CN101263411A - 显微镜照明装置和用于暗-和亮-场照明的适配器 - Google Patents

Abstract

本发明是暗场照明系统，包括：光源，其聚焦在聚光器的圆环进入狭缝(64)上；以及物镜(12)，与聚光器对准，使得物镜和聚光器被调准以在样品(32)上获得焦点。本发明本质上使用结构照明以获得改善的照明系统。本发明还包括系统和方法，其中，物镜耦合到光圈(65)并且与聚光器对准，使得当光圈关闭时，仅产生暗场图像，而当光圈打开时，容许光直接进入物镜并产生亮场照明。

Description

显微镜照明装置和用于暗-和亮-场照明的适配器

技术领域

本发明涉及显微镜学领域。尤其是，本发明涉及高分辨率光学显微镜学领域。

背景技术

图1a和1b示出两种类型的光照明。图1a示出亮场照明10。当(显微镜的)物镜12的孔径小于或等于聚光器(未示出)的孔径时，呈现亮场照明。亮场照明10的主要特征是所有的光14应该进入物镜。

图1b示出暗场照明16。当物镜12的孔径小于聚光器的孔径时，呈现暗场照明16。暗场照明16中，直接从聚光器出来的光不进入物镜12。然而，例如，聚光器的失调能够将背景光或噪声引入到系统，这减小反差。因此，对于暗场照明16，要求照明系统圆对称。

暗场照明16具有一些不同于亮场照明10的明显优点。暗场照明16比亮场照明10具有更高的反差和更好的光节省。

图1c示出涉及图1b中的暗场显微镜的对准问题。光源18、聚光器20、以及展像透镜22必须优选地对准，以便光路14的角度正确地横贯并照明样品，这里将进一步详细解释它。应当注意，图1b和1c被从图1a简化了，因为图1a和1b中都没有示出聚光器、展像透镜，也没有示出光源18，但是图1a和1b中分别描述的亮场和暗场显微镜能够包含这些元件。

暗场照明16中使用多种照明方法。两种通常使用的方法是临界照明和柯勒照明。图2a示出临界照明24。该系统包括均一地亮的光源18、光阑(diaphragm)28、聚光器孔径(aperture)26、聚光器20、载片30、耦合到载片30的样品32、以及显微镜物镜12。在此照明方法中，均一地亮的光源18靠近光阑的后面放置并且由聚光器20成像到显微镜物镜12的物平面上。调整场阑孔径的的大小，以便由聚光器20对它成的像正好覆盖该场。物镜12的目标长矛(object lance)中的任意点对的相干性的复杂程度与填充聚光器孔径26的复杂程度相同，归因于不相干的源；此外，它不依赖于聚光器20的像差。光源18聚焦在样品32上。分辨能力仅依赖于入射到物体上的光的相干性和显微镜物镜12的性质。聚光器20的像差对显微镜的分辨没有影响。

图2b示出适于柯勒照明34的现有技术显微镜系统内的柯勒照明34方法。该系统包括光源18、辅助透镜36、光阑28、聚光器孔径26、聚光器20、载片30、耦合到载片30的样品32、以及显微镜物镜12。在此方法中，辅助透镜36靠近光阑28放置，并在聚光器20的焦平面上形成光源的像，聚光器20现在包括聚光器光阑28。来自每个光源18点的光线然后从聚光器20作为平行光束射出。光源18聚焦在聚光器20的孔径上。源光上亮度分布中的不规则不引起场照明的强度中的不规则。

此外，高分辨率光学显微镜学中的最近进展已经由细胞生物学和纳米科学的需求推动。在荧光显微镜学中，已经证实了数十个纳米的图像分辨率。然而，在透射和反射显微镜学中，即使针对现代共焦仪器使用可见光照明，报道的横向图像分辨率也没有超过180nm。

