例如，参见美国专利5545806、5569825、5625126、5633425、5661016、5770429、5789650和5814318)。
术语与多肽“特异性结合”是指可确定在一群异源蛋白和其他生物制品中是否存在所述蛋白的一种结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，与特定蛋白结合的特定抗体不与样品中的其它蛋白以显著量结合。在这类条件下，与抗体的选择性结合可能会需要根据它对特定蛋白的特异性而被选出的抗体。可以使用各种免疫测定形式来选择会与特定蛋白选择性结合的抗体。例如，通常使用固相ELISA免疫测定法来选择可选择性地与蛋白进行免疫反应的抗体。关于可被用来确定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述请参见Harlow and Lane″Antibodies，A Laboratory Manual″Cold Spring HarborPublications，New York，(1988)。
核酸
本发明还提供了编码最长达125个氨基酸的多肽的核酸，所述多肽含有TNF受体样受体的PLAD；以及提供了编码由TNF受体样受体PLAD组成的多肽的核酸。
本发明还提供了编码最长达125个氨基酸的多肽的核酸，所述多肽含有分离的PLAD，其中所述多肽含有子序列R1-PLAD-R2，其中R1和R2是任选的，并且当存在时，它们可以是H、酰基、NH2、氨基酸和肽。
本发明进一步提供了编码这样一种多肽的核酸，所述多肽含有TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列，其中所述多肽为R1-TNF受体样受体PLAD-R2，其中R1或R2包括不位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD侧面的氨基酸序列。
本文所用术语“核酸”是指可以是DNA或RNA或其任何组合的单链或多链分子，包括对这些核酸的修饰。所述核酸可以代表编码链或其互补链或其任何组合。核酸的序列可以与本文所讨论的任何新基因的天然存在序列相同或者可以包括编码与天然存在序列中发现的氨基酸一样的氨基酸的备选密码子。也可以对这些核酸的典型结构进行修饰。这些修饰包括但不限于甲基化核酸、将磷酸残基上的未桥接氧用硫(产生硫代磷酸脱氧核苷酸)、硒(产生硒代磷酸(phosphorselenoate)脱氧核苷酸)或甲基基团(产生甲基膦酸脱氧核苷酸)来取代。
可以从通常存在编码PLAD的核酸分子的生物体中将其分离。例如，可以构建基因组DNA或cDNA文库并筛选目的核酸是否存在。构建和筛选这类文库的方法是本领域中已知的，用于进行所述构建和筛选步骤的试剂盒是市售的(例如，Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)。一旦分离，就可以将所述核酸直接克隆到适当的载体中，或者如果需要的话，可以对其进行修饰以帮助后续的克隆步骤。这些修饰步骤是常规的，一个实例是在所述核酸末端加入含有限制性位点的寡核苷酸接头。Sambrook et al.，″MolecularCloning，a Laboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中阐述了一般的方法。本发明也考虑了编码PLAD的不含配体结合位点的核酸。
一旦获得了所需的PLAD的核酸序列，就可以利用本领域中已知的技术在任何具体的氨基酸位置对编码特定氨基酸的序列进行修饰或改变。例如，可以设计跨越所述一个或多个氨基酸位置的以及任何氨基酸可被另一种氨基酸置换的PCR引物。然后可以扩增核酸并将其插入到野生型PLAD编码序列中以获得在所述PLAD的任何位置上的氨基酸的许多可能组合的任一种。或者，本领域技术人员可以通过点突变技术在特定核酸序列中的任何位点引入特定的突变。Smith，M.″In vitro mutagenesis″Ann.Rev.Gen.，19：423-462(1985)和Zoller，M.J.″New molecular biology methods for protein engineering″Curr.Opin.Struct.Biol.，1：605-610(1991)中阐述了一般的方法。这些技术可被用来改变编码序列而不改变所编码的氨基酸序列。
一种获得编码PLAD的DNA分子的方法的另一个实例是合成编码所述PLAD的重组DNA分子。例如，寡肽合成方法在是本领域中常规的，用于编码特定蛋白区域的寡核苷酸是很容易通过自动DNA合成来获得的。可以合成双链分子一条链的核酸并且使其与它的互补链杂交。人们可以设计这些寡核苷酸使得所得的双链分子具有内部限制性位点或在末端含有适当的5’或3’突出端以克隆到适当的载体内。通过下述方法可以很容易地合成编码相对较大的蛋白的双链分子：首先构建几种不同的编码所述蛋白特定区域的双链分子，之后将这些DNA分子连接在一起。例如，Cunningham，et al.，″Receptor andAntibody Epitopes in Human Growth Hormone Identified byHomolog-Scanning Mutagenesis，″Science，243：1330-1336(1989)已经通过首先构建重叠和互补的合成寡核苷酸并将这些片段连接起来从而构建了编码人生长激素基因的合成基因。也可参见Ferretti，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.82：599-603(1986)，其中公开了用合成的寡核苷酸来合成1057个碱基对的合成的牛视紫红质基因。通过以这种方式构建PLAD，本领域技术人员可以很容易地获得任何特定的PLAD，所述PLAD在PLAD内的任何一个或多个特定位置上具有所需氨基酸。也参见美国专利5,503,995，所述专利描述了一种制备合成基因的酶模板反应方法。这类技术在本领域中是常规的并且是有详尽记录的。然后可以按照下文所述在体内或体外表达这些核酸或编码PLAD的核酸片段。
本发明还提供了编码PLAD的分离的核酸，所述核酸位于适合于表达它的载体中。一旦对编码特定的目的PLAD的核酸或该核酸的一个区域进行构建、修饰或分离后，就可以将该核酸克隆到适当的载体中，所述载体可以指导该野生型和/或修饰后PLAD的体内或体外合成。考虑到了所述载体应具有指导和调控插入基因或核酸转录所需的功能元件。这些功能元件包括但不限于启动子、所述启动子的上下游区域例如可能会调控所述启动子转录活性的增强子、复制起点、有助于所述启动子附近的插入片段克隆的适当的限制性位点、抗生素抗性基因或能用来筛选含有所述载体或所述的含插入片段的载体的细胞的其它标记、RNA剪接点、转录终止区或者能用来帮助所述插入基因或杂合基因表达的任何其它区(通常参见Sambrook et al.)。
已有许多本领域普通技术人员已知的用于表达所述核酸插入片段的E.coli(大肠埃希氏菌(Escherichia coli))表达载体。其它适合使用的微生物宿主包括杆菌例如枯草杆菌(Bacillus Substilis)，以及其它肠杆菌(Bacillus)例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)种。在这些原核宿主中，人们也可以制备表达载体，所述表达载体通常含有与所述宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，应存在任何数量的各种已知启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或λ噬菌体的启动子系统。所述启动子通常会控制表达，任选地具有操纵子序列；并且应含有核糖体结合位点序列，例如用于启动并完成转录和翻译。如果需要的话，可以通过插入5’端Met密码子并符合读框地插入下游核酸插入物来提供氨基末端甲硫氨酸。也可以使用标准的寡核苷酸突变方法来移除核酸插入片段的羧基末端延伸部分。
此外，可以使用酵母表达。酵母表达系统具有多种优势。首先，有证据表明酵母分泌系统产生的蛋白呈现出具有正确的二硫键配对。其次，翻译后糖基化是通过酵母分泌系统来有效地进行的。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的前-原-α因子前导区(由MF″-1基因编码)通常可被用来指导酵母的蛋白分泌(Brake，et al.，Alpha-Factor-Directed Synthesis andSecretion of Mature Foreign Proteins in Saccharomyces cerevisiae.Proc.Nat.Acad.Sci.，81：4642-4646(1984))。前-原-α因子的前导区含有信号肽和原区段，所述原区段包括由KEX2基因编码的酵母蛋白酶的识别序列：这种酶可切割Lys-Arg二肽切割信号序列的羧基侧上的前体蛋白。所述核酸编码序列可以在框内与所述前-原-α因子的前导区融合。然后将这种构建体置于强转录启动子例如乙醇脱氢酶I启动子或糖酵解启动子的控制之下，。所述核酸编码序列之后是翻译终止密码子，所述翻译终止密码子之后是转录终止信号。或者，所述核酸编码序列可以与另一种蛋白编码序列(如Sj26或β-半乳糖苷酶)融合以便于通过亲和色谱来纯化所述融合蛋白。对于用于酵母表达的构建体来说，插入蛋白酶切割位点来分离融合蛋白的各组成部分是可行的。也可以在杆状病毒系统中实现有效的翻译后糖基化和重组蛋白表达。
哺乳动物细胞能在有利于重要的翻译后修饰(例如折叠和半胱氨酸配对)的环境中表达蛋白、加入复杂的糖结构以及分泌活性蛋白。用于在哺乳动物细胞中表达活性蛋白的载体以在强病毒启动子和多腺苷酸化信号之间插入了蛋白编码序列为特征。所述载体可以含有赋予了用于基因扩增的潮霉素抗性、庆大霉素或G418抗性的基因，或者其它适合被用作可筛选标记的基因或表型，或者的甲氨蝶呤抗性基因。使用甲氨蝶呤抗性编码载体可以将所述嵌合蛋白编码序列导入到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中或者使用适合的筛选标记将其导入到其他细胞系中。通过DNA印迹分析可以确证是否在转化的细胞中存在所述载体DNA。通过RNA印迹可以证实产生了对应于插入片段编码序列的RNA。本领域中已经开发了许多其它适合的能够分泌完整的人类蛋白的宿主细胞系，包括CHO细胞系、Hela细胞、骨髓瘤细胞系、Jurkat细胞等。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子、增强子和必需的信息加工位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。优选的表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。通过已知的方法可以将含有目的核酸区段的载体转移到宿主细胞中，这些方法会根据细胞宿主的类型变化。例如，氯化钙转化通常被用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或脂质转染试剂(lipofectin)介导的转染或电穿孔可被用于其它真核细胞宿主。
可采用用于在哺乳动物细胞中表达基因或核酸的备选载体，那些载体与被开发用来表达人γ-干扰素、组织纤溶酶原激活因子、凝血因子VIII、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶Nexinl和嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白的载体类似。此外，所述载体可以包括可以用于在哺乳动物细胞(如COS-7)中表达插入核酸的CMV启动子序列和多腺苷酸化信号。
昆虫细胞也能表达哺乳动物蛋白。在含有杆状病毒载体的昆虫细胞中生产的重组蛋白可经过类似于野生型蛋白的翻译后修饰。简言之，用于在昆虫细胞中表达活性蛋白的杆状病毒载体以插入了苜蓿银纹夜蛾(Autographicacalifornica)核型多角体病毒(AcNPV)启动子下游的蛋白编码序列为特征，所述启动子是针对编码主要的包涵体蛋白--多角体蛋白的基因的。用病毒DNA和质粒DNA的混合物转染所培养的昆虫细胞例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞系并且对所述病毒子代进行平板培养。多角体蛋白基因的缺失或插入失活会导致产生包涵体阴性病毒，所述病毒会形成与野生型包涵体阳性病毒明显不同的蚀斑。这些特征性蚀斑形态允许可视地筛选AcNPV基因已经被选定的杂合基因所取代的重组病毒。
本发明还提供了含有预期核酸的载体，所述载体位于适合于表达所述核酸的宿主中。通过已知的方法可以将含有目的核酸区段的载体转移到宿主细胞中，这些方法会根据细胞宿主的类型变化。例如，氯化钙转化、转导和电穿孔通常被用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或脂质转染试剂(lipofectin)介导的转染或电穿孔可被用于其它细胞宿主。
或者，本发明的核酸可以与一个或多个指导和调控插入核酸转录的功能元件可操作地连接，且所述核酸可被表达。例如，核酸可以与细菌或噬菌体启动子可操作地连接并且被用来指导所述核酸的体外转录。一个进一步的实例包括在偶联的转录-翻译系统中使用本文提供的核酸，其中所述核酸指导转录且由此产生的RNA会被用作翻译的模板以生产多肽。本领域技术人员应理解这些反应的产物可以被用在许多用途(例如使用标记RNA作为探针和使用多肽来产生抗体)中或用在将所述多肽给予至细胞或受试者的方法中。
结合载体进行的核酸表达可以是在体内或在体外的。体内合成包括转化可以用作所述载体的宿主细胞的原核或真核细胞。或者，所述核酸的表达可以存在于体外表达系统中。例如，通常被用来合成相对较大量的mRNA的体外转录系统是市售的。在这类体外转录系统中，编码PLAD的核酸可被克隆到表达载体中并邻近转录启动子。例如，所述Bluescript II克隆载体和表达载体含有侧面为强原核转录启动子的多个克隆位点(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)。包含所有用于在体外根据DNA模板合成RNA的所需试剂(如Bluescript载体)的试剂盒是可以获得的(Stratagene Cloning Systems，LaJolla，CA)。然后在体外通过这种系统产生的RNA可以在体外翻译产生所需的PLAD多肽(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)。
基因治疗方法
通过基因治疗方法可以给予编码含有PLAD或由PLAD组成的多肽的核酸。编码本发明的多肽的核酸可被置于载体中并且在体内或离体条件下通过标准方法将其送递到受试者的细胞中。
本发明的核酸编码多肽可以被功能性地连接到可特异地用于该多肽分泌的特异性前导肽上。例如所述肽可以具有信号序列，例如鼠Ig-λ信号序列(Blezinger et al.Nat.Biotechnol.17：343-8，1999)、大鼠胰岛素前导序列(Fakhral et al.J.Immunother.20：437-8，1997)、FGF-4信号序列(Ueno et al.Aterioscler.Thromb.Vasc.Biol.，17：2453-2460，1997)、人生长激素信号肽(Rade et al.Gene Ther.6：385-92，1999)、β内酰胺酶信号序列(Hughes et al.Hum.Gene Ther.5：1445-55，1994)、牛促乳素信号序列(Gorman et al.Bran Res.Mol.Brain Res.44：143-146，1997)和其它类似的信号序列。
对于体内给药，所述细胞可以是在受试者体内的且所述核酸可以通过可药用载体来给予。受试者可以是任何需要在细胞中选择性表达核酸的动物。在一个优选的实施方案中，本发明的动物是人。此外，可以通过本发明的方法来治疗的非人类动物可包括但不限于猫、狗、鸟、马、奶牛、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠、沙鼠和兔以及任何其它可以按照本文所述方法在细胞中选择性表达核酸的动物。
在上述包括在受试者细胞中引入外源DNA的方法中(即基因转导或转染)，本发明的核酸可以是裸露DNA形式或者所述核酸可以位于用来将所述核酸送送递到细胞以便在细胞内表达该核酸的载体中。所述载体可以是市售的制品，例如腺病毒载体(Quantum Biotechnologies，Inc.(Laval，Quebec，Canada))。可以通过各种机制将所述核酸或载体送递到细胞中。作为一个实例，可以通过脂质体来进行送递，使用市售的脂质体制品例如
Figure A20068002984100321
Figure A20068002984100322
(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，MD)、
Figure A20068002984100323
(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和(Promega Biotec，Inc.，Madison，WI)，以及其它按照本领域的标准方法开发的脂质体。此外，可以通过电穿孔以及Sonoporation仪器(ImaRx Pharmaceutical Corp.，Tucson，AZ)在体内送递本发明的核酸和载体，用于电穿孔的技术可以从Genetronics，Inc.(SanDiego，CA)获得。
作为一个实例，可以通过病毒系统来进行载体送递，例如可以包装重组体逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统。然后所述重组体逆转录病毒可被用来进行感染从而将核酸送递到被感染的细胞中。将所述核酸导入哺乳动物细胞中的确切方法为，当然不限于使用逆转录病毒载体。其它可以被广泛地用于该过程的技术包括使用腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、慢病毒载体、假型逆转录病毒载体和痘病毒载体，例如痘苗病毒载体。也可以使用物理转导技术，例如脂质体送递机制、受体介导的机制以及其它胞吞机制。本发明可以与任何的这些或其它通常使用的基因转移方法一起使用。
本发明的核酸和核酸送递运载体(例如病毒；脂质体、质粒、载体)可以位于可药用载体中以用于在体内给予至受试者。“可药用”是指不会在生物学上或其他方面具有不良作用的物质，即可以将所述物质与所述核酸或运载体一同给予受试者，同时不会引起任何不良的生物学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。应当然地选择可使活性成分的任何降解降到最低并且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体，这是本领域技术人员所熟知的。
所述核酸或运载体可以以下述方式给药：口服、肠胃外(例如静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、经皮肤、体外、局部等。所需要的核酸或载体的确切量会随受试者的不同而变化，这取决于受试者的物种、年龄、体重和总体状况、进行治疗的任何病症的严重度或机理、所用的具体核酸或运载体、其给药模式等。
PLAD自缔合抑制剂
本发明进一步提供了一种包括PLAD自缔合抑制剂或TNF样受体寡聚抑制剂的组合物。“抑制剂”被定义为一种可与PLAD结合的化合物或一种可与靶标的PLAD结合并且阻止PLAD活性的化合物(包括抗体)。一旦与PLAD结合，所述抑制剂可以中断或防止PLAD自缔合，因此抑制TNF受体样受体的寡聚化。TNF样受体寡聚化抑制剂可以是PLAD特异性结合的抗体(多克隆或单克隆)、与PLAD结合的配体、与PLAD结合的多肽、与PLAD或基于PLAD的肽模拟物结合的化合物。例如，包括PLAD或由PLAD组成的多肽可以与天然存在的TNF受体样受体的PLAD缔合，因此防止或抑制该TNF受体样受体与其它天然存在的TNF受体样受体自缔合。所述包括PLAD或由PLAD组成的多肽可以是可溶性PLAD。也考虑了抗个体基因型抗体和亲和力成熟抗体。其它抑制剂包括但不限于设计用于阻断PLAD自缔合的分子或化合物。所述抑制剂可以是抑制PLAD自缔合的全蛋白或蛋白片段，因此防止了TNF受体样受体的寡聚化。所述抑制剂可以是根据本文所述方法鉴定的有机分子。TNF受体及它们的寡聚复合体的晶体结构可被用来设计可中断PLAD自缔合的分子。也可以分析所述晶体结构以设计可模拟PLAD并且中断PLAD自缔合的分子。
因此，提供了一种制备小分子抑制剂的方法，通过该方法生产该抑制剂。提供了干扰TNFR装配和TNF结合的小分子(SM)和PLAD-肽衍生物。根据TNFR1蛋白二聚体的晶体结构，进行了PLAD缔合结合表面搜索。结合了保守同源性检索的上述搜索以及基于本文PLAD突变的数据使得可以鉴定一些潜在的链间缔合位点。例如，如PLAD二聚体结构所示(图23)，每条肽链第34位的两个组氨酸环似乎在链间袋中彼此呈镜像固定互相镜锁(mirror-lock)。由于组氨酸残基的咪唑是中断PLAD自缔合的良好候选物，所以咪唑和咪唑衍生物可以是有效的受体特异性阻断物并且可被用于治疗TNF介导的疾病。
本文公开了可干扰TNFR装配和TNF结合的化合物。一般来说，适合的抑制剂是那些可进入所述PLAD二聚结构的链间袋并且会干扰位于第34位的两个组氨酸环之间的相互作用的化合物。从这个意义上讲，不优选含有较大取代基的抑制剂，所述取代基会妨碍进入到所述链间袋中或阻止第34位的两个组氨酸之间相互作用的中断。相反，优选含有具有以下性质的取代基的抑制剂，所述取代基使得进入所述链间袋很容易并且可促进插入和随后第34位的两个组氨酸之间的相互作用的中断。此外，甚至更优选含有具有以下性质的取代基的抑制剂，所述取代基相对于所述链间袋中的其它残基具有更高的亲和力，因此可促进和/或增强PLAD二聚结构中抑制剂的结合。本领域技术人员可以用电脑分析假定的抑制剂以评估某些取代基是否会增强或妨碍与所述PLAD二聚结构的结合。
本文所用的术语“被取代的”应该被认为包括所有允许的有机化合物取代基。在一个广义方面中，所述允许的取代基包括非环状的和环状的、支链的和非支链的、碳环的和杂环的以及芳香的和非芳香的有机化合物取代基。示例性的取代基包括例如下文所述的取代基。对于合适的有机化合物来说，所述允许的取代基可以是一个或多个并且可相同或不同的。对于本公开来说，所述杂原子(如氮)可以具有氢取代基和/或本文所述有机化合物的任何允许的取代基，所述取代基满足杂原子的配价。本公开不意欲受到所述允许的有机化合物取代基的任何方式的限制。术语“取代”或“用...取代”也包括隐含的条件，即这种取代应依照被取代原子和取代基的许可配价且所述取代产生的是稳定的化合物，例如不会自发地经历转化的化合物，所述转化例如重排、环化、消除等。
