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CN101243120B - 聚合物试剂和聚合物试剂组合物的制备方法 - Google Patents

聚合物试剂和聚合物试剂组合物的制备方法 Download PDF

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CN101243120B CN2006800302363A CN200680030236A CN101243120B CN 101243120 B CN101243120 B CN 101243120B CN 2006800302363 A CN2006800302363 A CN 2006800302363A CN 200680030236 A CN200680030236 A CN 200680030236A CN 101243120 B CN101243120 B CN 101243120B
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Abstract

本发明提供了制备水溶性聚合物的活性碳酸酯的方法。也提供了与水溶性聚合物的活性碳酸酯相关的其它方法，以及提供相应的组合物。

Description

聚合物试剂和聚合物试剂组合物的制备方法
                     发明领域
本发明涉及制备水溶性非肽类聚合物(“聚合物试剂(polymeric reagents)”)的方法，以及涉及水溶性非肽类聚合物组合物、偶联物、药物组合物和施用药物组合物的方法。
                     发明背景
科学家和临床医生在将活性剂开发成适于输送至患者的形式的尝试中面对许多挑战。活性剂，例如蛋白质，通常经注射而不是经口被输送。以这种方式，蛋白质被引入体循环而不暴露于胃中的蛋白水解环境中。
然而，蛋白质的注射具有许多缺点。例如，许多蛋白质具有相对短的半衰期，从而需要反复注射，这通常是不方便和痛苦的。而且，许多蛋白质可诱导一种或更多种免疫应答，结果患者的免疫系统企图破坏或另外中和该免疫原性蛋白。当然，一旦蛋白质被破坏或被另外中和，该蛋白质不能够发挥其预期药效。因此，即使通过注射施用，例如蛋白质等活性剂的输送通常也是麻烦的。
在着眼于通过注射输送活性剂的问题方面已经取得了一些成功。例如，将活性剂偶联到水溶性聚合物已经得到了免疫原性和抗原性降低的聚合物-活性剂偶联物。此外，由于通过肾脏的清除率降低和/或在体循环中的酶促降解降低，聚合物-活性剂偶联物相比于其未偶联的对应物通常具有增加的半衰期。由于具有更长的半衰期，聚合物-活性剂偶联物要求更低频率的给药，这又降低了疼痛注射和与卫生保健专业人员会面的总次数。而且，当偶联于水溶性聚合物，仅微溶的活性剂表现为水溶性显著增强。
由于其广为证明的安全性以及其被FDA批准用于局部应用和内用，聚乙二醇已经被偶联到活性剂。当活性剂偶联到聚乙二醇或“PEG”聚合物时，被偶联的活性剂通常被称为“PEG化的”。商业成功的PEG化的活性剂，例如PEGASYS
Figure 2006800302363_1
 PEG化干扰素α-2a(Hoffmann-LaRoche，Nutley，NJ)、PEG-INTRON
Figure 2006800302363_2
 PEG化干扰素α-2b(ScheringCorp.，Kennilworth，NJ)和NEULASTATM PEG-非格司亭(PEG-filgrastim)(Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA)，证明了施用偶联形式的活性剂相对于未偶联的对应物可具有显著的优势。小分子例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(Zalipsky(1993)Bioconjug.Chem.4(4)：296-299)和氟尿嘧啶(Ouchi et al.(1992)Drug Des.Discov.9(1)：93-105)也已经被PEG化。Harris等人已提供了PEG化对药物影响的综述。Harris et al.(2003)Nat.Rev.Drug Discov.2(3)：214-221.
