CN101248182B

CN101248182B - 天冬酰胺和蛋白被增强的玉米植株和种子

Info

Publication number: CN101248182B
Application number: CN2006800260163A
Authority: CN
Inventors: B·费布里; S·安德森; S·斯克林; J·克劳利; B·秋
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2005-05-16
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2026-05-15
Also published as: MX2007014298A; US20070006338A1; MX291669B; US20120291154A1; BRPI0610816B1; EP1882038B1; JP2008539784A; WO2006124678A2; AR053269A1; CA2625583C; AU2006247506A1; US20110020526A1; AU2006247506B2; CN101248182A; ZA200709564B; CA2625583A1; BRPI0610816A2; WO2006124678A3; JP5016594B2; EP1882038A2

Abstract

本发明涉及具有增强的蛋白和氨基酸水平的玉米植株和种子。本发明还涉及在转基因玉米细胞中提供天冬酰胺合成酶表达的DNA构建物。所述DNA构建物用于生产转基因玉米植株和种子，并选择具有增强的蛋白和氨基酸水平的植株和种子的一种方法中。

Description

天冬酰胺和蛋白被增强的玉米植株和种子

发明背景

本申请要求2005年5月16日提交的美国临时申请序号60/681,348的优先权，该临时申请的完整公开内容在此引入作为参考。

1.发明领域

本发明一般地讲涉及植物生物技术领域，更具体地讲涉及增强玉米植株和种子中的天冬酰胺和蛋白。

2.相关领域描述

农民和消费者期望玉米植株具有改良的农艺性状，例如增加的产量、增加的种子蛋白产量和改良的营养组成。期望的玉米植株营养成分尤其包括纤维、抗氧化物如维生素E、硒、铁、镁、锌、维生素B、木脂体类、酚酸(phenolic acid)、必需氨基酸和植物雌激素(phytoestrogen)。尽管在植物育种方面的相当大的努力已提供了一些在这些所需性状方面的获益，但将特定非宿主DNA导入植物基因组中的能力进一步提供了产生具有这些性状的植株的机会。具体地说，尽管常规玉米的产量在这几年中稳定增长，但玉米植株更有效地同化氮或增加种子蛋白含量的能力还没有类似的增加。

氮利用度对植物生产率、生物量和作物产量(包括种子蛋白产量)具有显著的积极作用。在植物中，无机氮由土壤中被同化，还原为氨，并以转运氮的氨基酸天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸的形式掺入到有机氮中。天冬酰胺(Asn)因为其高氮碳比(2N∶4C对2N∶5C)和因为其相对惰性而成为一种优选的酰胺转运分子。Asn和其它氨基酸还用作蛋白合成的组件。

在植物中，Asn在由天冬酰胺合成酶(AsnS)催化的反应中由谷氨酰胺、天冬氨酸和ATP合成。谷氨酸、AMP和焦磷酸作为副产物生成。业已描述了两种形式的AsnS：谷氨酰胺依赖性形式和氨依赖性形式。谷氨酰胺依赖性AsnS既可催化谷氨酰胺依赖性反应，也可催化氨依赖性反应，但谷氨酰胺是优选的氮源。

高蛋白浓度被认为是包括大豆、玉米和小麦在内的大部分主要作物的一种重要品质。例如，已通过传统育种鉴别出高蛋白玉米、小麦和大豆品种。但是，以此方式开发的大部分高蛋白系具有产量下降或其它农艺劣势。如果作物(尤其是玉米)的蛋白含量能增加至目前可获水平之上，则其对人食用和产物在动物饲料中的应用都应当是合乎需要的。这在所述作物用作人和动物用的食物和饲料时会提供大大增强的营养价值的利益。

发明概述

本发明提供了一种用于处理作物和其它植物制品以便增加植物中的蛋白和氨基酸含量的方法和组合物。所述方法和组合物增加玉米组织、尤其是种子中的游离氨基酸和蛋白水平。更具体地说，提供在其基因组中含异源DNA组合物的转基因玉米植株和种子，所述异源DNA组合物所表达的基因产物涉及增加的天冬酰胺和增加的蛋白生物合成。所述产物的表达增强食用和饲用玉米源及得自转基因玉米种子或其部分的加工制品的营养价值。

在一个方面，本发明提供增加玉米植株中的蛋白含量的方法。还包括一种含选自SEQ ID NO 1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16和17的多核苷酸序列的DNA构建物，其中所述多核苷酸分子编码天冬酰胺合成酶多肽或具有天冬酰胺合成酶活性的多肽。

在一个实施方案中，本发明包括用异源DNA组合物转化的玉米植物细胞，所述异源DNA组合物编码被鉴别为SEQ ID NO：4的天冬酰胺合成酶。更具体地说，与不表达异源玉米AsnS2多核苷酸分子的相同品种的玉米植株相比，异源玉米AsnS2(天冬酰胺合成酶同功酶2)多核苷酸分子在转基因玉米植株中的表达导致转基因植株(例如转基因玉米植株种子)中的天冬酰胺和蛋白水平提升。

本发明还涉及动物饲料，所述动物饲料含有上述蛋白或氨基酸含量增加的种子，或这些种子的加工制品，例如粗粉。因此，本发明还包括含天冬酰胺合成酶的玉米种子，所述天冬酰胺合成酶通过含编码玉米天冬酰胺合成酶的DNA分子的异源DNA构建物的表达而产生。这类种子的一个实施方案是收获的谷粒，本发明还包括由这些谷粒制备的粗粉、谷蛋白和其它玉米制品。

本发明包括含SEQ ID NO 18-45中的一个或多个的分离的核酸引物序列或其互补物。本发明包括检测或鉴别转化植株或其子代的基因组中编码本发明植物AsnS多肽或具有AsnS活性的植物多肽的异源多核苷酸分子的方法，所述多核苷酸分子包含选自SEQ ID NO 18-45的多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子在DNA扩增方法中用作DNA引物。

附图简述

图1图示了pMON79706的质粒图谱。

图2图示了pMON66229的质粒图谱。

图3图示了pMON66230的质粒图谱。

图4图示了pMON66231的质粒图谱。

图5图示了pMON66239的质粒图谱。

图6，在pMON79706事件中的转基因表达。误差棒代表95％置信区间，对于转基因事件n＝5，对于近交系对照n＝10。

图7，在pMON92870事件中的转基因表达。误差棒代表95％置信区间，对于转基因事件n＞3株植株，对于近交系对照n＝8株植株。

核酸序列和多肽序列的描述

SEQ ID NO：1是编码玉米(Zea mays)AsnS1的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：2是玉米(Zea mays)AsnS1多肽。

SEQ ID NO：3是编码玉米(Zea mays)AsnS2的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：4是玉米(Zea mays)AsnS2多肽。

SEQ ID NO：5是编码玉米(Zea mays)AsnS3的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：6是玉米(Zea mays)AsnS3多肽。

SEQ ID NO：7是编码大豆(Glycme max)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：8是大豆(Glycine max)AsnS多肽。

SEQ ID NO：9是编码苟养木杆菌(Xylella fastidiosa)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：10是编码野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：11是编码嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：12是编码水稻(Oryza sativa)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：13是编码红藻(Gaidieria sulphuraria)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：14是编码红藻(Galderia sulphuraria)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：15是编码红藻(Galdieria sulphuraria)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：16是编码红藻(Galdieria sulphuraria)AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：17是编码酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGPG3913 AsnS的多核苷酸序列。

SEQ ID NO：18是正向(f)AsnS PCR引物序列。

SEQ ID NO：19是正向(f)AsnS PCR引物序列。

SEQ ID NO 20-43是用于Gateway克隆法的初级和次级的正向(f)和反向(r)AsnS PCR引物序列。

SEQ ID NO：44，正向(f)AsnS PCR引物序列。

SEQ ID NO：45，正向(f)AsnS PCR引物序列。

SEQ ID NO：46，ZmASSense引物。

SEQ ID NO：47，ZmASAntisense引物。

SEQ ID NO：48，玉米AsnS3正向引物。

SEQ ID NO：49，玉米AsnS3反向引物。

发明详述

以下是本发明的详述，提供此详述是为了帮助本领域技术人员实施本发明。除非本文另有定义，否则术语按照相关领域一般技术人员的常规用法理解。分子生物学中普通术语的定义还可见于Rieger等，1991；和Lewin，1994。使用陈述于37 CFR§1.822的DNA碱基命名法。使用氨基酸残基的标准单字母和三字母命名法。在不偏离本发明的精神或范围的情况下，本领域一般技术人员可对本文所述实施方案实施修改和变更。

本发明提供一种方法，该方法通过将在转基因植物细胞中表达AsnS多肽的异源多核苷酸导入玉米植物细胞基因组中增加玉米植株中的蛋白含量。本发明提供含(含意味着“包括但不限于”)编码AsnS多肽的多核苷酸分子或多核苷酸分子区段的DNA构建物，其中所述AsnS多肽可选地有效连接至叶绿体转运肽。

编码AsnS多肽或其类似物或等位基因的多核苷酸分子或编码转运肽或标记/报告基因的多核苷酸分子是“分离的”，也就是说它们已至少部分地在体外制备，例如分离自其天然状态、分离自细胞、纯化和扩增，例如它们与对通常被发现以其天然状态与它们结合的那些元件来说是异源的遗传元件相结合。本文使用的已导入到宿主细胞中的含AsnS编码多核苷酸分子的异源DNA构建物，优选与以其天然未转化态存在于细胞中的任意多核苷酸分子都不相同，并就存在于宿主细胞基因组中的其它DNA分子而言是分离的。

本文使用的在转化植物、植物组织或植物细胞中的“改变的或增加的”天冬酰胺水平是大于在未含本发明DNA构建物的对应植物、植物组织或植物细胞中存在的水平。

本发明的物质还可以是重组体。本文使用的术语重组体指得自多核苷酸分子的人为操作或由多核苷酸分子的人为操作产生(但间接地产生)的任意物质(例如DNA、肽等)。

在一个优选方面，如本文所用的种子营养质量的增强(例如增加的种子蛋白含量)依据植物生产下述种子的能力测定，所述种子具有的蛋白或营养成分产量比在蛋白或营养质量方面无此增加的种子高。在本发明的一个特别优选的方面，相对于与营养增强植物具有相似遗传背景的植物检测营养质量的增加，在本文的异源DNA构建物中描述的表达或过表达蛋白或片段的本发明植物除外。

多核苷酸分子

本发明包括和提供在其基因组中含转基因的转基因玉米植株和种子，所述转基因包含编码玉米天冬酰胺合成酶(Zm.AsnS2)的异源DNA分子，所述DNA分子例如包含SEQ ID NO：3和与这些序列具有至少90％、95％或99％同一性且具有功能性天冬酰胺合成酶活性的序列。

本发明的另一方面是一种通过将DNA构建物导入玉米细胞中增加玉米植株中的蛋白的方法，所述DNA构建物提供编码天冬酰胺合成酶的异源多核苷酸分子，例如SEQ ID NO 1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16和17。所述多核苷酸可与这些实例中的任一种不同，但不改变其编码的多肽。例如，能够编码这些保守氨基酸置换的密码子当然是本领域已知的。另外，本发明预期，在本发明中可使用其中已缺失、置换或添加一个或多个氨基酸而不改变天冬酰胺合成酶功能的多肽。

在本发明的一个方面，本发明的多核苷酸被称作是导入的多核苷酸分子。如果多核苷酸分子由于人为操作被插入到细胞或生物中，无论怎样间接，该多核苷酸分子都被称作是“导入的”。导入的多核苷酸分子的实例包括但不限于已通过转化、转染、注射和射流(projection)导入到细胞中的多核苷酸，以及已通过缀合、内吞、吞噬作用等导入到生物中的多核苷酸。优选地，将所述多核苷酸插入到细胞基因组中。

一个亚组的本发明多核苷酸分子是片段多核苷酸分子。片段多核苷酸分子可由相当大部分的或实际上大部分的本发明多核苷酸分子，例如具体公开的那些多核苷酸组成。备选地，所述片段可包含较小的寡核苷酸(具有约15个至约400个核苷酸残基，更优选具有约15个至约30个核苷酸残基，或具有约50个至约100个核苷酸残基，或具有约100个至约200个核苷酸残基，或具有约200个至约400个核苷酸残基，或具有约275个至约350个核苷酸残基)。本发明的一种或多种多核苷酸分子的片段可为探针以及具体为PCR引物分子。PCR引物是一种在与另一种多核苷酸形成双链结构时能够启动聚合酶活性的多核苷酸分子。本领域有各种各样的测定PCR探针结构的方法和PCR技术。

如果本文使用的两种多核苷酸序列能够形成反平行的双链多核苷酸结构，则认为这两种分子能够彼此特异性杂交。

如果一种多核苷酸分子与另一种多核苷酸分子表现出完全的互补性，则这种多核苷酸分子认为是所述另一种多核苷酸分子的“互补物”。如本文所用的，当分子的每个核苷酸都与另一种分子的核苷酸互补时，则认为所述分子表现出“完全互补性”。如果两种分子可彼此杂交，其稳定性足以允许它们在至少常规的“低严格”条件下保持彼此退火，则这两种分子被认为是“最低互补的(minimallycomplementary)”。同样，如果分子可彼此杂交，其稳定性足以允许它们在至少常规的“高严格”条件下保持彼此退火，则两种分子被认为是“互补的”。常规的严格条件描述于Sambrook等，(2001)和Haymes等，(1985)。因此，与完全互补性的偏离是允许的，只要这种偏离未完全排除分子形成双链结构的能力。因此，为使多核苷酸分子用作引物或探针，其仅需足以能够在所用特定溶剂和盐浓度下形成稳定双链结构的序列互补性。

