CN101259266B - 一种前脂肪细胞异种疫苗及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种前脂肪细胞异种疫苗及其制备方法和用途，属于生物技术领域。本发明前脂肪细胞异种疫苗是用小鼠前脂肪细胞系3T3-L1作为疫苗细胞来源，疫苗的制备是通过体外培养扩增细胞，用多聚甲醛进行固定后，再洗弃残余的多聚甲醛，制备成细胞悬液而得。本发明前脂肪细胞异种疫苗可进行主动免疫能够预防肥胖症的发生并用于治疗肥胖症。

Description

一种前脂肪细胞异种疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种前脂肪细胞异种疫苗及其制备方法和用途，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，随着我国社会经济的发展、人民物质生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖症的发病率呈逐年上升的趋势。肥胖症是一种严重威胁人类健康的全球性慢性疾病。现已知肥胖症是高血压、高血脂、糖尿病、心血管疾病、睡眠呼吸暂停综合征等多种慢性疾病和社会心理障碍的重要危险性因素，是导致早死、致残、影响生活质量和增加国家财政负担的重要的全球性的健康问题。

按照世界卫生组织规定，当进食热量超过人体消耗量而以脂肪形式贮存于体内，致使体重指数(Body mass index，BMI)：体重(Kg)/身高²(m²)大于25～29.9者为超体重，≥30.0称肥胖症。现美国有3200万妇女，2600万男性超标准体重。世界卫生组织认为肥胖、艾滋病、吸毒、酒精中毒将成为二十一世纪全球四大健康问题，预防和治疗肥胖症是本世纪前50年世界各国所要面临的最大的流行病挑战。

肥胖的主要原因是机体能量的摄入超过消耗，多余的能量以脂肪形式贮存所致。机体能量平衡受饮食、运动、内分泌疾病及遗传等多重因素的影响。限制能量摄入和增加运动相结合被推荐为有效的减肥方法。在美国，29％的男性和44％的女性认为自己在尽力减肥，但仅20％的人承认做到了限制能量摄入和增加运动相结合，尽管这可使体重下降，却难以长期维持减重的效果。由此可见，对大多数肥胖患者而言，减重是困难的，而长期保持减重将面临更严峻的挑战。因此，适当选择使用减肥药物是未来的必然趋势。

目前治疗肥胖症的药物按作用机制，可分为三类：作用于中枢的食欲抑制剂、作用于外周减少营养吸收的脂酶抑制剂和增加能量消耗的药物。就临床应用而言，目前获准广泛应用而未发现严重副反应的只有作用于中枢的食欲抑制剂西布曲明和作用于外周减少营养吸收的脂酶抑制剂奥利斯他，但其应用时间不长，尚需作长期追踪的临床评估。西布曲明的主要副作用有口干、厌食、便秘、失眠、恶心、腹痛、眩晕等胃肠道及中枢神经系统刺激作用，少数患者心率稍增快、血压轻度增高，但有很大个体差异，一般可耐受。奥利斯他的主要副作用为胃肠道不适，包括脂肪便、脂肪泻、腹痛、腹胀、肛门排气增多和大便失禁等，少数人因为胃肠道不良反应放弃使用。综上所述，现在人们迫切希望开发出更为安全、有效的减肥药。

现在研究已表明肥胖不仅是脂肪细胞体积的增大，也包括脂肪细胞数目的增加。脂肪细胞体积的改变主要通过脂肪生成或脂肪溶解作用。脂肪细胞数目的增多是通过前脂肪细胞增殖与分化以及成熟脂肪细胞的增殖实现；其数目的减少则通过脂肪细胞、前脂肪细胞的凋亡及其他可能的机制如脂肪细胞的去分化而实现。肥胖者的前脂肪细胞或脂肪细胞去分化之后，在体外培养的条件下具有过度增殖的特点。通常脂肪细胞数目增多与减少之间保持在一种平衡状态，当脂肪细胞数目增多明显多于减少时，就有可能导致肥胖症的发生。有研究表明单纯性肥胖儿童脂肪细胞的凋亡率明显低于非肥胖儿童，这种异常有可能参与了肥胖症的发生过程。肥胖症被认为一定程度上是前脂肪细胞细胞的增殖、分化及成熟脂肪细胞的增殖失控的结果。因此，可以推断设法诱导前脂肪细胞和成熟脂肪细胞凋亡将是治疗肥胖症的一项重要策略。