通常，偶联物的形成包括活性剂和聚合物试剂之间的反应。尽管小规模量的聚合物试剂可从商业来源例如Nektar Therapeutics获得，但是当需要商业规模或生产规模的聚合物试剂时了关注。具体而言，存在这样的关注：用于产生期望的偶联物的具体聚合物试剂(用于制备在制造所需偶联物的聚合物试剂的中间体)不能以及时、有效和经济的方式加以合成，且在很大程度上不含有潜在有害的杂质。
例如，带有活性酯的聚合物——其可用作聚合物试剂以及在制备其它聚合物试剂中有用的中间体——的常规合成需要过量的低分子量试剂[例如二(1-苯并三唑)碳酸酯]，所述的分子量试剂必须被去除。尽管复杂，低分子量试剂的去除是必要的，以便低分子量试剂不与其它分子反应，从而引入导致产物相对不纯和收率降低的不期望的副反应和副产物。
在制备带有活性酯的聚合物的一种途径中，美国专利6,624,246描述了带有苯并三唑碳酸酯基团的甲氧基聚乙二醇的合成(″mPEG-BTC″)。如其中所描述，该方法实际上包括mPEG-BTC形成，然后是mPEG-BTC纯化以纯化该mPEG-BTC种，以及去除未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯和任何其它低分子量产物(例如，1-苯并三唑醇)。如美国专利6,624,246所述，mPEG-BTC的纯化包括多个沉淀步骤。该方法的示意图被提供如下。
Figure S2006800302363D00031
B)mPEG-BTC纯化
a)蒸馏出有机溶剂，形成三种产物残留
b)在二氯甲烷中重新溶解该三种产物
Figure S2006800302363D00032
在mPEG-BTC的制备中——其中聚乙二醇部分具有约20,000道尔顿的重均分子量，使用了八倍过量的diBTC，以实现所有mPEG-OH向mPEG-BTC的100％转化。尽管大量的diBTC确保了MPEG-OH向mPEG-BTC的最佳转化，但是相对大的量的diBTC仍保持为未反应并且必须在进行任何进一步的合成步骤之前加以去除。否则，剩余的diBTC将与遇到的任何反应基(例如，醇基团、胺基团等)反应并引入不期望的杂质和降低总收率。
如在美国专利5,932,462中所述，mPEG-BTC与赖氨酸(带有两个氨基基团和单个羧酸基团)反应，从而提供“赖氨酸支化”结构，其中mPEG残基被连接到每一个氨基基团上并且羧酸可用于进一步官能化。尽管消耗任意过量的diBTC并添加过量的赖氨酸是可能的，但是由于至少两个原因，这样的途径是有缺陷的。首先，diBTC和mPEG-BTC都将竞争可利用的赖氨酸氨基基团，从而得到期望的赖氨酸支化结构和仅具有单个mPEG残基、单个BTC基团和单个羧酸的另一种的混合物。第二，即使该途径是成功的，它也未解决这样的情况，其中含非赖氨酸残基的产物是期望的。
仅仅通过在mPEG-BTC纯化期间破坏来自mPEG-BTC形成的过量diBTC，便可避免在赖氨酸反应期间含有过量的diBTC。异丙醇(Isopropyl alcohol)(IPA，异丙醇)可用来替代乙醚，以从二氯甲烷溶液中沉淀the mPEG-BTC[即，例如，在上面的示意图中的步骤B(c)]。如果进行该变化，则IPA与过量的diBTC反应，形成异丙基-BTC，其在二氯甲烷和IPA的混合物中是可溶的。遗憾的是，在大规模的这类操作中，一些异丙基-BTC被截留在mPEG-BTC沉淀中。由于异丙基-BTC将在任何与赖氨酸的反应中与mPEG-BTC竞争，在生产可以继续之前异丙基-BTC必须被去除。为除去截留的异丙基-BTC，一个或两个另外的“预沉淀”步骤必须被进行，以得到不含异丙基-BTC的mPEG-BTC。由于每次预沉淀导致mPEG-BTC产物的一些损失——因为仅约85-95％的固体被回收，所以该途径是昂贵的并且需要额外的时间。
在另一种制备带有活性酯的聚合物的途径中，美国专利5,281,698描述了带有琥珀酰亚胺碳酸酯的甲氧基聚乙二醇(″mPEG-SC″)的合成。如其中所述，该方法实际上包括mPEG-SC形成，然后是mPEG-SC纯化以纯化该mPEG-SC种，以及去除未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯和任何其它低分子量产物(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)。如美国专利5,281,698所述，mPEG-SC的纯化包括分离和多个沉淀步骤。该方法的示意图被提供如下。
Figure S2006800302363D00051
B)mPEG-SC纯化
a)过滤反应混合物
b)蒸馏出有机溶剂，形成三种产物残留
c)在二氯甲烷中重新溶解该三种产物
d)加入乙醚，冷却并形成，冷却并形成mPEG-SC的沉淀
e)再重复沉淀(步骤c和d)两次
在mPEG-SC的制备中——其中聚乙二醇部分具有约6100道尔顿的重均分子量，使用了二十倍过量的DSC，以实现所有mPEG-OH向mPEG-SC的100％转化。尽管大量的DSC确保了MPEG-OH向mPEG-SC的最佳转化，但是相对大的量的DSC仍未反应并且必须在进行任何进一步的合成步骤之前加以去除。否则，剩余的DSC将与遇到的任何活性基团(例如，醇基团、胺基团等)反应并引入不期望的杂质和降低总收率。