促进DNA杂交的适宜严格条件是例如6.0X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、约45℃，接着于20-25℃用2.0X SSC清洗，这些条件是本领域技术人员已知的，或者可见于Ausubel等编辑，(1989)，6.3.1-6.3.6节。例如，清洗步骤的盐浓度可选自约2.0X SSC、50℃的低严格性至约0.2X SSC、65℃的高严格性。另外，清洗步骤中的温度可由室温约22℃的低严格条件至约65℃的高严格条件。温度和盐都可变，或者温度和盐浓度中的任一种可保持恒定，使得核酸将与本文提供的多核苷酸分子(例如SEQ ID NO 1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18-45所陈述)及其互补物中的一种或多种在中等严格条件(例如约2.0X SSC和约65℃)下特异性杂交。

在本发明方法的一个实施方案中，本发明的任一种多核苷酸序列或多肽序列或这二种序列中任一种的片段都可用于检索相关序列。本文使用的“相关序列检索”指测定两个序列之间相关性的任意方法，包括但不限于对比序列同源性的检索：例如，在数据库中对单个多肽序列的关联性进行PBLAST检索。其它检索可使用基于轮廓(profile)的方法进行，例如HMM(隐马尔可夫模型(Hidden Markov model))META-MEME，其由南达科他州的南达科他州立大学(South DakotaState University，SD)维护，以及PSI-BLAST，其由国立卫生研究所国家医学图书馆的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnilogy Information，National Library of Medicine，NationalInstitues of Health，NCBI)维护。

多核苷酸分子可编码基本相同或基本同源的多肽分子。同一性或同源性的程度可通过使用计算机软件如WISCONSIN PACKAGE Gap程序确定。Genetics Computer Group，Inc.的WISCONSIN PACKAGE10.0版-UNIX中的Gap程序基于Needleman和Wunsch，1970的方法。使用BLAST 2.2.1软件套装中的TBLASTN程序(Altschul等，(1997))或使用BLOSUM62矩阵(Henikoff和Henikoff，1992)。本发明的多核苷酸分子还可以编码同系物多肽。本文使用的同系物多肽分子或其片段是在第二个物种中的对应蛋白或其片段(例如玉米rubisco(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)小亚基是拟南芥rubisco小亚基的同系物)。同系物还可以通过分子进化或DNA改组技术产生，使得所述分子保留原始多肽的至少一种功能性或结构性特征(参见例如美国专利5,811,238)。

在一个优选实施方案中，本发明的任一种多核苷酸分子都可有效连接至在植物细胞中用于引起mRNA分子产生的启动子区，其中，连接至启动子的多核苷酸分子对该启动子而言是异源的。本文使用的“异源”DNA是天然并不紧邻相邻DNA的任意DNA序列。“天然的”指天然存在的核酸序列。“异源”序列经常起源于外部来源或物种，或者如果来自相同来源，则由其原始形式和/或基因组中的位置改变。

本文使用的术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括含5个或多个氨基酸的任意分子。在本领域众所周知，蛋白、肽或多肽分子可经历修饰，包括翻译后修饰，例如但不限于二硫键形成、糖基化、磷酸化或寡聚化。因此，本文使用的术语“蛋白”、“肽分子”或“多肽”包括通过任意生物或非生物过程修饰的任意蛋白。术语“氨基酸”和“多个氨基酸”指所有天然存在的L-氨基酸。该定义意味着包括正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、高半胱氨酸和高丝氨酸。

“蛋白片段”是其氨基酸序列包含该蛋白的一部分氨基酸序列的肽或多肽分子。含一个或多个不来源于该蛋白的额外肽区的蛋白或其片段是“融合”蛋白。此类分子可被衍化，以包含糖或其它部分(例如匙孔

血蓝蛋白)。本发明的融合蛋白或肽分子优选经重组手段生产。

植物构建物和植物转化体

一种或多种编码天冬酰胺合成酶的本发明DNA构建物可用于植物转化或转染。可将外源遗传物质转移入植物细胞中，并使植物细胞再生为全株、可育株或不育株。外源遗传物质是能够插入到任意生物中的任意来源的任意遗传物质，无论是不是天然存在的。

在本发明的再一方面，本发明的多核苷酸序列还编码参与胞内定位、输出或翻译后修饰的肽，例如叶绿体转运肽。

本文使用的术语“基因”包括提供转录调节的核酸分子，该分子包含在植物中有功能的启动子、5′非翻译分子如内含子和前导序列、转录的核酸分子和3′转录终止分子。

编码本发明多肽的多核酸分子可以各种方式与其它非天然的或异源的序列组合。所述“异源”序列指未被发现与编码本发明多肽的核苷酸序列天然接合的任意序列，包括例如未被发现天然接合在一起的相同植物的核苷酸序列的组合，或源于两个不同物种的两种序列的组合。术语“有效连接的(operably linked)”用于指调节性或结构性多核苷酸分子的物理和功能性排列，该排列使有效连接的结构性多核苷酸分子的表达受调节。

DNA构建物或转基因的表达指来源于本发明的多核苷酸分子或其翻译的有义或反义RNA或者蛋白的转录和稳定累积。“有义”RNA指包含mRNA的RNA，所以可被细胞翻译为多肽或蛋白。“反义RNA”指与全部或部分的目标初级转录物或mRNA互补并阻断目标基因表达的RNA转录物(美国专利5,107,065，在此引入作为参考)。反义RNA的互补性可针对特定基因转录物的任意部分，即针对5’非编码序列、3′非翻译序列、内含子或编码序列。“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，其被称为初级转录物，或者其可为来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，称为成熟RNA。

本文使用的术语植物表达盒指含必需DNA调节分子的构建物，其中所述调节分子有效连接至靶分子，以提供在植物细胞中的表达。

在一个实施方案中，本发明的DNA构建物可包含引起本发明多肽过表达的启动子，其中“过表达”指多肽的表达一般在宿主细胞中不存在，或者以比编码所述多肽的内源基因正常表达高的水平存在于所述宿主细胞中。可引起本发明多肽过表达的启动子一般来说是本领域已知的，提供组成型表达模式的启动子实例包括花椰菜花叶病毒19S启动子和花椰菜花叶病毒35S启动子(美国专利5,352,605)、玄参花叶病毒35S启动子(美国专利6,051,753)、甘蔗杆状病毒启动子(美国专利5,994,123)、鸭跖草黄化斑驳病毒启动子(Medberry等，1992)、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶启动子、腺嘌呤磷酸核糖转移酶启动子、水稻肌动蛋白1启动子(美国专利5,641,876)、玉米遍在蛋白启动子、甘露碱合酶启动子和章鱼碱合酶启动子。

这样的遗传构建物可转移到单子叶或双子叶植物中，所述植物包括但不限于苜蓿、苹果、拟南芥(Arabidopsis)、香蕉、油菜(Brassicacampestris)、canola、蓖麻子、咖啡、玉米、棉花、棉籽、菊花、海甘蓝、黄瓜、石槲属(Dendrobium)物种、薯蓣属(Dioscorea)物种、桉树、羊茅、亚麻、剑兰、百合、亚麻子、黍、香瓜、芥菜、燕麦、油椰子、油料油菜(oilseed rape)、花生、黑麦草、菜豆属(Phaseolus)、水稻、高粱、大豆、黑麦、tritordeum、草坪草、小麦、红花、芝麻、甜菜、甘蔗、酸果蔓、番木瓜、红花和向日葵(Christou，1996)。在一个优选实施方案中，所述遗传物质被转移到玉米细胞中。

编码蛋白的多核苷酸分子的转移可导致该多肽在转化细胞或转基因植物中表达或过表达。由本发明的多核苷酸分子编码的一种或多种蛋白或其片段可在转化细胞或转化植物中过表达。

在一个实施方案中，本发明的DNA构建物包含编码多肽序列的多核苷酸分子，所述分子选自：SEQ ID NO 1、3、5、7、9、10、11、12、13、14、15、16和17。本发明提供转化玉米细胞，其中，相对于无此DNA构建物的未转化玉米植株，所述细胞具有增强的天冬酰胺水平。

在另一个实施方案中，本发明的DNA构建物包含有效连接至玉米天冬酰胺合成酶编码序列的异源DNA分子，例如SEQ ID NO 1、3或5，所述DNA构建物被转化入玉米细胞。在一个优选实施方案中，含SEQ ID NO：3的本发明DNA构建物在转化的玉米细胞中提供，DNA构建物的表达提供了相对于未用该DNA构建物转化的玉米植株具有增加的天冬酰胺的玉米植株或具有增加的蛋白的玉米植株种子。

在某些实施方案中，一种或多种AsnS产物的水平可在整个植株中增加，或位于植株的一个或多个特定器官或组织中。在不限制本发明范围的情况下，几种启动子序列对表达上述酶的基因有用。例如，玉米C4型PPDK启动子(Glackin等，1990)、玉米C4型PEPC启动子(Hudspeth和Grula，1989)、水稻Rubisco小亚基启动子(Kyozuka等，1993)和集光叶绿素a/b结合蛋白启动子(Sakamoto等，1991)、P-FDA启动子(US20040216189A1，其多核苷酸序列在此引入作为参考)和P-RTBV启动子(美国专利5,824,857，其多核苷酸序列在此引入作为参考)。例如，可增加植物的一个或多个组织和器官中的天冬酰胺或蛋白水平，所述组织和器官包括但不限于：根、块茎、茎、叶、柄、果实、浆果、坚果、皮、荚、种子和花。优选器官是种子。

为了在植物源组织如叶、种子、根或茎中表达，优选所用启动子在这些特定组织中具有相对高的表达。本发明蛋白的组织特异性表达是特别优选的实施方案。

DNA构建物或载体还可包括目标编码区和完全或部分用于终止该区域转录的多核苷酸序列。已分离出许多这样的序列，包括T-NOS3′区(Ingelbrecht等，1989；Bevan等，1983)。调节性转录终止区同样可在本发明的植物表达构建物中提供。转录终止区可由编码目标基因的DNA序列提供，或者可由来源于不同基因源的便利转录终止区提供，例如与转录起始区天然结合的转录终止区。技术人员将认识到，任何能够终止植物细胞中的转录的便利转录终止区都可用于本发明的构建物中。

载体或构建物还可包括调节元件，例如内含子。其实例包括Adh内含子1(Callis等，1987)、蔗糖合酶内含子(Vasil等，1989)、hsp70内含子(美国专利5,859,347)和TMVω元件(Gallie等，1989)。适宜时可纳入这些调节元件和其它调节元件。

载体或构建物还可包括选择标记。选择标记还可用于选择含外源遗传物质的植物或植物细胞。选择标记的实例包括但不限于：neo基因(Potrykus等，1985)，其编码卡那霉素抗性，可使用卡那霉素、nptII、G418、hpt等选择；bar基因，其编码双丙氨磷(bialaphos)抗性；突变型EPSP合酶基因，其编码草甘膦抗性(Hinchee等，1988；Reynaerts等，1988；Jones等，1987)；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈(bromoxynil)抗性(Stalker等，1988)；突变型乙酰乳酸合酶基因，其赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(ALS)(美国专利4,761,373；D′Halluin等，1992)；和DHFR基因，其抗氨甲蝶呤(Thillet等，1988)。

植物转化

最常用的植物细胞转化方法是农杆菌介导的DNA转移法以及粒子轰击或微弹轰击介导的方法(即基因枪)。通常，期望核转化，但如果期望特异性转化质体，例如叶绿体或造粉体，则可利用微弹介导传递所需多核苷酸来转化植物质体。

通过农杆菌介导的转化将转基因导入植物中的方法使用T-DNA(转移DNA)，其掺入转基因的遗传元件，并将这些遗传元件转移入植物基因组中。一般来说，将边界为右边界DNA分子(RB)和左边界DNA分子(LB)的转基因转移到植物基因组中的单个基因座。“T-DNA分子”指经农杆菌介导的转化法整合入植物基因组中的DNA分子。T-DNA分子的末端在本发明中被限定为侧接农杆菌Ti质粒的T-DNA的边界区。这些边界区一般来说被称为右边界(RB)区和左边界(LB)区，以核苷酸序列和长度可变的形式存在，这取决于它们是来源于生产胭脂碱还是章鱼碱的农杆菌菌株。在设计用于将转基因转移到植物中的DNA构建物中常用的边界区经常有数百个多核苷酸长，含切口位点，在该位点处内切核酸酶消化DNA，以提供用于插入到植物基因组中的位点。T-DNA分子一般包含一个或多个植物表达盒。

对于微弹轰击(美国专利5,550,318、5,538,880和5,610,042，每个均明确地整体在此引入作为参考)，粒子用多核苷酸包被，并通过推进力传递入细胞中。示例性粒子包括由钨、铂和优选金构成的那些粒子。通过粒子加速将DNA传递入植物细胞中的有用方法是BiolisticsParticle Delivery System(BioRad，Hercules，California)，其可用于推动将包被有DNA或细胞的粒子穿过屏(例如不锈钢或Nytex屏)而推进到覆盖有悬浮培养的单子叶植物细胞的滤器表面上。微弹轰击技术可广泛应用，可用于转化实际上任意植物物种。已通过微弹轰击转化的物种实例包括单子叶植物物种，例如玉米(PCT公开说明书WO95/06128)、大麦、小麦(美国专利5,563,055，其整体在此引入作为参考)、水稻、燕麦、黑麦、甘蔗和高粱；以及许多双子叶植物，一般来说包括烟草、大豆(美国专利5,322,783，其整体在此引入作为参考)、向日葵、花生、棉花、番茄和豆科植物(美国专利5,563,055，其整体在此引入作为参考)。