本文中“A1”、“A2”、“A3”和“A4”被用作通用符号以代表各具体的取代基。这些符号可以是任何取代基，不限于本文所公开的那些，并且当在一种情况下它们被限定为某些取代基时，在另一种情况下它们可以被定义为某些其它的取代基。
本文所用术语“烷基”为1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。所述烷基也可以是被取代的或未被取代的。可以用一种或多种基团来取代所述烷基，所述基团包括但不限于如下所述的烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代(sulfo-oxo)、磺酰基、砜、亚砜或巯基。
在本说明书中，“烷基”一般用来指未被取代的烷基基团和被取代的烷基基团；但是，本文中也可以通过鉴定烷基基团上的一个或多个特定取代基来特指所述被取代的烷基基团。例如，术语“卤代烷基”特指用一个或多个卤化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基基团。如下所述，术语“烷氧基烷基”特指用一个或多个烷氧基基团取代的烷基基团。如下所述，术语“烷氨基”特指用一个或多个氨基基团取代的烷基基团等等。当在一种情况下使用“烷基”而在另一种情况下使用特定的术语如“烷基醇”时，并非意在暗示术语“烷基”并不会也指特定的术语例如“烷基醇”等。
该实践也可被用于本文所述的其它基团。即，当术语如“环烷基”是指未被取代的和被取代的环烷基部分时，该取代的部分还可被特别地指明；例如一种具体的被取代的环烷基可以被称为，例如“烷基环烷基”。类似地，一种被取代的烷氧基可以被特异性地称为，例如“卤代烷氧基”、一种具体的被取代的烯基可以是，例如：“烯基醇”等。同样，使用上位术语例如“环烷基”和下位术语例如“烷基环烷基”的实践也并非意在暗示该上位术语不包括该下位术语。
本文所用术语“烷氧基”是通过单独的末端醚键结合的烷基；即，“烷氧基”基团可以被定义为-OA1，其中A1是如上所述的烷基。
本文所用术语烷氧基烷基是含有烷氧基取代基并且可被定义为-A1-O-A2的烷基基团，其中A1和A2为烷基基团。
本文所用术语“烯基”为结构式中至少含有一个碳-碳双键的具有2至24个碳原子的烃基。不对称结构(如(A1A2)C＝C(A3A4))意在包括E和Z型异构体。这一点可以根据本文的结构式来推测，其中存在不对称烯，或者可以通过键符号C＝C来明确地标明。所述烯基可以被一个或多个基团所取代，所述基团包括但不限于如下文所述的烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基。
本文所用术语“炔基”为结构式中至少含有一个碳-碳三键的具有2至24个碳原子的烃基。所述炔基基团可以被一个或多个基团所取代，所述基团包括但不限于如下所述的烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基。
本文所用术语“芳基”为含有任何基于碳的芳族基团的基团，所述芳族基团包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯氧基苯等。术语“芳基”也包括“杂芳基”，所述杂芳基被定义为含有芳族基团并且至少具有一个掺入所述芳族基团环内的杂原子的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、硫和磷。同样，术语“非杂芳基”也被包括在术语“芳基”内，它的定义为含有不含杂原子的芳族基团的基团。所述芳基基团可以是被取代的或未被取代的。所述芳基基团可以被一种或多种基团所取代，所述基团包括但不限于如本文所述的烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤代物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基。术语“联芳基”是一种特定类型的芳基基团并且被包括在芳基的定义中。联芳基是指通过稠环结构结合在一起的两个芳基基团(如在萘中)或者是通过一个或多个碳-碳键连接的两个芳基基团(如在联苯基中)。
本文所用术语“环烷基”是由至少三个碳原子构成的非芳族碳环。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“杂环烷基”为其中至少一个环上碳原子被杂原子取代的如上所述环烷基基团，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。所述环烷基和杂环烷基基团可以是被取代的或未被取代的。所述环烷基和杂环烷基基团可以被一个或多个基团所取代，所述基团包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基。
本文所用术语“环烯基”是由至少三个碳原子构成并且含有至少一个双键(即C＝C)的非芳族碳环。环烯基的实例包括但不限于环丙稀基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。术语“杂环烯基”为一类如上文所定义的环烯基基团并且被包括在术语“环烯基”的含义中，其中所述环的至少一个碳原子被杂原子取代，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷。所述环烯基基团和杂环烯基基团可以是被取代的或未被取代的。所述环烯基基团和杂环烯基基团可以被一个或多个基团所取代，所述基团包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基。
本文所用术语“环状基团”是指芳基基团、非芳基基团(即环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基基团)或两者。环状基团具有一个或多个被取代的或未被取代的环系统。环状基团可以含有一个或多个芳基基团、一个或多个非芳基基团或者一个或多个芳基基团和一个或多个非芳基基团。
本文所用术语“醛”可用式-C(O)H来表示。在本说明书通篇中，“C(O)”是C＝O的缩写符号。
本文所用术语“胺”或“氨基”可用式NA1A2A3来表示，其中A1、A2和A3可以独立地为如上所述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“羧酸”可用式-C(O)OH来表示。本文所用“羧酸根”可用式-C(O)O-来表示。
本文所用术语“酯”可用式-OC(O)A1或-C(O)OA1来表示，其中A1可以是如上所述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“醚”可用式A1OA2来表示，其中A1和A2可以独立地为如上所述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“酮”可用式A1C(O)A2来表示，其中A1和A2可以独立地为如上所述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“卤化物”是指卤素氟、氯、溴和碘。
本文所用术语“羟基”可用式-OH来表示。
本文所用术语“氮”可用式-NO2来表示。
本文所用术语“甲硅烷基”可用式-SiA1A2A3来表示，其中A1、A2和A3可以独立地为如上所述的氢、烷基、卤代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“硫代氧代”可用式-S(O)A1、-S(O)2A1、-OS(O)2A1或-OS(O)2OA1来表示，其中A1可为如上所述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。在本说明书通篇中，“S(O)”是S＝O的缩写符号。
本文所用术语“磺酰基”是指可用式-S(O)2A1来表示的硫代氧代基团，其中A1可以是如上所述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“磺酰氨基”或“氨磺酰基”可用式-S(O)2NH-来表示。
本文所用术语“砜”可用式A1S(O)2A2来表示，其中A1和A2可以独立地为如上所述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“亚砜”可用式A1S(O)A2来表示，其中A1和A2可以独立地为如上所述的烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环烷基或杂环烯基基团。
本文所用术语“巯基”可用式-SH来表示。
本文所用的“R1”、“R2”“R3”、“Rn”、(其中n为整数)可以独立地具有一个或多个上述基团。例如，如果R1为直链烷基基团，那么所述烷基基团的一个氢原子任选地可以被羟基基团、烷氧基基团、烷基基团、卤化物等所取代。根据所选的基团，可以将一个第一基团掺入到第二基团中或者可以将所述第一基团悬吊(即连接)到所述第二基团上。例如，对于短语“含氨基基团的烷基基团”，所述氨基基团可以被掺入到烷基基团的骨架上。或者，所述氨基基团可被连接到所述烷基基团的骨架上。所选基团的性质将会决定所述第一基团是被嵌入还是被连接到所述第二基团上。
除非另作说明，含有的化学键仅以实线而未以楔形或虚线示出的化学式考虑了每种可能的异构体，，例如每种对映异构体和非对映异构体以及异构体的混合物，如外消旋或非消旋手性(scalemic)混合物。
提供了一种通过给予有效量的咪唑或咪唑衍生物来抑制配体与TNF受体样受体结合的方法。
本文所考虑到的抑制剂的实例通常为5元含氮杂环，所述杂环通过各种取代基来起作用。这类抑制剂的实例在下文中示出，并且一般通过未被取代的基本杂环结构的名称来确定(即，其中Rn为H)。
咪唑        吡唑        噁唑        噻唑
Figure A20068002984100392
1，2，3-三唑        1，2，4-三唑        吡咯
Figure A20068002984100393
异噁唑              异噻唑
在具有上述结构的抑制剂的许多实例中，R1、R2、R3、R4和R5若存在，则独立地为H、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、硫代氧代、磺酰基、砜、亚砜或巯基。在具体的实例中，R1-5独立地为C1-C6烷基、C1-C6烷氧基烷基或C1-C6烷氧基基团。示例性C1-C6烷基基团和C1-C4烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、2-乙基丁基、2-甲基戊基等。对应的C1-C6烷氧基含有与氧原子键合的上述C1-C6烷基，所述氧原子也与所述阳离子环键合。烷氧基烷基基团含有与烷基键合的醚基并且最多总共含有六个碳原子。应该注意到有两种异构的1，2，3-三唑。
本发明也考虑到了靶向TNF受体样受体的其它区域，使得与该区域一旦结合后，所述受体中PLAD的构象就会被破坏，从而阻止它与另一个PLAD缔合。例如，本领域技术人员可以靶向p60TNFR的CRD3，使得p60 TNFR的CRD3区一旦被结合，所述受体的构象就会被改变，从而防止p60 TNFR的PLAD与另一个PLAD缔合。
因此，本发明还提供了一种通过给予有效量的TNF受体样受体寡聚化抑制剂来抑制细胞中TNF受体样受体寡聚化的方法。
本发明也考虑到了通过增强PLAD自缔合来增强TNF受体样受体的作用。例如，存在需要增强TNFR信号传导的情况。在这类情况下，PLAD自缔合激动剂可被用来将由于弱PLAD相互作用而对TNFR作用具有抗性的细胞转化成对TNFR作用敏感的细胞，所述激动剂例如某些可与PLAD结合并且具有增强PLAD自缔合的特定性质的抗体或分子。这类增强的PLAD自缔合可以提高配体结合以及信号传导。需要这类增强的PLAD相互作用的疾病状态的实例包括但不限于自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)和高IgM综合征。
本发明还提供了利用PLAD作为靶向部分来将生物试剂送递到细胞中。例如，与毒素相连的PLAD可被送递到细胞中，使得与TNF-R上的天然存在的PLAD一结合，寡聚化就受到抑制，并且所述天然存在的TNF-R一内化，与毒素连接的PLAD就会被内化，从而将所述毒素送递到细胞中。
本文通篇所用的“TNF受体样受体”是指TNF受体超家族的任何成员，包括但不限于TNF-R、p60(也称为p55和TNFR1)、p80(也称为p75、TNFR2)、Fas(CD95/APO-1)、TRAIL受体、LTβR、CD40、CD30、CD27、HVEM、OX40、DR4、TROY、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4-1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2(参见表1)。根据表1中给出的GenBank登记号而列出的核苷酸序列、多肽序列以及任何信息(例如信号序列和成熟蛋白残基数)的全部内容通过引用的方式纳入本说明书。
如先前所述，TNF受体样受体寡聚的抑制剂包括与PLAD特异性结合的抗体、配体、肽模拟物、化合物和多肽。这些多肽包括含有PLAD或由分离的(例如可溶的)PLAD组成的多肽。
本发明还提供了一种通过给予有效量的TNF受体样受体寡聚化抑制剂来抑制配体与TNF受体样受体结合的方法。例如，通过给予一种抑制剂(如包括TNFR-PLAD或由TNFR-PLAD组成的多肽)，可以抑制TNF受体寡聚化，从而防止TNF-α与TNF受体结合并且减小TNF-α的有害作用。类似地，给予含有CD40受体-PLAD(CD40R-PLAD)的多肽可抑制CD40R寡聚化，从而防止CD40配体与CD40R结合并且减小CD40R对病情(如同种异体移植物排斥、类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮)的有害作用。抑制配体与TNF受体样受体结合会导致抑制借助于TNF受体样受体的信号转导，从而提供了一种调节借助于TNF受体样受体的信号传导的方法。此外，本发明已经证实TNF受体样受体通过同型缔合来结合配体和传导信号，即TNFR-PLAD与TNFR-PLAD相互作用；Fas-PLAD与Fas-PLAD相互作用；CD40-PLAD与CD40-PLAD相互作用等。因此，利用PLAD自缔合来干扰肽和肽模拟物的治疗可以确保受体特异性治疗，因为本发明证明了每种受体仅会通过所述PLAD与其自身缔合。例如干扰TNF-R1功能而不影响TNF-R2优于现在的非选择性治疗。类似地，特异性干扰特定的TNF受体样受体功能而不影响其它TNF受体样受体功能是非常理想的，并且可由本文教导提供。
蛋白治疗方法
本发明还提供了一种通过给予有效量的PLAD自缔合抑制剂来治疗受试者体内的炎症的方法。本发明还提供了一种通过给予有效量的PLAD自缔合抑制剂来治疗受试者体内与自身免疫性疾病相关的炎症的方法。这类疾病包括但不限于周期热综合征、脓毒病综合征和成人呼吸窘迫综合征。因此，提供了一种其中所述炎症与脓毒性关节炎有关并且所述抑制剂是TNF受体样受体的可溶性PLAD的方法。
在本发明中，所述受试者可以是任何哺乳动物，优选人，并且可以包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、山羊、猴子、马和猩猩。
本文所用“治疗”描述了患者临床状态的改善。所述改善包括从减轻炎性应答到完全改善炎性疾病。
本文所用“自身免疫性疾病”描述了一种受试者的身体对其自身的身体成分产生了伴有有害作用的功能障碍性免疫应答的疾病状态或综合征，。这可以包括B细胞的产生或者可包括T细胞的产生，所述B细胞会针对所有抗原、变应原或主要组织相容性(MHC)抗原产生特异性抗体，所述T细胞具有可识别自身成分并产生会引起炎症的细胞因子的受体。自身免疫性疾病的实例包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性硬化、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、糖尿病、恶性贫血、自身免疫性胃炎、银屑病、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肿病、结节病、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性卵巢炎、大疱性类天疱疮、天疱疮、多内分泌腺疾病、斯提勒尔氏病、兰伯特-伊顿肌无力综合征、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性葡萄膜炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征和强直性脊柱炎。
由于某些TNFR受体(如HVEA)是病毒受体且这些受体会依赖于寡聚化作用，本发明也考虑到了通过阻止PLAD装配来阻断病毒进入。
所用的最佳剂量应根据所治疗的个体以及所用的抑制剂而变化。抑制剂的量也应根据个体的年龄、身材、体重、状况等而变化。本领域技术人员应认识到执业医师所优化的剂量是最佳的，并且例如，Remington’sPharmaceutical Sciences中描述了用于确定剂量和用药方案以及制备剂型的方法。例如，通过与目前在炎症或自身免疫性疾病的治疗或预防中所用的药剂比较，可以确定适合的剂量和给药方案。
通常，根据所要获得的临床反应可以按0.1至100mg/kg体重的剂量范围来口服给予或肠胃外给予本发明的抑制剂。例如，当所述抑制剂是可溶性PLAD或含PLAD化合物时，可以以0.5至100mg/kg的量来给予所述抑制剂，例如5mg/kg。在一个进一步的实例中，当所述抑制剂是可溶性(分离的)p60PLAD且所述疾病是关节炎(例如脓毒性关节炎)时，可以以每个关节0.5至100mg的剂量来给予所述PLAD。例如，关节内给予剂量为4mg/kg或肠胃外给予16mg/kg的p60 PLAD可有效地治疗脓毒性关节炎。在疾病征候和症状长期缓和或稳定后可以完全停止抑制剂的给药并且在所述疾病征候或症状恶化后或者在免疫状态明显变化后可以再次给药，这可以通过本领域医师所熟知的常规随访免疫研究来确定。
通过评估病史、征候、症状以及客观实验室测试的具体方面来确定所给予的特定剂量的抑制剂在治疗本文所述的炎症或自身免疫性疾病方面的效果，所述客观实验室测试在评估所治疗的特定病症的病理生理活性方面具有证明性用途。这些征候、症状以及客观实验室测试可根据所治疗的具体病症而变化，这是本领域任何医师所熟知的。例如，根据与适当的对照组的比较以及关于所述疾病在一般人群或特定个体中的正常进程的知识，如果1)证明了受试者的复发频率或严重度获得了改善；2)证明了疾病或病症进程得到了稳定；3)减少了使用其它免疫抑制药剂的需求，则可以认为一种特定的治疗是有效的。
一旦证实通过一种特定抑制剂可以显著改善或稳定疾病活动后，就可以依照简化的或不连续的治疗方案来评估特定的征候、症状或实验室测试。根据评估本文所述的特定征候、症状或客观实验室测试的标准方法，如果疾病活动复发，那么可以再次开始治疗。
此外，通过长期评估标准征候、症状和客观实验室测试(本领域技术人员已知的)可以确定所给予的特定剂量的肽配体在预防受试者自身免疫性疾病方面的效果，所述受试者未患有自身免疫性疾病但有发展出自身免疫性疾病的危险。该时间间隔可以很长(即，数年/数十年)。根据目前关于本领域医师和研究人员所熟悉的特定疾病的已知危险因素的知识(如特别强的疾病家族史或者暴露于或获得了可能导致产生自身免疫性疾病的因素或条件)可以确定有发展出自身免疫性疾病风险的患者。
“可药用”是指不会在生物学上或其他方面具有不良作用的物质，即可以将所述物质与所选的化合物一同给予个体，同时不会引起任何不良生物效应或以不良方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。载体的选择取决于给药方法和具体的患者。给药方法可以是口服的、舌下的、粘膜的、吸入的、吸收的或通过注射。也应该注意并非所有的给予本文所述TNF受体样受体寡聚抑制剂的方法都需要可药用载体。
本发明中，可以口服给予或胃肠外给予在用于人受试者的可药用载体中的PLAD自缔合或TNF样寡聚抑制剂。适合用于口服或吸入给药的载体可以包括一种或多种用于人受试者的可药用载体。适合用于口服的载体包括一种或多种也可用作调味剂、润滑剂、助悬剂或保护剂的物质。适合的固态载体包括磷酸钙、碳酸钙、硬脂酸镁、糖、淀粉、明胶、纤维素、羧聚甲烯(carboxypolymethylene)或环糊精。适合的液态载体包括水、不含热原的盐水、可药用油或任何这些的混合物。所述液体也可以含有其它适合的药物添加剂例如缓冲剂、防腐剂、调味剂、粘度或渗透调节剂、稳定剂或助悬剂。适合的液态载体的实例包括含有或不含各种添加剂的水，所述添加剂包括作为ph-调节胶的羧聚乙烯。所述抑制剂可以被包含在肠溶胶囊中，所述肠溶胶囊可将多肽释放肠道中以避免胃内破坏作用。为了经肠胃外给予拮抗剂，用可含添加剂(如油酸乙酯或异丙基肉豆蔻酸酯)的盐水制备无菌溶液或悬液并且可以将其注射到例如皮下或肌内组织中以及静脉内。
筛选方法
一种筛选PLAD缔合抑制剂的方法，包括：a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有包括编码一种分离的PLAD的核酸序列的核酸，另一种质粒含有编码另一种分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与假定的抑制剂接触；并c)测量PLAD的自缔合，其中同未与所述假定抑制剂接触的细胞中的PLAD缔合相比，步骤b)的细胞中PLAD缔合的减少表明了存在PLAD缔合抑制剂。
本筛选方法的一个实例是一种筛选PLAD-缔合抑制剂的方法，包括：a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有的核酸包括编码与荧光供体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列，另一种质粒含有的含有编码与荧光受体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与所述抑制剂接触；并c)测量FRET，其中同未与所述抑制剂接触的细胞中的FRET测量相比，FRET的下降表明存在PLAD缔合抑制剂。