因此，对于这样的有效方法存在需求：从低分子量试剂被添加的同一反应混合物中去除过量的低分子量试剂，所述的分子量试剂如diBTC和/或其活性降解物，从而实现“一锅法”反应。本发明致力于本领域中的这个和其它需求。
                     发明概述
在一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
(a)混合含有胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，其中所述含有活化碳酸酯试剂的组合物被添加，使得存在相对于胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；和
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗。
在发明的一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
(a)混合含有羟端基水溶性聚合物的组合物与含有二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下面的结构：
          CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)是2至约4000的整数，其中所述含有二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物被添加，使得存在相对于羟端基水溶性聚合物过量的二(1-苯并三唑)碳酸酯，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下面的结构：
其中(n)是2至约4000的整数；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯被基本上消耗。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
(a)混合含有羟端基水溶性聚合物的组合物与含有二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下面的结构：
           CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)是2至约4000的整数，其中所述含有二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物被添加，使得存在相对于羟端基水溶性聚合物过量的二琥珀酰亚胺碳酸酯，从而得到含有羟端基水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下面的结构：
其中(n)是2至约4000的整数；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯被基本上消耗。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
(a)混合含有羟端基水溶性聚合物的组合物与含有对硝基苯基氯甲酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下面的结构：
            CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)是2至约4000的整数，其中所述含有对硝基苯基氯甲酸酯的组合物被添加，使得存在相对于羟端基水溶性聚合物过量的对硝基苯基氯甲酸酯，从而得到含有羟端基水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的对硝基苯基氯甲酸酯的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下面的结构：
Figure S2006800302363D00072
其中(n)是2至约4000的整数；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的对硝基苯基氯甲酸酯的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的对硝基苯基氯甲酸酯被基本上消耗。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
使如下制备的水溶性聚合物的活性碳酸酯与活性剂在偶联条件下反应，从而得到水溶性聚合物-活性剂偶联物：
(i)混合含有胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，其中所述含有活化碳酸酯试剂的组合物被添加，使得存在相对于胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；和