不考虑转化方法，为选择或记录转化植物细胞，被导入细胞中的DNA含有在可再生植物组织中有功能以产生化合物的基因，该化合物赋予植物组织对在其他情况下有毒的化合物的抗性。用作可选择、可筛选或可记录标记的目标基因应包括但不限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶(LUX)以及抗生素或除草剂耐受基因。抗生素抗性基因的实例包括赋予针对卡那霉素(和新霉素、G418)和博来霉素的抗性的基因。

由各种转化外植体再生、发育和栽培植株在本领域已有充分文件记载。此再生和培养方法通常包括以下步骤：选择转化细胞，并培养这些个性化细胞通过通常的胚发育期至生根的幼苗期。转基因胚和种子类似地再生。此后将所获转基因生根枝条种植在适宜的植物生长培养介质如土壤中。经受得住接触选择剂的细胞或已在筛选测定中记录为阳性的细胞可在支持植株再生的培养基中培养。将发育中的幼苗转移至无土植物生长混合物中，并进行幼苗锻炼，然后转移至温室或生长室让其成熟。

对任意转化细胞或组织均可使用本发明。本文使用的所谓可转化的指能够进一步繁殖以产生植株的细胞或组织。技术人员知晓，许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA和适合的培养条件之后，所述植物细胞或组织可形成分化的植株。适于这些用途的组织可包括但不限于未成熟胚、盾片(scutellar)组织、悬浮细胞培养物、未成熟花序、枝条分生组织、茎段外植体、愈伤组织、胚轴组织、子叶、根和叶。

可使用任意合适的植物培养基。适宜培养基的实例应包括但不限于基于MS的培养基(Murashige和Skoog，1962)或基于N6的培养基(Chu等，18：659，1975)，它们补加额外的植物生长调节剂，这些植物生长调节剂包括但不限于植物生长素(auxin)、细胞分裂素、ABA和赤霉素。本领域技术人员熟知各种组织培养基，其在适宜地补加时支持植物组织生长和发育，并适于植物转化和再生。这些组织培养基可作为商品购买，或自行制备和改变。本领域技术人员知晓，用于转化和再生的培养基和培养基补加物，例如营养物和生长调节物，以及其它培养条件，例如培养过程中的照度、pH和培养温度，可对具体目标品种优化。

本发明的任一种多核苷酸分子都可与其它遗传元件(例如载体、启动子、增强子等)组合在一起以永久或瞬时方式导入到植物细胞中。而且，本发明的任一种多核苷酸分子均可以允许由所述多核苷酸分子编码的蛋白或其片段表达或过表达的方式导入到植物细胞中。

本发明还提供本发明植物的部分，特别是繁殖部分和贮藏部分。植物部分包括但不限于种子、胚乳、胚珠、花粉或块茎。在本发明的一个特别优选的实施方案中，植物部分是玉米种子。在一个实施方案中，玉米种子(或谷粒)是动物饲料的组成部分。

在一个优选实施方案中，玉米饲料或得自玉米种子的玉米粉或蛋白设计用于家畜或人或这二者。生产饲料、谷粉和蛋白的方法是本领域已知的。参见例如美国专利4,957,748、5,100,679、5,219,596、5,936,069、6,005,076、6,146,669和6,156,227。在一个优选实施方案中，蛋白制品是高蛋白制品。此高蛋白制品优选具有大于约5％(重量/体积)、更优选大于10％(重量/体积)乃至更优选大于15％(重量/体积)的蛋白含量。

常用于不同性状和作物的育种方法的描述可见于若干参考书中的一种(例如Hayward，1993；Richards，1997；Allard，1999)。

其它生物

本发明的多核苷酸可导入到任意细胞或生物中，例如哺乳动物细胞、哺乳动物、鱼细胞、鱼、鸟细胞、鸟、藻类细胞、藻类、真菌细胞、真菌或细菌细胞。本发明的蛋白可在合适的细胞或生物中生产。优选的宿主和转化体包括：真菌细胞如曲霉属(Aspergillus)、酵母、哺乳动物(特别是牛和猪)、昆虫、细菌和藻类。特别优选的细菌是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和大肠杆菌(E.coli)。

在本发明的一个方面，本发明的一种或多种核酸分子用于确定植物(优选canola、玉米、油菜(Brassica campestris)、油料油菜、油菜籽、大豆、海甘蓝、芥菜、蓖麻子、花生、芝麻、棉籽、亚麻子、红花、油椰子、亚麻或向日葵)中的表达水平(即样品中的mRNA浓度等)或部分或全部由本发明的一种或多种多核苷酸分子编码的蛋白的表达模式(即表达动力学、降解速率、稳定性情况等)。许多方法可用于比较两种或多种细胞或组织样品之间的表达。这些方法包括杂交测定，例如RNA印迹测定、RNA酶保护测定和原位杂交。备选地，所述方法包括PCR型测定。在一个优选方法中，通过将来自两个或多个样品的多核苷酸与多核苷酸阵列杂交来评价表达。所述阵列包含多种已知或怀疑存在于细胞或组织样品中的怀疑序列。

纳入以下实施例是为了阐述本发明的各个方面，根据本文的公开内容，本领域技术人员应认识到，可在所公开的具体方面做出许多改变，仍获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。

实施例

本领域技术人员会认识到本发明提供的方法和组合物的许多优势。纳入以下实施例是为了证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当认识到，以下实施例中所公开的技术代表了发明人发现的在本发明实施中运行良好的技术，因此可被认为构成了用于本发明实施的优选模式。但是，按照本文的公开内容，本领域技术人员会认识到，可对所公开的具体实施方案做出许多改变，仍获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。本文提及的所有参考文献都在此引入作为参考，从而它们对本文使用的方法、技术或组合物进行补充、解释、提供背景或讲解。

实施例1

玉米和大豆植物cDNA和基因组文库的构建

该实施例描述了由玉米和大豆植株组织制备的cDNA文库的产生，由这些文库分离出本发明的玉米AsnS和大豆多核苷酸序列。cDNA文库使用本领域已知的技术如Alba，2004由玉米(Zea mays)和大豆(Glycine max)组织产生。玉米cDNA文库由两种不同组织制备。一个文库由在近交系90DDD5的迟缓期(dilatory phase)收获的初期谷粒制备。第二个玉米cDNA文库由玉米近交系H99的抽丝生长期(silkingphase)的花丝组织(silk tissue)和来自玉米近交系MO17的萌发中的花粉制备。为由大豆(Glycine max)构建cDNA文库，由A3237品种(Asgrow)的再水合干大豆种子切下分生组织和部分胚轴。外植体如下制备：首先使经表面消毒的种子在固体组织培养基上于28℃以18小时光照/日发芽6天，然后将发芽种子转移至4℃达至少24小时。对于用于文库制备的组织，去除子叶，以富集特定目标组织。使用0.5-2g组织制备总RNA和polyA+RNA。对于所有的cDNA文库，收集植物组织，并立即冷冻在液氮中。收获的组织储存于-80℃，直至制备总RNA。总RNA使用Invitrogen Corporation(Invitrogen Corporation，Carlsbad，Califomia，U.S.A.)的Trizol试剂基本如生产商所推荐的纯化。PolyA+RNA(mRNA)使用磁性oligodT珠基本如生产商(Dynabeads，Dynal Biotech，Oslo，Norway)所推荐的纯化。

植物cDNA文库的构建在本领域众所周知，存在许多克隆策略。许多cDNA文库构建试剂盒是商品化的。使用用于cDNA合成和质粒克隆的Superscript^TM质粒系统(Invitrogen Corporation)如在SuperscriptII cDNA文库合成方法中所述制备cDNA文库。检查cDNA文库，以证实合适的插入片段：载体比率。

使用下文描述的改良基因组DNA分离法(Dellaporta等，1983)，使用分离自玉米(Zea mays)的基因组DNA构建基因组DNA文库。在土壤或培养皿中培育玉米籽苗并收获，在液氮中保持冷冻，直至提取。使用研钵和研棒将组织研磨成细粉，同时用液氮保持组织冷冻。将粉末化组织转移至韦林搅切器，该搅切器含在临使用前加入的200mL冷(0℃)DNA提取缓冲液(350mM山梨醇；100mM Tris；5mM EDTA；用HCl将pH调至7.5；亚硫酸氢钠，3.8mg/mL)，并以高速匀浆30-60秒。匀浆物通过一层粗棉布过滤，并收集在离心瓶中。然后以2500×g离心样品20分钟，废弃上清液和任何疏松的绿色材料。然后将沉淀重悬浮在1.25mL DNA提取缓冲液中，并转移至50mL聚丙烯管中。然后加入核裂解缓冲液(1.75mL，含200mM Tris；50mM EDTA；2MNaCl；2.0％(重量/体积)CTAB；pH用HCl调节至7.5)，接着加入0.6mL 5％(重量/体积)sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)。轻轻混合管，将样品于65℃温育20分钟。加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，再轻轻混合管。然后以2500×g离心各管15分钟，将获得的上清液转移至干净的管。将等体积的冰冷异丙醇倾倒至样品上，颠倒样品几次，直至形成沉淀。使用玻璃吸管由溶液中取出沉淀，通过使沉淀风干2-5分钟去除残余异丙醇。将沉淀重悬浮在400μL TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH调节至8.0)中。

实施例2

通过非连接反应依赖性克隆法和Gateway克隆法

分离AsnS多核苷酸序列和玉米转化

该实施例阐述了使用非连接反应依赖性克隆法(ligationindependent cloning)和Gateway

克隆法分离编码AsnS的多核苷酸序列，以及含编码AsnS多肽的多核苷酸分子的本发明DNA构建物的构建，其中所述AsnS多肽分离自如表1所述的各种植物和微生物源。用于驱动所连接的AsnS编码多核苷酸分子表达的启动子分子是水稻肌动蛋白1启动子P-Os.Actl(美国专利5,641,876，在此引入作为参考)；玉米(Zea mays)PPDK(Matsuoka等，1993)、P-RTBV-1(美国专利5,824,857，在此引入作为参考)和P-Zm.NAS(编码玉米的烟酰胺合酶2多肽的基因组区的启动子分子)。

表1.AsnS编码序列源、启动子和DNA构建物

非连接反应依赖性克隆被开发用于克隆PCR产物，基于非回文单链末端的退火。LIC是一种有效的克隆方法，其不受限制位点的限制，或不受需要限制酶消化或连接反应的限制，并允许无缝接合(Aslanidis和de Jong，1990)。

通过使用“切口内切核酸酶(nicking endonuclease)”和限制性内切核酸酶在载体中产生末端单链DNA区段。切口内切核酸酶是切断多核苷酸双链中一条链以在克隆载体上产生单链尾的内切核酸酶。载体首先用标准限制性内切核酸酶线性化。然后用切口内切核酸酶消化。在热处理后，在载体中产生末端单链DNA区段。推荐约55％的GC含量用于下游PCR扩增和有效退火。可将启动子、标记或其它序列元件加入到PCR扩增产物的5′和3′末端，以产生可用于下游应用的线性构建物。

由基础载体pMON82060和如SEQ ID NO 5提供的编码AsnS多肽的玉米AsnS3多核苷酸分子来组装DNA构建物pMON92870。使用限制性内切核酸酶HpaI质粒骨架pMON82060线性化。然后用切口内切核酸酶N.BbvC IA(New England Biolabs，Beverly，MA)处理质粒骨架。在消化后，将反应物加热至65℃。这引起被切断的DNA链与其互补DNA链解离。获得的线性化质粒骨架留下两个可用于组装的末端单链DNA区段。

用聚合酶链反应在编码AsnS的DNA分子中产生末端单链DNA区段。编码AsnS多肽的玉米AsnS3多核苷酸序列(SEQ ID NO：5)用于设计正向PCR引物(SEQ ID NO：48)和反向PCR引物(SEQ ID NO：49)：

SEQ ID NO：48：

GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATC

SEQ ID NO：49：

GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAGACCGCG

使用高保真度热聚合酶KOD热启动DNA聚合酶(Novagen，Madison，WI)进行聚合酶链反应扩增。聚合酶链反应在含1X KOD热启动DNA聚合酶缓冲液、1M甜菜碱(Sigma，St.Louis，MO)、1mMMgSO4、250μM dNTP、5pmol各种引物和1单位KOD热启动DNA聚合酶的25μL体积中进行。聚合酶链反应使用以下循环仪参数在PTC-225 DNA Engine Tetrad^TM热循环仪(MJ Research Inc.，Waltham，MA)中进行：

1. 94℃，2分钟

2. 94℃，15秒

3. 70℃，30秒(每循环-1℃)

4. 72℃，5分钟

5.转到步骤2，9次

6. 94℃，15秒

7. 60℃，30秒

8. 72℃，5分钟

9.转到步骤6，24次

10. 72℃，10分钟

11. 10℃保持

12.结束

进行第二轮聚合酶链反应，以在其中产生末端单链DNA区段的区域中导入尿苷残基。许多DNA聚合酶不能读取DNA模板链中的尿苷残基，或者不能使用尿苷残基来聚合链。因此使用能够掺入和读取尿苷的酶(Expand High Fidelity^TM plus PCR System；Roche，Indianapolis，IN)进行聚合酶链反应。该方法的改进和提供预期结果的其它方法的使用是本领域技术人员已知的。

将组装的DNA构建物转化入ElectroMAX^TM DH10B大肠杆菌感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。将0.5μL(微升)等份的组装反应物与20μL ElectroMAX^TM DH10B感受态细胞在冰上混合，并加载入MicroPulser 0.2mm电穿孔池(Bio-Rad Laboratories Inc.，HerculesCA)中，用于电穿孔。使用165-2100 MicroPulser电穿孔仪(Bio-RadLaboratories Inc.)以1.8kV对细胞进行电穿孔。经电穿孔的细胞在180μL SOC培养基(Invitrogen Inc.)中于37℃温育1小时。然后将细胞接种在含壮观霉素(75mg/L)的LB琼脂平板上，并于37℃过夜培养。选择菌落，并在LB培养基中于37℃过夜培养。使用QIAprep