发明内容

本发明是暗场照明系统，包括：光源，固定于聚光器的进入狭缝上；以及物镜，与所述聚光器对准，使得所述物镜和所述聚光器被调整以在样品上获得焦点。本发明本质上使用结构照明以获得改进的照明系统。本发明还包括系统和方法，其中，所述物镜耦合到光圈(iris)并且与所述聚光器对准，以便当所述光圈关闭时，仅产生暗场图像，而当所述光圈打开时，容许光直接进入所述物镜并产生亮场照明。

在本发明的一方面，一种用于照明样品的照明系统，包括：光源，聚焦在聚光器的进入狭缝上；以及物镜，与所述聚光器对准，其中，所述物镜和所述聚光器被调整以在样品上获得焦点。所述系统还包括用于将所述光源聚焦在所述聚光器的进入狭缝上的构件，其中，所述聚焦构件包括准直透镜和光导(light guide)和/或平面反射镜。

在本发明的另一方面，一种照明样品的方法，包括步骤：将光源聚焦在聚光器的进入狭缝上、将物镜与所述聚光器对准、以及调整所述物镜和所述聚光器以在样品上获得焦点。利用聚焦构件将所述光源聚焦在所述聚光器的所述进入狭缝上，其中，所述聚焦构件包括准直透镜和光导和/或平面反射镜。

在本发明的另一方面，一种用于产生混合照明的高分辨率系统，包括：光源，聚焦在聚光器的圆环进入狭缝上；以及物镜，与所述聚光器对准，其中耦合到所述物镜的光圈打开以便容许光直接进入所述物镜。所述物镜的前透镜由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明，并且所述物镜是大孔径显微镜物镜。所述系统还包括适配器，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝；展像透镜，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准，并且光导在所述光源和所述准直透镜和/或平面反射镜之间耦合，该平面反射镜用于将来自所述光源的光反射到所述聚光器的所述进入狭缝。此外，所述照明系统生成衍射条纹，并提供窄化的点扩展函数(PSF)。

在本发明的另一方面，一种产生高分辨率系统中的混合照明的方法，包括步骤：将光源聚焦到聚光器的圆环入口上、将物镜与所述聚光器对准、以及打开耦合到所述物镜的光圈以便容许光直接进入所述物镜。所述方法还包括通过进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明所述物镜的前透镜的步骤，其中，所述物镜是大孔径显微镜物镜。

所述方法还包括利用适配器或利用展像透镜照明所述聚光器的所述进入狭缝的步骤。所述方法还包括步骤：将所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准、在所述光源和所述准直透镜之间耦合光导、以及提供平面反射镜以将来自所述光源的光反射到所述聚光器的所述进入狭缝。此外，所述照明系统生成衍射条纹，并提供窄化的点扩展函数(PSF)。

在本发明的另一方面，一种用于产生暗场照明的高分辨率系统，包括：光源，聚焦到聚光器的圆环进入狭缝上；以及物镜，所述物镜耦合到光圈并与所述聚光器对准，其中所述光圈被关闭，以便仅产生暗场图像。所述物镜的前透镜由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明，并且所述物镜是大孔径显微镜物镜。所述系统还包括适配器，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝；和/或展像透镜，用于照明所述聚光器的进入狭缝。所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准。

在本发明的另一方面，一种用于产生混合照明的高分辨率系统，包括：光源，聚焦到聚光器的圆环进入狭缝上；以及物镜，所述物镜耦合到光圈并与所述聚光器对准，其中，当所述光圈打开以便容许光直接进入所述物镜时，基本上产生亮场照明，并且当关闭所述光圈时，仅产生暗场照明。所述物镜的前透镜由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明，并且所述物镜是大孔径显微镜物镜。所述系统还包括适配器，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝；和/或展像透镜，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝，并且另外，其中所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准。