本发明还提供了一种筛选PLAD缔合激动剂的方法，包括：a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有包括编码一种分离的PLAD的核酸序列的核酸，另一种质粒含有编码另一种分离的PLAD的核酸序列；b)将所述细胞与假定激动剂接触；c)测量PLAD的自缔合，其中同未与所述假定激动剂接触的细胞中的PLAD缔合相比，步骤b)的细胞中PLAD缔合的增加表明存在PLAD缔合激动剂。
下面的实例举例说明了使用FRET来测量PLAD缔合。此外，在进行上述筛选方法时，可以使用单个质粒来送递多个编码PLAD的核酸。在包括FRET分析的方法中，可以使用单个质粒来送递多个编码PLAD的核酸，所述PLAD与荧光供体或受体功能性地连接。
本领域技术人员也可以利用酵母双杂交筛选方法来筛选PLAD缔合抑制剂或激动抗剂。也可以通过使用细胞测定法来鉴定PLAD缔合的抑制剂或激动剂，所述细胞测定法可以包括但不限于细胞凋亡诱导、NF-KB诱导、淋巴细胞成熟或活化以及坏死诱导(3、4、8、15、29、33、42、45)。
下述实施例中更加具体地描述了本发明，所述实施例仅意在举例说明，因为其中的许多修改和变化对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1
洗涤H9淋巴瘤细胞并重悬于PBS中。然后在4℃下用100ng/ml的人重组体TNFα(R&D Systems)旋转孵育细胞1小时。然后用2mM交联剂DTSSP(Pierce)处理细胞30分钟并用20mM Tris.Cl[pH 7.5]在冰上终止所述反应15分钟。用加入了蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim)的150mM NaCl、20mM Tris.Cl[pH 7.5]、1mM EDTA、30mM NaF、2mM b-甘油磷酸酯和1mM原钒酸钠裂解细胞。在非还原(不含β-巯基乙醇)或还原(含有280mM β-巯基乙醇)的条件下将等量的溶胞产物电泳并且用特异性抗体分析p60和p80复合体(19)。用Kodak Image Station 440进行光密度分析。
发现p80复合体所示出的分子大小是单元大小的约三倍，符合糖基化和未糖基化三聚体(图1A)。令人惊奇的是，在存在或不存在TNFα的情况下均可有效地捕捉到p80复合体(通过光密度分析测得占链的65-70％，图1A，泳道3和4)。尽管事实是大多数p60存在于高尔基体中并且无法接触到交联剂(7)，无论是否加入TNFα，都有差不多15-20％的p60链被交联成明显的三聚体以及不连续的较高级的复合体(图1A，泳道11和12)。对照实验显示没有可检测的内源TNFα且没有显示出其它蛋白(如p80)与p60复合体交联。蛋白质印迹分析证实溶胞产物中不含TNFα。使用抗-p60抗体的交联复合体的免疫沉淀显示蛋白质印迹中的p60复合体中没有可检测水平的p80。
通过用β-巯基乙醇切割交联剂可将所述复合体分解成单体(图1A，泳道7、8、15和16)。因此，这些结果表明在配体结合前p60和p80链会自缔合。
为验证非配体依赖性自装配的可能性，鉴定了介导这种现象的TNFR的结构域。已经确定当过表达时，p60的胞质死亡结构域可以自缔合并且会触发凋亡(8)。但是，由于所观察的预装配复合体显然是非信号传导性的，所以人们假设所述装配域存在于胞质区外。人们发现在酵母双杂交相互作用测定中，p60和p80的ECD的N末端区可以特异性地自缔合(9)。
通过聚合酶链式反应(PCR)可以产生p60、p80、HVEM、DR4和CD40的各种截短形式和突变形式并且将它们测序。简言之，扩增p80的前导序列和前10个氨基酸残基使得可以在3’端包括HA表位标签以在受体的N-末端产生HA标签。用BamH I和EcoR I消化所述PCR产物并将其克隆到pcDNA3中。然后通过EcoRI和XhoI位点将含有受体片段的PCR片段导入至该质粒中。对于所述GFP/CFP/YFP嵌合体来说，可通过PCR扩增所述片段并将其符合读框地导入p60ΔCD-HA的Xho I和Xba I位点中。按照每个制造商的说明书用Fugene6(Boehringer Mannheim)转染293T细胞。用150mM NaCl、20mM Tris.Cl[pH7.5]、1mM EDTA、30mM NaF、2mM β-甘油磷酸酯、1mM原钒酸钠、5mM碘乙酰胺、2mM二硫苏糖醇(DTT)、1％TRITON X-100和蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim)裂解细胞。在用蛋白G琼脂糖微球(BoehringerMannheim)和正常小鼠IgG预清除后，用2mg抗-GFP和蛋白G琼脂糖微球将蛋白从所述溶胞产物中免疫沉淀下来。用含0.5M NaCl的裂解缓冲液将所述免疫复合体洗涤两次，然后用常规裂解缓冲液洗涤三次。在Tris/甘氨酸胶(Novex)上辨析免疫复合体。Jurkat细胞的转染显示了类似的结果。在哺乳动物细胞中，人们发现嵌合p60受体会与无尾p60(p60ΔCD-HA)强烈地相互作用而不会与TNFR样受体疱疹病毒侵入调控因子(HVEMΔCD-HA)相互作用，所述嵌合p60受体的胞质结构域被绿色荧光蛋白(GFP)所取代(图1B，比较泳道2和3)。
GFP无法单独与p60ΔCD-HA缔合(图1B，泳道5)。观察到全长p80和无尾p80之间有类似的胞外部分同型相互作用(图1C，泳道6)。
此外，仅移除p80的第10-54位氨基酸(a.a.)，即重叠CRD1，会完全阻止与完整p80的非配体依赖性缔合(图1C，泳道7)。通过在p60中进行类似的缺失(a.a.1-54)可以消除自缔合(参见下文)。
通过将p80的N-末端部分(a.a.10-54)附加到p60受体上，然后所述p60受体与全长p80相互作用，可进一步说明该p80的N-末端部分的重要性(图1D，比较泳道3与泳道4和5，图9)。因此，该结构域足以介导异源受体的特异性缔合。该缔合是非配体依赖性的，因为嵌合p8010-546055-211(R1)具有两个由EcoRI限制性位点编码的氨基酸，所述限制性位点被插入在p80和p60序列的接合处，所述氨基酸中止了TNFα的结合(图1E，图片k和1)。因此，在缺少配体的情况下，一种与TNFR-ECD的配体结合袋不同的新的功能结构域介导了自装配。自此，该结构域被称为前配体装配域(PLAD)。
p60或p80中缺失所述PLAD可完全消除配体结合(表2和图1E，比较图片d、f和h)。然而，加入p80的PLAD会使得缺失PLAD的p60可以与TNFα结合，但是如上所述，通过插入两个由EcoRI位点编码的氨基酸可以阻止这种结合(图1E，图片j和1)。因此，TNFR与TNFα的有效结合取决于受体的自装配。或者，移除PLAD可以破坏整个ECD结构。由于先前的结果显示移除CRD1不会破坏p60 ECD的正确折叠(13)，所以后一种可能性是不可能的。然而，为明确地辨清这些可能性，在p60ΔCD-HA的CRD 1-3中引入氨基酸置换并且测定它们对p60ΔCD-GFP-HA相互作用的影响。按照每个制造商的说明书使用Quikchange法(Stratagene)进行诱变。通过DNA测序证实所述突变。p60和p80中除K19外，所有置换的氨基酸都是保守性的。p80中对应的残基为E22。PLAD中的两种置换KY19/20AA和K32A(5)消除了自缔合(图2A，比较泳道3和5与泳道2)并且排除了TNFα结合(表2)，所述置换并不欲中断直接的配体接触。PLAD中另一个残基的置换--Q24A不影响自缔合或TNFα结合(图2A，泳道4和表2)。表2中所指的残基数是基于p60的成熟序列的。CRD2配体结合袋中PLAD外侧的两种其它置换--E57A和N66F会中断TNFα结合但对受体自缔合几乎没有影响(表2和图2A，泳道6和7)。人们也发现缺少胞质尾区的突变受体与野生型ECD的缔合与它显性干涉p60诱导的凋亡方面的能力有关，表明了所述突变受体通过PLAD进入内源功能性p60受体复合体(表2)。这些结果显示PLAD本身与配体接触结构域不同但是对于有效的TNFα结合和受体功能来说是仍是必要的。
与单体受体链不同，预计预装配受体复合体中受体链的胞质部分彼此极其接近。这样TNFα结合会造成胞质结构域较紧密的缔合，从而导致了信号传导蛋白的募集。为评估这一假说，采用了实施例II(11)中所述的新型流式细胞方法来分析两种GFP光谱变体之间的荧光共振能量转移(FRET)，青色荧光蛋白(CFP)作为荧光供体，黄色荧光蛋白(YFP)作为荧光受体(12)。FRET是一种有效的测量活细胞中分子相互作用的方法。由于当荧光团之间距离增加时能量转移迅速减弱，所以GFP变体之间的FRET允许检测
Figure A20068002984100471
内的分子间相互作用。
产生了嵌合蛋白，其中用CFP或YFP置换p60和p80的胞质区并且进行测试以确定不同的受体对之间是否发生了能量转移。用双激光FACSvantage仪器进行FRET，在514nm处激发YFP蛋白，然后在413nm处激发CFP蛋白。然后通过检测546nm处的发射来检测CFP到YFP的能量转移。用远远多于CFP蛋白的YFP蛋白来转染细胞。然后使用Flowjo程序(Treestar Inc.)分析CFP阳性群的FRET。
观察到了p60ΔCD-CFP和p60ΔCD-YFP之间的能量转移，所述能量转移基本上是在加入TNFα后增加的(图2B，图片a)。通过缺失PLAD或通过可防止PLAD缔合的K32A突变来阻止该FRET(图2B，图片b和c)。类似的p80ΔCD-CFP：p80ΔCD-YFP对分析显示了通过加入TNFα而再次增加的强FRET信号(图2B，图片d)。使用p60ΔCD-YFP作为受体和p80ΔCD-CFP或CFP-p80ΔCD(与胞外结构域的N-末端融合的CFP)作为供体的对照显示没有FRET(图2B，图片e和f)。这些数据一起证明了在活细胞中，p60和p80链自身都极其接近且配体可诱导复合体的变化，所述变化会导致胞质中的CFP和YFP部分发生紧密的缔合。
p60和p80的PLAD与TNFR家族中许多受体的第一CRD的比较显示出形成所述结构域的二硫键支架的半胱氨酸之外的保守性(图3A，p80中的Y23、P36、G37和T50)。某些其它含有DR4和Fas的TNFR样受体显示出CRD1的保守性较差，由此产生了这些受体中是否存在PLAD样结构域的疑问。本发明探究了TNFR超家族其它成员中是否存在非配体依赖性自缔合。
令人吃惊的是，TRAIL受体1(DR4)和CD40的ECD都会自缔合，但与其它TNFR样受体的ECD相互作用不显著(图3B)。这些嵌合体也表现出了同型特异性FRET(图3C)。如实施例II中所述，Fas(CD95/APO-1)也可以与其自身特异性缔合(11)。因此，通过PLAD的自装配是TNFR家族的一个保守性特征。
本发明表明了在缺少配体的情况下，p60和p80TNFR通过被称为PLAD的新型N-末端结构域可预装配成功能性复合体。这揭示了CRD1是如何在p60和p80的配体结合和受体信号传导中起到重要作用的(10)。到目前为止，通过TNFR超家族成员进行信号传导的基本概念是配体可使单体受体链附着到三倍复合体上，这会导致胞质信号转导蛋白的募集(1、3、5、6)。该模型很大程度上是以与配体复合的p60的晶体结构为基础的，该晶体结构表明三个受体链环绕着所述三聚配体的亚基间沟并保持分开至少
Figure A20068002984100481
所述配体与延伸的CRD2和CRD3结构域接触，而CRD1结构域不与配体相互作用或彼此不相互作用(5)。近来关于DR5/TRAIL复合体结构的描述显示出了类似的受体-配体相互作用(13)。然而，所述结合了配体的结构似乎并不会反映配体结合前的受体结构。现在人们已经清楚细胞表面上的p60和p80会自缔合，如果缺失PLAD，则它们仅以单体形式存在。交联内源p60和p80受体表明三聚体是占优势构象，但是也可以存在其它的寡聚复合体。
由于现在已经清楚前缔合是TNFα结合所需的，所以关于配体如何与预缔合受体复合体相互作用受到极大的关注。利用两大类模型的其中之一可以解释TNFR信号传导，所述模型为：1)链旋转和重排；和2)超团簇(supercluster)形成模型(图3D)。在链旋转和重排模型中，配体嵌入预形成的受体三聚体中，导致PLAD接触被中断以及链被旋转和重排成三聚体，所述三聚体仅通过与配体三聚体接触而被稳定化。或者，配体结合可能会触发预装配的TNFR三聚体的聚簇，其中所述PLAD接触未被完全中断。PLAD-介导的预装配的TNFR三聚体的存在重新阐明了通过该受体大家族所进行的信号传导的重要方面，已知该受体家族中许多成员对于淋巴细胞功能和稳态是至关重要的(2)。特异性同型ECD接触以及PLAD中关键残基的保守性是TNFR超家族成员的特征，所述超家族包括通过死亡结构域进行信号传导的受体(p60、DR4和Fas)以及不通过死亡结构域进行信号传导的受体(p80和CD40)。在细胞表面上将链预分类为同型复合体可以促进应答的有效性和特异性。“受体干扰”应该被避免，在所述受体干扰例如p80链(缺少死亡结构域)被TNFα募集到与p60构成复合体，并且导致对凋亡的明显抑制。p80通过提供独立的促凋亡信号实际增强了p60-诱导的凋亡这一事实支持了这一观点(15)。预形成的三聚体也可以避免常规模型可能要求的必要条件，即连续地募集受体链以“建立”复合体，因此导致可通过TNFR样受体进行快速信号传导(3)。
对其它受体家族的预装配已有记载，特别是IL-1和IL-2，它们由不同多肽的异聚体构成(16)。特别值得注意的是最近关于红细胞生成素受体二聚体预缔合的描述，所述二聚体显然经历了“剪刀式”运动以接纳配体(17)。如果是那样的话，则可通过同样的氨基酸接触来进行受体链自缔合，所述氨基酸接触对于配体结合是至关重要的(17)。相反，TNFR超家族利用了与CRD2/3配体接触区不同的专用自缔合结构域。PLAD的鉴定可提供通过特异性抑制TNFR样受体的前配体装配并因而阻止信号传导的疗法来治疗TNFα或相关配体导致的疾病的新疗法。
实施例II
在人自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)中，编码异常形式Fas(CD95/APO-1)的杂合突变会显性干涉Fas诱导的淋巴细胞凋亡。本发明证明了这种情况来源于利用胞外结构域的野生型和突变体Fas受体的预缔合，而不依赖于配体诱导的受体寡聚化。发现预缔合的Fas受体复合体是信号转导所必需的，并且通过绿色荧光蛋白(GFP)变体之间的FRET的新的应用在活细胞中证实了预缔合的Fas受体复合体。这些结果提供了一种用于人疾病中Fas信号传导和显性干涉的新的分子机制。
Fas(APO-1/CD95)是转导对于免疫稳态和耐受至关重要的凋亡信号的细胞表面受体(19-21)。Fas是具有三个富含半胱氨酸的胞外结构域(CRD)的317个氨基酸的1型膜糖蛋白，所述胞外结构域是肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的特征。
对于人类，携带杂合Fas突变的患有1A型ALPS的患者的淋巴细胞具有减少的Fas诱导的凋亡，并且突变体等位基因的转染会导致对Fas诱导的凋亡的显性干涉(29-34)。这被认为是由于配体介导的交联将野生型和有缺陷的Fas链交联成了混合的不能募集下游信号分子的三聚体复合体。然而，已经研究了通过改变的RNA剪接导致大多数CRD2的胞外结构域(ECD)缺失(Pt 2，缺失a.a.52-96)的显性干涉突变。Fas-阴性293T细胞上该突变的表达表明该突变体不与对抗性抗体结合(图4A)(33、35)。该突变体也不能与三聚化的FasL结合，而胞质死亡结构域中的ALPS突变(例如Pt 6，A241D)并不影响FasL结合或APO-1结合(图4A)。甚至在未与对抗性抗体或FasL结合的情况下，Pt 2突变体也能以几乎与Pt 6死亡结构域突变体一样的效率显性干涉Fas诱导的凋亡(图4B)。共转染细胞的表面染色表明与那些单独用WT Fas转染的细胞相比，Fas表达没有减少，排除所述突变体Fas分子抑制正常等位基因表达的可能性(36)。因此，通过常规的由FasL诱导的受体单体交联的信号传导模型不能解释显性干涉，因为在该过程中Pt 2突变体Fas分子不会成为混合受体复合体的一部分。因此，使用构建体测试了Pt 2 Fas和野生型Fas之间的非配体依赖性相互作用，在所述构建体中野生型Fas的胞质结构域被绿色荧光蛋白(GFP)所置换(HA-Fas 1-210：GFP)，以避免由所述死亡结构域导致的假相互作用(24、37)。在缺少FasL的情况下，用Fas 1-210：GFP嵌合物免疫共沉淀全长Fas受体和Pt 2 Fas受体(图4C)。该相互作用是特异性的，因为TNFR家族的另一成员--与GFP融合的疱疹病毒侵入介质(HVEMΔCD：GFP)--不与Fas免疫沉淀。
为进行这些免疫沉淀研究，按照制造商的说明书用Fugene 6(BoehringerMannheim)转染293T细胞。用150mM NaCl、20mM Tris.Cl[pH 7.5]、1mMEDTA、5mM碘乙酰胺、2mM二硫苏糖醇(DTT)、10％甘油、1％TRITON X-100和蛋白酶抑制剂(Boehringer Mannheim)裂解细胞。在用蛋白G琼脂糖微球(Boehringer Mannheim)和正常小鼠IgG预清除后，用1mg抗-GFP(RocheMolecular Biochemicals)和蛋白G琼脂糖微球免疫沉淀蛋白。用裂解缓冲液洗涤免疫复合体三次。用2μl抗AU1(Covance)和蛋白A微球免疫沉淀AU1。将蛋白在Tris/甘氨酸凝胶(Novex)上电泳，转移到硝酸纤维素膜上并且用指定的抗体进行印迹。将条带用SuperSignal WestDura(Pierce)显影。用1D图像分析软件(Kodak)进行光密度分析。
在实施例I中，描述了被称为“前配体装配域”(PLAD)的保守性N-末端结构域，所述结构域介导TNFR超家族其它成员的特异性自缔合。然而，Fas的N-末端缺少几种在其它TNFR家族受体中保守的关键性氨基酸，因此产生了Fas是否含有功能性PLAD的疑问。
构建了截短或去除了第一CRD的N-末端Fas突变体，并且测试了配体结合、Fas-Fas缔合以及凋亡功能(图5)。用适当的引物和Pwo高保真聚合酶(Roche Molecular Biochemicals)通过PCR诱变产生Fas截短突变体。对于AU-1标记的受体，使用了一种具有预先插入到Fas CRD 1上游区中的AU-1标签的模板。为进行HA标记，将突变克隆到改造的pcDNA3载体的EcoRI/XhoI位点中，所述载体在HA标签序列之前含有p80的前导序列。点突变是使用Quickchange技术(Stratagene)来产生的，用Pwo代替Pfu聚合酶。通过限制酶作图和自动测序来验证突变。
上述研究表明成熟Fas蛋白中的形成第一CRD亚结构域的起始43个氨基酸(a.a.)的缺失可显著减少配体结合但不会阻止APO-1激动性抗体的结合(39)。缺失编码整个CRD1的起始66个氨基酸会阻断与FasL和APO-1的结合(图5A)。这两种缺失表现出了由APO-1抗体启动的凋亡中的相应缺陷(图5C)以及所述截短链与具有不同标签的Fas 1-210蛋白的共沉淀的缺乏，所述Fas1-210蛋白含有完整的ECD(图5B，泳道1-4)。因此，尽管有部分的FasL结合和正常的APO-1结合，从Fas N-末端移除仅43个氨基酸即会阻止凋亡诱导，这与这些截短型受体与野生型Fas的缔合的缺失相关。基于大多数所预测的与FasL的接触均存在于CRD2和CRD3中这一事实，由66个氨基酸(构成CRD1)的缺失导致的FasL结合的缺失是令人意外的(22、23)。通过比较这些结果与那些在实施例I中用p60和p80获得的结果，假设了Fas受体复合体的非配体依赖性前装配对提供有效的FasL结合和受体信号传导可能是至关重要的。为进一步探究受体自缔合中配体结合的必要条件，测试了一种Fas点突变-R86S(23)，这一R86S突变移除了对于结合FasL非常重要的一个CRD2接触残基，发现它在细胞表面表达时不与FasL结合(图5A，下图)。如利用两种不同的对抗性抗-Fas抗体的染色结果所示，整个受体结构是保存完整的(图5A和(18))；并且如免疫共沉淀所示，仍旧会发生完整Fas的自缔合(图5B，泳道5-7)。甚至更加有意义的是，当与野生型(WT)受体共表达时，该突变体会显性干涉FasL诱导的凋亡，同时其自身不与FasL结合(图5D，实心条)。用APO-1抗体在相同细胞中诱导的凋亡在所有转染中均未受损，表明了两种受体都在细胞表面上功能性表达(图5D，空心条)。因此，显性干涉不依赖于天然存在和基因工程改造的Fas突变体的配体结合。相反，Fas功能与自缔合能力有关。
为定量测定活细胞中的Fas受体自缔合，开发了基于具有不同光谱的GFP突变体--青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)之间荧光共振能量转移(FRET)的流式细胞测定和显微测定。CFP和YFP具有有利于FRET的光谱性质，因为CFP的最大发射波长接近于YFP的最大吸收波长(40)。由于这些蛋白间的FRET在距离大于时会迅速下降，所以CFP和YFP融合蛋白之间存在FRET则表明它们的荧光蛋白结构域非常接近。当将C-末端符合读框地融合了CFP和YFP(在第210位代替了所述死亡结构域)的Fas受体共转染到293THEK细胞中时，它们在细胞表面上得以适当表达(36)。
通过标准PCR克隆技术来使Fas和其它TNF家族受体与CFP和YFP产生符合读框的融合，利用蛋白质印迹和荧光显微术来证实正确的蛋白表达。用1μg所述的YFP融合蛋白构建体和2μg所述的CFP构建体转染293T细胞。24-36小时后，用PBS收集细胞并且用FACSvantage细胞仪进行分析，用于CFP时将氪激光器(Spectrophysics)调到413nm，用于YFP时将ILT气冷激光器调到514nm。用470nm/20nm带通滤波器检测CFP。用546nm/10nm带通滤波器检测YFP和FRET，分别使用514nm和413nm激光器产生的信号。然后用514和413nm激光器连续照射细胞使得可以从每个细胞中检测到全部三种信号。采用补偿校正以使得在单独用CFP或YFP转染的细胞中不存在可见的FRET信号。从每个样品中收集50,000次事件并且利用FlowJo软件包(Treestar)分析数据。为测量FRET的效率，在利用505-545nm带通滤波器用通过5分钟的照射漂白YFP之前和之后，用荧光显微镜测量共转染细胞的CFP发射强度。对照表明这种大强度基本上彻底地漂白了YFP，同时基本没有直接漂白CFP。针对这种直接漂白进行了校正。使用下述公式来计算FRET效率：E％＝[1-(YFP漂白前的CFP发射/YFP漂白后的CFP发射)]×100％。