Spin小型制备试剂盒(QIAgen Sciences，Valencia，CA)分离质粒DNA构建物。用ABI 3730xl DNA Analyzer使用BigDye Terminator(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行DNA测序。

使用“Gateway

克隆法”，如生产商(Invitrogen Corp.)所述，完成编码玉米AsnS2、大豆AsnS和酵母AsnS1的多核苷酸序列的克隆。Gateway

克隆法(通路克隆法)的目标是制备表达克隆。该两步法包括首先将目标基因克隆入入门载体中，接着将目标基因由入门载体(entryvector)亚克隆入目的载体(destination vector)，以产生表达载体。该克隆技术基于λ噬菌体所使用的位点特异性重组系统，以将其DNA整合入大肠杆菌染色体中。

将用于随后的重组克隆的DNA构建物—两个attB或attR重组序列克隆入重组载体中，侧接壮观霉素/链霉素抗性基因(SPC/STR)和AsnS编码多核苷酸序列。使用初级和次级引物序列(SEQ ID NO 20-43)由从其各自物种制备的cDNA文库或基因组文库分离编码AsnS的多核苷酸序列。将连续的attB1/R1、SPC/STR基因、AsnS基因和attB2/R2序列作为单个多核苷酸分子移入用于在植物细胞中表达的重组构建物中，这些重组构建物是称为pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)或pMON79653(酿酒酵母AsnS)的双链DNA质粒。这些DNA构建物包含农杆菌右边界(O-OTH.-RB)区和左边界(LB)区，以及由Herrera-Estrella等，1983；Bevan，1984；Klee等，1985公开的其它元件，e35S启动子(P-CAMV.35S，串联重复的增强子，美国专利5,322,938)、attB1/R1遗传元件(O-Lam.attB1/R1)、SPC/STR基因、对应的AsnS编码区(CR)、attB2/R2遗传元件(O-Lam.attB2/R2)、马铃薯蛋白酶抑制剂II终止子(St.Pis)、农杆菌NOS启动子(P-AGRtu..nos，Fraley等，1983)、农杆菌左边界(O-OTH.-LB)、卡那霉素抗性基因(CR-OTH.-Kan，美国专利6,255,560)以及大肠杆菌复制起点(Ec.ori.ColE)。

对于pMON79706、pMON79700或pMON79653，在氯霉素选择(25μg/mL)和卡那霉素选择(50μg/mL)下在Library EfficiencyDB3.1^TM细胞(Invitrogen Corporation)中扩增DNA构建物。载体DNA使用QIAGEN质粒试剂盒(QIAGEN Inc.)由细菌培养物纯化。

如在美国专利第5,015,580号中所述，使用放电粒子加速基因传递装置将pMON79700、pMON79706和pMON79653的DNA导入玉米胚中。对于LH59预培养的未成熟胚的微弹轰击，优选使用最大电压的35％-45％。在微弹轰击后，将玉米组织在27℃于黑暗中培养。用于制备本发明的转基因植物的转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚的转化和随后的可育转基因植物的再生，公开于美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公开号20040216189，这些专利在此引入作为参考。

通过在适宜的再生培养基上培养转化的愈伤组织，以启动枝条发育和幼苗形成，由转化的玉米细胞产生可育转基因玉米植株。当幼苗约3英寸高并具有根时(转移至培养基后约4-6周)将幼苗转移至土壤。将植株保持在26℃生长室中达2周，接着在温室的喷雾苗台上保持2周。随后将植株移植入5加仑盆中，在温室中培育至成熟。与玉米LH59近交系进行相互授粉。由玉米植株收集种子，并用于蛋白分析和进一步的育种活性分析。

实施例3

载体构建和用AsnS多核苷酸序列转化玉米

使用PCR(聚合酶链反应)扩增玉米AsnS2(SEQ ID NO：3，pMON79706，图1)。用于PCR反应的反应条件依照生产商的方案(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)。使用各30nmol的正向(f)引物(SEQ ID NO：32)和反向(r)引物(SEQ ID NO：33)以及各10μmol的dATP、dCTP、dGTP和TTP、2.5单位TaKaRaLA Taq的1X LA PCR缓冲液II(Takara Bio INC，Shiga，Japan)扩增如上所述制备的约100ng玉米DNA。于94℃初始温育1分钟后，如下进行35个循环的PCR：94℃、45秒，接着于60℃退火45秒，72℃、1分15秒，接着进行1个循环的72℃、7分钟。

制备5种AsnS2 DNA构建物。第一种玉米AsnS2构建物如下制备：如上所述通过PCR由pMON79706分离1821个碱基对的AsnS2片段，接着用XbaI和EcoRI限制酶进行限制消化。将获得的AsnS2基因连接入也已用XbaI和EcoRI消化的pMON61560中。用NotI消化获得的穿梭载体(pMON66246)，将含AsnS2基因的插入片段连接入也已用NotI消化的pMON30167中，所述AsnS2基因与PPDK启动子和RGLUT1终止子有效连接。含EPSPS基因的pMON30167质粒供草甘膦选择用。获得的最终质粒称为pMON66230(图3)。

第二种AsnS2构建物使用前述AsnS2基因(pMON79706)制备。通过将XbaI/EcoRI消化的AsnS2基因插入到也已用XbaI和EcoRI消化的pMON61562中制备构建物，导致AsnS2基因与NAS启动子和RGLUT1终止子有效连接。获得的质粒用NotI消化，并连接入NotI消化的pMON30167中。获得的质粒称为pMON66229(图2)。

第三种AsnS2构建物使用前述AsnS2基因(pMON79706)制备。通过用NotI和XbaI限制酶消化，由pMON78810分离在该构建物中使用的P-FDA启动子。然后将P-FDA启动子连接入先前已用NotI和XbaI消化以去除其PPDK启动子的pMON66246中。获得的质粒用NotI消化，并连接入NotI消化的pMON30167中。获得的质粒称为pMON66231(图4)。

第四种AsnS2构建物使用前述AsnS2基因(pMON79706)制备。通过PCR由pMON74576产生在该构建物中使用的P-RTBV启动子。用NotI和XbaI消化721bp的片段，并连接入先前已用NotI和XbaI消化的pMON66246中。获得的质粒含与P-RTBV启动子和RGLUT1终止子有效连接的AsnS2基因，该质粒用NotI消化，并连接入NotI消化的pMON30167中。获得的质粒称为pMON66239(图5)。

第五种AsnS2构建物使用前述AsnS2基因(pMON79706)制备。使用引物对ZmASSense

5’TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG3’(SEQ ID NO：46)和ZmASAntisense

5’TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG3’(SEQ ID NO：47)，由pMON66240扩增玉米AsnS2。PCR设置如下：在总体积50μl PCR反应物中，各1μl 10mM的ZmASSense和ZmASAntisense引物，0.2-0.5μg(1μl)pMON66240的质粒DNA，5μl 10X AccuPrime^TM Pfx ReactionMix，1μl ACCuPrime^TM Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)以及41μl蒸馏水。用以下循环参数进行PCR反应：94℃、1分钟，接着30个循环：94℃、15秒变性；58℃、15秒退火和68℃、4分钟；接着于68℃延伸10分钟。PCR产物使用QIAGEN(QIAGEN Inc.)的PCR纯化试剂盒纯化。用NcoI和EcoRI限制酶消化等份的玉米AsnS2PCR产物，用AflIII和NcoI消化另一等份的PCR产物。然后将NcoI和EcoRJ片段克隆入pMON94901的NcoI和EcoRI位点。将玉米AsnS2的AflIII和NcoI 5’末端片段克隆入玉米AsnS2的NcoI和EcoRI片段的NcoI位点处。获得的质粒(pMON74940)含与e35S启动子和Hsp17终止子有效连接的玉米AsnS2，用NotI消化该质粒，并连接入NotI消化的pMON53616中，构建pMON74946。

上述各种构建物均包含用于表达草甘膦不敏感II型EPSPS的表达盒，作为选择转基因事件的工具(美国专利5,633,435)。各种构建物的核酸序列使用如PE Applied Biosystems BigDye terminator v.3.0(PEApplied Biosystems，Foster City，CA)陈述的标准方法测定，并证实克隆接合的完整性。pMON66229、pMON66230、pMON66231、pMON66239和pMON74946载体用于随后的玉米细胞转化和这些细胞再生为完整玉米植株。通过农杆菌介导的转化法，如在美国公开专利申请20050048624中的描述，将目标构建物导入玉米系LH244的未成熟胚中。

实施例4

玉米种子样品的蛋白和氨基酸分析

该实施例陈述了使用HPLC和近红外检测选择具有增加的天冬酰胺和蛋白的本发明种子的蛋白和氨基酸分析方法。对于种子蛋白分析，使用近红外透光光谱法(Infratec model 1221，Tecator，HoganasSweden)测量用于每次处理的由50-100个种子组成的小体积样本。该方法基于在近红外辐射的吸收和包含在典型种子样品中的化学成分量之间存在线性关联的观察结果。在分析未知样品之前，用校准试样收集光谱数据，随后使用主要分析技术分析校准试样。使用的主要技术是氮燃烧(Murray和Williams，1987)。使用分光计的光谱数据和原始数据开发多变量模型。在此情况下，使用152个校准试样建立PLS-1(部分最小二乘回归I型)多变量模型。在分光计上扫描每个未知样品至少5次，以每次扫描预测其蛋白含量。每次扫描样品时，将其加回到样品池，以提供测试样品的精确表示。将多次扫描的预测蛋白值平均，然后对每个样品报告。

通过HPLC对玉米组织进行游离氨基酸分析。对于每个样品，用1.5mL 10％三氯乙酸在2mL离心管中提取20-50mg冻干组织。样品在温和振荡下于室温过夜提取。提取的样品通过离心澄清，取出上清液用于进一步分析。用具有荧光检测器和96孔板自动取样器、并装备有Zorbax Eclipse AAA C18柱(4.6×75mm，3.5μm，AgilentTechnologies，Palo Alto，CA)和Zorbax Eclipse AAA分析保护柱(4.6×12.5mm，5μm)的Agilent Series 1100 HPLC通过HPLC进行游离氨基酸分析。样品在临分离前用邻苯二甲醛预衍化。游离氨基酸用40mM磷酸缓冲液pH 7.6/甲醇/乙腈梯度分离，接着于340nm/450nm(激发/发射)进行荧光检测。游离氨基酸基于外部氨基酸标准品定量，并用Chem Station软件(Agilent)对峰积分。相对标准偏差通常小于8％。

实施例5

转基因玉米植株中天冬酰胺水平和谷粒蛋白含量的大田评价

该实施例陈述了玉米AsnS构建物(pMON79706和pMON92870)对转化的玉米植株和种子中的天冬酰胺和蛋白水平作用的大田评价结果；以及玉米AsnS构建物(pMON79700和pMON79653)对谷粒蛋白含量的作用的大田评价结果。玉米组织中游离天冬酰胺的相对浓度得自用pMON79706或pMON92870转化的R₀玉米植株产生的近交系。对于pMON79706，R₀转化体与亲本近交系LH59回交，产生BC₁种子。将与转基因分离的BC₁种子种植在大田苗圃中，记录单株的NPTII标记基因存在情况。对于用于游离氨基酸分析的各个转基因事件，收集叶组织，以进行转基因阳性植株和转基因阴性植株的游离氨基酸分析。将pMON79706转基因植株的叶游离氨基酸与各个事件中的阴性等基因系(isoline)植株对比，并通过采用JMP 5.1软件(SAS Institute，Cary，NC)通过Student T检验进行统计分析。对于pMON92870，将R₀转化体与亲本近交系LH244回交，产生BC₁种子。将BCl种子种植在大田苗圃中并自授粉，产生BC₁S₁种子，随后将BC₁S₁种子种植在第二个近交系苗圃中。在记录NPTII标记基因的存在情况后，鉴别各个转基因事件的转基因阳性植株。由以有规律间隔种植在苗圃中的转基因阳性BC₁S₁植株和亲本近交系样地收集叶组织。通过进行方差分析和通过使用SAS 9.1软件进行Student T检验比较转基因进入植株(transgenic entries)和亲本对照，在统计学上分析pMON92870的叶游离氨基酸。对于两种构建物的游离氨基酸分析，通过在花期取下顶部完全展开叶而收集叶组织，接着在干冰上冷冻。冷冻研磨叶样品，冻干，并通过HPLC检测游离氨基酸含量。

观察到pMON79706和pMON92870的多个转基因事件，表明叶天冬酰胺含量显著增加(表2)。根据0.05或以下的p值指示，所测试的7个pMON79706事件中有4个显示出叶天冬酰胺浓度显著增加。在表达第二种玉米天冬酰胺合成酶基因的pMON92870转基因事件中，5个事件中有4个显示出叶天冬酰胺水平显著增加(表2)。这些数据表明，玉米AsnS2和玉米AsnS3分别在pMON79706和pMON92870中的水稻肌动蛋白启动子下的转基因表达可导致游离天冬酰胺特异性增加，这与活性天冬酰胺合成酶的过表达一致。