神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是迄今发现的中枢性刺激食欲的最有效的物质，有研究发现经外科手术侧脑室插管，脑室内(intracerebroventricularly，i.c.v.)注射神经肽Y-Y5受体的反义寡聚脱氧核糖核酸可以导致脂肪细胞的凋亡和脂肪分解。瘦素(leptin，又称消脂素)是脂肪细胞产生的一种肽类激素，它可能作用于下丘脑的相应受体从而发挥其调节脂肪组织代谢及脂肪细胞数目的作用。瘦素对脂肪细胞的分解代谢无直接作用，这一点可由目前为止在脂肪组织中尚未发现瘦素的受体而支持。Gullicksen等发现脑室内(i.c.v.)注射瘦素不仅可以诱导脂肪细胞凋亡，而且脂肪细胞体积也缩小。

由此可见，目前研究发现的可以诱导脂肪细胞凋亡的神经肽Y和瘦素都需要外科手术进行脑室内(i.c.v.)注射才有诱导脂肪细胞凋亡的治疗效果，此种复杂的脑外科手术不仅花费昂贵，而且风险较大、一般患者难以接受，基本上没有临床实施的可行性。因此，寻找有效的并且临床可行的诱导前脂肪细胞和成熟脂肪细胞凋亡的方法是当今肥胖症治疗研究的关键问题和国际上的研究热点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种前脂肪细胞异种疫苗及其制备方法和用途，为诱导前脂肪细胞凋亡提供了新的方法。

发明概述

我们利用前脂肪细胞异种免疫，诱导机体对自身前脂肪细胞产生免疫应答，阻止自身前脂肪细胞的增值和分化为成熟脂肪细胞，有效抑制脂肪组织的产生。在正常情况下，机体对自身抗原不产生免疫应答，即自身耐受性；所以，我们将生物进化中的异种同源基因、异种免疫排斥及自身免疫反应相结合，用以克服自身抗原的免疫耐受性。在本发明中，我们将设计诱导前脂肪细胞凋亡的方法，并探讨其可行性。

本发明利用被固定了的异种前脂肪细胞作为疫苗进行主动免疫的方法，并用同种前脂肪细胞和异种成纤维细胞作对照，来打破机体对自身前脂肪细胞的免疫耐受，诱导机体产生针对自身前脂肪细胞的交叉免疫反应，从而导致前脂肪细胞凋亡，达到治疗肥胖症的目的，最终实现肥胖症治疗新途径的突破。

发明详述

本发明的技术方案如下：

本发明的前脂肪细胞异种疫苗，是用小鼠3T3-L1前脂肪细胞作为前脂肪细胞来源制作的前脂肪细胞异种疫苗。可作为交叉抗原异种免疫，激发机体免疫系统，对机体前脂肪细胞产生免疫应答。

本发明的前脂肪细胞异种疫苗制备方法，步骤如下：

将小鼠3T3-L1前脂肪细胞于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、0.1mg/mL的链霉素的DMEM培养基上培养，当小鼠3T3-L1前脂肪细胞汇合达70％时，用胰蛋白酶消化、传代。收集体外培养的前脂肪细胞，用PBS洗3次。用PBS配制3％多聚甲醛，pH 7.4，作为固定液，在4℃固定细胞24h。用PBS洗3次，37℃孵育2h以去除残余的多聚甲醛。用PBS重悬后即为前脂肪细胞异种疫苗。

用本发明制备的异种前脂肪细胞疫苗进行免疫预防，通过抗大鼠前脂肪细胞自身抗体的研究和前脂肪细胞凋亡的检测，结果显示本发明前脂肪细胞异种疫苗可打破机体对自身前脂肪细胞的免疫耐受，诱导机体产生针对自身前脂肪细胞的交叉免疫反应，从而导致前脂肪细胞凋亡，达到治疗肥胖症的目的，可用于肥胖症的治疗。

本发明前脂肪细胞异种疫苗的用途，用于制备预防或治疗肥胖症的药物。本发明前脂肪细胞异种疫苗可进行主动免疫能够预防肥胖症的发生和治疗肥胖症。

附图说明

图1为雄性大鼠治疗组和对照组中的体重-时间曲线。

图2为雌性大鼠治疗组和对照组中的体重-时间曲线。

图3是大鼠的前脂肪细胞中自身抗体储存的免疫组化照片。

图4是体内前脂肪细胞凋亡的免疫荧光照片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

(一)疫苗细胞、对照细胞的培养和疫苗制备：

1、试剂：

(1)磷酸盐缓冲液(PBS)：取ZLI-9061PBS溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，测pH值应在7.2-7.4之间，若偏离此范围，用0.1N的HCL或NaOH调整。