当利用流式细胞术检测时，由于FRET，用CFP和YFP Fas融合蛋白共转染的细胞的CFP发射触发了YFP波长处的强荧光发射(图6A，Fas1-210：CFP/Fas 1-210：YFP)，特别是在YFP高水平表达时。使用了一种通过9个氨基酸的肽连接物将CFP与YFP共价融合(CFP-YFP)的构建体作为阳性对照(41)。在这些细胞中，也检测到了随表达水平线性增长的强FRET信号。在含有或不含所述死亡结构域的Fas融合蛋白之间检测到了FRET，但是在Fas和TNF家族成员TNFR1或HVEM之间未检测到FRET(图6A和B)。当与Fas 1-210共表达时，截短或移除了PLAD的N-末端截短形式的Fas产生的FRET信号降低(图6B)。为定量测量这些不同受体突变体之间的FRET效率，对选择性光漂白YFP受体分子后的CFP脱淬灭(dequenching)(FRET的另一特征)进行了基于显微镜的测定(40、24)(图6C)。缺少死亡结构域的Fas的自缔合产生了观测效率为16％的FRET。当两个分子上均带有死亡结构域时，FRET效率升至27％，这表明了死亡结构域的寡聚性质(42)。Pt 2 Fas产生了与Fas 1-210相近的FRET效率，显示了接近正常的自缔合，但是使用Fas 43-210时信号减弱，使用Fas 67-210时没有明显的FRET效率。这些结果表明Fas分子在细胞表面上特异性自缔合，并且这一性质依赖于PLAD。
为测试天然Fas受体是否会在未转染的T淋巴细胞表面上自缔合，进行了化学交联研究(图7)。加入不能穿透细胞的可切割巯基的交联剂3，3’-二硫双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)会将去糖基化细胞溶胞产物中Fas的表观分子量从45变为140kD，这对应于形成Fas三聚体(图7A，泳道2)。与单体条带的光密度比较表明有60％的Fas链被交联成三聚体。用二硫苏糖醇(DTT)切割交联剂会将大多数三聚复合体还原为单体态(图7A，泳道5-8)。DTSSP诱导的复合体类似于那些在使用APO-1对抗性抗体或FasL激发而未进行化学交联后存在的复合体(图7A，泳道3-4)(25)。激动剂诱导的复合体是通过分子间二硫键连接的，这可通过DTT还原来证明(图7A，泳道7-8)。对这些细胞的免疫沉淀的Fas信号传导复合体进行的检测表明，抗体或配体激发会触发FADD和半胱天冬酶-8的募集并且导致半胱天冬酶-8被蛋白酶解成其41和43kD的加工后形式(图4B)以及聚(ADP-核糖)聚合酶的半胱天冬酶依赖性切割(图7C)。然而，用DTSSP处理过的细胞中的信号传导复合体表现出中度的FADD缔合，但没有半胱天冬酶-8结合或加工并且没有PARP切割，表明预缔合受体复合体的化学交联不足以触发凋亡信号。值得注意的是，DTSSP的预处理可防止响应于随后的APO-1处理的活性信号传导复合体的形成(图7B)。这些结果表明Fas受体的非共价预缔合不依赖于过表达。配体结合触发了受体复合体结构的变化，所述结构变化与链间二硫键形成和分子内信号传导有关。Fas受体的化学交联似乎会捕获非信号传导态的预缔合复合体。
保守性N-末端PLAD是发挥适当的Fas受体功能所必需的，并且因此可以在ALPS的显性干涉中起到关键作用。比较了国立卫生研究院所研究的大量ALPS患者的结构、显性干涉(DI)和Fas-Fas自缔合(SA)(29、33-35)(图8)，人们发现每个与疾病相关的显性干涉突变样品中都保留了PLAD，包括影响了Fas胞外或胞内部分的突变。在Pt 1和20中，突变产生了仅编码成熟Fas蛋白的前57和62a.a.的提前终止多肽，表明PLAD本身足以进行显性干涉(图8A)。利用点突变移除全部或部分死亡结构域(Pt 5、30或33)或消除其FADD结合功能(Pt 3、6、26、29或31)会产生有效的显性干涉Fas分子(29)。因此，测试了通过去除了死亡结构域的Fas的基因工程终止突变体(Fas 1-210)进行的显性干涉是否需要PLAD。结果表明N-末端截短破坏了通过Fas 1-210进行的显性干涉(图8B)。来自ALPS患者(ALPS Pt 26，D244V)的Fas死亡结构域点突变体中的PLAD截短(最多缺失至a.a.42)消除了该天然突变体的显性抑制作用(图8B)。
这些发现一起重新明确了ALPS中Fas突变显性干涉正常Fas功能的机理。显然显性干涉Fas突变保留了N-末端PLAD，因为该结构域负责野生型和突变体Fas分子间的复合体形成。遗传显性干涉的主要分子原理是突变体蛋白必须充分地与特异性功能复合体中的野生型蛋白相互作用(43)。先前，与人疾病相关的显性负性突变已经被证明会通过掩蔽配体、阻断细胞内信号传导或阻止WT链被转运到细胞表面来干扰正常的受体信号传导(44)。对于Fas而言，所述数据表明显性干涉来源于一种新的机制，所述机制包括在配体结合前，由PLAD介导的野生型和突变体受体之间的缔合。这些发现解释了为什么虽然ALPS Pt 2体内的异常Fas蛋白和其它Fas ECD突变体不能结合FasL但还会产生足以导致疾病的显性干涉。由于PLAD的移除可以消除含有缺失或突变的死亡结构域的Fas分子的显性负性功能，所以PLAD介导的相互作用也会导致大量携带会影响Fas死亡结构域的突变的ALPS患者的显性干涉相互作用。PLAD相互作用也可能参与了Fas诱导的凋亡的下调，所述下调是通过含有全部该结构域的可溶性备选剪接形式的Fas来进行的(45)。预计不编码功能性PLAD的天然受体突变体不是显性干涉的。PLAD介导的显性干涉也可以在通过诱骗受体进行的信号传导调节中起作用(20)，并且会在由TNF家族其它成员的异源遗传异常导致的疾病发病中起作用。
这些结果也提出了一种新的用于理解由Fas进行的跨膜信号传导的模型，所述模型包括通过配体将预缔合三聚体转化成信号传导态而不是配体诱导的单个受体链的寡聚。FRET研究使得可以评估在缺少配体的情况下，细胞表面上CFP和YFP标记的Fas分子间的距离。对于随机取向的CFP和YFP而言，
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半径-R0为
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(23)。假设与Fas融合的CFP和YFP是等量表达、彼此之间随机取向并且随机相配成等边三聚体，那么所观察到的FRET效率(图3C)表明：与全长Fas分子融合的CFP和YFP生色团之间的距离上限是与Fas 1-210融合的CFP和YFP生色团之间的距离上限是
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由于在Fas和其它TNFR家族受体之间未观察到FRET，所以这些距离比观察到的在细胞表面上随机分布的分子之间的距离要近得多并且是特异性的。FRET需要阈水平的YFP表达(图3A，FAS1-210：CFP/FAS1-210：YFP)这一事实反映了混合的CFP标记的Fas和YFP标记的Fas的统计或者预缔合实际上依赖于受体密度。由于预缔合增强了Fas信号传导，因此通过改变Fas表达或其它方法来调控受体预缔合量是一种新的用于调节凋亡信号传导的机制。
通过受体复合体重排进行的信号传导可能是广泛使用的机制，以确保对配体的快速和特异性细胞响应。然而，这一信号传导机制也赋予了对于由ALPS中天然存在的受体变体或病原性异源突变导致的显性干涉的易感性。
实施例III
方法
小鼠和试剂
BALB/c、C57BL/6、DBA/1J、C3H/HeJ、C3H/HeN、TNFR1和TNFR2敲除小鼠购自Jackson Laboratory。TNF-α转基因小鼠购自Taconic。所有实验中均使用6-8周龄的雄性小鼠并且将其饲养在免疫实验室(NIAID、NIH)的动物房中。利用CBER合成CpG DNA。CpG DNA 1668序列为5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’(SEQ ID NO：61)(50)。通过使用P60 PLAD和P80PLAD制备抗P60(1H11)或抗P80PLAD(3H11)的小鼠单克隆抗体(MAb)。
PLAD-GST融合蛋白的纯化
按照文献所述的方法进行PLAD-GST融合蛋白的克隆和纯化(78)。用4-20％Tris-甘氨酸凝胶和质谱来验证纯化的PLAD-GST融合蛋白并且储存在-80℃下。用Detoxi-Gel AffinityPak柱(Pierce)移除LPS。
P60和P80 PLAD蛋白的体外测试
用胰蛋白酶处理后收集L929细胞。用不同剂量的PLAD蛋白预处理细胞30分钟，之后加入TNF-α(2ng)。类似地，用PLAD蛋白和GST预处理42.3细胞。在30分钟预处理后，加入TNF-α(3ng)、Fas的抗体(11)(10ng)和蛋白A(20ng)并在37℃下培养。利用血细胞计数器或流式细胞术在规定的时间点对细胞死亡进行定量测定。按照制造商的说明书(R&D systems)测量TNF-α结合。
PLAD蛋白的免疫原性和半衰期
采用ELISA来研究PLAD蛋白的体内免疫原性和半衰期。PLAD蛋白可以引发抗体应答，其中至少一半是针对所述GST部分(附图5a)。利用在各个时间所取样的血液，采用ELISA测量P60 PLAD或P80 PLAD蛋白的体内半衰期，其半衰期接近5小时(附图5b、c)。
采用PLAD蛋白疗法的由TNF-α、CpG DNA触发的关节炎的发展
在存在或不存在100μg PLAD蛋白的情况下，将TNF-α、CpG DNA或LPS关节内注射到小鼠膝关节中。注射后3天处死小鼠并且取出关节以进行组织病理学检查。
CIA的诱导和用PLAD蛋白治疗CIA
将用等体积的完全弗氏佐剂(Sigma)乳化II型鸡胶原(Sigma)，将0.1ml含100μgII型胶原的乳液真皮内注射至雄性DBA/1J小鼠的尾基部。在21天时，给小鼠追加100μg用等体积的不完全弗氏佐剂(Sigma)乳化的II型胶原。在首次免疫后的22天，开始用PLAD蛋白或PBS进行预防性处理，按编号方式(in coded fashion)每周腹膜内给药三次直至第52天。在小鼠已经产生关节炎后三天开始用P60 PLAD蛋白或PBS进行治疗性处理。腹膜内给予P60PLAD蛋白(每隔一天给予400μg)两周，然后在各组之间转换(switch)所述处理。在“盲法”实验中，由两名不知道所述处理的独立的检查员每三天对小鼠进行一次分析并且评估关节炎的程度：足肿胀度和临床评分。通过用测径器测量足爪厚度来测定关节肿胀。使用下述评分级别来评估临床关节炎：0级，无肿胀；1级，轻度肿胀和红斑；2级，明显肿胀；3级，关节僵直。以0-3级和最大可能评分12对每只动物各肢分级。
关节的组织病理学检查
在将组织常规固定、脱钙和石蜡包埋后，制作关节切片并且用苏木精和伊红染色。由研究人员对所有切片进行编号并且进行盲法评估。按照从0级(无炎症迹象)、1级(滑膜被覆层增生的轻度炎症，最低限度为没有软骨破坏)到2和4级(逐渐增加的炎性细胞浸润或软骨和骨破坏的程度)的级别来判断滑膜炎、血管翳形成或者骨/软骨破坏的程度。
体外破骨细胞形成测定
从BALB/c小鼠的胫骨中提取骨髓细胞，并且在含有M-CSF的α-MEM培养基中培养。3天后，在存在或不存在PLAD蛋白的情况下，用TNF-α(20ng/ml)和M-CSF(50ng/ml)进一步诱导骨髓巨噬细胞4天。然后固定细胞并且按照制造商的说明书(Sigma)针对破骨细胞标志物TRAP进行染色。
免疫荧光(66)
在存在或不存在P60和P80 PLAD蛋白的情况下，在体外用TNF-α处理从TNFR1或TNFR2敲除小鼠的脾脏分离的单核细胞。用抗NF-κB p65的兔抗体(C-20，Santa Cruz)对经固定和透化的细胞进行染色。然后洗涤细胞并用FITC-偶联的驴抗兔抗体孵育细胞。用共聚焦显微镜以盲法方式分析核NF-κB并且进行评分。
统计分析
分别使用Fisher检验和Mann-Whitney U检验分析各组中的发病率和严重度的不同。P≤0.05被认为是显著的。
结果
重组体PLAD-GST融合蛋白
为获得含有人P60或P80 TNFR的PLAD结构域的可溶性蛋白，制备谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白。亲和性纯化提供了全长分子量分别为34kD和33kD(基于氨基酸序列的预期大小)的P60和P80 PLAD-GST融合蛋白(图1b和附图1)。进行蛋白质印迹并通过质谱进行蛋白质测序以确证凝胶上的两条带都为P60或P80 PLAD蛋白(图1c)。
PLAD蛋白抑制TNF-α诱导的细胞死亡
进行该实验以确定纯化的PLAD蛋白是否会抑制TNF-α对L929细胞的细胞病变作用(63)。纯化的P60 PLAD蛋白以剂量依赖方式明显地抑制了小鼠和人TNF-α诱导的细胞死亡(图2a、b)。该保护作用与英夫利昔单抗和依那西普相当(附图2)。相反，对照CD40 PLAD蛋白没有作用(图2c)。也测试了需要来自P60和P80的信号以经历由TNF-α(15)诱导的死亡的人42.3细胞。人们发现P60或P80 PLAD蛋白会抑制TNF-α诱导的细胞死亡但不抑制抗-Fas诱导的细胞死亡(图2d)。仅GST蛋白不会抑制TNF-α诱导的或抗-Fas诱导的细胞死亡。此外，P60 PLAD蛋白与依那西普和英夫利昔单抗一样有效地抑制L929细胞中TNF-α诱导的半胱天冬酶-8激活(图2e)。因此，纯化的人P60或P80 PLAD蛋白有效地阻断人或小鼠TNF-α。
P60 PLAD抑制TNF-α或CpG DNA诱导的关节炎
也测试了PLAD蛋白是否会抑制体内TNF-α诱导的关节炎。在加入或不加入100μg PLAD蛋白的情况下，通过关节内注射小鼠TNF-α(45ng)来诱导关节炎。P60 PLAD蛋白强力抑制了TNF-α诱导的关节炎的特征，包括滑膜炎、血管翳和骨侵蚀(图3a、b)。相反，单独的P80 PLAD或GST蛋白并不明显地影响疾病(图3a、c)(附图3a)。
TNF-α在SA的发病机制中起到重要作用(49、50、61)。含CpG的细菌DNA和LPS都是能强烈地诱导可触发关节炎的TNF-α从单核细胞和巨噬细胞中释放出来的细菌成分(49、61)。共同注射100μg P60 PLAD蛋白可以显著减轻CpG DNA诱导的关节炎中的血管翳和骨破坏(P＜0.05)(图3a、d)，但是100μgP80 PLAD则不能(附图3b)。P60 PLAD蛋白而非P80 PLAD蛋白可显著地减轻LPS诱导的关节炎。
P60 PLAD抑制胶原诱导的关节炎(CIA)中的MMP表达
基质金属蛋白酶(MMP)是关节炎过程中软骨和骨破坏的重要介质，TNF-α可以诱导MMP表达。因此，该实验确定了P60-PLAD蛋白是否抑制CIA中的MMP表达。结果表明P60 PLAD蛋白显著地抑制了CIA的MMP表达(图25)。注：左图中的深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示MMP表达。
P60 PLAD抑制胶原诱导的关节炎(CIA)中的iNOS表达
一氧化氮(NO)是短效自由基气体。过量的一氧化氮是有毒的并且会导致慢性炎症。重要的是，已经证明TNFα可通过激活可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)刺激巨噬细胞/单核细胞产生一氧化氮并且提高NO水平，由此导致局部关节损害。因此来确定P60 PLAD蛋白是否会抑制CIA中的iNOS表达。结果显示P60 PLAD蛋白显著抑制受CIA侵袭的关节中的iNOS表达(图26)。注：左图中的深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示iNOS表达。这些结果支持了本文的教导，即通过干扰TNFR装配，P60PLAD阻断CIA中TNF-α诱导的组织损害。
结论
本发明的结果证实了TNFR1中的PLAD为重要的治疗靶标。人们发现CD95PLAD通过介导显性干涉来参与ALPS的发病机制(11)。P60和P80 PLAD蛋白可阻断TNF-α与TNFR1结合但不会直接与TNF-α结合。最重要的是，通过全身以及关节内给药，在几种关节炎的小鼠模型中，P60 PLAD表现出显著的改善作用。此外，通过P60 PLAD治疗可以显著地减少关节的炎性细胞浸润。在先前的实例中，人们发现P60和P80 PLAD的同型结合是选择性的并且不会彼此间交叉结合或与CD95 PLAD交叉结合(11、53)。那些实验证实P60和P80 PLAD优先作用于对应的受体但是可能不会是完全特异性的(图5e、f)。此外，P60PLAD可以在几种关节炎的小鼠模型中抑制所述疾病过程的关键方面。总之，我们的数据显示PLAD是一种重要的关节炎药物靶标。
P60 PLAD蛋白可有效地抑制由TNF-α产生的NF-κB诱导。P60和P80 PLAD蛋白可以受体优先方式抑制TNF-α诱导的NF-κB易位。此外，NF-κB是RANKL诱导的破骨细胞形成所需的(71)。破骨细胞介导的骨和软骨侵蚀会导致关节炎中的大多数永久损伤(67、68、69)。本发明的结果显示出了血管翳中的破骨细胞激活以及TNF-α转基因小鼠中骨破坏的位点。在TNF-α转基因小鼠的关节炎关节和胶原诱导的关节炎中存在大量的RANK和RANKL表达(69)。P60PLAD治疗显著地减少了被覆层和血管翳中的RANK和RANKL。
英夫利昔单抗和依那西普都可以直接结合并且阻断TNF-α的作用，并且现在它们已被广泛地用于RA和其它疾病的治疗中(48)。然而，已观察到了副作用例如狼疮样疾病、分枝杆菌感染和淋巴瘤发病率升高(72-75)。两种药物都直接阻断TNF-α与两种TNFR的结合。因此，它们可有效地抑制TNFR2所介导的药效同时阻断TNFR1的疾病诱导作用。P60 PLAD是可以优先地靶向TNFR1的小蛋白结构域。在我们的模型中，约4mg/kg(关节内)或16mg/kg(肠胃外)的P60 PLAD蛋白剂量具有与英夫利昔单抗(10mg/kg)(76)和依那西普(0.4mg/kg)33剂量类似的作用，所述英夫利昔单抗和依那西普的剂量已经在临床上被用于改善关节炎。P60 PLAD蛋白提供了一种抑制TNF-α的致病作用的新方法所述方法可以用于治疗RA。
实施例IV
PLAD蛋白直接与TNF受体结合
为确定PLAD蛋白是否会直接与TNFR结合，将P80-PLAD蛋白与依那西普混合，通过与P80 PLAD蛋白混合来测试含有TNFR2的完整胞外结构域的TNFR2融合蛋白。免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)的结果显示P80-PLAD-GST蛋白而非单纯的GST蛋白可与依那西普缔合，表明了PLAD蛋白可与TNFR直接结合并且因此抑制了TNFα活性(图24)。
表1
表2
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在本申请中，参考了各种出版物。这些出版物的公开内容全部通过引用的方式纳入本申请中，以便更加充分的描述本发明所属技术领域的现有技术。
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序列表
SEQ ID NO：1
成熟p60的1-54位氨基酸(TNFR1)
GenBank Accession No.M75866
GenBank Accession No.AAA61201
LVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRE
SEQ ID NO：2
成熟p80的10-54位氨基酸(TNFR2)
GenBank登记号     M32315
GenBank登记号     AAA59929
YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCD
SEQ ID NO：3
Fas的1-43位氨基酸
GenBank登记号     .M67454
GenBank登记号      AAA63174
RLSSKSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFC
SEQ ID NO：4
Fas的1-66位氨基酸
GenBank登记号     M67454
GenBank登记号     AAA63174
RLSS KSVNAQVTDINSKGLELRKTVTTVETQNLEGLHHDGQFCH
KPCPPGERKARDCTVNGDEPDC
SEQ ID NO：5
LtBR的13-50位氨基酸
GenBank登记号     L04270
GenBank登记号     AAA36757
CRDQEKEYYEPQHRICCSRCPPGTYVSAKCSRIRDTVC
SEQ ID NO：6
CD40的6-39位氨基酸
GenBank登记号    .X60592
GenBank登记号    .CAA43045
CREKQYLlNSQCCSLCQPGQKLVSDCTEFTETEC
SEQ ID NO：7
CD30的11-51位氨基酸
GenBank登记号    .M83554
GenBank登记号    .AAA51947
CHGNPSHYYDKAVRRCCYRCPMGLFPTQQCPQRPTDCRKQC
SEQ ID NO：8
CD27的7-42位氨基酸
GenBank登记号    .M63928
GenBank登记号     AAA58411
CPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQC
SEQ ID NO：9
HVEM的6-37位氨基酸
GenBank登记号    U70321
GenBank登记号    AAB58354
CKEDEYPVGSECCPKCSPGYRVKEACGELTGT
SEQ ID NO：10
0X40的3-36位氨基酸
GenBank登记号    X75962
GenBank登记号    CAA53576
CVGDTYPSNDRCCHECRPGNGMVSRCSRSQNTVC
SEQ ID NO：11
DR4的109-138位氨基酸
GenBank登记号    U90875
GenBank登记号    AAC51226
CNRCTE GVGYTNASNNLFACLPCTAC KSDE
TNFR1的全长序列(p60)
GenBank登记号    M75866
455个氨基酸
Figure A20068002984100721
TNFR2的全长序列(p80)
GenBank登记号    M32315
461个氨基酸
Figure A20068002984100722
Fas全长序列
GenBank登记号    M67454
335个氨基酸
Figure A20068002984100731
LtBR全长序列
GenBank登记号    L04270
435个氨基酸
Figure A20068002984100732
CD40受体的全长序列
GenBank登记号    X60592