由用pMON79706或pMON92870转化的R₀玉米植株得到的近交系获得玉米种子中的蛋白相对浓度。让pMON79706的BC₁转基因植株(上文描述)自授粉，将获得的BC₁S₁谷粒培养至成熟，并检测单穗的蛋白含量。蛋白以0％湿度下的干重百分率检测。将pMON79706转基因植株的谷粒蛋白与各个事件中的阴性等基因系植株对比，并通过采用SAS 9.1软件通过Student T检验在统计学上分析。对于pMON98270，让BC₁S₁植株自授粉，并培育至成熟，检测单穗的蛋白含量。用自行开发的空间方法通过进行区域旁(by-location)分析在统计学上分析pMON92870的谷粒蛋白。区域旁分析是一种两步法。分析中的第一步包括通过使用系统地布置在大田中(每个第6块样地)的所有空间对照样地拟合各向异性球形半变距图模型来评估大田中的空间自相关。分析的第二步包括使用在分析的第一步评估的空间自相关结构来调整转基因进入植株的空间变异值。在调整空间自相关性后，进行平均值对比，其中转基因进入植株的平均值与亲本对照相对比，以检验转基因和对照平均值之间差异的统计学显著性。

pMON79706和pMON92870的多个事件都显示出近交系谷粒蛋白含量的显著增加(表3)。分析的5个pMON79706事件中有3个在统计学上显示出谷粒蛋白含量显著增加(p＜0.05)，另两个事件显示出显著增加的趋势(p＜0.15)。两个事件没有为统计学分析返回足够的穗数。4个pMON92870转基因事件中有3个显示出谷粒蛋白含量显著增加(p＜0.1)，一个事件未检验，原因是用于分析的穗数不够。这些数据证实，pMON79706和pMON92870产生除增加叶天冬酰胺含量以外还增加玉米中的谷粒蛋白含量的转基因事件。

表2.在用玉米AsnS2基因(pMON79706)或玉米AsnS3基因(pMON92870)转化的近交系玉米中的相对叶天冬酰胺浓度

^a以两个单独实验测定pMON79706和pMON92870的叶天冬酰胺。

^b以叶组织中总游离氨基酸的百分率检测的相对游离天冬酰胺

表3.用玉米AsnS2基因(pMON79706)或玉米AsnS3基因(pMON92870)转化的近交系玉米中的谷粒蛋白含量。

^a以两个单独实验测定pMON79706和pMON92870的谷粒蛋白。

^b以基于0％湿度的总谷粒组合物百分率检测的谷粒蛋白。

^cnd；未测定。

在第二个试验中在多个组织中证实了高天冬酰胺和谷粒蛋白表型pMON79706。在BC₁代后，在两个邻接苗圃中让5个pMON79706事件自授粉，产生所述转基因纯合型的BC₁S₃种子。通过比较纯合型BC₁S₃植株和LH59玉米品种对照，在研究中确定了于玉米V8生长期由pMON79706构建物表达产生的天冬酰胺相对浓度(表4)。将转基因进入植株和对照种植在大田样地中具有5个重复区组的随机化完全区组设计中。采集两种植物的上部完全展开叶和茎部分的样品并合并，放置在干冰上，研磨，冻干，并通过HPLC检测游离氨基酸含量。后面有“*”的值表示与LH59对照有显著差异性(Dunnett氏单尾检验；(SAS 9.1，Cary，NC))。在V8生长期和R₁代进行的天冬酰胺检测表明，5个pMON79706事件的植株的游离天冬酰胺有显著增加。V8叶组织中的相对游离天冬酰胺水平增加至13.9％，相比之下在LH59品种对照中为3.4％，茎天冬酰胺增加至39％，相比之下在对照中为9.6(表4)。对于谷粒蛋白分析，每块样地取样10穗，脱粒，并分析谷粒蛋白浓度。在所述5个pMON79706事件中谷粒蛋白也显著增加(表4)。结果表明，作为一种普遍趋势，产生显著的天冬酰胺增加的事件还产生同样显著的籽粒蛋白增加(表2-4)。

表4.在用玉米AsnS2基因(pMON79706)转化的BC₁S₃玉米植株中于V8生长期的相对天冬酰胺浓度和成熟时的谷粒蛋白浓度

^*显著的，p＜0.05

对在水稻肌动蛋白启动子下表达天冬酰胺合成酶基因的3种不同构建物观察到杂种谷粒蛋白有显著增加。如下由pMON79706(玉米AsnS2)、pMON79700(大豆AsnS)和pMON79653(酵母AsnS1)的R₀转基因事件产生纯合近交玉米系：首先使R₀事件与轮回亲本LH59回交，接着在两个邻接的近交系苗圃中进行转基因阳性选择株的自授粉，使用NPTII选择标记记录接合性。然后，各个构建物的纯合事件在与雌性近交系的杂交中用作雄性花粉供体，以产生F₁杂种。在多位置试验中种植F₁杂种种子，分析各个构建物的转基因事件的最终谷粒蛋白，并在基于对照杂种中的谷粒蛋白进行空间校正分析之后，与回交亲本杂种对照对比，其中所述对照杂种以有规律间隔种植在整个大田中。收获每块样地的谷物，脱粒，并分析蛋白含量。使用自行开发的空间方法通过进行区域旁分析和跨区域(across location)分析来分析数据。区域旁分析是一种两步法。分析的第一步包括通过使用系统地布置在大田中(每个第3块样地)的所有空间对照样地拟合各向异性球形半变距图模型来评估大田中的空间自相关。分析的第二步包括使用在分析的第一步中评估的空间自相关结构来调整转基因进入植株的空间变异值。在分别调整各个区域的空间自相关性后，进行跨区域分析，其中将转基因进入植株的平均值与亲本对照相对比，以检验转基因和对照平均值之间差异的统计学显著性(P＝0.20)。全部5个pMON79706事件都在杂种试验中显示出谷粒蛋白显著增加，这与该构建物的转基因事件的近交系中谷粒蛋白增加的观察结果相一致(表5)。另两种天冬酰胺合成酶构建物pMON79700(大豆AsnS)和pMON79653(酵母AsnS)也分别在5个事件中的2个和2个事件中的2个中显示出谷粒蛋白水平显著增加。

表5.在用玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)和酵母(Saccharomycescerevisiae)的天冬酰胺合成酶基因转化的杂种玉米中的谷粒蛋白含量^a

^a以基于0％湿度的总谷粒组合物百分率检测的谷粒蛋白。

实施例6

归因于pMON79706和pMON92870的转基因表达

和天冬酰胺合成酶活性的大田评价

在pMON79706和pMON92870的转基因事件中证实了转基因表达。对于pMON79706，在采用BC1S3纯合近交系的大田试验中用于测定叶天冬酰胺含量的组织，还用于以花期的pMON79706的3’-终止子序列(St.Pis4)的表达检测结果为基础测定转基因表达。由5块(对于近交系对照为10块)重复样地的每一块中收集两个叶样品并合并，在干冰上冷冻。然后冷冻研磨叶样品，用于表达分析。对于RNA提取，将50mg冷冻组织等分入96孔板。每个样品均用含ABI核酸裂解溶液(Applied Biosystems，Foster City，CA)对1X PBS ph7.4(无MgCl或CaCl)的1∶1溶液的500μl裂解缓冲液提取。使用滤板由新鲜冷冻的组织样品提取RNA，以由粗裂解物捕获核酸，使用50μl ABI洗脱缓冲液洗脱结合的RNA。使用5μl RNA模板和5μl ABI一步RT-PCR试剂进行定量PCR。反应在ABI Taqman 7900PCR设备上进行40个PCR循环，循环参数为：48℃、30分钟；95℃、10分钟；95℃、10秒；60℃、1分钟。在40个循环的每一个中由每个孔获取来源于马铃薯蛋白酶抑制剂II的终止子序列(St.Pis4)和内源对照(遍在蛋白)的荧光检测结果。一部分样品在没有逆转录酶的情况下进行检测，以监测DNA污染。通过由内源对照的循环阈值中扣除St.Pis4循环阈值来计算样品的相对表达。测定循环阈值(Ct)，由St.Pis4值减去内源对照值计算ΔCt。通过计算平均内源对照信号并将St.Pis4信号值设定在40建立原位野生型。将未知样品的ΔCt由原位野生型的ΔCt中扣除。最终的数据以相对于野生型的pinII(St.Pis4)表达报告。定量RT-PCR分析证实了6个pMON79706事件中有6个过表达转基因(图6)。

转基因表达还在含pMON92870的近交系事件中得到证实。如下由在大田苗圃中生长的近交系植株花期的叶组织测定RNA表达：首先收集每株植株(每个事件4-8株植株)的上部展开叶，并在干冰上冷冻。预先基于NPTII标记基因的存在情况鉴别出转基因阳性植株。在冷冻的同时研磨叶组织，并分析pMON92870的3’-终止子序列(St.Pis4)的表达。定量RT-PCR分析表明，6个含pMON92870的事件中有5个与近交系对照相比显示出转基因表达增加(图7)。pMON92870事件ZM_M103316中的低RNA表达与该事件中的低叶天冬酰胺含量和谷粒蛋白含量相一致。

在pMON79706和pMON92870的转基因事件中检测天冬酰胺合成酶基因的表达对天冬酰胺合成酶活性的作用。将冷冻研磨的叶组织等分(200-400mg)入预冷的96深孔板的各孔中。在缓冲液A(100mMHepes-OH，pH 8.0，0，1mM EDTA，10mM MgCl₂，2mM天冬氨酸，0.5mM DTT，67mM巯基乙醇，20％(体积/体积)甘油，0.1mM ATP，1％(体积/体积)P9599(Sigma Company)，25mM KCl)中提取蛋白。向各孔中加入少量沙。然后将缓冲液A以4∶1(缓冲液∶组织)的比率加入到孔内的叶组织中。然后将板在油漆搅拌器(painter shaker)中搅动2分钟，以混合样品，然后以5000x g离心10分钟。将上清液(100-200μL)在用缓冲液A平衡的96孔macro spin板(SNS S025L，The Nest Group Inc.，Southboro，MA)中脱盐。然后立即测定上清液，或将上清液冷冻在液氮中，并保持于-80℃，直至使用。为测定天冬酰胺合成酶活性，将经脱盐的蛋白提取物(10-50μL)加入到含100μL测定溶液(100mMHepes，pH 8.0，10mM MgCl₂，2mM天冬氨酸，5mM DTT，10mM ATP，1mM氨基(氧基)乙酸(天冬氨酸氨基转移酶抑制剂)，1mM天冬氨酸半醛(天冬酰胺酶抑制剂))的各孔中。为启动反应，将谷氨酰胺(对于标准测定为2mM终浓度)加入溶液中，然后混合。然后将测定混合物温育1-2小时。然后通过加入等体积的20％(重量/体积)三氯乙酸终止反应。然后过滤混合物，以去除沉淀，并通过HPLC检测天冬酰胺。用于HPLC的样品体积由0.5μL增加至2.5μL，激发波长由340nm减至235nm，荧光计增益由10增加至13。这产生0.5-100μM天冬酰胺的检测灵敏度，并允许检测100s微单位内的活性水平。

对于pMON79706，用于测定叶天冬酰胺合成酶活性的组织来自大田试验，该试验采用于V7生长期收获的BC1S3纯合近交系。已表明pMON79706的事件展示出叶天冬酰胺合成酶活性增加(表6)。天冬酰胺合成酶活性增加至近交系品种对照的5倍。还在花期时测定了近交系大田苗圃中的pMON92870转基因事件的天冬酰胺合成酶活性。5个pMON92870事件有4个也显示出酶活性增加(表6)。在水稻肌动蛋白启动子下表达玉米AsnS2(pMON79706)或玉米AsnS3(pMON92870)的玉米植株中增加的天冬酰胺合成酶活性与用这些构建物观察到的基因表达增加和叶天冬酰胺增加相一致。

表6.pMON79706和pMON92870的转基因事件的近交系中的天冬酰胺合成酶活性^a

^a由两个不同大田试验测定pMON79706和pMON92870的酶活性。

实施例7

pMON66231、pMON66239和pMON74946

对天冬酰胺和谷粒蛋白含量的作用的大田评价

由用pMON66231转化的R₀玉米植株(LH244背景)得到的杂种系，获得玉米组织中的游离天冬酰胺的相对含量(图4)，在pMON66231中，玉米AsnS2处于玉米FDA启动子控制之下。通过使R₀植株与雄性近交系LH59杂交制备杂种，产生分离的(1∶1)F₁群。将获得的F₁种子种植在3个中西部区域，每个区域有两个复本。样地在V3生长期喷洒草甘膦，以消除无转基因分离株(null segregant)。杂种对照种植在周围，并与杂种对照进行对比。在花期时于日落后2小时在全部3个区域由每块样地中的3株植株收集上部的叶并合并。立即将叶放置在干冰上，然后储存于-80℃，直至加工。冷冻研磨叶，一部分冻干，通过HPLC进行游离氨基酸分析。首先，采用用于已删除的学生化残差(deleted studentized residual)的两步法(two-pass method)使用Bonferroni调整过的p值筛选数据的离群值。鉴别离群值，并由数据集中剔除，然后开始方差分析计算。按照跨区域随机化完全区组设计来分析数据。用固定效应模拟构建物-事件组合，区域中的位置和重复(reps)用随机效应模拟。通过进行构建物-事件组合的最小二乘法的对比实施处理比较。在12个pMON66231事件的11个中相对叶天冬酰胺显著增加，天冬酰胺水平高达16％，相比之下在对照中为3％(表7)。还测量了成熟谷粒蛋白：在每块样地收获10个穗后接着脱粒，并合并各块样地的种子，然后检测谷粒蛋白含量，来测量成熟谷粒蛋白。发现12个事件中有9个相对于LH244/LH59杂种对照显著增加成熟谷粒中的蛋白含量。