(ii)将含有反应性分子的组合物添加到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
使如下制备的聚合物试剂与活性剂在偶联条件下反应，从而得到水溶性聚合物-活性剂偶联物：
(a)混合含有胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，其中所述含有活化碳酸酯试剂的组合物被添加，使得存在相对于胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗；和
(c)使水溶性聚合物的活性碳酸酯在一个或更多个反应中反应，形成聚合物试剂。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了合成方法，所述方法包括：
使如下制备的聚合物试剂与活性剂在偶联条件下反应，从而得到水溶性聚合物-活性剂偶联物：
(a)混合含有胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，其中所述含有活化碳酸酯试剂的组合物被添加，使得存在相对于胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中所述含有反应性分子的组合物被添加，使得基本上所有未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗；和
(c)使水溶性聚合物的活性碳酸酯在一个或更多个反应中反应，形成聚合物试剂。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了含有偶联物的组合物的制备方法，所述方法包括混合根据本文所描述的合成方法制备的水溶性聚合物的活性碳酸酯或(由其制备的聚合物试剂)与活性剂，从而得到含偶联物的组合物。
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了含偶联物的组合物，所述组合物由本文所提供的含偶联物的组合物的制备方法产生。
                     发明详述
在详细描述本发明的一个或更多个实施方式之前，应当理解，本发明并不限于具体的聚合物、试剂等，因为这些可以变化。
必须注意到，如在本说明书和权利要求书中所使用，单数形式的“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数的所指物，除非上下文明确另外指出。因此，例如，提及“聚合物”包括单个聚合物以及两个或更多个相同或不同的聚合物，提及“活化碳酸酯试剂”是指单个活性碳酸酯试剂以及两个或更多个相同或不同活性碳酸酯试剂，等等。
在描述本发明和要求保护本发明时，下列术语将根据下面提供的定义进行使用。
如本文所使用，“PEG”、“聚乙二醇”和“聚(乙二醇)”是互换的。通常，根据本发明使用的PEG包括下列结构：“-(OCH2CH2)n-”，其中(n)为2至4000。如本文所使用，取决于末端氧是否已经被取代，PEG也包括“-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-”和“-(OCH2CH2)nO-”。在整个说明书和权利要求书中，应当记住，术语“PEG”包括具有各种端基或封端基团的结构。术语“PEG”也是指含有大部分——也就是说，在50％以上——的-OCH2CH2-或-CH2CH2O-重复亚单元。对于具体的形式，PEG可以具有任意数量的各种分子量、以及各种结构或几何形状，例如“支化”、“线型”、“叉化”、“多官能”等，将在下面更详细描述。
术语“封端的(end-capped)”和“末端的(terminallycapped)”在本文中可互换用来指具有封端部分的聚合物末端或端点。典型地，尽管并非必须，封端部分包括羟基或C1-20烷氧基，更优选C1-10烷氧基，仍更优选C1-5烷氧基。因此，封端部分的例子包括烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基和苄氧基)、以及芳基、杂芳基、环、杂环和类似物。必须记住，封端部分可包括聚合物中末端单体的一个或更多个原子[例如，在CH3(OCH2CH2)n-中的末端部分“甲氧基”]。此外，设想前述任何一种的饱和、不饱和、取代和未取代形式被考虑。而且，封端基团也可以是硅烷。封端基团还可有利地包括可检测标记。当聚合物具有包括可检测标记的封端基团时，聚合物和/或聚合物偶联的部分(例如活性剂)的量或位置可通过合适的检测器加以确定。这类标记非限制性地包括荧光剂、化学发光剂、在酶标记中使用的部分、比色部分(例如，染料)、金属离子、放射性部分和类似标记。合适的检测器包括光度计、薄膜、分光计等。封端基团还可有利地包括磷脂。当聚合物具有包括磷脂的封端基团时，独特性能被赋予该聚合物和所得到的偶联物。示例性的磷脂非限制性地包括选自被称为磷脂酰胆碱的磷脂类的那些。具体的磷脂非限制性地包括选自二月桂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、山嵛炔酰磷脂酰胆碱、花生四烯酸磷脂酰胆碱和卵磷脂的那些。