277个氨基酸
CD30受体的全长序列
GenBank登记号    M83554
595个氨基酸
Figure A20068002984100742
CD27受体的全长序列
GenBank登记号    M63928
260个氨基酸
Figure A20068002984100751
HVEM受体的全长序列
GenBank登记号    U70321
283个氨基酸
Figure A20068002984100752
0X40受体的全长序列
GenBank登记号    X75962
283个氨基酸
Figure A20068002984100753
DR4受体的全长序列
GenBank登记号    U90875
283个氨基酸
Figure A20068002984100761
CD40的CRD1
SEQ ID NO：25
Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys
Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr
Glu Cys
HVEM的CRD1
SEQ ID NO：26
Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys
Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr
Val Cys
CD3O的CRD1
SEQ ID NO：27
Cys His Gly Asn Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys
Cys Tyr Arg Cys Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Pro Gln
Arg Pro Thr Asp Cys Arg Lys Gln Cys
SEQ ID NO：28
T2蛋白的20-61位氨基酸(粘液瘤病毒)
GenBank登记号    M95181
GenBank登记号    AAA46632
PYGADRGKCRGNDYEKDGLCCTSCPPGSYASRLCGPGSDTVC
SEQ ID NO：29
s002R蛋白的34-61位氨基酸(肖普纤维瘤病毒)
GenBank登记号    AF170722
GenBank登记号    AAF18043
EKDGLCCASCHPGFYASRLCGPGSNTVC
SEQ ID NO：30
UL144的56-77位氨基酸(HCMV)
GenBank登记号    AF179208
GenBank登记号    AF13375
CTPCPNGTYVSGLYNCTDCTEC
SEQ ID NO：31
CrmC蛋白的30-73位氨基酸(牛痘病毒)
GenBank登记号    AF482758
GenBank等记号    AAM13631
HAPVNGSCDDGEYLDKTHNQCCNRCPPGEEAKIRCSGSDNTKCE
SEQ ID NO：32
CrmC(A53R)蛋白的30-73位氨基酸(痘苗病毒)
GenBank登记号    AJ416893
GenBank登记号    CAC95181
HAPVNGSCDEGEYLDKRHNQCCNRCPPGEFAKVRCNGNDNTKCE
SEQ ID NO：33
CrmD蛋白的31-67位氨基酸(牛痘病毒)
GenBank登记号    U87581
GenBank登记号    AAB94351
CNGTDYNSNSNNLCCKQCDPGMYMTHSCNTTSNTKCD
SEQ ID NO：34
CrmE蛋白的28-58位氨基酸(牛痘病毒)
GenBank登记号    AJ272008
GenBank登记号    CAC15562
YYNSQELKCCKLCKPGTYSDHRCDKYSDTIC
SEQ ID NO：35
ORF167L假定蛋白的80-117位氨基酸(淋巴囊肿病病毒)
GenBank登记号    AY380826
GenBank登记号    AAU10940
CRQGYYYDPESEMCFPCSNCESSKVKVTTCNRTHDTVC
SEQ ID NO：36
EVM003蛋白的24-65位氨基酸(小鼠脱脚病病毒)
GenBank登记号    NC_004105
GenBank登记号    NP_671521
YTPINGKCNGTDYNSNNLCCKQCNPGMYMTHSCNTTSNTKCD
SEQ ID NO：37
CrmB蛋白的25-65位氨基酸(骆驼痘病毒)
GenBank登记号    AF438165
GenBank登记号    AAL73920
YAPSNGKCKDNEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQC
SEQ ID NO：38
TNFR2同系物蛋白的25-65位氨基酸(猴痘病毒)
GenBank登记号    DQ011155
Genbank登记号    AAY97399
HAPSNGKCKDNEYRSRNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQ
SEQ ID NO：39
G2R蛋白的25-65位氨基酸(类天花病毒)
GenBank登记号    U88151
Genbank登记号    AAB94376
YTPPNGKCKDTEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCDSKTNTQC
SEQ ID NO：40
成熟TNF1的1-124位氨基酸
VCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRH
CLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGT
VHLSCQEKQNTVC
SEQ ID NO：41
假定蛋白的139-171位氨基酸(空肠弯曲杆菌RM1221)
GenBank登记号    CP000025
Genbank登记号    AW35633
DINSEGMEDLSFDDDAQDDNANKTLETQNLEHD
SEQ ID NO：42
假定蛋白的438-454位氨基酸(布氏锥虫)
GenBank登记号    AC091702
Genbank登记号    AAX79885
TEINELRQTITDVETNL
SEQ ID NO：43
假定蛋白的488-517位氨基酸(金黄色葡萄球-菌-)
GenBank登记号    BA000017
Genbank登记号    BAB56791
DENSKELERLQKIAFNVETKTLESLVDEGQ
SEQ ID NO：44
T2蛋白的全长序列(粘液瘤病毒)
GenBank登记号    M95181
326个氨基酸
MFRLTLLLAYVACVYGGGAPYGADRGKCRGNDYEKDGLCCTSCPPGSYASRLCGP
GSDTVCSPCKNETFTASTNHAPACVSCRGRCTGHLSESQSCDKTRDRVCDCSAGNY
CLLKGQEGCRICAPKTKCPAGYGVSGHTRTGDVLCTKCPRYTYSDAVSSTETCTSS
FNYISVEFNLYPVNDTSCTTTAGPNEVVKTSEFSVTLNHTDCDPVFHTEYYGTSGSE
GAGGFFTGMDRYQNTTKMCTLNIEIRCVEGDAVRTIPRTSDGVGVLSHSETITVIGG
CLSDVNVDIEYSDSNHPEEVDDFVEYHWGTRLRLFPSPKRCRLVS
SEQ ID NO：45
s002R蛋白的全长序列(肖普纤维瘤病毒)
GenBank登记号    AF170722
325个氨基酸
MLRLIALLVCVYVYGDDVPYSSNQGKCGGHDYEKDGLCCASCHPGFYASRLCGP
GSNTVCSPCEDGTFTASTNHAPACVSCRGPCTGHLSESQPCDRTHDRVCNCSTGNY
CLLKGQNGCRICAPQTKCPAGYGVSGHTRAGDTLCEKCPPHTYSDSLSPTERCGTSF
NYISVGFNLYPVNETSCTTTAGHNEVIKTKEFTVTLNYTDCDPVFHTEYYATSGKEG
AGGFFTGTDIYQNTTKVCTLNVEIQCSEGDDIHTLQKTNGGSTMPHSETITVVGSCLS
DVNVDIMYSDTNHPGEVDDFVEYHWGTRLRFFPLPKRCTPVS
SEO ID NO：46
UL144蛋白的全长序列(HCMV)
GenBank登记号    AF179208
175个氨基酸
MKPLVMLICFAVILLQLGVTKVCQHNEVQLGNECCPPCGSGQRVTKVCTDYTSVTC
TPCPNGTYVSGLYNCTDCTECNDTEVTIRNCTSTNNTVCASKNYTSFSISGVQHHKQ
RQNHTAHVTVKQGKSGRHTLARLSLFIFLVGIILLILYLIAAYRSEKCQQCCSIGKIFY
RTL
SEQ ID NO：47
CrmC蛋白的全长序列(牛痘病毒)
GenBank登记号    AF482758
186个氨基酸
MDIKNLLTVCTILYISTLVTADIPTSSLPHAPVNGSCDDGEYLDKTHNQCCNRCPPGE
FAKIRCSGSDNTKCERCPPHTYTTVPNYSNGCHQCRKCPTGSFDKVKCTGTQNSKC
SCLPGWFCATDSSKTEDCRDCIPKRKCPCGYFGGIDELGNPLCKSCCVGEYCDDIRN
HRVGPFPPCKLSKCN
SEQ ID NO：48
CrmC(A53R)蛋白的全长序列(痘苗病毒)
GenBank登记号    AJ416893
186个氨基酸
MDIKNLLTACTIFYITTLATADIPTSSLPHAPVNGSCDEGEYLDKRHNQCCNRCPPGE
FAKVRCNGNDNTKCERCPPHTYTAIPNYSNGCHQCRKCPTGSFDKVKCTGTQNSK
CSCLPGWYCATDSSQTEDCRDCIPKRRCPCGYFGGIDEQGNPICKSCCVGEYCDYL
RNYRLDPFPPCKLSKCN
SEQ ID NO：49
CrmD蛋白的全长序列(牛痘病毒)
GenBank登记号    U87581
148个氨基酸
MMKMTPSYILLVYMFVVVSGDVPYEHINGKCNGTDYNSNSNNLCCKQCDPGMYM
THSCNTTSNTKCDKCPDGTFTSIPNHIPTCLSCRGKCSSNQVETKSCSNTQAEYVSV
HPDTTANLKDQMVAGYVYHKQSVILVTAYMATHLKEM
SEQ ID NO：50
CrmE蛋白的全长序列(牛痘病毒)
GenBank登记号    AJ272008
167个氨基酸
MTKVIIILGFLIINTNSLSMKCEQGVSYYNSQELKCCKLCKPGTYSDHRCDKYSDTIC
GHCPSDTFTSIYNRSPWCHSCRGSCGTNRVEVTPCTPTTNRICHCDSNSYCLLKASD
GNCVTCAPKTKCGRGYGKKGEDEMGNTICKKCRKGTYSDIVSDSDQCKPMTR
SEQ ID NO：51
ORF167L假定蛋白的全长序列(淋巴囊肿病病毒)
GenBank登记号    AY380826
289个氨基酸
MMLFILFLLPITVHTATDCPPGYYISKYYPAGTPMCSPCSPGTYTGLQNSLRKCLRCS
TCSHNEEPKVACSTTSDVQCQCRQGYYYDPESEMCFPCSNCESSKVKVTTCNRTHD
TVCKCKEGYYDKNGVCVKCGNCYLGEGVKSKCANNTDVTCELCKNGTFSDKVSS
SNICYLYTMCTLGLTQLNFNVTWFDTICINCSMSTDLLDLETFFTINFVTQRRFPEDD
LKNMFRLTYNKTRNDIDSANRDDVEGSFTYDPNLPYTMKQLDYLIASKFLMTAYK
KISQICQL
SEQ ID NO：52
EVM003蛋白的全长序列(小鼠脱脚病病毒)
GenBank登记号    NC_004105
320个氨基酸
MMKMTPSYILLVYMFVVVSGDVPYTPINGKCNGTDYNSNNLCCKQCNPGMYMTH
SCNTTSNTKCDKCPDDTFTSIPNHSPACLSCRGKCSSNQVETKSCSNTQDRVCVCAS
GYYCEFEGSNGCRLCVPQTKCGSGYGVYGYSSKGDVICKKCPGNIDKCDLSFNSID
VEINMYPVNKTSCNSSIGSSSTISTSELTITLTHEDCTPVFIGDYYSVVDKLATSGFFT
NDKVHQDLTTQCKINLEIKCNSGRESRQLTPTTKVYFMPHSETVTVVGDCLSNLDV
YIVYANTDAIYSDMDVVAYHTSYILNVDHIPPNDCERD
SEQ ID NO：53
CrmB蛋白的全长序列(骆驼痘病毒)
GenBank登记号    AF438165
349个氨基酸
MKSVLYSYILFLSCIIINGRDVTPYAPSNGKCKDNEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCD
SKTNTQCTPCGSGTFTSRNNHLPACLSCNGRCDSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYY
CILKGSSGCKACVSQTKCGIGYGVSGHTSAGDVICSPCGLGTYSRTVSSADKCEPVP
SNTFNYIDVEINLYPVNDTSCTRTTTTGISESISTSELTITMNHKDCDPVFREEYFSVL
NKVATSGFFTGENRYQNISKVCTLNFEIKCNNKGSSSKQLTKAKNDDGIMPHSETVT
LVGDCLSSVDIYILYSNTNTQDYETDTISYHAGNVLDVDSHMPGSCDIHKLITNSKPT
HFL
SEQ ID NO：54
TNFR2同系物蛋白的全长序列(猴痘病毒)
GenBank登记号    DQ011155
348个氨基酸
MRSVLYSYILFLSCIIINGRDLAPHAPSNGKCKDNEYRSRNLCCLSCPPGTYASRLCD
SKTNTQCTPCGSDTFTSHNNHLQACLSCNGRCDSNQVETRSCNTTHNRICECSPGY
YCLLKGSSGCRTCISKTKCGIGYGVSGYTSTGDVICSPCGPGTYSHTVSSTDKCEPVT
SNTFNYIDVEINLYPVNDTSCTRTTTTGLSESISTSELTITMNHKDCDPVFRAEYFSVL
NNVATSGFFTGENRYQNTSKICTLNFEIKCNNKDSSSKQLTKTKNDTIMPHSETVTL
VGDCLSSVDIYILYSNTNTQDYETDTISYHMGNVLDVNSHMPASCDIHKLITNSQNP
THL
SEQ ID NO：55
G2R蛋白的全长序列(类天花病毒)
GenBank登记号    U88151
349个氨基酸
MKSVLYLYILFLSCIIINGRDAAPYTPPNGKCKDTEYKRHNLCCLSCPPGTYASRLCD
SKTNTQCTPCGSGTFTSRNNHLPACLSCNGRCNSNQVETRSCNTTHNRICECSPGYY
CLLKGSSGCKACVSQTKCGIGYGVSGHTSVGDVICSPCGFGTYSYTVSSTDKCEPVP
NNTFNYIDVEITLYPVNDTSCTRTTTTGLSESILTSELTITMNHTDCNPVFREEYFSVL
NKVATSGFFTGENRYQNISKVCTLNFEIKCNNKGSSFKQLTKAKNDDGMMSHSETV
TLAGDCLSSVDIYILYSNTNAQDYETDTISYRVGNVLDDDSHMPGSCDIHKLITNSKP
TRFL
SEQ ID NO：56
假定蛋白的全长序列(空肠弯曲杆菌RM1221)
GenBank登记号    CP000025
547个氨基酸
MKILLLNENPVVSRLVSLSAKKMSYDFEELNAYSENLGNYDVIVVDSDTPAPLKILK
EKCDRLIFLAPRNQNVEDIDAQILQKPFLPTDFLNLLNNKDANKHTSIDLPMLSNDEN
PYADISLDLDNLNLDDLPDENSLDINSEGMEDLSFDDDAQDDNANKTLETQNLEHD
NLEQETIKEQTQEDTQTDLDLTLEDSESEKEDLSQEHTALDTEPSLDELDDKNDEDL
EIKEDDKNEEIEKQELLDDSKTNTLEMQEELSESQDDNANKTLETQNLEHDNLEQET
IKEQTQEDTQTDLDLTLEDGESEKEDLSQEHTALDTEPSLDELDDKNDEDLEDNKEL
QANISDFDDLPEVEEQEKEMDFDDLPEDAEFLGQAKYNEESEENLEEFAPVVEEDV
QDEIDDFASNLSTQDQIKEELAQLDELDYGIDSDNSSKVLEDFKDEPILDDKELGTNE
EEVVVPNLNISDFDTLKESDIQEALGEEILEKNEEPIVSDVTKDDNSEEIVNELSQSIA
GAITSSIKDDTLKAAKGMNMNININISFKED
SEQ ID NO：57
假定蛋白的全长序列(布氏锥虫)
GenBank登记号    AC091702
496个氨基酸
MLRCRVADVVSSDQMCEMTNFPPVQATVGYVQLLRRLSFKREFFVPFVPTKHVIFT
FQTRNPLEEGKVKDEVTDLVSHYFNWIRERGVYSFQILQLYVCILSGCTVVVIE
CPDTLTTLDVHSFSQEPEAPTVGKRRVLVFPCDNDEISDSELESNYYIVPTCTLCAER
LEPTLTGYSSPTCSCVDGRECRCLLEQSSCVVCQTSITMQHESQKVQCEQCSRTGDP
WICLVCGYVGCSRYQAKHAREHYLQHKHLFSMSLLTQQIWDYDSDAFVHRVVVLL
DNATGAVNRVQYPDRDNIPSSLADEYVDAAAEKVSKKHINAKFDSKVETSNEQLA
LMIISELNTRRVEYETEMHGGSHHLNDELMGDPSLCSVIVAERACAASRERWWQLH
NANKSIQEELMQRRREEEAHQKTIDELQQELRSVVQHYATREYSLLTEINELRQTIT
DVETNLRTFAKLSRGLGNDTLEHVRIVGGTKEPKPRRRGGNNTRDGRA
SEQ ID NO：58
假定蛋白的全长序列(金黄色葡萄球菌)
GenBank登记号    BA000017
680个氨基酸
MEIFETILIFIAVVILSSFVHTFIPKVPLAFIQIFLGMLLFITPIPVQFNFDSELFMVTMIAP
LLFVEGVNVSRVHLRKYIKPVMMMALGLVITTVIGVGLFIHWIWPDLPIGAAFAIAAI
LCPTDAVAVQAITKGKVLPKGAMTILEGESLLNDAAGIISFKIAVGVLVTGAFSLVD
AVQLFLIASIGGAVVGLLIGMALVRFRLTLMRRGYENINMFTIIQLLTPFVTYLIAELF
HASGIIAAVVAGLVHGFERDRIMQVRTQLQMSYNHTWNILGYVLNGFVFSILGFLVP
EVIIKIIKTEPHNLIFLIGITIVVALAVYLFRFVWVYVLYPYFYLAISPFQKMMTKNDD
DNPTTEKPPKRSLYALIMTLCGVHGTISLAIALTLPYFLAGHHAFTYRNDLLFIASGM
VIISLVVAQVLLPLLTKPAPKTVIGNMSFKVARIYILEQVIDYLNQKSTFETSFKYGNV
IKEYHDKLAFLKTVEKDDENSKELERLQKLAFNVETKTLESLVDEGQITNSVLENYM
RYAERTQVYRQASLIRRMIVLLRGALLKRRVQTRVNSASSLSVTDNLMELNKINKL
VHYNVVSRLSKETTKDNTLEIGMVCDGYLMRIENLTPSNFFNSASEDTITKIKLNAL
REQRRILRELIDTDEVSEGTALKLREAINYDEMVIVDSMT
SEQ ID NO.59
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEF
PNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYG
VSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYD
ALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQAT
FGGGDHPPKSDLVPRGSPEFLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKC
HKGTYLYNDCPGPGQDTDCREFPGRLERPHRD
SEQ ID NO：60
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEF
PNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYG
VSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYD
ALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQAT
FGGGDHPPKSDLVPRGSPEFYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHA
KVFCTKTSDTVCDEFPGRLERPHRD
SEQ ID NO.61
TCCATGACGTTCCTGATGCT
序列表
<110>The Government of the United States of America，as represented by theSecretary，Department of Health and Human Services
Lenardo，Michael J.
Chang，Francis Ka-Ming
Siegel，Richard M.