附图说明

图1a示出现有技术的亮场照明系统的框图；

图1b示出现有技术的暗场照明系统的框图；

图1c示出现有技术的暗场照明系统的框图；

图2a示出现有技术的临界照明系统的图示；

图2b示出现有技术的柯勒照明系统的图示；

图3示出根据本发明的实施例的暗场适配器的图示；

图4示出根据本发明的实施例的系统的框图；

图5示出根据本发明的实施例的系统的框图；

图6a和6b示出根据本发明的实施例的具有聚光器的照明系统和物镜和圆环光圈的图示；

图7a示出对于NA＝1.4的半径为50nm的不透明圆盘的心形聚光器的图像和强度曲线；

图7b示出对于NA＝1.4的半径为50nm的不透明圆盘的亮场聚光器的图像和强度曲线；

图7c示出对于NA＝1.1的半径为50nm的不透明圆盘的心形聚光器的图像和强度曲线；

图7d示出对于NA＝0.7的半径为50nm的不透明圆盘的心形聚光器的图像和强度曲线。

具体实施方式

本发明包括照明系统，其包括光源、光导、准直系统，它们能够耦合到适配器或展像透镜、反射镜和聚光器。照明系统能够具有几乎完美的光学对准。系统提供大的光节省的完美的圆对称。可选适配器和可选展像透镜节省光并将所有可利用的光送入聚光器的狭缝。聚光器能够防止球形像差。光适配器和/或可选展像透镜通过聚光器的进入狭缝提供圆环光进入。

本发明的照明系统的特点是柯勒照明的主原理和临界照明的主性质。柯勒照明由系统中的光学设计预设定和固定(fixed)，从而将光源聚焦到聚光器的进入狭缝上。然后能够(向上或向下)调整照明系统以将从聚光器出来的源光聚焦到样品上，其特征是临界照明的主性质的一个。这样，初始地固定了柯勒照明，并且然后能够向上或向下调整本发明的照明系统以获得照明点的合适位置和大小，其是临界照明的主特征。

以上照明系统的所述特征提供当前标准的暗场、落射荧光(epi-fluorescence)、以及TIRF显微镜学不能获得的提高的反差和分辨率。TIRF(全内反射荧光)显微镜仅提供单边照明。本发明的照明系统提供360°对称的圆形照明。

该系统提供在活细胞和细胞过程发生时它们的独特视图。小的照明体积造成不扫描而作三维横截面图的能力。选择的荧光激发消除焦点未对准的光并减小传统的落射荧光中的光褪色。与传统的落射荧光系统相比，本发明的照明系统具有至少四倍好的光节省和更高的透射效率。因此，较小的点大小产生提高的反差并降低样品的褪色。

本发明的照明系统优选地是自包含(self-contained)和便携式的。能够将其容易地安装到标准透射光显微镜上。该装置提供简单的定位、定中心和聚焦并且不需要熟练的操作员来对准和操作。

本发明的照明系统能够用于药物领域、生物医疗工业、制药工业、血液学、法医学、食品工业、军事和其它应用中。

图5示出本发明的照明系统40的一个实施例。图5中，来自光源18的光经由光导60传递到至少一个准直透镜58。光然后被可选平面反射镜62反射并聚焦在暗场聚光器20的进入狭缝或孔径26上。聚光器20将光导引并聚焦到样品32上。如图5中所示，经由进入狭缝或孔径26中的至少一个将光导引到聚光器20。通过调整系统40的透镜中的一个，能够将输入光移向狭缝26的内部边缘或狭缝26的外部边缘。将光移向狭缝26的内部边缘导致较低的分辨率但是较大的光强。将光移向狭缝26的外部边缘导致较高的分辨率但是较小的光强。

图4示出本发明的照明系统40的另一实施例。图4中，适配器42在光导60和聚光器20之间耦合。适配器42提供较好的光节省，并且能够用于与聚光器20组合以便适配器有合适的大小和形状以装配在暗场聚光器的腔内，其由此提供光源18和聚光器20之间的装配。如上述，适配器42能够用展像透镜(未示出)代替。

图3示出如照明系统40中使用的适配器。适配器包括外部间隔物48、内部间隔物50、光纤52、第一端部44附近的平行光束54、以及第二端部46附近的柱形光束56。中心轴通过适配器42在通常平行于使用的显微镜和聚光器的方向的方向上延伸。