关于如本文所描述的聚合物，“非天然生成的(Non-naturally occurring)”是指在自然中不是作为整体被发现的聚合物。然而，非天然发生的聚合物可以包含天然生成的一个或更多个单体或单体的链段，只要整体聚合物结构未在自然中被发现。
如在“水溶性聚合物”中的术语“水溶性”是指在室温下溶于水的任何聚合物。通常，水溶性聚合物将透射的光是由过滤后的同一溶液透射的光的至少约75％，更优选至少约95％。按重量计，水溶性聚合物优选至少约35％(按重量计)是水可溶的，更优选至少约50％(按重量计)是水可溶的，仍更优选约70％(按重量计)是水可溶的，且仍更优选约85％(按重量计)是水可溶的。然而，最优选的是，水溶性聚合物约95％(按重量计)是水可溶的或者完全水可溶的。
上下文中的例如PEG等水溶性聚合物的情况下，分子量可以表示成数均分子量或重均分子量。除非另外说明，本文中所有提及分子量是指重均分子量。两种分子量——数均和重均——确定，都可以使用凝胶渗透色谱或其它液相色谱技术进行测量。测量分子量值的其它方法也可以被使用，例如利用端基分析或依数性(凝固点降低、沸点升高或渗透压)的测量来确定数均分子量或者利用光散射技术、超离心或粘度测定法来确定重均分子量。本发明的聚合物通常是多分散性的(即，聚合物的数均分子量和重均分子量不相等)，具有低多分散性，优选在约1.2以下，更优选在约1.15以下，仍更优选在约1.10以下，仍更优选在约1.05以下，以及最优选在约1.03以下。如本文所使用，将不时提及具有重均分子量或数均分子量的单一水溶性聚合物；这类提及应当被理解为是指该单一溶解聚合物获自具有所述分子量的水溶性聚合物的组合物。
术语“活性的(active)”或“活化的(activated)”，当与具体官能团结合使用时，是指容易与另一分子上的亲电体或亲核体反应的反应性官能团。这不同于那些要求强催化剂或很不切实际的反应条件以进行反应的基团(即，“非反应性”或“惰性”基团)
如本文所使用，术语“官能团”或其任何同义词意图包括其保护形式以及未保护形式。
术语“间隔部分(spacer moiety)”、“键”或“连接体”用于本文是指用于将相互连接的部分相连接的原子或原子的集合，所述相互连接的部分例如聚合物的末端和活性剂或活性剂的亲电体或亲核体。间隔部分可以是水解稳定的或可以包括生理上可水解的或酶可降解的键。
“烷基”是指烃链，其长度通常在约1至15个原子的范围内。这类烃链优选但不必须是饱和的，且可以是支链或直链，尽管通常直链是优选的。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、3-甲基戊基和类似基团。如本文所使用，“烷基”包括环烷基以及含亚环烷基的烷基。
“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基基团，并可以是直链或支链的。低级烷基的非限制性例子包括甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
“环烷基”是指饱和或不饱和的环烃链，包括桥连的、稠合的或螺环化合物，优选由3至约12个碳原子，更优选3至约8个碳原子组成。“亚环烷基(cycloalkylene)”是指被插入烷基链的环烷基基团，其通过在环体系中的任何两个碳上键合该链而被插入。
“烷氧基”是指-O-R基团，其中R是烷基、取代的烷基[优选C1-6烷基(例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等等)或取代的C1-6烷基]、芳基、取代的芳基。
术语“取代的”，如在“取代的烷基”中，是指用一个或多个非干扰取代基取代的部分(例如，烷基)，所述非干扰取代基例如但不限于：烷基，C3-8环烷基例如环丙基、环丁基等；卤代，例如氟代、氯代、溴代和碘代；氰基；烷氧基；低级苯基；取代的苯基；硝基和类似取代基。“取代的芳基”是具有一个或多个非干扰取代基的芳基。对于苯环上的取代，取代基可以是任何方向(即，邻、间或对)。
“非干扰取代基”是当存在于分子中时通常与该分子内含有的其它官能团是不反应的那些基团。
“芳基”意指一个或多个芳环，每一个具有5或6个核心碳原子。芳基包括多个芳环，其可以是稠合的，如在萘基中，或者未稠合的，如在联苯基中。芳环也可以与一个或多个环烃、杂芳基或杂环稠合或未与它们稠合。如本文所使用，“芳基”包括杂芳基。
“杂芳基”是含有一个至四个杂原子的芳基基团，所述杂原子优选硫、氧、或氮、或它们的组合。杂芳环可以与一个或多个环烃、杂环、芳基或杂环稠合。
“杂环”或“杂环的”是指一个或更多个具有5-12个原子的环，更优选5-7个原子，具有或不具有不饱和或芳香性，并含有至少一个不是碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
“取代的杂芳基”是具有一个或多个作为取代基的非干扰基团的杂芳基。
“取代的杂环”是具有一个或多个由非干扰取代基形成的侧链的杂环。