表7.在pMON66231转基因事件中的相对叶天冬酰胺含量和成熟谷粒蛋白含量。

^a以叶组织中的总游离氨基酸百分率检测的相对游离天冬酰胺

^b与杂种对照对比

由用pMON66239和pMON74946转化的R₀玉米植株(LH244背景)得到的杂种系，获得玉米组织中的游离天冬酰胺相对含量，在pMON66239和pMON74946中玉米AsnS2分别处于RTBV或e35S启动子控制之下。通过使R₀植株与雄性近交系LH59杂交制备杂种，产生分离的(1∶1)F₁群。获得的F₁种子种植在夏威夷的一个区域，每个转基因事件有3个复本。样地在V3生长期喷洒草甘膦，以消除无转基因分离株。纳入无玉米AsnS2基因的杂种对照用于对比。在花期时于日落后2小时由每块样地中的3株植株收集上部叶并合并。立即将叶放置在干冰上，然后储存于-80℃，直至加工。冷冻研磨叶，一部分冻干，用于通过HPLC进行游离氨基酸分析。首先，采用用于已删除的学生化残差的两步法使用Bonferroni调整过的p值筛选数据的离群值。鉴别离群值，并由数据集中去除，然后开始方差分析计算。按照跨区域随机化完全区组设计分析数据。用固定效应模拟构建物-事件组合，重复用随机效应模拟。通过进行构建物-事件组合的最小二乘法的对比来实施处理比较。在13个pMON74946事件的10个中相对叶天冬酰胺显著增加，天冬酰胺水平高达16％，相比之下在对照中为2％(表8)。还检测成熟谷粒蛋白：在每块样地收获所有穗后接着脱粒，并合并各块样地的种子，然后检测谷粒蛋白含量，并以统计学分析叶天冬酰胺性状。发现13个事件中的10个相对于杂种对照在成熟谷粒中具有显著增加的蛋白含量，具有增加的叶天冬酰胺的该10个事件也在杂种试验中显示出蛋白增加。对于pMON66239转基因事件，15个事件中的11个显示出叶天冬酰胺含量增加，15个事件中的3个显示出谷粒蛋白以0.05α水平显著增加，但另5个转基因事件显示出增加的蛋白，p＜0.15，表明在RTBV启动子(pMON66239)下的玉米AsnS2的表达可增加叶天冬酰胺含量和籽粒蛋白含量，但程度比e35s启动子(pMON74946)下的情况低(表8)。

表8.在pMON74946和pMON66239转基因事件中的相对叶天冬酰胺含量和成熟谷粒蛋白含量。

^a以叶组织中的总游离氨基酸的百分率检测的相对天冬酰胺

^b与杂种对照对比。

* * * *

本文提及的所有出版物、专利和专利申请都在此引入作为参考，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被明确和单独地指出引入作为参考。