除了由于提高照明质量而改善由暗场显微镜观察的样品的清晰度外，此适配器42能够将需要的光源功率减小80-87％。此外，适配器42易于用于现有暗场显微镜中。

本发明的照明系统获得低于120nm的分辨率和50nm以下的探测。

传统的和光学的显微镜学的分辨率受到光的波动性限制并且传统地受限于Rayleigh标准；这通常称作衍射限制的分辨率(～240nm的限制)。在本发明的照明系统40中，产生无衍射限制的光学效果和改善的点扩展函数，这将系统的分辨率扩展得远高于衍射限制。

这些光学效果的一些包括驻消失波、等离子体谐振、以及荧光。系统40的几何形状和数值孔径产生理想的用于生成类似于TIRF的驻消失波的条件。还有，取决于样品的导电性，会生成局域化的表面等离子体谐振(LSPR)，这容许观察诸如碳纳米管和其它纳米材料的样品并提供较好的反差而没有空间分辨率的损失。因为光子也如粒子那样运转，所以它们能够被非常小的物体偏转和散射。因此，由于高的反差，使用系统40易于观察到非常小的物体(例如，病毒粒子)。

高分辨率光学显微镜学中最近的进展受到了对细胞生物学和纳米科学的需求的推动。在荧光显微镜学中，证实了数十纳米的图像分辨率。然而，在透射和反射显微镜学中，使用可见光照明，即使针对现代共焦仪器，报道的横向图像分辨率也没有超过180nm。

90nm的分辨率

本发明的系统40报道了使用大孔径心形圆环聚光器20(以后，圆环A-聚光器)获得的图像中90nm的分辨率。参照图6a和b，系统产生高度倾斜的空光锥。用光圈65与大孔径显微镜物镜12耦合，系统提供两个不同的照明方式(regime)。当光圈65关闭以便在通过样品32后没有光直接进入物镜12(图6a)时，仅有折射的、散射的、或衍射的光进入物镜12(图6a)。如果光圈65打开，以使得容许光直接进入物镜12，则物镜12的前透镜由进入物镜12(图6b)的空光锥产生的圆环光照明。在这种情况下，产生混合照明，其组合暗场和倾斜的空锥亮场照明。心形聚光器20是照明系统的组成部分，以便系统包括准直透镜和将光集中到聚光器的圆环进入狭缝上的第一面反射镜。作为照明系统的部分，聚光器被预对准并因此不需要另外的对准。

通过代替常规的亮场聚光器(以下，圆形C-聚光器)，照明系统设置在Olympus BX51显微镜上。照明系统通过液态光导与光源连接。用于此工作的物镜是来自Leica的无限校正的物镜HCXPLAPO100×/1.40-0.70、油、光圈。图像利用缩放中间透镜(自制的40×中继镜)放大，并由Peltier冷却相机和Dimension 8200 Dell计算机俘获。显微镜放在振动隔离的平台上。通过用Olympus亮场聚光器代替照明系统并由Olympus XCite12适配器将EXFO120光源与后显微镜光端口连接，获得了亮场图像。所有图像通过使用Richardson测试载片获得。

选择用于成像的高放大倍数的几何图案包括垂直光栅阵列，该阵列提供一系列在中心有200nm间隔的宽度为100nm的线、从250nm到50nm范围的垂直/水平分辨率条组、以及从4μm到60nm范围的实心圆。理查森载片的图案用JEOL 7000F场发射扫描电镜测试。刻度由NIST可跟踪主系统校准。因为确定了测试载片上圆的真实直径，所以这些圆被用于成像和分析衍射图案。

为了理解增强的分辨能力，呈现了针对C-和A-照明系统(C-圆形，A-圆环)的情况的光学图像的衍射理论的结果。为简单，在图像由容易评估的紧凑的部分给出时，针对半径r＝50nm的不透明盘的轴对称情况，执行计算。此外，与使用的光波长λ₀＝546nm相当的小的物体大小确保整体地干涉的照明条件。实验上，针对从N＝0.7到1.4的范围中的不同显微镜物镜数值孔径，测量了半径为50nm的盘(玻璃Richardson载片上的铬薄膜圆)的图像。理论与实验非常一致并且因此清楚地揭示了改善分辨率的机制。