<120>通过靶向肿瘤坏死因子受体的前配体装配域(PLAD)来缓解炎性关节炎
<130>14014/0365P2
<140>PCT/US2006/024909
<141>2006-06-26
<150>60/694,015
<151>2005-06-24
<150>60/717,589
<151>2005-09-16
<160>61
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>54
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>1
Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro
 1               5                  10                  15
Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys
            20                  25                  30
Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Asp Thr Asp Cys Arg Glu
    50
<210>2
<211>45
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>2
Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp
 1               5                  10                  15
Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala
            20                  25                  30
Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp
        35                  40                  45
<210>3
<211>43
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>3
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
 1               5                  10                  15
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
            20                  25                  30
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys
        35                  40
<210>4
<211>66
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>4
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
 1               5                  10                  15
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
            20                  25                  30
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
    50                  55                  60
Asp Cys
65
<210>5
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>5
Cys Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys
 1               5                  10                  15
Cys Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg
            20                  25                  30
Ile Arg Asp Thr Val Cys
        35
<210>6
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>6
Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys
 1               5                  10                  15
Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr GIu Thr
            20                  25                  30
Glu Cys
<210>7
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>7
Cys His Gly Asn Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys
 1               5                  10                  15
Cys Tyr Arg Cys Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln
            20                  25                  30
Arg Pro Thr Asp Cys Arg Lys Gln Cys
        35                  40
<210>8
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>8
Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met
1                5                  10                  15
Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys
            20                  25                  30
Ala Ala Gln Cys
        35
<210>9
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>9
Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys
1                5                  10                  15
Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr
            20                  25                  30
<210>10
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>10
Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys
1                5                  10                  15
Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr
            20                  25                  30
Val Cys
<210>11
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>11
Cys Asn Arg Cys Thr Glu Gly Val Gly Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn
1                5                  10                  15
Leu Phe Ala Cys Leu Pro Cys Thr Ala Cys Lys Ser Asp Glu
            20                  25                  30
<210>12
<211>455
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>12
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1                5                  10                  15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
            20                  25                  30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
        35                  40                  45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
    50                  55                  60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65                  70                  75                  80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
                85                  90                  95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
            100                 105                 110
Glu Tle Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
        115                 120                 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
    130                 135                 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145                 150                 155                 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
                165                 170                 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
            180                 185                 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
        195                 200                 205
Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu
    210                 215                 220
Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys
225                 230                 235                 240
Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu
                245                 250                 255
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser
            260                 265                 270
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val
        275                 280                 285
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys
    290                 295                 300
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly
305                 310                 315                 320
Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn
                325                 330                 335
Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp
            340                 345                 350
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro
        355                 360                 365
Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu
    370                 375                 380
Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala
                405                 410                 415
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly
            420                 425                 430
Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro
        435                 440                 445
Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg
    450                 455
<210>13
<211>461
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>13
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
 1               5                  10                  15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
            20                  25                  30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
        35                  40                  45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
    50                  55                  60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
                85                  90                  95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
            100                 105                 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
        115                 120                 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
    130                 135                 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145                 150                 155                 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
                165                 170                 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
            180                 185                 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
        195                 200                 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
    210                 215                 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225                 230                 235                 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
                245                 250                 255
Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly
            260                 265                 270
Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys
        275                 280                 285
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro
    290                 295                 300
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu
305                 310                 315                 320
Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser
                325                 330                 335
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly
            340                 345                 350
Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser
        355                 360                 365
Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile
    370                 375                 380
Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln
385                 390                 395                 400
Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro
                405                 410                 415
Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser
            420                 425                 430
Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro
        435                 440                 445
Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser
    450                 455                 460
<210>14
<211>335
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>14
Met Leu Gly Ile Trp Thr Leu Leu Pro Leu Val Leu Thr Ser Val Ala
 1               5                  10                  15
Arg Leu Ser Ser Lys Ser Val Asn Ala Gln Val Thr Asp Ile Asn Ser
            20                  25                  30
Lys Gly Leu Glu Leu Arg Lys Thr Val Thr Thr Val Glu Thr Gln Asn
        35                  40                  45
Leu Glu Gly Leu His His Asp Gly Gln Phe Cys His Lys Pro Cys Pro
    50                  55                  60
Pro Gly Glu Arg Lys Ala Arg Asp Cys Thr Val Asn Gly Asp Glu Pro
65                  70                  75                  80
Asp Cys Val Pro Cys Gln Glu Gly Lys Glu Tyr Thr Asp Lys Ala His
                85                  90                  95
Phe Ser Ser Lys Cys Arg Arg Cys Arg Leu Cys Asp Glu Gly His Gly
            100                 105                 110
Leu Glu Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg Thr Gln Asn Thr Lys Cys Arg
        115                 120                 125
Cys Lys Pro Asn Phe Phe Cys Asn Ser Thr Val Cys Glu His Cys Asp
    130                 135                 140
Pro Cys Thr Lys Cys Glu His Gly Ile Ile Lys Glu Cys Thr Leu Thr
145                 150                 155                 160
Ser Asn Thr Lys Cys Lys Glu Glu Gly Ser Arg Ser Asn Leu Gly Trp
                165                 170                 175
Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Ile Pro Leu Ile Val Trp Val Lys Arg
            180                 185                 190
Lys Glu Val Gln Lys Thr Cys Arg Lys His Arg Lys Glu Asn Gln Gly
        195                 200                 205
Ser His Glu Ser Pro Thr Leu Asn Pro Glu Thr Val Ala Ile Asn Leu
    210                 215                 220
Ser Asp Val Asp Leu Ser Lys Tyr Ile Thr Thr Ile Ala Gly Val Met
225                 230                 235                 240
Thr Leu Ser Gln Val Lys Gly Phe Val Arg Lys Asn Gly Val Asn Glu
                245                 250                 255
Ala Lys Ile Asp Glu Ile Lys Asn Asp Asn Val Gln Asp Thr Ala Glu
            260                 265                 270
Gln Lys Val Gln Leu Leu Arg Asn Trp His Gln Leu His Gly Lys Lys
        275                 280                 285
Glu Ala Tyr Asp Thr Leu Ile Lys Asp Leu Lys Lys Ala Asn Leu Cys
    290                 295                 300
Thr Leu Ala Glu Lys Ile Gln Thr Ile Ile Leu Lys Asp Ile Thr Ser
305                 310                 315                 320
Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val
                325                 330                 335
<210>15
<211>435
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>15
Met Leu Leu Pro Trp Ala Thr Ser Ala Pro Gly Leu Ala Trp Gly Pro
 1               5                  10                  15
Leu Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Leu Ala Ala Ser Gln Pro Gln Ala
            20                  25                  30
Val Pro Pro Tyr Ala Ser Glu Asn Gln Thr Cys Arg Asp Gln Glu Lys
        35                  40                  45
Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys Cys Ser Arg Cys Pro Pro
    50                  55                  60
Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg Ile Arg Asp Thr Val Cys
65                  70                  75                  80
Ala Thr Cys Ala Glu Asn Ser Tyr Asn Glu His Trp Asn Tyr Leu Thr
                85                  90                  95
Ile Cys Gln Leu Cys Arg Pro Cys Asp Pro Val Met Gly Leu Glu Glu
            100                 105                 110
Ile Ala Pro Cys Thr Ser Lys Arg Lys Thr Gln Cys Arg Cys Gln Pro
        115                 120                 125
Gly Met Phe Cys Ala Ala Trp Ala Leu Glu Cys Thr His Cys Glu Leu
    130                 135                 140
Leu Ser Asp Cys Pro Pro Gly Thr Glu Ala Glu Leu Lys Asp Glu Val
145                 150                 155                 160
Gly Lys Gly Asn Asn His Cys Val Pro Cys Lys Ala Gly His Phe Gln
                165                 170                 175
Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ala Arg Cys Gln Pro His Thr Arg Cys Glu
            180                 185                 190
Asn Gln Gly Leu Val Glu Ala Ala Pro Gly Thr Ala Gln Ser Asp Thr
        195                 200                 205
Thr Cys Lys Asn Pro Leu Glu Pro Leu Pro Pro Glu Met Ser Gly Thr
    210                 215                 220
Met Leu Met Leu Ala Val Leu Leu Pro Leu Ala Phe Phe Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Ala Thr Val Phe Ser Cys Ile Trp Lys Ser His Pro Ser Leu Cys Arg
                245                 250                 255
Lys Leu Gly Ser Leu Leu Lys Arg Arg Pro Gln Gly Glu Gly Pro Asn
            260                 265                 270
Pro Val Ala Gly Ser Trp Glu Pro Pro Lys Ala His Pro Tyr Phe Pro
        275                 280                 285
Asp Leu Val Gln Pro Leu Leu Pro Ile Ser Gly Asp Val Ser Pro Val
    290                 295                 300
Ser Thr Gly Leu Pro Ala Ala Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Pro Gln
305                 310                 315                 320
Gln Gln Ser Pro Leu Asp Leu Thr Arg Glu Pro Gln Leu Glu Pro Gly
                325                 330                 335
Glu Gln Ser Gln Val Ala His Gly Thr Asn Gly Ile His Val Thr Gly
            340                 345                 350
Gly Ser Met Thr Ile Thr Gly Asn Ile Tyr Ile Tyr Asn Gly Pro Val
        355                 360                 365
Leu Gly Gly Pro Pro Gly Pro Gly Asp Leu Pro Ala Thr Pro Glu Pro
    370                 375                 380
Pro Tyr Pro Ile Pro Glu Glu Gly Asp Pro Gly Pro Pro Gly Leu Ser
385                 390                 395                 400
Thr Pro His Gln Glu Asp Gly Lys Ala Trp His Leu Ala Glu Thr Glu
                405                 410                 415
His Cys Gly Ala Thr Pro Ser Asn Arg Gly Pro Arg Asn Gln Phe Ile
            420                 425                 430
Thr His Asp
        435
<210>16
<211>277
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>16
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
 1               5                  10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
        35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
    50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
            100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
    130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
                165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
            180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
        195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
    210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
                245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
            260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
        275
<210>17
<211>595
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>17
Met Arg Val Leu Leu Ala Ala Leu Gly Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu
 1               5                  10                  15
Arg Ala Phe Pro Gln Asp Arg Pro Phe Glu Asp Thr Cys His Gly Asn
            20                  25                  30
Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys Cys Tyr Arg Cys
        35                  40                  45
Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln Arg Pro Thr Asp
    50                  55                  60
Cys Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Asp Arg
65                  70                  75                  80
Cys Thr Ala Cys Val Thr Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr
                85                  90                  95
Pro Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Val Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met
            100                 105                 110
Phe Cys Ser Thr Ser Ala Val Asn Ser Cys Ala Arg Cys Phe Phe His
        115                 120                 125
Ser Val Cys Pro Ala Gly Met Ile Val Lys Phe Pro Gly Thr Ala Gln
    130                 135                 140
Lys Asn Thr Val Cys Glu Pro Ala Ser Pro Gly Val Ser Pro Ala Cys
145                 150                 155                 160
Ala Ser Pro Glu Asn Cys Lys Glu Pro Ser Ser Gly Thr Ile Pro Gln
                165                 170                 175
Ala Lys Pro Thr Pro Val Ser Pro Ala Thr Ser Ser Ala Ser Thr Met
            180                 185                 190
Pro Val Arg Gly Gly Thr Arg Leu Ala Gln Glu Ala Ala Ser Lys Leu
        195                 200                 205
Thr Arg Ala Pro Asp Ser Pro Ser Ser Val Gly Arg Pro Ser Ser Asp
    210                 215                 220
Pro Gly Leu Ser Pro Thr Gln Pro Cys Pro Glu Gly Ser Gly Asp Cys
225                 230                 235                 240
Arg Lys Gln Cys Glu Pro Asp Tyr Tyr Leu Asp Glu Ala Gly Arg Cys
                245                 250                 255
Thr Ala Cys Val Ser Cys Ser Arg Asp Asp Leu Val Glu Lys Thr Pro
            260                 265                 270
Cys Ala Trp Asn Ser Ser Arg Thr Cys Glu Cys Arg Pro Gly Met Ile
        275                 280                 285
Cys Ala Thr Ser Ala Thr Asn Ser Cys Ala Arg Cys Val Pro Tyr Pro
    290                 295                 300
Ile Cys Ala Ala Glu Thr Val Thr Lys Pro Gln Asp Met Ala Glu Lys
305                 310                 315                 320
Asp Thr Thr Phe Glu Ala Pro Pro Leu Gly Thr Gln Pro Asp Cys Asn
                325                 330                 335
Pro Thr Pro Glu Asn Gly Glu Ala Pro Ala Ser Thr Ser Pro Thr Gln
            340                 345                 350
Ser Leu Leu Val Asp Ser Gln Ala Ser Lys Thr Leu Pro Ile Pro Thr
        355                 360                 365
Ser Ala Pro Val Ala Leu Ser Ser Thr Gly Lys Pro Val Leu Asp Ala
    370                 375                 380
Gly Pro Val Leu Phe Trp Val Ile Leu Val Leu Val Val Val Val Gly
385                 390                 395                 400
Ser Ser Ala Phe Leu Leu Cys His Arg Arg Ala Cys Arg Lys Arg Ile
                405                 410                 415
Arg Gln Lys Leu His Leu Cys Tyr Pro Val Gln Thr Ser Gln Pro Lys
            420                 425                 430
Leu Glu Leu Val Asp Ser Arg Pro Arg Arg Ser Ser Thr Gln Leu Arg
        435                 440                 445
Ser Gly Ala Ser Val Thr Glu Pro Val Ala Glu Glu Arg Gly Leu Met
    450                 455                 460
Ser Gln Pro Leu Met Glu Thr Cys His Ser Val Gly Ala Ala Tyr Leu
465                 470                 475                 480
Glu Ser Leu Pro Leu Gln Asp Ala Ser Pro Ala Gly Gly Pro Ser Ser
                485                 490                 495
Pro Arg Asp Leu Pro Glu Pro Arg Val Ser Thr Glu His Thr Asn Asn
            500                 505                 510
Lys Ile Glu Lys Ile Tyr Ile Met Lys Ala Asp Thr Val Ile Val Gly
        515                 520                 525
Thr Val Lys Ala Glu Leu Pro Glu Gly Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ala
    530                 535                 540
Glu Pro Glu Leu Glu Glu Glu Leu Glu Ala Asp His Thr Pro His Tyr
545                 550                 555                 560
Pro Glu Gln Glu Thr Glu Pro Pro Leu Gly Ser Cys Ser Asp Val Met
                565                 570                 575
Leu Ser Val Glu Glu Glu Gly Lys Glu Asp Pro Leu Pro Thr Ala Ala
            580                 585                 590
Ser Gly Lys
        595
<210>18
<211>260
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>18
Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val
 1               5                  10                  15
Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr
            20                  25                  30
Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe
        35                  40                  45
Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro
    50                  55                  60
Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His
65                  70                  75                  80
Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys
                85                  90                  95
Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys
            100                 105                 110
Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu
        115                 120                 125
Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His
    130                 135                 140
Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met
145                 150                 155                 160
Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr
                165                 170                 175
His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile
            180                 185                 190
Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala
        195                 200                 205
Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu Ser
    210                 215                 220
Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr Ser Cys Pro Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu Pro
                245                 250                 255
Ala Cys Ser Pro
            260
<210>19
<211>283
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>19
Met Glu Pro Pro Gly Asp Trp Gly Pro Pro Pro Trp Arg Ser Thr Pro
1                5                  10                  15
Arg Thr Asp Val Leu Arg Leu Val Leu Tyr Leu Thr Phe Leu Gly Ala
            20                  25                  30
Pro Cys Tyr Ala Pro Ala Leu Pro Ser Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro
        35                  40                  45
Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys
    50                  55                  60
Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr Val Cys Glu Pro Cys Pro Pro
65                  70                  75                  80
Gly Thr Tyr Ile Ala His Leu Asn Gly Leu Ser Lys Cys Leu Gln Cys
               85                  90                  95
Gln Met Cys Asp Pro Ala Met Gly Leu Arg Ala Ser Arg Asn Cys Ser
            100                 105                 110
Arg Thr Glu Asn Ala Val Cys Gly Cys Ser Pro Gly His Phe Cys Ile
        115                  120                125
Val Gln Asp Gly Asp His Cys Ala Ala Cys Arg Ala Tyr Ala Thr Ser
    130                  135                140
Ser Pro Gly Gln Arg Val Gln Lys Gly Gly Thr Glu Ser Gln Asp Thr
145                 150                 155                 160
Leu Cys Gln Asn Cys Pro Pro Gly Thr Phe Ser Pro Asn Gly Thr Leu
                165                 170                 175
Glu Glu Cys Gln His Gln Thr Lys Cys Ser Trp Leu Val Thr Lys Ala
            180                 185                 190
Gly Ala Gly Thr Ser Ser Ser His Trp Val Trp Trp Phe Leu Ser Gly
        195                 200                 205
Ser Leu Val Ile Val Ile Val Cys Ser Thr Val Gly Leu Ile Ile Cys
    210                 215                 220
Val Lys Arg Arg Lys Pro Arg Gly Asp Val Val Lys Val Ile Val Ser
225                 230                 235                 240
Val Gln Arg Lys Arg Gln Glu Ala Glu Gly Glu Ala Thr Val Ile Glu
                245                 250                 255
Ala Leu Gln Ala Pro Pro Asp Val Thr Thr Val Ala Val Glu Glu Thr
            260                 265                 270
Ile Pro Ser Phe Thr Gly Arg Ser Pro Asn His
        275                 280
<210>20
<211>277
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>20
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
 1               5                  10                  15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
             20                  25                  30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
        35                  40                  45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
    50                  55                  60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65                  70                  75                  80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
                85                  90                  95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
            100                 105                 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
        115                 120                 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
    130                 135                 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145                 150                 155                 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
                165                 170                 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