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<120>天冬酰胺和蛋白被增强的玉米植株和种子

<130>MONS：089US

<140>Unknown

<141>2006-05-15

<150>60/681,348

<151>2005-05-16

<160>49

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1869

<212>DNA

<213>Zea mays

<400>1

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60

acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gcggcatcct cgctgtcctc 120

ggcgtcgctg aggtctccct cgccaagcgc tcccgcatca ttgagctctc gcgcaggtta 180

cggcaccgag ggcctgattg gagtggtttg cactgtcatg aggattgtta ccttgcacac 240

cagcggttgg ctattatcga tcctacatct ggagaccagc ctttgtacaa tgaggataaa 300

acagttgttg taacggtgaa cggagagatc tataaccatg aagaattgaa agctaagttg 360

aaaactcatg agttccaaac tggcagtgat tgtgaagtta tagcccatct ttacgaagaa 420

tatggcgaag aatttgtgga tatgttggat ggaatgttct cctttgttct tcttgataca 480

cgtgataaaa gcttcatcgc agctcgtgat gctattggca tctgcccttt atacatggga 540

tggggtcttg atggatcagt ctggttttct tcagagatga aggcattgag tgatgattgt 600

gaacgcttca taacatttcc cccagggcat ctctactcca gcaagacagg tggtctaagg 660

agatggtaca acccaccatg gttttcagag acggtccctt caacccctta caatgctctc 720

ttcctccggg agatgtttga gaaggctgtt attaagaggc tgatgactga tgtgccattt 780

ggtgtgcttt tatctggtgg actcgactct tctttggttg catctgttgc ttcgcggcac 840

ttaaacgaaa caaaggttga caggcagtgg ggaaataaat tgcatacttt ctgtataggc 900

ttgaagggtt ctcctgatct taaagctgct agagaagttg ctgattacct cagcactgta 960

catcatgagt tccacttcac agtgcaggag ggcattgatg ccttggaaga agtcatctac 1020

catattgaga catatgatgt tacaacaatc agagcaagta ccccaatgtt tttgatgtca 1080

cgcaaaatca aatctttggg tgtgaagatg gttatttctg gcgaaggttc agatgaaatt 1140

tttggtggtt acctttattt tcacaaggca ccaaacaaga aagaattcca tgaggaaaca 1200

tgtcggaaga taaaagcact acatctgtat gactgcttga gagctaacaa agcaacttct 1260

gcctggggtg ttgaggctcg tgttccattc cttgacaaaa gtttcatcag tgtagcaatg 1320

gacattgatc ctgaatggaa gatgataaaa cgtgacctcg gtcgaattga gaaatgggtt 1380

atccgtaatg catttgatga tgatgagagg ccctatttac ctaagcacat tctctacagg 1440

caaaaggaac agttcagtga tggtgttggg tatagttgga tcgatggatt gaaggaccat 1500

gccagccaac atgtctccga ttccatgatg atgaatgctg gctttgttta cccagagaac 1560

acacccacaa caaaagaagg gtactactac agaatgatat tcgagaaatt ctttcccaag 1620

cctgcagcaa ggtcaactgt tcctggaggt cctagtgtgg cctgcagcac tgccaaagct 1680

gttgaatggg acgcatcctg gtccaagaac cttgatcctt ctggccgtgc tgctttgggt 1740

gttcacgatg ctgcgtatga agacactgca gggaaaactc ctgcctctgc tgatcctgtc 1800

tcagacaagg gccttcgtcc agctattggc gaaagcctag ggacacccgt tgcttcagcc 1860

acagctgtc 1869

<210>2

<211>623

<212>PRT

<213>Zea mays

<400>2

Met Ile Cys Asp Lys Cys Ser Leu Val Arg Ser Phe Phe Val Gly Arg

1 5 10 15

Pro Arg Asp Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Ser Cys Arg Thr

20 25 30

Met Cys Gly Ile Lau Ala Val Leu Gly Val Ala Glu Val Ser Leu Ala

35 40 45

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<213>Xylella fastidiosa

<400>9

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60

acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gttccatttt tggaatcttc 120

aacctgcaac ccagtgacaa cctacagata ctgcgtcacc aagcattgga gtgctcgcaa 180

cggcaacggc atcgcggacc cgattggagc ggcgtttacg ttgatgtggg tgcgattctg 240

gtgcacgaac gtcttgctat cgttgatcca gctggcggtg cccagccact gctctccgag 300

gatggcaccc tggcgttggc ggtcaacggc gaaatctata accacgctgt actcaaagga 360

acattgcagc agccctatgc gttccaaact cattctgatt gcgaagtgat taatgcgctt 420

taccgcgaag aaactccaac ctcgtttctg aatcgcttaa atgggatttt tgcattcgta 480

ttatgggaca agactaccgg acgtggcctc atcgcacgcg atccaatggg tgtggtgccg 540

ctgtactggg ggcacgatca ggacggtcgc ttacgtgtcg cgtcagagat gaaagcattg 600

gttgagcatt gctccgacgt tgcacaattc ccacccggcc attggtacga caccacaacg 660

ggcacgctgg tgaagtatta cgaacgcccc tggaaaaact attctgcagt ggaaggagtg 720

caggtctcac tacaggaact gcgtgaagcg ttcgagcggg ccgtccatcg tcaactcatg 780

acagatgttc catacggtgt actgctttct ggtggattgg attcttccct ggtggctgcg 840

gtggccgcac gctacgcacg ccatcgcatc gaaaccaatg atcagagcga agcatggtgg 900

ccacgtctgc actcatttgc gattggactg aaagactcgc cagatttgag tgcggcgaac 960

gtggctgctg aggcgttgaa taccgtccac catcgtttcg agtacacctt ccaggagggg 1020

ctggatgttc tacctgaagt gattcgtcac attgaaactt acgatgtcac gacgattcgc 1080

gcatctacac caatgttcct gctggcacgt cgcattaagg cgatgggagt gaagatggtc 1140

ttgtcaggtg aaggtagcga tgaaattttt ggcggttacc tgtacttcca caaagcgccg 1200

aacgcacgcg agttccacga agaattggtc cgtaagctca acgccctgta ttactacgac 1260

tgcttgcgcg ccaacaaagc gatgatggcg tggggtgtcg agccgcgcgt gccgtttttg 1320

gaccgtgaat ttctcgatgt ggctatgcgg atggatgctc agcataagat ggtcgacaag 1380

accagcaacg gcccacaacg gatggagaaa ggcatcctgc gtgcagcgtt tgacggctat 1440

ttgccgccat caatcctgtg gcgacagaag gagcagttca gtgatggtgt tggctacggt 1500

tggatcgacg gactgaaagc acacgctgaa acgcaagtgt ctgaccatgc gctggcaact 1560

gccgagacac gtttccaggt gaatcctccc cagaccaaag aagcctatta ctaccgcagc 1620

atatttgagc gcttcttccc aagcccggcg gcggctgaga cggtaccggg cggtaaatca 1680

attgcctgtt cctcaccggc ggcgattgcc tgggatgcca gcttcgccac aatggctgac 1740

ccatccggtc gtgcagtcag cggggttcat caacaagcac tgctg 1785

<210>10

<211>1779

<212>DNA

<213>Xanthomonas campestris

<400>10

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcggaccggt 60

cgcgcctcag cagtcgctgt cgttaccatg tgttccatct tcggtatctt cggcctgcaa 120

cccggcgacg acctgcaggc cctgcgccgg caggccctgg aatgttcgca gcggcaacgc 180

catcgcgggc cggactggag cggcgtgtac gtcgatgccg gtgccatcct ggtgcacgag 240

cgcctggcca tcgtcgaccc ggcgggcggt tcgcagccgc tgttgtcgga ggacggcagc 300

ctggcgttgg cagtcaacgg cgagatctat aaccatcgcg aactcaaggc cgagctactg 360

cagccgtacg cttttcagac cggctcggac tgcgaagtga tcaacgcgct gtaccgcgaa 420

gatgcgccgg cctcctatct caaccgcctc aatggcatct tcgcctttgc gttgtgggac 480

aaggccgcgg ggcgggtgat catcgcgcgc gacccgattg gcgtggtgcc gttgtactgg 540

ggacacgacc gcgaaggccg tctgcgcgtg gcgtccgaac tcaagtcgct ggtggacgat 600

tgcgccgatg ctgcgcagtt tccgcctggt cattggtacg acagcgccac cggcgcattg 660

agccgctact acgagcgctc gtggcgcgaa tacagcgaag tggaaaatgt gcaggtgccg 720

ctgcaggaac tgcgcgaggc gttcgagcgc gcggtgcatc gccagctgat gaccgacgtg 780

ccctacggtg tgctgctgtc cggtggcctg gattcgtcgt tggtggcggc agtggccgcg 840

cgctacgcgc ggcatcgtat cgaagagaac gacaccaccg aagcctggtg gccgcgcctg 900

cattccttcg caatcggcct gaccggctcg ccggatctgg ccgctgccga agtggccgcc 960

gccgcgctcg gtaccgtgca ccacggcttc gaatacagct ttgaagaagg cctggatgca 1020

ttgccggaag tgatccgcca catcgaaacc tacgacgtca ccacgattcg tgcgtccacg 1080

ccgatgttcc tgctggcgcg gcgcatcaag gcgatgggcg tcaagatggt gctgtccggc 1140

gaaggcagcg acgagatctt cggtggctac ctgtacttcc acaaggcacc gaacgcccgc 1200

gaattccacg aagaactggt gcgcaagctc gatgcgctca acaactacga ttgcctgcgc 1260

gccaacaagt cgatgatggc ctggggcgtg gaaccgcgcg tgccgttcct ggatcgcgaa 1320

ttcctggacg tggcgatgcg catggacgcg cgcttcaaga tgatcgacaa gaccagcacc 1380

ggtgccaccc gcatcgagaa gggcatcttg cgcgaggcat ttgccggcta tctgccggaa 1440

tcgatcctgt ggcggcagaa ggagcaattc agcgatggcg ttggttatgg ctggatcgac 1500

ggcctcaagg cacatgccgc cgcgcacgtg agcgaccgcg aactcgcagc ggccgaccgg 1560

cgcttcccgg tgaacccgcc gcagaccaag gaagcctatt tctaccgcag tctgttcgag 1620

cagttcttcc ccagccaggc cgctgcggag acggtgccgg gtggtaaatc catcgcgtgt 1680

tcgtcgccga cggccattgc ctgggacgcg agctttgcgg cgatggccga tccgtcgggc 1740

cgtgcgattg ccggcgtgca cgcgcaggcg ttggcgtcc 1779

<210>11

<211>1941

<212>DNA

<213>Bacillus halodurans

<400>11

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60

acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gtggaattac aggctgggta 120

gattggcgac gcaacttgca aaatgagacg gaaacgatca aacagatggc ggaaacgcaa 180

acacatcgag ggcccgatga tttgaacgtt tggacagaga agcatgctgc cttaggccac 240

tcgcggctca ttgtcgttga tccggaaggc ggttgtcagc cgatgatgag ggagaggaat 300

ggcaaacgct atacgatcgt gtataacggc gaattataca atacagaaga tttacggaaa 360

gagcttatag taaaaggtta ccaatttcaa ggccattcgg atacggaagt attactcgtg 420

tcttatatcg aatggggtta ccaatgtgtg gagaagttca atggcatttt tgcgtttgcg 480

atttggaatg ataaagatca gagcttgttt atggcccgcg accgattagg ggtaaagccg 540

ctattttata ctgttcgcca tggattttta ctttttgcaa ctgagataaa agcgctgctt 600

gctcatcctg aaatcgagcc ggttcttacc gaagaagggc tatcggaagt gctcgggctt 660

gggccatcac gttcaccggg taatggcgtt tttgatgata ttcaagagtt gcgaccagct 720

catcttttga catacgatcg caatggggca aaagtgagcc gttattggag attaaaatca 780

atggctcatt ctgaagatgc gatggaaacg gccgcccatc ttcgcgactt attagaagat 840

actgtcgaac gtcagctatt tgcagatgtt ccagttggaa tgtttctttc gggtggagtc 900

gattcgagtg ctttaacggc aattgcggcg ctgatttacg agcgagaagg gaagggcctg 960

attcggacgt actcgattga ttatgacgaa aatgataagt attttaaagc gaatgacttt 1020

caaccgaatg ccgatggacc ttgggttgaa aaagtttcaa ctacttttcg aacgaaccac 1080

cacaatgctg tcatctcgat cgaggagttg gctaatcaat taaagcgagc ggtagagctt 1140

cgtgacttac ctggaatggc cgatgtagac tcttcattgt attggttttg taagcaaatc 1200

aaaaaagatg ttaccgttgg cttatcgggt gaatgtgctg acgaaatttt tggtgggtat 1260

ccttggttcc ataagccaga ggtcatgaat tttaatgggt ttccttggat gagatcagcg 1320

gatgaacgtc aggagcttct tcatgaacga tggcgccaaa agttaaattt gcccaaatac 1380

gttcatgatc gttataaaga aacgattgcc gaaacgcctc gcttcgaaga ggacacaccg 1440

gaagaagcgc gacgcaggga aatttcgtat ttgaacatgg tctggtttat gacaacgctt 1500

cttgatcgga aggatcgaat gagcatggga gcgagcttag aagtgcgagt tccattttct 1560

gaccaccgaa ttgtagaata cgcttggaac attccgtggg aaattaaaca attcggaggg 1620

agagagaagg gcattttacg aaaagcgttg gaaggcatcc tcccagatga agtgttatac 1680

cggaaaaaaa gtccttatcc gaaaacgcac catccaaaat acacgaaaat ggtccagcaa 1740

gagatggaac gaattctcgg tcaaagcgat agccccctct ttgatgtagt gaaccggaaa 1800

aagttaaaag agttaaccga aactggtggc aaggcattaa cgacacctta ttttgggcag 1860

cttatgacag gcccgcagct ccttgcccac ttcatccaaa tggagcattg gcttaagcat 1920

tacaatatca aattaattgg t 1941

<210>12

<211>1869

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>12

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcgggatatc 60

acaagtttgt acaaaaaagc aggctcctgc aggaccatgt gtggcatcct cgccgtgctc 120

ggcgtcgcag acgtctccct cgtcaagcgc tcccgcatca tcgagctatc ccgccggtta 180

cgtcatagag gccctgattg gagtggtata cactgctatc aggattgcta tcttgcacac 240

cagcggttgg ctattgttga tcccacatcc ggagaccagc cgttgtacaa tgaggacaaa 300

tctgttgttg tgacggtgaa tggagagatc tataaccatg aagaattgaa agctaacctg 360

aaatctcata aattccaaac tgctagcgat tgtgaagtta ttgctcatct gtatgaggaa 420

tatggggagg aatttgtgga tatgttggat gggatgttcg cttttgttct tcttgacaca 480

cgtgataaaa gcttcattgc agcccgtgat gctattggca tttgtccttt atacatgggc 540

tggggtcttg atggttcggt ttggttttcg tcagagatga aggcattaag tgatgattgc 600

gagcgattca tatccttccc ccctgggcac ttgtactcca gcaaaacagg tggcctaagg 660

agatggtaca acccaccatg gttttctgaa agcattccct ccaccccgta caatcctctt 720

cttctccgac agagctttga gaaggctatt attaagaggc taatgacaga tgtgccattt 780

ggtgttctct tgtctggtgg actggactct tctttggttg catctgttgt ttcgcggcac 840

ttggcagagg caaaagttgc cgcacagtgg ggaaacaaac tgcatacatt ttgcattggt 900

ttgaaaggtt ctcctgatct tagagctgct aaggaagttg cagactacct tggtactgtt 960

catcacgaac tccacttcac agtgcaggaa ggcattgatg cactggagga agtcatttac 1020

catgttgaga catatgatgt aacgacaatt agagcaagca ccccaatgtt cttgatgtca 1080

cgtaaaatta aatctttggg ggtgaagatg gttctttcgg gagaaggttc tgatgaaata 1140

tttggcggtt acctttattt tcacaaggca ccaaacaaga aggaattcca tgaggaaaca 1200

tgtcggaaga taaaagccct tcatttatat gattgcttga gagcgaacaa atcaacttct 1260

gcatggggtg ttgaggcccg tgttccgttc cttgacaaaa acttcatcaa tgtagctatg 1320

gacattgatc ctgaatggaa aatgataaaa cgtgatcttg gccgtattga gaaatgggtt 1380

ctccggaatg catttgatga tgaggagaag ccctatttac ctaagcacat tctatacagg 1440

caaaaggagc aattcagtga tggtgttggg tacagttgga ttgatggatt gaaggatcat 1500

gcaaatgaac atgtatcaga ttccatgatg atgaacgcta gctttgttta cccagaaaac 1560

actccagtta caaaagaagc gtactattat aggacaatat tcgagaaatt ctttcccaag 1620

aatgctgcta ggttgacagt acctggaggt cctagcgtcg cgtgcagcac tgctaaagct 1680

gttgaatggg acgcagcctg gtccaaaaac cttgatccat ctggtcgtgc tgctcttggt 1740

gttcatgatg ctgcatatga agatactcta caaaaatctc ctgcctctgc caatcctgtc 1800

ttggataacg gctttggtcc agcccttggg gaaagcatgg tcaaaaccgt tgcttcagcc 1860

actgccgtt 1869

<210>13

<211>1764

<212>DNA

<213>Galdieria sulphuraria

<400>13

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcggaccggt 60

cgcgcctcag cagtcgctgt cgttaccatg tgtgggattc ttgcggtgtt gggctcgtcg 120

ttaccggtcg aagagcttag agagttggtt aaaagctgca ccaaaaaact atatcacaga 180

ggtccagatg aagaacaata tttcattagt gaagatgggt ggtgtggttt aggctttgcc 240

aggttgaaga ttgttgatcc tgagcacggt gtccagccta tgttcaacga ccaacggaca 300

gtttggagtg tcactaatgg cgagctttac aaccatgaag agatccgaaa aacggaattg 360

aacaatatga cactccattc tcattctgac tgcgaaataa tgataccttt gtatgagaaa 420

tatgtttcta gtcagcgtta tgatcatgac attcaatatg tttataatct tctccgtgga 480

gtctttgctt cttgcctggt tgatttgaaa cgtggttttt tcatggctgg aagagatcct 540

atcggggtcc gagctctttt ttatgggaca agtaaagatg gtgctgtttg gtttgcttca 600

gaggcaaaag caattgtgga tgtttgtgat tatgtgacag cattcatacc aggtaccttt 660

gtgaaaggat acagaggccg cgaacaagca ttttctttta cgagatatta cgaaccagtg 720

tactggcatg atcactggat gccggtttct ccagttgact atcaactttt acatgacacc 780

tttgtgttgt cttgtaagcg tcgtttaatg tccgacgtgc ctattggagt atttatctct 840

ggtggtttgg gttcttctct tgtggcctcc gtcgccaaac gcttactgga tcccaactat 900

gattttcatt cttttgcttg tggtcttgaa ggagcaccag atgttgctgc agcgcaaaga 960

gttgccgatt tcttaggaac aaagcaccac gtattaacat ttactgtgga ggagggtatc 1020

caagcactag accaagtaat atatcacttg gaaacgtacg atgttaccac agttagagca 1080

tcgacgccga tgtatttgtt atcaggtttg tgcaaaaagt atgtcaaagt agtgttatca 1140

ggtgaaggag cagatgaaat cttcggtgga tatctctatt tccacaatgc accaaatgag 1200

attgcatttc atcaagaagt tgttcgccga gtgaaacttt tatacacagc cgacgtattg 1260

cgtggagata gagcaacggc agcacaaagt ttagaacttc gagttccgtt tcttgataga 1320

gactttctgg atgttgcaat gagtattcat ccgcgtgaaa aggttacttc taagcataga 1380

atcgagaaat atatcattcg ctatgccttt tccaaggagt tttgtggtga agagtatctt 1440