通过干涉光学系统形成的图像中的光幅度U₁(x₁，y₁)能够写作在物平面上的输入U₀(x₀，y₀)和点扩展函数(PSF)P(x，y)的卷积

$U_1(x_1,y_1)=\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}\underset{-\∞}{\overset{\∞}{\∫}}{U}_0(x_0,y_0)P(x_1-x_0,y_1-y_0){\mathrm{dx}}_0{\mathrm{dy}}_0---\left(1\right)$

首先，当几何上通过物体的透明部分的光束到达进入瞳孔时，考虑亮场照明方式。C-聚光器形成数值孔径N＝1.4的填满整个瞳孔的光锥。对于A-聚光器，N从1.2到1.4的空光锥仅照明进入瞳孔的对应周边环(图6B)。例如，在孔径N＝1.4、半径为a的瞳孔中，被照明的环的内部和外部半径是εa和a，其中ε＝1.2/1.4＝0.86(小于N＝1.2的进入孔径对应于暗场方式并且将在下面分开考虑)。省略推导，从方程(1)，不透明屏中的圆孔的图像是

$U_1\left({\mathrm{\ρ}}_1\right)=\frac{k_0\mathrm{Nr}}{a}{\∫}_{\mathrm{\ϵa}}^a{J}_1\left(\frac{k_0\mathrm{Nr\ρ}}{a}\right)J_0\left(\frac{k_{0}N{\mathrm{\ρ}}_1\mathrm{\ρ}}{a}\right)\mathrm{d\ρ}---\left(2\right)$

这里，ρ₁是像平面的半径，J₀(x)和J₁(x)是Bessel函数，并且k₀＝2π/λ₀，其中λ₀是真空中的光波长。此结果由Martin针对ε＝0(C-聚光器)推得，并且这里对亮场方式中的A-聚光器(0＜ε≤1)推广。如预期的，在类似点的孔的情况r→0下，对于圆环(εa≤ρ≤a)进入瞳孔，方程(2)减小到已知PSF函数。如果进入孔径无限地提高a→∞，则衍射条纹消失，并且图像仅是亮圆。然而，在通常情况下，对于方程(2)中的积分，没有显式的方程可用，但是能够使用商用软件对其进行计算。最后，使用Babinet原理，不透明圆盘的图像是

U_d(ρ₁)＝U-U₁(ρ₁)    (3)

这里U是没有任何物体时的幅度，因为盘r＝50mm的小的角度大小，在这种情况下其恒定。实验中，根据I_d(ρ₁)＝|U_d(ρ₁)|²测量强度。

接下来，考虑暗场方式(图6A)。对于A-聚光器20，当光圈65光阑将进入孔径减小到N＜1.2时，这发生。为了描述由铬盘散射的光波，我们根据Mie的理论的指导，因为衍射由传导球跟随。对于球半径r＜λ₀，散射的极图是强烈地各向异性的，最大值沿入射光束方向指向，如：

u₀(ξ)＝cos^mξ    (4)

随m增加，光围绕正向ξ＝0集中。

导致的进入孔径中的光分布表示为

利用PSF的通式，我们针对暗场方式写出：

最后，将方程(6)代入方程(1)中，给出暗场中的图像

U_1暗场(ρ₁)＝∫∫_物体P_暗场(ρ₁-ρ₀)dx₀dy₀    (7)