            180                 185                 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
        195                 200                 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
    210                 215                 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225                 230                 235                 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
            260                 265                 270
Thr Leu Ala Lys Ile
        275
<210>21
<211>468
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>21
Met Ala Pro Pro Pro Ala Arg Val His Leu Gly Ala Phe Leu Ala Val
 1               5                  10                  15
Thr Pro Asn Pro Gly Ser Ala Ala Ser Gly Thr Glu Ala Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Thr Pro Ser Lys Val Trp Gly Ser Ser Ala Gly Arg Ile Glu Pro Arg
        35                  40                  45
Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Pro Thr Ser Met Gly Gln His Gly Pro
    50                  55                  60
Ser Ala Arg Ala Arg Ala Gly Arg Ala Pro Gly Pro Arg Pro Ala Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ala Ser Pro Arg Leu Arg Val His Lys Thr Phe Lys Phe Val Val
                85                  90                  95
Val Gly Val Leu Leu Gln Val Val Pro Ser Ser Ala Ala Thr Ile Lys
            100                 105                 110
Leu His Asp Gln Ser Ile Gly Thr Gln Gln Trp Glu His Ser Pro Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Leu Cys Pro Pro Gly Ser His Arg Ser Glu Arg Pro Gly Ala
    130                 135                 140
Cys Asn Arg Cys Thr Glu Gly Val Gly Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn
145                 150                 155                 160
Leu Phe Ala Cys Leu Pro Cys Thr Ala Cys Lys Ser Asp Glu Glu Glu
                165                 170                 175
Arg Ser Pro Cys Thr Thr Thr Arg Asn Thr Ala Cys Gln Cys Lys Pro
            180                 185                 190
Gly Thr Phe Arg Asn Asp Asn Ser Ala Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser
        195                 200                 205
Thr Gly Cys Pro Arg Gly Met Val Lys Val Lys Asp Cys Thr Pro Trp
    210                 215                 220
Ser Asp Ile Glu Cys Val His Lys Glu Ser Gly Asn Gly His Asn Ile
225                 230                 235                 240
Trp Val Ile Leu Val Val Thr Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Val Ala
                245                 250                 255
Val Leu Ile Val Cys Cys Cys Ile Gly Ser Gly Cys Gly Gly Asp Pro
            260                 265                 270
Lys Cys Met Asp Arg Val Cys Phe Trp Arg Leu Gly Leu Leu Arg Gly
        275                 280                 285
Pro Gly Ala Glu Asp Asn Ala His Asn Glu Ile Leu Ser Asn Ala Asp
    290                 295                 300
Ser Leu Ser Thr Phe Val Ser Glu Gln Gln Met Glu Ser Gln Glu Pro
305                 310                 315                 320
Ala Asp Leu Thr Gly Val Thr Val Gln Ser Pro Gly Glu Ala Gln Cys
                325                 330                 335
Leu Leu Gly Pro Ala Glu Ala Glu Gly Ser Gln Arg Arg Arg Leu Leu
            340                 345                 350
Val Pro Ala Asn Gly Ala Asp Pro Thr Glu Thr Leu Met Leu Phe Phe
        355                 360                 365
Asp Lys Phe Ala Asn Ile Val Pro Phe Asp Ser Trp Asp Gln Leu Met
    370                 375                 380
Arg Gln Leu Asp Leu Thr Lys Asn Glu Ile Asp Val Val Arg Ala Gly
385                 390                 395                 400
Thr Ala Gly Pro Gly Asp Ala Leu Tyr Ala Met Leu Met Lys Trp Val
                405                 410                 415
Asn Lys Thr Gly Arg Asn Ala Ser Ile His Thr Leu Leu Asp Ala Leu
            420                 425                 430
Glu Arg Met Glu Glu Arg His Ala Lys Glu Lys Ile Gln Asp Leu Leu
        435                 440                 445
Val Asp Ser Gly Lys Phe Ile Tyr Leu Glu Asp Gly Thr Gly Ser Ala
    450                 455                 460
Val Ser Leu Glu
465
<210>22
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>22
Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys
 1               5                  10                  15
Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro
            20                  25                  30
Gly Gln Asp Thr Asp Cys
        35
<210>23
<211>36
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>23
Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser
 1               5                  10                  15
Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser
            20                  25                  30
Asp Thr Val Cys
35
<210>24
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>24
Cys Arg Asp Gln Glu Lys Glu Tyr Tyr Glu Pro Gln His Arg Ile Cys
 1               5                  10                  15
Cys Ser Arg Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Val Ser Ala Lys Cys Ser Arg
            20                  25                  30
Ile Arg Asp Thr Val Cys
        35
<210>25
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>25
Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys
 1               5                  10                  15
Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr
            20                  25                  30
Glu Cys
<210>26
<211>34
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>26
Cys Lys Glu Asp Glu Tyr Pro Val Gly Ser Glu Cys Cys Pro Lys Cys
 1               5                  10                  15
Ser Pro Gly Tyr Arg Val Lys Glu Ala Cys Gly Glu Leu Thr Gly Thr
            20                  25                  30
Val Cys
<210>27
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>27
Cys His Gly Asn Pro Ser His Tyr Tyr Asp Lys Ala Val Arg Arg Cys
1               5                   10                  15
Cys Tyr Arg Cys Pro Met Gly Leu Phe Pro Thr Gln Gln Cys Pro Gln
            20                  25                  30
Arg Pro Thr Asp Cys Arg Lys Gln Cys
        35                  40
<210>28
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>28
Pro Tyr Gly Ala Asp Arg Gly Lys Cys Arg Gly Asn Asp Tyr Glu Lys
 1               5                  10                  15
Asp Gly Leu Cys Cys Thr Ser Cys Pro Pro Gly Ser Tyr Ala Ser Arg
            20                  25                  30
Leu Cys Gly Pro Gly Ser Asp Thr Val Cys
        35                 40
<210>29
<211>28
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>29
Glu Lys Asp Gly Leu Cys Cys Ala Ser Cys His Pro Gly Phe Tyr Ala
 1               5                  10                  15
Ser Arg Leu Cys Gly Pro Gly Ser Asn Thr Val Cys
            20                  25
<210>30
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>30
Cys Thr Pro Cys Pro Asn Gly Thr Tyr Val Ser Gly Leu Tyr Asn Cys
 1               5                  10                  15
Thr Asp Cys Thr Glu Cys
            20
<210>31
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>31
His Ala Pro Val Asn Gly Ser Cys Asp Asp Gly Glu Tyr Leu Asp Lys
 1               5                  10                  15
Thr His Asn Gln Cys Cys Asn Arg Cys Pro Pro Gly Glu Phe Ala Lys
            20                  25                  30
Ile Arg Cys Ser Gly Ser Asp Asn Thr Lys Cys Glu
        35                  40
<210>32
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>32
His Ala Pro Val Asn Gly Ser Cys Asp Glu Gly Glu Tyr Leu Asp Lys
 1               5                  10                  15
Arg His Asn Gln Cys Cys Asn Arg Cys Pro Pro Gly Glu Phe Ala Lys
            20                  25                  30
Val Arg Cys Asn Gly Asn Asp Asn Thr Lys Cys Glu
        35                  40
<210>33
<211>37
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>33
Cys Asn Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Ash Ser Asn Asn Leu Cys Cys Lys
 1               5                  10                  15
Gln Cys Asp Pro Gly Met Tyr Met Thr His Ser Cys Ash Thr Thr Ser
            20                  25                  30
Asn Thr Lys Cys Asp
        35
<210>34
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>34
Tyr Tyr Asn Ser Gln Glu Leu Lys Cys Cys Lys Leu Cys Lys Pro Gly
 1               5                  10                  15
Thr Tyr Ser Asp His Arg Cys Asp Lys Tyr Ser Asp Thr Ile Cys
            20                  25                  30
<210>35
<211>38
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>35
Cys Arg Gln Gly Tyr Tyr Tyr Asp Pro Glu Ser Glu Met Cys Phe Pro
 1               5                  10                  15
Cys Ser Asn Cys Glu Ser Ser Lys Val Lys Val Thr Thr Cys Asn Arg
            20                  25                  30
Thr His Asp Thr Val Cys
        35
<210>36
<211>42
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>36
Tyr Thr Pro Ile Asn Gly Lys Cys Asn Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asn
 1               5                  10                  15
Asn Leu Cys Cys Lys Gln Cys Asn Pro Gly Met Tyr Met Thr His Ser
            20                  25                  30
Cys Asn Thr Thr Ser Asn Thr Lys Cys Asp
        35                  40
<210>37
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>37
Tyr Ala Pro Ser Asn Gly Lys Cys Lys Asp Asn Glu Tyr Lys Arg His
 1               5                  10                  15
Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu
            20                  25                  30
Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln Cys
        35                  40
<210>38
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>38
His Ala Pro Ser Asn Gly Lys Cys Lys Asp Asn Glu Tyr Arg Ser Arg
 1               5                  10                  15
Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu
            20                  25                  30
Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln
        35                  40
<210>39
<211>41
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>39
Tyr Thr Pro Pro Asn Gly Lys Cys Lys Asp Thr Glu Tyr Lys Arg His
 1               5                  10                  15
Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu
            20                  25                  30
Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln Cys
        35                  40
<210>40
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>40
Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
 1               5                  10                  15
Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly
            20                  25                  30
Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr
        35                  40                  45
Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg
    50                  55                  60
Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp
65                  70                  75                  80
Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu
                85                  90                  95
Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val
            100                 105                 110
His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys
        115                 120
<210>41
<211>33
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>41
Asp Ile Asn Ser Glu Gly Met Glu Asp Leu Ser Phe Asp Asp Asp Ala
 1               5                  10                  15
Gln Asp Asp Asn Ala Asn Lys Thr Leu Glu Thr Gln Asn Leu Glu His
            20                  25                  30
Asp
<210>42
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>42
Thr Glu Ile Asn Glu Leu Arg Gln Thr Ile Thr Asp Val Glu Thr Asn
 1               5                  10                  15
Leu
<210>43
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>43
Asp Glu Asn Ser Lys Glu Leu Glu Arg Leu Gln Lys Ile Ala Phe Asn
 1               5                  10                  15
Val Glu Thr Lys Thr Leu Glu Ser Leu Val Asp Glu Gly Gln
            20                  25                  30
<210>44
<211>326
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>44
Met Phe Arg Leu Thr Leu Leu Leu Ala Tyr Val Ala Cys Val Tyr Gly
 1               5                  10                  15
Gly Gly Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Arg Gly Lys Cys Arg Gly Asn Asp
            20                  25                  30
Tyr Glu Lys Asp Gly Leu Cys Cys Thr Ser Cys Pro Pro Gly Ser Tyr
        35                  40                  45
Ala Ser Arg Leu Cys Gly Pro Gly Ser Asp Thr Val Cys Ser Pro Cys
    50                  55                  60
Lys Asn Glu Thr Phe Thr Ala Ser Thr Asn His Ala Pro Ala Cys Val
65                  70                  75                  80
Ser Cys Arg Gly Arg Cys Thr Gly His Leu Ser Glu Ser Gln Ser Cys
                85                  90                  95
Asp Lys Thr Arg Asp Arg Val Cys Asp Cys Ser Ala Gly Asn Tyr Cys
            100                 105                 110
Leu Leu Lys Gly Gln Glu Gly Cys Arg Ile Cys Ala Pro Lys Thr Lys
        115                 120                 125
Cys Pro Ala Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Arg Thr Gly Asp Val
    130                 135                 140
Leu Cys Thr Lys Cys Pro Arg Tyr Thr Tyr Ser Asp Ala Val Ser Ser
145                 150                 155                 160
Thr Glu Thr Cys Thr Ser Ser Phe Asn Tyr Ile Ser Val Glu Phe Asn
                165                 170                 175
Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser Cys Thr Thr Thr Ala Gly Pro Asn
            180                 185                 190
Glu Val Val Lys Thr Ser Glu Phe Ser Val Thr Leu Asn His Thr Asp
        195                 200                 205
Cys Asp Pro Val Phe His Thr Glu Tyr Tyr Gly Thr Ser Gly Ser Glu
    210                 215                 220
Gly Ala Gly Gly Phe Phe Thr Gly Met Asp Arg Tyr Gln Asn Thr Thr
225                 230                 235                 240
Lys Met Cys Thr Leu Asn Ile Glu Ile Arg Cys Val Glu Gly Asp Ala
                245                 250                 255
Val Arg Thr Ile Pro Arg Thr Ser Asp Gly Val Gly Val Leu Ser His
            260                 265                 270
Ser Glu Thr Ile Thr Val Ile Gly Gly Cys Leu Ser Asp Val Asn Val
        275                 280                 285
Asp Ile Glu Tyr Ser Asp Ser Asn His Pro Glu Glu Val Asp Asp Phe
    290                 295                 300
Val Glu Tyr His Trp Gly Thr Arg Leu Arg Leu Phe Pro Ser Pro Lys
305                 310                 315                 320
Arg Cys Arg Leu Val Ser
                325
<210>45
<211>325
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>45
Met Leu Arg Leu Ile Ala Leu Leu Val Cys Val Val Tyr Val Tyr Gly
 1               5                  10                  15
Asp Asp Val Pro Tyr Ser Ser Asn Gln Gly Lys Cys Gly Gly His Asp
            20                  25                  30
Tyr Glu Lys Asp Gly Leu Cys Cys Ala Ser Cys His Pro Gly Phe Tyr
        35                  40                  45
Ala Ser Arg Leu Cys Gly Pro Gly Ser Asn Thr Val Cys Ser Pro Cys
    50                  55                  60
Glu Asp Gly Thr Phe Thr Ala Ser Thr Asn His Ala Pro Ala Cys Val
65                  70                  75                  80
Ser Cys Arg Gly Pro Cys Thr Gly His Leu Ser Glu Ser Gln Pro Cys
                85                  90                  95
Asp Arg Thr His Asp Arg Val Cys Asn Cys Ser Thr Gly Asn Tyr Cys
            100                 105                 110
Leu Leu Lys Gly Gln Asn Gly Cys Arg Ile Cys Ala Pro Gln Thr Lys
        115                 120                 125
Cys Pro Ala Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Arg Ala Gly Asp Thr
    130                 135                 140
Leu Cys Glu Lys Cys Pro Pro His Thr Tyr Ser Asp Ser Leu Ser Pro
145                 150                 155                 160
Thr Glu Arg Cys Gly Thr Ser Phe Asn Tyr Ile Ser Val Gly Phe Asn
                165                 170                 175
Leu Tyr Pro Val Asn Glu Thr Ser Cys Thr Thr Thr Ala Gly His Asn
            180                 185                 190
Glu Val Ile Lys Thr Lys Glu Phe Thr Val Thr Leu Asn Tyr Thr Asp
        195                 200                 205
Cys Asp Pro Val Phe His Thr Glu Tyr Tyr Ala Thr Ser Gly Lys Glu
    210                 215                 220
Gly Ala Gly Gly Phe Phe Thr Gly Thr Asp Ile Tyr Gln Asn Thr Thr
225                 230                 235                 240
Lys Val Cys Thr Leu Asn Val Glu Ile Gln Cys Ser Glu Gly Asp Asp
                245                 250                 255
Ile His Thr Leu Gln Lys Thr Asn Gly Gly Ser Thr Met Pro His Ser
            260                 265                 270
Glu Thr Ile Thr Val Val Gly Ser Cys Leu Ser Asp Val Asn Val Asp
        275                 280                 285
Ile Met Tyr Ser Asp Thr Asn His Pro Gly Glu Val Asp Asp Phe Val
    290                 295                 300
Glu Tyr His Trp Gly Thr Arg Leu Arg Phe Phe Pro Leu Pro Lys Arg
305                 310                 315                 320
Cys Thr Pro Val Ser
                325
<210>46
<211>175
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>46
Met Lys Pro Leu Val Met Leu Ile Cys Phe Ala Val Ile Leu Leu Gln
 1               5                  10                  15
Leu Gly Val Thr Lys Val Cys Gln His Asn Glu Val Gln Leu Gly Asn
            20                  25                  30
Glu Cys Cys Pro Pro Cys Gly Ser Gly Gln Arg Val Thr Lys Val Cys
        35                  40                  45
Thr Asp Tyr Thr Ser Val Thr Cys Thr Pro Cys Pro Asn Gly Thr Tyr
    50                  55                  60
Val Ser Gly Leu Tyr Asn Cys Thr Asp Cys Thr Glu Cys Ash Asp Thr
65                  70                  75                  80
Glu Val Thr Ile Arg Asn Cys Thr Ser Thr Asn Asn Thr Val Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Lys Asn Tyr Thr Ser Phe Ser Ile Ser Gly Val Gln His His Lys
            100                 105                 110
Gln Arg Gln Asn His Thr Ala His Val Thr Val Lys Gln Gly Lys Ser
        115                 120                 125
Gly Arg His Thr Leu Ala Arg Leu Ser Leu Phe Ile Phe Leu Val Gly
    130                 135                 140
Ile Ile Leu Leu Ile Leu Tyr Leu Ile Ala Ala Tyr Arg Ser Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys Gln Gln Cys Cys Ser Ile Gly Lys Ile Phe Tyr Arg Thr Leu
                165                 170                 175
<210>47
<211>186
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>47
Met Asp Ile Lys Asn Leu Leu Thr Val Cys Thr Ile Leu Tyr Ile Ser
 1               5                  10                  15
Thr Leu Val Thr Ala Asp Ile Pro Thr Ser Ser Leu Pro His Ala Pro
            20                  25                  30
Val Asn Gly Ser Cys Asp Asp Gly Glu Tyr Leu Asp Lys Thr His Asn
        35                  40                  45
Gln Cys Cys Asn Arg Cys Pro Pro Gly Glu Phe Ala Lys Ile Arg Cys
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Asp Asn Thr Lys Cys Glu Arg Cys Pro Pro His Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Thr Val Pro Asn Tyr Ser Asn Gly Cys His Gln Cys Arg Lys Cys
                85                  90                  95
Pro Thr Gly Ser Phe Asp Lys Val Lys Cys Thr Gly Thr Gln Asn Ser
            100                 105                 110
Lys Cys Ser Cys Leu Pro Gly Trp Phe Cys Ala Thr Asp Ser Ser Lys
        115                 120                 125
Thr Glu Asp Cys Arg Asp Cys Ile Pro Lys Arg Lys Cys Pro Cys Gly
    130                 135                 140
Tyr Phe Gly Gly Ile Asp Glu Leu Gly Asn Pro Leu Cys Lys Ser Cys
145                 150                 155                 160
Cys Val Gly Glu Tyr Cys Asp Asp Ile Arg Asn His Arg Val Gly Pro
                165                 170                 175
Phe Pro Pro Cys Lys Leu Ser Lys Cys Asn
            180                 185
<210>48
<211>186
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>48
Met Asp Ile Lys Asn Leu Leu Thr Ala Cys Thr Ile Phe Tyr Ile Thr
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ala Thr Ala Asp Ile Pro Thr Ser Ser Leu Pro His Ala Pro
            20                  25                  30
Val Asn Gly Ser Cys Asp Glu Gly Glu Tyr Leu Asp Lys Arg His Asn
        35                  40                  45
Gln Cys Cys Asn Arg Cys Pro Pro Gly Glu Phe Ala Lys Val Arg Cys
    50                  55                  60
Asn Gly Asn Asp Asn Thr Lys Cys Glu Arg Cys Pro Pro His Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Thr Ala Ile Pro Asn Tyr Ser Asn Gly Cys His Gln Cys Arg Lys Cys
                85                  90                  95
Pro Thr Gly Ser Phe Asp Lys Val Lys Cys Thr Gly Thr Gln Asn Ser
            100                 105                 110
Lys Cys Ser Cys Leu Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Thr Asp Ser Ser Gln
        115                 120                 125
Thr Glu Asp Cys Arg Asp Cys Ile Pro Lys Arg Arg Cys Pro Cys Gly
    130                 135                 140
Tyr Phe Gly Gly Ile Asp Glu Gln Gly Asn Pro Ile Cys Lys Ser Cys
145                 150                 155                 160
Cys Val Gly Glu Tyr Cys Asp Tyr Leu Arg Asn Tyr Arg Leu Asp Pro
                165                 170                 175
Phe Pro Pro Cys Lys Leu Ser Lys Cys Asn
            180                 185
<210>49
<211>148
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>49
Met Met Lys Met Thr Pro Ser Tyr Ile Leu Leu Val Tyr Met Phe Val
 1               5                  10                  15
Val Val Ser Gly Asp Val Pro Tyr Glu His Ile Asn Gly Lys Cys Asn
            20                  25                  30
Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asn Ser Asn Asn Leu Cys Cys Lys Gln Cys
        35                  40                  45
Asp Pro Gly Met Tyr Met Thr His Ser Cys Asn Thr Thr Ser Asn Thr
    50                  55                  60
Lys Cys Asp Lys Cys Pro Asp Gly Thr Phe Thr Ser Ile Pro Asn His
65                  70                  75                  80
Ile Pro Thr Cys Leu Ser Cys Arg Gly Lys Cys Ser Ser Asn Gln Val
                85                  90                  95
Glu Thr Lys Ser Cys Ser Asn Thr Gln Ala Glu Tyr Val Ser Val His
            100                 105                 110
Pro Asp Thr Thr Ala Asn Leu Lys Asp Gln Met Val Ala Gly Tyr Val
        115                 120                 125
Tyr His Lys Gln Ser Val Ile Leu Val Thr Ala Tyr Met Ala Thr His
    130                 135                 140
Leu Lys Glu Met
145
<210>50
<211>167
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>50
Met Thr Lys Val Ile Ile Ile Leu Gly Phe Leu Ile Ile Asn Thr Asn
 1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Met Lys Cys Glu Gln Gly Val Ser Tyr Tyr Asn Ser Gln
            20                  25                  30
Glu Leu Lys Cys Cys Lys Leu Cys Lys Pro Gly Thr Tyr Ser Asp His
        35                  40                  45
Arg Cys Asp Lys Tyr Ser Asp Thr Ile Cys Gly His Cys Pro Ser Asp
    50                  55                  60
Thr Phe Thr Ser Ile Tyr Asn Arg Ser Pro Trp Cys His Ser Cys Arg
65                  70                  75                  80
Gly Ser Cys Gly Thr Asn Arg Val Glu Val Thr Pro Cys Thr Pro Thr
                85                  90                  95
Thr Asn Arg Ile Cys His Cys Asp Ser Asn Ser Tyr Cys Leu Leu Lys
            100                 105                 110
Ala Ser Asp Gly Asn Cys Val Thr Cys Ala Pro Lys Thr Lys Cys Gly
        115                 120                 125
Arg Gly Tyr Gly Lys Lys Gly Glu Asp Glu Met Gly Asn Thr Ile Cys
    130                 135                 140
Lys Lys Cys Arg Lys Gly Thr Tyr Ser Asp Ile Val Ser Asp Ser Asp
145                 150                 155                 160
Gln Cys Lys Pro Met Thr Arg
                165
<210>51
<211>289
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>51
Met Met Leu Phe Ile Leu Phe Leu Leu Pro Ile Thr Val His Thr Ala
 1               5                  10                  15
Thr Asp Cys Pro Pro Gly Tyr Tyr Ile Ser Lys Val Tyr Pro Ala Gly
            20                  25                  30
Thr Pro Met Cys Ser Pro Cys Ser Pro Gly Thr Tyr Thr Gly Leu Gln
        35                  40                  45
Asn Ser Leu Arg Lys Cys Leu Arg Cys Ser Thr Cys Ser His Asn Glu
    50                  55                  60
Glu Pro Lys Val Ala Cys Ser Thr Thr Ser Asp Val Gln Cys Gln Cys
65                 70                  75                  80
Arg Gln Gly Tyr Tyr Tyr Asp Pro Glu Ser Glu Met Cys Phe Pro Cys
                85                  90                  95
Ser Asn Cys Glu Ser Ser Lys Val Lys Val Thr Thr Cys Asn Arg Thr
            100                 105                 110
His Asp Thr Val Cys Lys Cys Lys Glu Gly Tyr Tyr Asp Lys Asn Gly
        115                 120                 125
Val Cys Val Lys Cys Gly Asn Cys Tyr Leu Gly Glu Gly Val Lys Ser
    130                 135                 140
Lys Cys Ala Asn Asn Thr Asp Val Thr Cys Glu Leu Cys Lys Asn Gly
145                 150                 155                 160
Thr Phe Ser Asp Lys Val Ser Ser Ser Asn Ile Cys Tyr Leu Tyr Thr
                165                 170                 175
Met Cys Thr Leu Gly Leu Thr Gln Leu Asn Phe Asn Val Thr Trp Phe
            180                 185                 190
Asp Thr Ile Cys Ile Asn Cys Ser Met Ser Thr Asp Leu Leu Asp Leu
        195                 200                 205
Glu Thr Phe Phe Thr Ile Asn Phe Val Thr Gln Arg Arg Phe Pro Glu
    210                 215                 220
Asp Asp Leu Lys Asn Met Phe Arg Leu Thr Tyr Asn Lys Thr Arg Asn
225                 230                 235                 240
Asp Ile Asp Ser Ala Asn Arg Asp Asp Val Glu Gly Ser Phe Thr Tyr
                245                 250                 255
Asp Pro Asn Leu Pro Tyr Thr Met Lys Gln Leu Asp Tyr Leu Ile Ala
            260                 265                 270
Ser Lys Phe Leu Met Thr Ala Tyr Lys Lys Ile Ser Gln Ile Cys Gln
        275                 280                 285
Leu
<210>52
<211>320
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>52
Met Met Lys Met Thr Pro Ser Tyr Ile Leu Leu Val Tyr Met Phe Val
 1               5                  10                  15
Val Val Ser Gly Asp Val Pro Tyr Thr Pro Ile Asn Gly Lys Cys Asn
            20                  25                  30
Gly Thr Asp Tyr Asn Ser Asn Asn Leu Cys Cys Lys Gln Cys Asn Pro
        35                  40                  45
Gly Met Tyr Met Thr His Ser Cys Asn Thr Thr Ser Asn Thr Lys Cys
    50                  55                  60
Asp Lys Cys Pro Asp Asp Thr Phe Thr Ser Ile Pro Asn His Ser Pro
65                  70                  75                  80
Ala Cys Leu Ser Cys Arg Gly Lys Cys Ser Ser Asn Gln Val Glu Thr
                85                  90                  95
Lys Ser Cys Ser Asn Thr Gln Asp Arg Val Cys Val Cys Ala Ser Gly
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Glu Phe Glu Gly Ser Asn Gly Cys Arg Leu Cys Val Pro