cctgacgata ttctttggag acaaaaagaa cagttttcgg atggcgtggg ctatagctgg 1500

atcgatggtt taaaggcgta ttgtgaaaag gccgtttccg atgcagactt gcaaaatgcc 1560

gctcagcgtt ttccgcacga tactccaaca accaaagagg catatgttta ccgagctata 1620

ttcgaaaaac attttgggaa ttgcaaggca gtacaaggtc ttcgtgaatc agttgcaaga 1680

tgggtaccta tgtggagtga cagcacggat cctagcggtc gtgcacaaaa agttcatgtg 1740

gctgcatatt caaatggagg agac 1764

<210>14

<211>1905

<212>DNA

<213>Galdieria sulphuraria

<400>14

atgtgttgct ctccttacct cctgatggta tctagtatct accaactgac actatattgc 60

ttctctttac atacgtatct tgctcgatgc cttctcccta gtgttgacca gtgttactca 120

catagtcttt gctcatttca ttgtaatgca gataccaagc ggggtaccag atctgagctc 180

ccgcgggata tcacaagttt gtacaaaaaa gcaggctcct gcaggaccat gtgtgggatt 240

cttgcggtgt tgggctcgtc gttaccggtc gaagagctta gagagttggt taaaagctgc 300

accaaaaaac tatatcacag aggtccagat gaagaacaat atttcattag tgaagatggg 360

tggtgtggtt taggctttgc caggttgaag attgttgatc ctgagcacgg tgtccagcct 420

atgttcaacg accaacggac agtttggagt gtcactaatg gcgagcttta caaccatgaa 480

gagatccgaa aaacggaatt gaacaatatg acactccatt ctcattctga ctgcgaaata 540

atgatacctt tgtatgagaa atatgtttct agtcagcgtt atgatcatga cattcaatat 600

gtttataatc ttctccgtgg agtctttgct tcttgcctgg ttgatttgaa acgtggtttt 660

ttcatggctg gaagagatcc tatcggggtc cgagctcttt tttatgggac aagtaaagat 720

ggtgctgttt ggtttgcttc agaggcaaaa gcaattgtgg atgtttgtga ttatgtgaca 780

gcattcatac caggtacctt tgtgaaagga tacagaggcc gcgaacaagc attttctttt 840

acgagatatt acgaaccagt gtactggcat gatcactgga tgccggtttc tccagttgac 900

tatcaacttt tacatgacac ctttgtgttg tcttgtaagc gtcgtttaat gtccgacgtg 960

cctattggag tatttatctc tggtggtttg ggttcttctc ttgtggcctc cgtcgccaaa 1020

cgcttactgg atcccaacta tgattttcat tcttttgctt gtggtcttga aggagcacca 1080

gatgttgctg cagcgcaaag agttgccgat ttcttaggaa caaagcacca cgtattaaca 1140

tttactgtgg aggagggtat ccaagcacta gaccaagtaa tatatcactt ggaaacgtac 1200

gatgttacca cagttagagc atcgacgccg atgtatttgt tatcaggttt gtgcaaaaag 1260

tatgtcaaag tagtgttatc aggtgaagga gcagatgaaa tcttcggtgg atatctctat 1320

ttccacaatg caccaaatga gattgcattt catcaagaag ttgttcgccg agtgaaactt 1380

ttatacacag ccgacgtatt gcgtggagat agagcaacgg cagcacaaag tttagaactt 1440

cgagttccgt ttcttgatag agactttctg gatgttgcaa tgagtattca tccgcgtgaa 1500

aaggttactt ctaagcatag aatcgagaaa tatatcattc gctatgcctt ttccaaggag 1560

ttttgtggtg aagagtatct tcctgacgat attctttgga gacaaaaaga acagttttcg 1620

gatggcgtgg gctatagctg gatcgatggt ttaaaggcgt attgtgaaaa ggccgtttcc 1680

gatgcagact tgcaaaatgc cgctcagcgt tttccgcacg atactccaac aaccaaagag 1740

gcatatgttt accgagctat attcgaaaaa cattttggga attgcaaggc agtacaaggt 1800

cttcgtgaat cagttgcaag atgggtacct atgtggagtg acagcacgga tcctagcggt 1860

cgtgcacaaa aagttcatgt ggctgcatat tcaaatggag gagac 1905

<210>15

<211>1851

<212>DNA

<213>Galdieria sulphuraria

<400>15

atggtatcta gtatctacca actgacacta tattgcttct ctttacatac gtatcttgct 60

cgatgccttc tccctagtgt tgaccagtgt tactcacata gtctttgctc atttcattgt 120

aatgcagata ccaagcggga gctcgacgtc cctcagcagt cgctgtgcga taccatgtgt 180

gggattcttg cggtgttggg ctcgtcgtta ccggtcgaag agcttagaga gttggttaaa 240

agctgcacca aaaaactata tcacagaggt ccagatgaag aacaatattt cattagtgaa 300

gatgggtggt gtggtttagg ctttgccagg ttgaagattg ttgatcctga gcacggtgtc 360

cagcctatgt tcaacgacca acggacagtt tggagtgtca ctaatggcga gctttacaac 420

catgaagaga tccgaaaaac ggaattgaac aatatgacac tccattctca ttctgactgc 480

gaaataatga tacctttgta tgagaaatat gtttctagtc agcgttatga tcatgacatt 540

caatatgttt ataatcttct ccgtggagtc tttgcttctt gcctggttga tttgaaacgt 600

ggttttttca tggctggaag agatcctatc ggggtccgag ctctttttta tgggacaagt 660

aaagatggtg ctgtttggtt tgcttcagag gcaaaagcaa ttgtggatgt ttgtgattat 720

gtgacagcat tcataccagg tacctttgtg aaaggataca gaggccgcga acaagcattt 780

tcttttacga gatattacga accagtgtac tggcatgatc actggatgcc ggtttctcca 840

gttgactatc aacttttaca tgacaccttt gtgttgtctt gtaagcgtcg tttaatgtcc 900

gacgtgccta ttggagtatt tatctctggt ggtttgggtt cttctcttgt ggcctccgtc 960

gccaaacgct tactggatcc caactatgat tttcattctt ttgcttgtgg tcttgaagga 1020

gcaccagatg ttgctgcagc gcaaagagtt gccgatttct taggaacaaa gcaccacgta 1080

ttaacattta ctgtggagga gggtatccaa gcactagacc aagtaatata tcacttggaa 1140

acgtacgatg ttaccacagt tagagcatcg acgccgatgt atttgttatc aggtttgtgc 1200

aaaaagtatg tcaaagtagt gttatcaggt gaaggagcag atgaaatctt cggtggatat 1260

ctctatttcc acaatgcacc aaatgagatt gcatttcatc aagaagttgt tcgccgagtg 1320

aaacttttat acacagccga cgtattgcgt ggagatagag caacggcagc acaaagttta 1380

gaacttcgag ttccgtttct tgatagagac tttctggatg ttgcaatgag tattcatccg 1440

cgtgaaaagg ttacttctaa gcatagaatc gagaaatata tcattcgcta tgccttttcc 1500

aaggagtttt gtggtgaaga gtatcttcct gacgatattc tttggagaca aaaagaacag 1560

ttttcggatg gcgtgggcta tagctggatc gatggtttaa aggcgtattg tgaaaaggcc 1620

gtttccgatg cagacttgca aaatgccgct cagcgttttc cgcacgatac tccaacaacc 1680

aaagaggcat atgtttaccg agctatattc gaaaaacatt ttgggaattg caaggcagta 1740

caaggtcttc gtgaatcagt tgcaagatgg gtacctatgt ggagtgacag cacggatcct 1800

agcggtcgtg cacaaaaagt tcatgtggct gcatattcaa atggaggaga c 1851

<210>16

<211>1851

<212>DNA

<213>Galdieria sulphuraria

<400>16

atggtatcta gtatctacca actgacacta tattgcttct ctttacatac gtatcttgct 60

cgatgccttc tccctagtgt tgaccagtgt tactcacata gtctttgctc atttcattgt 120

aatgcagata ccaagcggga gctcgacgtc cctcagcagt cgctgtgcga taccatgtgt 180

gggattcttg cggtgttggg ctcgtcgtta ccggtcgaag agcttagaga gttggttaaa 240

agctgcacca aaaaactata tcacagaggt ccagatgaag aacaatattt cattagtgaa 300

gatgggtggt gtggtttagg ctttgccagg ttgaagattg ttgatcctga gcacggtgtc 360

cagcctatgt tcaacgacca acggacagtt tggagtgtca ctaatggcga gctttacaac 420

catgaagaga tccgaaaaac ggaattgaac aatatgacac tccattctca ttctgactgc 480

gaaataatga tacctttgta tgagaaatat gtttctagtc agcgttatga tcatgacatt 540

caatatgttt ataatcttct ccgtggagtc tttgcttctt gcctggttga tttgaaacgt 600

ggttttttca tggctggaag agatcctatc ggggtccgag ctctttttta tgggacaagt 660

aaagatggtg ctgtttggtt tgcttcagag gcaaaagcaa ttgtggatgt ttgtgattat 720

gtgacagcat tcataccagg tacctttgtg aaaggataca gaggccgcga acaagcattt 780

tcttttacga gatattacga accagtgtac tggcatgatc actggatgcc ggtttctcca 840

gttgactatc aacttttaca tgacaccttt gtgttgtctt gtaagcgtcg tttaatgtcc 900

gacgtgccta ttggagtatt tatctctggt ggtttgggtt cttctcttgt ggcctccgtc 960

gccaaacgct tactggatcc caactatgat tttcattctt ttgcttgtgg tcttgaagga 1020

gcaccagatg ttgctgcagc gcaaagagtt gccgatttct taggaacaaa gcaccacgta 1080

ttaacattta ctgtggagga gggtatccaa gcactagacc aagtaatata tcacttggaa 1140

acgtacgatg ttaccacagt tagagcatcg acgccgatgt atttgttatc aggtttgtgc 1200

aaaaagtatg tcaaagtagt gttatcaggt gaaggagcag atgaaatctt cggtggatat 1260

ctctatttcc acaatgcacc aaatgagatt gcatttcatc aagaagttgt tcgccgagtg 1320

aaacttttat acacagccga cgtattgcgt ggagatagag caacggcagc acaaagttta 1380

gaacttcgag ttccgtttct tgatagagac tttctggatg ttgcaatgag tattcatccg 1440

cgtgaaaagg ttacttctaa gcatagaatc gagaaatata tcattcgcta tgccttttcc 1500

aaggagtttt gtggtgaaga gtatcttcct gacgatattc tttggagaca aaaagaacag 1560

ttttcggatg gcgtgggcta tagctggatc gatggtttaa aggcgtattg tgaaaaggcc 1620

gtttccgatg cagacttgca aaatgccgct cagcgttttc cgcacgatac tccaacaacc 1680

aaagaggcat atgtttaccg agctatattc gaaaaacatt ttgggaattg caaggcagta 1740

caaggtcttc gtgaatcagt tgcaagatgg gtacctatgt ggagtgacag cacggatcct 1800

agcggtcgtg cacaaaaagt tcatgtggct gcatattcaa atggaggaga c 1851

<210>17

<211>1803

<212>DNA

<213>Saccharomyces cerevisiae

<400>17

atgatttgtg acaaatgcag cctcgtgcgg agcttttttg taggtagacc gcggaccggt 60

cgcgcctcag cagtcgctgt cgttaccatg tgtggtatct ttgcagcctt caagcatgaa 120

gatattcaca acttcaaacc aaaagctcta caactatcta aaaaaatcag acaccgtggc 180

ccagattggt caggaaatgc cgttatgaat tccaccattt tcgttcacga gaggttggct 240

attgttggtt tagactccgg tgcccagcca atcacttcag ctgatggcga atatatgctt 300

ggcgttaatg gtgagatcta caaccacatc caactaaggg agatgtgctc tgattacaag 360

tttcaaactt tcagtgactg tgaacccatc ataccgttat atttggaaca tgatatcgat 420

gctccaaaat atctggacgg tatgttcgca ttttgtctgt atgattccaa gaaagaccgt 480

attgtcgctg caagagaccc tatcggtgtt gtcactttat acatggggcg ttcttctcag 540

tctccagaga ccgtttattt tgcctccgaa ttaaaatgtc taactgacgt ttgtgacagt 600

atcatttcgt tccctcctgg tcatgtctac gattctgaaa cggacaagat tactcgttac 660

tttaccccag actggttgga tgaaaagcgt atcccatcca ccccagttga ctaccatgct 720

atcagacaca gtttagaaaa ggccgttaga aagaggctaa tggctgaagt tccatacggt 780

gttcttctat ccggtgggct ggactcttct ttgattgctg cgattgctgc tcgtgaaacg 840

gaaaaagcta atgctgatgc taacgaagac aacaatgttg acgagaagca acttgcaggt 900

atcgatgacc aaggccatct acacacatcc ggttggtctc gtttgcattc gtttgcgatt 960

ggtctaccaa atgcacctga tttacaagcg gctagaaaag tcgccaaatt cattggttct 1020

atccaccatg aacacacttt tacattacaa gaaggtttgg atgctttgga cgacgtgatc 1080

taccatttgg aaacttacga cgttaccact atcagagctt ctacaccaat gttcttacta 1140

tctagaaaga ttaaggccca aggtgtcaaa atggttcttt ctggtgaagg ctcggacgaa 1200

atattcggtg gctatctata tttcgcacaa gcaccttctg ctgcagaatt tcacaccgaa 1260

tctgtgcaac gtgtcaagaa cttgcatttg gcagattgtt tgagagctaa taagtccacg 1320

atggcttggg gtctagaagc tcgtgttccc ttcttagaca aagacttttt gcagctatgt 1380

atgaacattg atccaaatga aaagatgatc aagccaaagg aaggacgtat cgaaaaatac 1440

attttaagaa aggcattcga cactacagat gaaccagatg ttaagccata cctacctgaa 1500

gaaatcttat ggagacaaaa ggaacaattt tccgatggtg ttggctactc atggattgac 1560

ggcctaagag acactgctga aagggccatt tctgacgcca tgtttgccaa tccaaaggct 1620

gattggggcg acgatattcc aaccaccaaa gaagcttact ggtacaggct gaagtttgat 1680

gcttggtttc ctcaaaagac tgcggcagac actgtcatga gatggattcc aaaggccgat 1740

tggggttgtg ccgaagatcc ttcaggtaga tacgccaaaa tacacgaaaa gcacgtcagt 1800

gct 1803

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>18

gcagucgctg ucgtuaccat g 21

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>19

gcgaguaccg cugggtucta 20

<210>20

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>20

gctcctgcag gaccatgtgt tccatttttg gaatcttca 39

<210>21

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>21

ctgggtctcg agctacagca gtgcttgttg atgaacc 37

<210>22

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>22

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 53

<210>23

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>23

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210>24

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>24

gctcctgcag gaccatgtgt ggaattacag gctggg 36

<210>25

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>25

ctgggtctcg agctaaccaa ttaatttgat attgtaatgc ttaagcc 47

<210>26

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>26

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 53

<210>27

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>27

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210>28

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>28

gctcctgcag gaccatgtgc ggcatcctcg c 31

<210>29

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>29

ctgggtctcg agctagacag ctgtggctga agcaac 36

<210>30

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>30

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 53

<210>31

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>31

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210>32

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>32

gctcctgcag gaccatgtgc ggcatacttg ctgtg 35

<210>33

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>33

ctgggtctcg agctatccct cgatggcaac gc 32

<210>34

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>34

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 53

<210>35

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>35

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210>36

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>36

gctcctgcag gaccatgtgt ggcatcctcg ccgt 34

<210>37

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>37

ctgggtctcg agctaaacgg cagtggctga agca 34

<210>38

<211>53

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>38

ccccttttat aatgccaact ttgtacaaaa aagcaggctc ctgcaggacc atg 53

<210>39

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>39

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210>40

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>40

gctcctgcag gaccatgtgt ggtattcttg ctgttcttgg 40

<210>41

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>41

ctgggtctcg agctagccct ggatggcaac acc 33

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>42

ctgggtctcg agctagccct ggatggcaac acc 33

<210>43

<211>48

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>43

ggggtcttat aatgccaact ttgtacaaga aagctgggtc tcgagcta 48

<210>44

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>44

cctctagatg tgcggcatac ttgctg 26

<210>45

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物序列

<400>45

cgaattctat ccctcgatgg caacg 25

<210>46

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>46

tcctagacat gtccggcata cttgctg 27

<210>47

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>47

tgcagaattc tatccctcga tgg 23

<210>48

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>48

gcagtcgctg tcgttacccg gcatcatgtg tggcatc 37

<210>49

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400>49

gcgagtaccg ctgggttcta acgtactctc gtcagaccgc g 41

Claims

1.制备具有增加的天冬酰胺的转基因玉米植株的方法，所述方法包括：

a)用含启动子分子的异源DNA构建物转化玉米细胞，其中所述启动子分子在玉米细胞中有功能，且有效连接至编码天冬酰胺合成酶多肽的DNA分子；

b)将所述玉米细胞再生为完整玉米植株；

c)选择相对于未用所述DNA构建物转化的玉米植株组织而言在组织中具有增加的天冬酰胺的玉米植株；

d)培养所述玉米植株至成熟；和

e)由所述玉米植株收获种子，

其中所述天冬酰胺合成酶多肽的序列如SEQ ID NO：6所示。

2.权利要求1的方法，其中所述DNA分子的序列如SEQ ID NO：5所示。

3.权利要求1的方法，所述方法还包含以下步骤：

f)选择具有增加的蛋白的种子。

4.相对于其它玉米粉具有增加的蛋白的玉米粉，其中所述玉米粉包含异源DNA构建物，所述异源DNA构建物含有效连接至编码异源天冬酰胺合成酶多肽的DNA分子的启动子分子，

其中所述天冬酰胺合成酶多肽的序列如SEQ ID NO：6所示。

5.权利要求4的玉米粉，其中所述玉米天冬酰胺合成酶多肽是玉米AsnS2多肽。

6.权利要求4的玉米粉，其中所述DNA分子的序列如SEQ IDNO：5所示。

7.动物饲料，所述动物饲料由权利要求4的玉米粉制备。