其中，为简单，向量ρ表示点(x，y)。

图7a和7b包括半径为50mm的不透明盘的图像和强度曲线图，其中在图7a中使用心形聚光器，而在图7b中使用Olympus亮场聚光器，获得NA＝1.4。图7c针对NA＝1.1的心形聚光器示出相同的内容，而图7d针对NA＝0.7的心形聚光器示出相同的内容。图7a和7b证实，对C-和A-聚光器，理论和实验非常一致。尤其是，对于A-聚光器，理论精确地描述了中心最小值的形状和第一衍射环的位置和高度(图7a)。拟合规定方程(5)中仅有的未知参数为m＝6。

从预测R＝0.61(λ₀/N)＝238nm的著名的Rayleigh标准的观点来考虑图7a&b中的结果是有趣的。如所知，R是针对各向同性的照明点源和圆形进入孔径的Airy图案中的第一暗环的半径。实验上，对于C-聚光器，半径为260nm(图7b)，如预料的稍高于R＝238nm，因为被成像的盘的有限大小r＝50nm。显著地，对于A-聚光器，观察的半径165nm(图7a)比R小(238/165)＝1.44倍。实际上，这不是意外的事情，而是与已知的当进入孔径是环形的时对衍射图案中的中心点的窄化一致，因为亮场方式中A-聚光器仅照明进入瞳孔上的周边环。类似地，但是较小的窄化被在图7c和7d中的暗场图像中观察到了，其中，测得的暗处的半径在N＝1.1时为270nm(图7c)而在N＝0.7时为420nm(图7d)，对应地比Rayleigh的标准值小1.1和1.5倍。再次，这由进入瞳孔上的类圆环的散射光的分布引起。我们的对于任意幅度瞳孔滤光器的数学分析(未示出)限定针对PSF窄化的较上界限为x₁/x₀＝3.83/2.40＝1.6倍，其中x₀和x₁是Bessel函数J₀(x)和J₁(x)的第一正根。

在亮场中使用环形A-聚光器的实际分辨率比λ₀/5好。对于使用的数值孔径N＝1.4，这超过Rayleigh的标准R＝λ₀/2.32.2倍。所述的理论解释来源于两个原因的增强的图像分辨率。首先，对于环形A-聚光器，PSF较窄。其次，对于A-聚光器，PSF的衍射条纹强(图7a)并且随后将相位改变π。因此，方程(1)中PSF与物体形状的卷积较少涂抹(smear)图像的边缘；该作用仅对相干照明出现。

现在我们将理论与实验比较。亮场中，计算不包含任何拟合参数，因为方程(2)中所有的值是已知的并且在上述文本中列出。

总之，使用标准研究透射光学显微镜在成像中证实了λ₀/5或比90nm好的分辨率，仅通过使用具有心形环形聚光器20(图6)的自制的照明系统对该显微镜做了修改。此分辨能力在视觉观察或CCD相机记录中获得，没有任何图像后处理。除了报道的数据，观察到了对活细胞的实时成像中的高分辨率。计算显示增强的分辨率完全与成像系统的经典衍射理论一致并且源于大孔径相干圆环照明。

已经根据具体实施例描述了本发明，具体实施例结合了细节以促进对本发明的构成和操作原理的理解。这里对其具体实施例和细节的该参考不是意在限定所附权利要求的范围。对本领域技术人员，可以在选作示例的实施例中作出修改而不脱离本发明的精神和范围是明显的。

Claims (40)

1、一种用于照明样品的照明系统，包括：

光源，聚焦在聚光器的进入狭缝上；以及

物镜，与所述聚光器对准，其中，所述物镜和所述聚光器被调整以在所述样品上获得焦点。

2、如权利要求1所述的照明系统，所述系统还包括用于将所述光源聚焦在所述聚光器的所述进入狭缝上的构件。

3、如权利要求2所述的照明系统，其中，所述聚焦构件包括准直透镜和光导。

4、如权利要求2所述的照明系统，其中，所述聚焦构件包括平面反射镜。

5、一种照明样品的方法，所述方法包括步骤：

将光源聚焦在聚光器的进入狭缝上；

将物镜与所述聚光器对准；以及

调整所述物镜和所述聚光器以在所述样品上获得焦点。

6、如权利要求5所述的方法，其中，所述光源用固定构件固定在所述聚光器的所述进入狭缝上。

7、如权利要求6所述的方法，其中，所述固定构件包括准直透镜和光导。

8、如权利要求6所述的方法，其中，所述固定构件包括平面反射镜。

9、一种用于产生混合照明的高分辨率系统，所述系统包括：

光源，聚焦在聚光器的圆环进入狭缝上；以及

物镜，与所述聚光器对准，其中耦合到所述物镜的光圈是打开的以便容许光直接进入所述物镜。

10、如权利要求9所述的系统，其中，所述物镜的前透镜由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明。