(2)固定液：用PBS配制3％多聚甲醛，pH 7.4。

2、材料：

前脂肪细胞来源于体外培养的人、鼠等前脂肪细胞系，其中小鼠前脂肪细胞系3T3-L1、人成纤维细胞系MRC-5和NIH/3T3细胞系均购自ATCC(American Type CultureCollection)，购买方便，因此，我们用小鼠前脂肪细胞系3T3-L1作为疫苗细胞来源，并用人成纤维细胞系MRC-5、小鼠成纤维细胞系NIH/3T3作为对照细胞。

3、试验方法：

小鼠3T3-L1前脂肪细胞的培养：在含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、0.1mg/mL的链霉素的DMEM培养基中培养细胞。当小鼠3T3-L1前脂肪细胞汇合达70％时，用胰蛋白酶消化、传代。人成纤维细胞系MRC-5和NIH/3T3细胞系均用含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、0.1mg/mL的链霉素的DMEM培养基按常规细胞系培养法培养，将其置于含5％C0₂37℃培养箱中大量扩增。

收集体外培养扩增后的细胞于离心管中，包括各种前脂肪细胞和对照细胞，用PBS洗3次。用固定液在4℃固定细胞24h。用PBS洗3次，37℃孵育2h以去除残余的多聚甲醛。加PBS制备成细胞悬液，用血细胞记数板记数细胞后，用0.9％生理盐水制备细胞悬液，浓度为10⁶/ml。即制备出前脂肪细胞异种疫苗，放置于离心管，密封，-80℃冰箱保存备用。

(二)前脂肪细胞异种疫苗免疫预防大鼠进食高能饲料后发生肥胖症的作用：

将6-8周龄、雌性SD大鼠随机分为治疗组和对照组(每组10只)，治疗组大鼠每只用浓度为10⁶/ml的小鼠前脂肪细胞1ml，对照组大鼠同样用人成纤维细胞系MRC-5、NIH/3T3细胞和0.9％生理盐水各1ml腹腔内注射，每周1次，连续4周。当第4次注射免疫完成后，给SD大鼠喂高能量饲料(脂肪和蛋白质含量较高)，高能量饲料成分为粗蛋白25％，，脂肪11％，，碳水化合物等64％。同样方法对雄性大鼠进行研究。观察疫苗免疫组和对照组雌雄性大鼠的体重变化，并用非参数的秩和检验进行统计学分析，对用异种前脂肪细胞作为疫苗免疫是否能够预防肥胖症的发生进行分析。

将雌性大鼠治疗组和对照组中的体重-时间作曲线，其结果见附图1。雄性大鼠的体重-时间作曲线见附图2。

可以看出，经异种小鼠前脂肪细胞免疫后的大鼠，不论雌性和雄性，体重都得到明显的抑制，统计学分析P＜0.05。而人成纤维细胞系MRC-5、NIH/3T3细胞和0.9％生理盐水免疫后的大鼠.，体重没有明显变化，统计学分析P＞0.05。

(三)大鼠的前脂肪细胞中自身抗体储存的检测

通过用异种前脂肪细胞免疫大鼠的血清和未被异种前脂肪细胞免疫大鼠的血清(作对照)作为第一抗体的免疫组织化学技术染色免疫大鼠的前脂肪细胞和成熟脂肪细胞，可以鉴定出在被免疫大鼠的前脂肪细胞中有自身抗体储存(图3所示)。

(四)前脂肪细胞凋亡的检测：

用末端脱氧核苷酰转移酶(TUNEL法)标记免疫荧光染色法检测到体内前脂肪细胞的凋亡(图4所示)。

Claims (2)

1.一种前脂肪细胞异种疫苗，其特征在于，是用小鼠3T3-L1前脂肪细胞作为前脂肪细胞来源，按以下方法制得：

将小鼠3T3-L1前脂肪细胞于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素的DMEM培养基上培养，当小鼠3T3-L1前脂肪细胞汇合达70％时，用胰蛋白酶消化、传代；收集体外培养的前脂肪细胞，用PBS洗3次；用PBS配制3％多聚甲醛，pH 7.4，作为固定液，在4℃固定细胞24h；用PBS洗3次，37℃孵育2h以去除残余的多聚甲醛；用PBS重悬后即为前脂肪细胞异种疫苗。

2.权利要求1所述的一种前脂肪细胞异种疫苗的用途，用于制备预防或治疗肥胖症的药物。

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