        115                 120                 125
Gln Thr Lys Cys Gly Ser Gly Tyr Gly Val Tyr Gly Tyr Ser Ser Lys
    130                 135                 140
Gly Asp Val Ile Cys Lys Lys Cys Pro Gly Asn Ile Asp Lys Cys Asp
145                 150                 155                 160
Leu Ser Phe Asn Ser Ile Asp Val Glu Ile Asn Met Tyr Pro Val Asn
                165                 170                 175
Lys Thr Ser Cys Asn Ser Ser Ile Gly Ser Ser Ser Thr Ile Ser Thr
            180                 185                 190
Ser Glu Leu Thr Ile Thr Leu Thr His Glu Asp Cys Thr Pro Val Phe
        195                 200                 205
Ile Gly Asp Tyr Tyr Ser Val Val Asp Lys Leu Ala Thr Ser Gly Phe
    210                 215                 220
Phe Thr Asn Asp Lys Val His Gln Asp Leu Thr Thr Gln Cys Lys Ile
225                 230                 235                 240
Asn Leu Glu Ile Lys Cys Asn Ser Gly Arg Glu Ser Arg Gln Leu Thr
                245                 250                 255
Pro Thr Thr Lys Val Tyr Phe Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Val
            260                 265                 270
Val Gly Asp Cys Leu Ser Asn Leu Asp Val Tyr Ile Val Tyr Ala Asn
        275                 280                 285
Thr Asp Ala Ile Tyr Ser Asp Met Asp Val Val Ala Tyr His Thr Ser
    290                 295                 300
Tyr Ile Leu Asn Val Asp His Ile Pro Pro Asn Asp Cys Glu Arg Asp
305                 310                 315                 320
<210>53
<211>349
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>53
Met Lys Ser Val Leu Tyr Ser Tyr Ile Leu Phe Leu Ser Cys Ile Ile
 1               5                  10                  15
Ile Asn Gly Arg Asp Val Thr Pro Tyr Ala Pro Ser Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Asp Asn Glu Tyr Lys Arg His Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln
    50                  55                  60
Cys Thr Pro Cys Gly Ser Gly Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asp Ser Asn Gln Val Glu
                85                  90                  95
Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Glu Cys Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Tyr Tyr Cys Ile Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val
        115                 120                 125
Ser Gln Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Ser
    130                 135                 140
Ala Gly Asp Val Ile Cys Ser Pro Cys Gly Leu Gly Thr Tyr Ser Arg
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Ser Ala Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Ser Asn Thr Phe
                165                 170                 175
Asn Tyr Tle Asp Val Glu Ile Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser
            180                 185                 190
Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Ile Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val Phe Arg
    210                 215                 220
Glu Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe
225                 230                 235                 240
Thr Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Ser Lys Gln Leu Thr
            260                 265                 270
Lys Ala Lys Asn Asp Asp Gly Ile Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr
        275                 280                 285
Leu Val Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu Tyr Ser
    290                 295                 300
Asn Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr His Ala
305                 310                 315                 320
Gly Asn Val Leu Asp Val Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys Asp Ile
                325                 330                 335
His Lys Leu Ile Thr Asn Ser Lys Pro Thr His Phe Leu
            340                 345
<210>54
<211>348
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>54
Met Arg Ser Val Leu Tyr Ser Tyr Ile Leu Phe Leu Ser Cys Ile Ile
 1               5                  10                  15
Ile Asn Gly Arg Asp Leu Ala Pro His Ala Pro Ser Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Asp Asn Glu Tyr Arg Ser Arg Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln
    50                  55                  60
Cys Thr Pro Cys Gly Ser Asp Thr Phe Thr Ser His Asn Asn His Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asp Ser Asn Gln Val Glu
                85                  90                  95
Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Glu Cys Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Tyr Tyr Cys Leu Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Arg Thr Cys Ile
        115                 120                 125
Ser Lys Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly Tyr Thr Ser
    130                 135                 140
Thr Gly Asp Val Ile Cys Ser Pro Cys Gly Pro Gly Thr Tyr Ser His
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Ser Thr Asp Lys Cys Glu Pro Val Thr Ser Asn Thr Phe
                165                 170                 175
Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Asn Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser
            180                 185                 190
Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Ser Thr Ser
        195                 200                 205
Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Lys Asp Cys Asp Pro Val Phe Arg
    210                 215                 220
Ala Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Asn Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe
225                 230                 235                 240
Thr Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Thr Ser Lys Ile Cys Thr Leu Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Asp Ser Ser Ser Lys Gln Leu Thr
            260                 265                 270
Lys Thr Lys Asn Asp Thr Ile Met Pro His Ser Glu Thr Val Thr Leu
        275                 280                 285
Val Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu Tyr Ser Asn
    290                 295                 300
Thr Asn Thr Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr His Met Gly
305                 310                 315                 320
Asn Val Leu Asp Val Asn Ser His Met Pro Ala Ser Cys Asp Ile His
                325                 330                 335
Lys Leu Ile Thr Asn Ser Gln Asn Pro Thr His Leu
            340                 345
<210>55
<211>349
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>55
Met Lys Ser Val Leu Tyr Leu Tyr Ile Leu Phe Leu Ser Cys Ile Ile
 1               5                  10                  15
Ile Asn Gly Arg Asp Ala Ala Pro Tyr Thr Pro Pro Asn Gly Lys Cys
            20                  25                  30
Lys Asp Thr Glu Tyr Lys Arg His Asn Leu Cys Cys Leu Ser Cys Pro
        35                  40                  45
Pro Gly Thr Tyr Ala Ser Arg Leu Cys Asp Ser Lys Thr Asn Thr Gln
    50                  55                  60
Cys Thr Pro Cys Gly Ser Gly Thr Phe Thr Ser Arg Asn Asn His Leu
65                  70                  75                  80
Pro Ala Cys Leu Ser Cys Asn Gly Arg Cys Asn Ser Asn Gln Val Glu
                85                  90                  95
Thr Arg Ser Cys Asn Thr Thr His Asn Arg Ile Cys Glu Cys Ser Pro
            100                 105                 110
Gly Tyr Tyr Cys Leu Leu Lys Gly Ser Ser Gly Cys Lys Ala Cys Val
        115                 120                 125
Ser Gln Thr Lys Cys Gly Ile Gly Tyr Gly Val Ser Gly His Thr Ser
    130                 135                 140
Val Gly Asp Val Ile Cys Ser Pro Cys Gly Phe Gly Thr Tyr Ser Tyr
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Ser Thr Asp Lys Cys Glu Pro Val Pro Asn Asn Thr Phe
                165                 170                 175
Asn Tyr Ile Asp Val Glu Ile Thr Leu Tyr Pro Val Asn Asp Thr Ser
            180                 185                 190
Cys Thr Arg Thr Thr Thr Thr Gly Leu Ser Glu Ser Ile Leu Thr Ser
        195                 200                 205
Glu Leu Thr Ile Thr Met Asn His Thr Asp Cys Asn Pro Val Phe Arg
    210                 215                 220
Glu Glu Tyr Phe Ser Val Leu Asn Lys Val Ala Thr Ser Gly Phe Phe
225                 230                 235                 240
Thr Gly Glu Asn Arg Tyr Gln Asn Ile Ser Lys Val Cys Thr Leu Asn
                245                 250                 255
Phe Glu Ile Lys Cys Asn Asn Lys Gly Ser Ser Phe Lys Gln Leu Thr
            260                 265                 270
Lys Ala Lys Asn Asp Asp Gly Met Met Ser His Ser Glu Thr Val Thr
        275                 280                 285
Leu Ala Gly Asp Cys Leu Ser Ser Val Asp Ile Tyr Ile Leu Tyr Ser
    290                 295                 300
Asn Thr Asn Ala Gln Asp Tyr Glu Thr Asp Thr Ile Ser Tyr Arg Val
305                 310                 315                 320
Gly Asn Val Leu Asp Asp Asp Ser His Met Pro Gly Ser Cys Asp Ile
                325                 330                 335
His Lys Leu Ile Thr Asn Ser Lys Pro Thr Arg Phe Leu
            340                 345
<210>56
<211>547
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>56
Met Lys Ile Leu Leu Leu Asn Glu Asn Pro Val Val Ser Arg Leu Val
 1               5                  10                  15
Ser Leu Ser Ala Lys Lys Met Ser Tyr Asp Phe Glu Glu Leu Asn Ala
            20                  25                  30
Tyr Ser Glu Asn Leu Gly Asn Tyr Asp Val Ile Val Val Asp Ser Asp
        35                  40                  45
Thr Pro Ala Pro Leu Lys Ile Leu Lys Glu Lys Cys Asp Arg Leu Ile
    50                  55                  60
Phe Leu Ala Pro Arg Asn Gln Asn Val Glu Asp Ile Asp Ala Gln Ile
65                  70                  75                  80
Leu Gln Lys Pro Phe Leu Pro Thr Asp Phe Leu Asn Leu Leu Asn Asn
                85                  90                  95
Lys Asp Ala Asn Lys His Thr Ser Ile Asp Leu Pro Met Leu Ser Asn
            100                 105                 110
Asp Glu Asn Pro Tyr Ala Asp Ile Ser Leu Asp Leu Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Leu Asp Asp Leu Pro Asp Glu Asn Ser Leu Asp Ile Asn Ser Glu Gly
    130                 135                 140
Met Glu Asp Leu Ser Phe Asp Asp Asp Ala Gln Asp Asp Asn Ala Asn
145                 150                 155                 160
Lys Thr Leu Glu Thr Gln Asn Leu Glu His Asp Asn Leu Glu Gln Glu
                165                 170                 175
Thr Ile Lys Glu Gln Thr Gln Glu Asp Thr Gln Thr Asp Leu Asp Leu
            180                 185                 190
Thr Leu Glu Asp Ser Glu Ser Glu Lys Glu Asp Leu Ser Gln Glu His
        195                 200                 205
Thr Ala Leu Asp Thr Glu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Asp Asp Lys Asn
    210                 215                 220
Asp Glu Asp Leu Glu Ile Lys Glu Asp Asp Lys Asn Glu Glu Ile Glu
225                 230                 235                 240
Lys Gln Glu Leu Leu Asp Asp Ser Lys Thr Asn Thr Leu Glu Met Gln
                245                 250                 255
Glu Glu Leu Ser Glu Ser Gln Asp Asp Asn Ala Asn Lys Thr Leu Glu
            260                 265                 270
Thr Gln Asn Leu Glu His Asp Asn Leu Glu Gln Glu Thr Ile Lys Glu
        275                 280                 285
Gln Thr Gln Glu Asp Thr Gln Thr Asp Leu Asp Leu Thr Leu Glu Asp
    290                 295                 300
Gly Glu Ser Glu Lys Glu Asp Leu Ser Gln Glu His Thr Ala Leu Asp
305                 310                 315                 320
Thr Glu Pro Ser Leu Asp Glu Leu Asp Asp Lys Asn Asp Glu Asp Leu
                325                 330                 335
Glu Asp Asn Lys Glu Leu Gln Ala Asn Ile Ser Asp Phe Asp Asp Leu
            340                 345                 350
Pro Glu Val Glu Glu Gln Glu Lys Glu Met Asp Phe Asp Asp Leu Pro
        355                 360                 365
Glu Asp Ala Glu Phe Leu Gly Gln Ala Lys Tyr Asn Glu Glu Ser Glu
    370                 375                 380
Glu Asn Leu Glu Glu Phe Ala Pro Val Val Glu Glu Asp Val Gln Asp
385                 390                 395                 400
Glu Ile Asp Asp Phe Ala Ser Asn Leu Ser Thr Gln Asp Gln Ile Lys
                405                 410                 415
Glu Glu Leu Ala Gln Leu Asp Glu Leu Asp Tyr Gly Ile Asp Ser Asp
            420                 425                 430
Asn Ser Ser Lys Val Leu Glu Asp Phe Lys Asp Glu Pro Ile Leu Asp
        435                 440                 445
Asp Lys Glu Leu Gly Thr Asn Glu Glu Glu Val Val Val Pro Asn Leu
    450                 455                 460
Asn Ile Ser Asp Phe Asp Thr Leu Lys Glu Ser Asp Ile Gln Glu Ala
465                 470                 475                 480
Leu Gly Glu Glu Ile Leu Glu Lys Asn Glu Glu Pro Ile Val Ser Asp
                485                 490                 495
Val Thr Lys Asp Asp Asn Ser Glu Glu Ile Val Asn Glu Leu Ser Gln
            500                 505                 510
Ser Ile Ala Gly Ala Ile Thr Ser Ser Ile Lys Asp Asp Thr Leu Lys
        515                 520                 525
Ala Ala Leu Lys Gly Met Asn Met Asn Ile Asn Ile Asn Ile Ser Phe
    530                 535                 540
Lys Glu Asp
545
<210>57
<211>496
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>57
Met Leu Arg Cys Arg Val Ala Asp Val Val Ser Ser Asp Gln Met Cys
 1               5                  10                  15
Glu Met Thr Asn Phe Pro Pro Val Gln Ala Thr Val Gly Tyr Val Gln
            20                  25                  30
Leu Leu Arg Arg Leu Ser Phe Lys Arg Glu Phe Phe Val Pro Phe Val
        35                  40                  45
Pro Thr Lys His Val Ile Phe Thr Phe Gln Thr Arg Asn Pro Leu Glu
    50                  55                  60
Glu Gly Lys Val Lys Asp Glu Val Thr Asp Leu Val Ser His Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Asn Trp Ile Arg Glu Arg Gly Val Tyr Ser Phe Gln Ile Leu Gln Leu
                85                  90                  95
Tyr Val Cys Ile Leu Ser Gly Cys Thr Val Val Val Ile Glu Cys Pro
            100                 105                 110
Asp Thr Leu Thr Thr Leu Asp Val His Ser Phe Ser Gln Glu Pro Glu
        115                 120                 125
Ala Pro Thr Val Gly Lys Arg Arg Val Leu Val Phe Pro Cys Asp Asn
    130                 135                 140
Asp Glu Ile Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Asn Tyr Tyr Ile Val Pro
145                 150                 155                 160
Thr Cys Thr Leu Cys Ala Glu Arg Leu Glu Pro Thr Leu Thr Gly Tyr
                165                 170                 175
Ser Ser Pro Thr Cys Ser Cys Val Asp Gly Arg Glu Cys Arg Cys Leu
            180                 185                 190
Leu Glu Gln Ser Ser Cys Val Val Cys Gln Thr Ser Ile Thr Met Gln
        195                 200                 205
His Glu Ser Gln Lys Val Gln Cys Glu Gln Cys Ser Arg Thr Gly Asp
    210                 215                 220
Pro Trp Ile Cys Leu Val Cys Gly Tyr Val Gly Cys Ser Arg Tyr Gln
225                 230                 235                 240
Ala Lys His Ala Arg Glu His Tyr Leu Gln His Lys His Leu Phe Ser
                245                 250                 255
Met Ser Leu Leu Thr Gln Gln Ile Trp Asp Tyr Asp Ser Asp Ala Phe
            260                 265                 270
Val His Arg Val Val Val Leu Leu Asp Asn Ala Thr Gly Ala Val Asn
        275                 280                 285
Arg Val Gln Tyr Pro Asp Arg Asp Asn Ile Pro Ser Ser Leu Ala Asp
    290                 295                 300
Glu Tyr Val Asp Ala Ala Ala Glu Lys Val Ser Lys Lys His Ile Asn
305                 310                 315                 320
Ala Lys Phe Asp Ser Lys Val Glu Thr Ser Asn Glu Gln Leu Ala Leu
                325                 330                 335
Met Ile Ile Ser Glu Leu Asn Thr Arg Arg Val Glu Tyr Glu Thr Glu
            340                 345                 350
Met His Gly Gly Ser His His Leu Asn Asp Glu Leu Met Gly Asp Pro
        355                 360                 365
Ser Leu Cys Ser Val Ile Val Ala Glu Arg Ala Cys Ala Ala Ser Arg
    370                 375                 380
Glu Arg Trp Trp Gln Leu His Asn Ala Asn Lys Ser Ile Gln Glu Glu
385                 390                 395                 400
Leu Met Gln Arg Arg Arg Glu Glu Glu Ala His Gln Lys Thr Ile Asp
                405                 410                 415
Glu Leu Gln Gln Glu Leu Arg Ser Val Val Gln His Tyr Ala Thr Arg
            420                 425                 430
Glu Tyr Ser Leu Leu Thr Glu Ile Asn Glu Leu Arg Gln Thr Ile Thr
        435                 440                 445
Asp Val Glu Thr Asn Leu Arg Thr Phe Ala Lys Leu Ser Arg Gly Leu
    450                 455                 460
Gly Asn Asp Thr Leu Glu His Val Arg Ile Val Gly Gly Thr Lys Glu
465                 470                 475                 480
Pro Lys Pro Arg Arg Arg Gly Gly Asn Asn Thr Arg Asp Gly Arg Ala
                485                 490                 495
<210>58
<211>680
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>58
Met Glu Ile Phe Glu Thr Ile Leu Ile Phe Ile Ala Val Val Ile Leu
 1               5                  10                  15
Ser Ser Phe Val His Thr Phe Ile Pro Lys Val Pro Leu Ala Phe Ile
            20                  25                  30
Gln Ile Phe Leu Gly Met Leu Leu Phe Ile Thr Pro Ile Pro Val Gln
        35                  40                  45
Phe Asn Phe Asp Ser Glu Leu Phe Met Val Thr Met Ile Ala Pro Leu
    50                  55                  60
Leu Phe Val Glu Gly Val Asn Val Ser Arg Val His Leu Arg Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Ile Lys Pro Val Met Met Met Ala Leu Gly Leu Val Ile Thr Thr Val
                85                  90                  95
Ile Gly Val Gly Leu Phe Ile His Trp Ile Trp Pro Asp Leu Pro Ile
            100                 105                 110
Gly Ala Ala Phe Ala Ile Ala Ala Ile Leu Cys Pro Thr Asp Ala Val
        115                 120                 125
Ala Val Gln Ala Ile Thr Lys Gly Lys Val Leu Pro Lys Gly Ala Met
    130                 135                 140
Thr Ile Leu Glu Gly Glu Ser Leu Leu Asn Asp Ala Ala Gly Ile Ile
145                 150                 155                 160
Ser Phe Lys Ile Ala Val Gly Val Leu Val Thr Gly Ala Phe Ser Leu
                165                 170                 175
Val Asp Ala Val Gln Leu Phe Leu Ile Ala Ser Ile Gly Gly Ala Val
            180                 185                 190
Val Gly Leu Leu Ile Gly Met Ala Leu Val Arg Phe Arg Leu Thr Leu
        195                 200                 205
Met Arg Arg Gly Tyr Glu Asn Ile Asn Met Phe Thr Ile Ile Gln Leu
    210                 215                 220
Leu Thr Pro Phe Val Thr Tyr Leu Ile Ala Glu Leu Phe His Ala Ser
225                 230                 235                 240
Gly Ile Ile Ala Ala Val Val Ala Gly Leu Val His Gly Phe Glu Arg
                245                 250                 255
Asp Arg Ile Met Gln Val Arg Thr Gln Leu Gln Met Ser Tyr Asn His
            260                 265                 270
Thr Trp Asn Ile Leu Gly Tyr Val Leu Asn Gly Phe Val Phe Ser Ile
        275                 280                 285
Leu Gly Phe Leu Val Pro Glu Val Ile Ile Lys Ile Ile Lys Thr Glu
    290                 295                 300
Pro His Asn Leu Ile Phe Leu Ile GIy Ile Thr Ile Val Val Ala Leu
305                 310                 315                 320
Ala Val Tyr Leu Phe Arg Phe Val Trp Val Tyr Val Leu Tyr Pro Tyr
                325                 330                 335
Phe Tyr Leu Ala Ile Ser Pro Phe Gln Lys Met Met Thr Lys Asn Asp
            340                 345                 350
Asp Asp Asn Pro Thr Thr Glu Lys Pro Pro Lys Arg Ser Leu Tyr Ala
        355                 360                 365
Leu Ile Met Thr Leu Cys Gly Val His Gly Thr Ile Ser Leu Ala Ile
    370                 375                 380
Ala Leu Thr Leu Pro Tyr Phe Leu Ala Gly His His Ala Phe Thr Tyr
385                 390                 395                 400
Arg Asn Asp Leu Leu Phe Ile Ala Ser Gly Met Val Ile Ile Ser Leu
                405                 410                 415
Val Val Ala Gln Val Leu Leu Pro Leu Leu Thr Lys Pro Ala Pro Lys
            420                 425                 430
Thr Val Ile Gly Asn Met Ser Phe Lys Val Ala Arg Ile Tyr Ile Leu
        435                 440                 445
Glu Gln Val Ile Asp Tyr Leu Asn Gln Lys Ser Thr Phe Glu Thr Ser
    450                 455                 460
Phe Lys Tyr Gly Asn Val Ile Lys Glu Tyr His Asp Lys Leu Ala Phe
465                 470                 475                 480
Leu Lys Thr Val Glu Lys Asp Asp Glu Asn Ser Lys Glu Leu Glu Arg
                485                 490                 495
Leu Gln Lys Ile Ala Phe Asn Val Glu Thr Lys Thr Leu Glu Ser Leu
            500                 505                 510
Val Asp Glu Gly Gln Ile Thr Asn Ser Val Leu Glu Asn Tyr Met Arg
        515                 520                 525
Tyr Ala Glu Arg Thr Gln Val Tyr Arg Gln Ala Ser Leu Ile Arg Arg
    530                 535                 540
Met Ile Val Leu Leu Arg Gly Ala Leu Leu Lys Arg Arg Val Gln Thr
545                 550                 555                 560
Arg Val Asn Ser Ala Ser Ser Leu Ser Val Thr Asp Asn Leu Met Glu
                565                 570                 575
Leu Asn Lys Ile Asn Lys Leu Val His Tyr Asn Val Val Ser Arg Leu
            580                 585                 590
Ser Lys Glu Thr Thr Lys Asp Asn Thr Leu Glu Ile Gly Met Val Cys
        595                 600                 605
Asp Gly Tyr Leu Met Arg Ile Glu Asn Leu Thr Pro Ser Asn Phe Phe
    610                 615                 620
Asn Ser Ala Ser Glu Asp Thr Ile Thr Lys Ile Lys Leu Asn Ala Leu
625                 630                 635                 640
Arg Glu Gln Arg Arg Ile Leu Arg Glu Leu Ile Asp Thr Asp Glu Val
                645                 650                 655
Ser Glu Gly Thr Ala Leu Lys Leu Arg Glu Ala Ile Asn Tyr Asp Glu
            660                 665                 670
Met Val Ile Val Asp Ser Met Thr
        675                 680
<210>59
<211>294
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>59
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
 1               5                  10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            l80                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
Gly Ser Pro Glu Phe Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg
225                 230                 235                 240
Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser
                245                 250                 255
Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
            260                 265                 270
Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Phe Pro Gly Arg Leu
        275                 280                 285
Glu Arg Pro His Arg Asp
    290
<210>60
<211>286
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>60
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
 1                5                  10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg
    210                 215                 220
Gly Ser Pro Glu Phe Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu
225                 230                 235                 240
Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser
                245                 250                 255
Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val
            260                 265                 270
Cys Asp Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg Asp
        275                 280                 285
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：标记＝合成构建体
<400>61
tccatgacgt tcctgatgct                                      20

Claims (33)

1. 一种38个至125个氨基酸的多肽，包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列。
2. 权利要求1的多肽，其中所述PLAD选自：TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTβR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、OX40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcR1的PLAD和DcR2的PLAD。
3. 一种由TNF受体样受体的前配体装配域的氨基酸序列组成的多肽。
4. 一种包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽为R1-TNF受体样受体PLAD-R2，其中R1或R2包括在天然存在的TNF受体样受体中不位于TNF受体样受体PLAD侧翼的氨基酸序列。
5. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-TNF受体样受体PLAD-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
6. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-p60的氨基酸1-54(SEQ IDNO：1)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
7. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-p80的氨基酸10-54(SEQ IDNO：2)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
8. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-Fas的氨基酸1-43(SEQ IDNO：3)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
9. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-Fas的氨基酸1-66(SEQ IDNO：4)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
10. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-LTβR的氨基酸13-50(SEQ IDNO：5)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
11. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-CD40的氨基酸6-39(SEQ IDNO：6)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
12. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-CD30的氨基酸11-51(SEQ IDNO：7)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
13. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-CD27的氨基酸7-42(SEQ IDNO：8)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
14. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-HVEM的氨基酸6-37(SEQ IDNO：9)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
15. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-OX40的氨基酸3-36(SEQ IDNO：10)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
16. 权利要求1的多肽，其中所述多肽为R1-DR4的氨基酸109-138(SEQ IDNO：11)-R2，其中R1为H、酰基、NH2、氨基酸或肽，R2为H、酰基、NH2、氨基酸或肽。
17. 权利要求3的多肽，其中所述PLAD选自：TNF-R的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD和TRAIL的PLAD。
18. 一种编码权利要求1的多肽的分离的核酸。
19. 权利要求18的分离的核酸，所述核酸在载体中。
20. 一种适合用于在宿主中表达权利要求19所述核酸的载体。
21. 一种通过给予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制细胞中TNF受体寡聚化的方法。
22. 一种通过给予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制细胞中Fas寡聚化的方法。
23. 一种通过给予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制TNF受体样受体与配体结合的方法。
24. 一种通过给予有效量的权利要求1或3的多肽来抑制Fas与配体结合的方法。
25. 一种通过给予有效量的权利要求1或3的多肽来治疗受试者体内炎症的方法。
26. 权利要求25的方法，其中所述炎症与自身免疫性疾病相关。
27. 权利要求25的方法，其中所述炎症与类风湿性关节炎、骨关节炎或脓毒性关节炎相关。
28. 一种包括PLAD缔合抑制剂的组合物。
29. 权利要求25的方法，其中所述抑制剂为与TNF受体样受体的PLAD特异性结合的抗体。
30. 权利要求25的方法，其中所述抑制剂为TNF受体样受体的PLAD。
31. 权利要求30的方法，其中所述可溶性PLAD为p60的PLAD。
32. 一种筛选PLAD缔合抑制剂的方法，包括：
a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有的核酸包括编码与荧光供体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列，另一种质粒含有的含有编码与荧光受体功能性连接的分离的PLAD的核酸序列；
b)将所述细胞与假定的抑制剂相接触；并且
c)测量FRET，其中同未与所述假定抑制剂接触的细胞中的FRET测量结果相比，FRET下降表明存在PLAD缔合抑制剂。
33. 一种筛选PLAD缔合抑制剂的方法，包括：
a)用以下两种质粒转染同一细胞，其中一种质粒含有包括编码一种分离的PLAD的核酸序列的核酸，另一种质粒含有编码另一种分离的PLAD的核酸序列；
b)将所述细胞与假定的抑制剂相接触；
c)测量PLAD的自缔合，其中同未与所述假定的抑制剂接触的细胞中的PLAD缔合相比，步骤b)细胞中PLAD缔合的减少表明了存在PLAD缔合抑制剂。
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