11、如权利要求9所述的系统，其中，所述物镜是大孔径显微镜物镜。

12、如权利要求9所述的系统，还包括适配器，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。

13、如权利要求9所述的系统，还包括展像透镜，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。

14、如权利要求9所述的系统，其中，所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准。

15、如权利要求14所述的系统，还包括光导，在所述光源和所述准直透镜之间耦合。

16、如权利要求15所述的系统，还包括平面反射镜，用于将来自所述光源的光反射到所述聚光器的所述进入狭缝。

17、如权利要求9所述的系统，其中，所述照明系统生成衍射条纹。

18、如权利要求9所述的系统，其中，所述照明系统提供窄化的点扩展函数(PSF)。

19、一种产生高分辨率系统中的混合照明的方法，所述方法包括步骤：

将光源聚焦到聚光器的圆环进入口上；

将物镜与所述聚光器对准；以及

打开耦合到所述物镜的光圈以便容许光直接进入所述物镜。

20、如权利要求19所述的方法，还包括由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明所述物镜的前透镜的步骤。

21、如权利要求13所述的方法，其中，所述物镜是大孔径显微镜物镜。

22、如权利要求20所述的方法，还包括利用适配器照明所述聚光器的所述进入狭缝的步骤。

23、如权利要求20所述的方法，还包括经由展像透镜照明所述聚光器的所述进入狭缝的步骤。

24、如权利要求19所述的方法，还包括将所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准的步骤。

25、如权利要求24所述的方法，还包括在所述光源和所述准直透镜之间耦合光导的步骤。

26、如权利要求25所述的方法，还包括提供平面反射镜以将来自所述光源的光反射到所述聚光器的所述进入狭缝的步骤。

27、如权利要求19所述的方法，其中，所述照明系统生成衍射条纹。

28、如权利要求19所述的方法，其中，所述照明系统提供窄化的点扩展函数(PSF)。

29、一种用于产生暗场照明的高分辨率系统，所述系统包括：

光源，聚焦到聚光器的圆环进入狭缝上；以及

物镜，所述物镜耦合到光圈并与所述聚光器对准，其中，所述光圈是关闭的，以便仅产生暗场图像。

30、如权利要求29所述的系统，其中，所述物镜的前透镜由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明。

31、如权利要求29所述的系统，其中，所述物镜是大孔径显微镜物镜。

32、如权利要求29所述的系统，还包括适配器，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。

33、如权利要求29所述的系统，还包括展像透镜，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。

34、如权利要求29所述的系统，其中，所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准。

35、一种用于产生混合照明的高分辨率系统，所述系统包括：

光源，聚焦到聚光器的圆环进入狭缝上；以及

物镜，所述物镜耦合到光圈并与所述聚光器对准，其中，当所述光圈打开以便容许光直接进入所述物镜时，基本上产生亮场照明，并且当所述光圈关闭时，仅产生暗场照明。

36、如权利要求35所述的系统，其中，所述物镜的前透镜由进入所述物镜的空光锥产生的圆环光照明。

37、如权利要求35所述的系统，其中，所述物镜是大孔径显微镜物镜。

38、如权利要求35所述的系统，还包括适配器，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。

39、如权利要求35所述的系统，还包括展像透镜，用于照明所述聚光器的所述进入狭缝。

40、如权利要求35所述的系统，其中，所述聚光器与所述光源的进入端口和准直透镜预对准。

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