如本文所使用，“有机基团”应包括烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基。
“亲电体”和“亲电基团”是指离子或可以是离子的原子或原子的集合，其具有亲电中心，即寻找电子的中心，能够与亲核体反应。
“亲核体”和“亲核基团”是指离子或可以是离子的原子或原子的集合，其具有亲核中心，即寻找亲电中心或能够与亲电体反应的中心。
“生理上可切割的(physiologically cleavable)”或“可水解的”键是在生理条件下与水反应(即，被水解)的键。优选的是在pH8、25℃下水解半衰期约30分钟以下的键。键在水中水解的倾向将不但取决于连接两个给定原子的键的一般类型而且取决于连接于这两个给定原子上的取代基。适当的水解不稳定的或弱的键包括但不限于羧酸酯、磷酸酯、酸酐、乙缩醛、酮缩醇、酰氧基烷基醚、亚胺、原酸酯、肽和寡核苷酸。
“酶可降解的键”意指经受一种或多种酶的降解的键。
“水解稳定的”键(lingage或bond)是指化学键，通常是共价键，其在水中基本上是稳定的，也就是说，在生理条件下在长期期间内不经历任何明显程度的水解。水解稳定的键的例子包括但不限于下列：碳-碳键(例如，在脂族链中)、醚、酰胺、氨基甲酸乙酯等。通常，水解稳定的键是在生理条件下表现出每日约1-2％以下的水解速率的键。代表性化学键的水解速率可以在大多数标准化学教材中找到。
“药学上可接受赋形剂”是指可任选地被包括在组合物之内并在施用后不给患者带来明显的不利毒理效应的赋形剂。
“治疗有效量”在本文中用来指在血流中或在靶组织中提供期望的偶联物(或相应的未偶联活性剂)水平所需的偶联物的量。精确的量将取决于许多因素，例如，具体的活性剂、治疗组合物的成分和物理特性、目标患者群体、输送方式、个体患者考虑因素和类似因素，并可以由本领域普通技术人员方便地确定。
“多官能的”是指其中具有其中含有三个或更多个官能团的聚合物，其中官能团可以相同或不同。多官能聚合物试剂通常将含有约3-100个官能团、或3-50个官能团、或3-25个官能团、或3-15个官能团、或3-10个官能团，或在聚合物骨架中将含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。
“任选的”或“任选地”是指随后描述的情况可发生或可不发生，这样，说明书包括其中该情况发生的情形以及该情况不发生的情形。
“基本上”(除非在别处的具体上下文具体限定或上下文另外清楚地指出)是指接近全部或完全，例如，满足下列之一或多个：所述情况的50％以上、51％或以上、75％或以上、80％或以上、90％或以上和95％或以上。
关于“基本上非含水的”是指这样的组合物或反应介质：(i)具有每百万份10,000份以下(1％以下)的水，更优选具有每百万份1,000份以下(0.1％以下)的水，仍更优选每百万份100份以下(0.01％以下)的水，仍更优选每百万份10份以下(0.001％以下)的水。优选地，但不必须地，基本上非含水的条件包括惰性气氛。
如本文所使用，术语“消耗”将指使用分子中和未反应的活化碳酸酯试剂[例如二(1-苯并三唑)碳酸酯]，可选的，所述反应性分子可以是结合在树脂或柱上的部分，用化学方法破坏所有或大部分化学过程中的未反应活性碳酸酯试剂。
如在一锅合成法中，“一锅”是指前一反应的产物在进行下一反应之前不需要被分离。
除非特别相反地说明，术语“混合(或结合)(combining)”，如在作为合成方法的一部分而将两种或更多种组合物“混合”在一起中，不被限于添加的顺序。
“活化碳酸酯”包括diBTC以及二(1-苯并三唑)碳酸酯(BTC)、二琥珀酰亚胺碳酸酯(″DSC″)、对硝基苯基卤代甲酸酯、二琥珀酰亚胺草酸酯和三光气——即使一种或多种化合物可能不是真正的“碳酸酯”(其中卤代选自氟代、氯代、溴代或碘代)——以及diBTC内的一个或两个苯并三唑基的烷氧基取代基。然而，活性碳酸酯在与胺端基、羟端基或硫羟端基的水溶性聚合物反应后必定产生活化的氨基甲酸乙酯-、碳酸酯、或硫代碳酸酯封端的水溶性聚合物。活化的氨基甲酸乙酯-、碳酸酯、或硫代碳酸酯封端的水溶性聚合物依次是能与蛋白质或与试剂反应形成活性基团封端的水溶性聚合物的氨基甲酸乙酯-、碳酸酯、或硫代碳酸酯封端的水溶性聚合物。
除非上下文明确另外指出，当术语“约”在数值之前时，数值应当被理解成所描述的数值的±10％。
合成方法的步骤
合成方法包括下列步骤：
(a)混合含有胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，其中所述含有活化碳酸酯试剂的组合物被添加，使得存在相对于胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；和
(b)将含有反应性分子的组合物添加到某组合物，所述组合物含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂，其中，添加所述含有反应性分子的组合物使得基本上所有未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗。
除了其它，该混合步骤导致形成含有活性氨基甲酸乙酯-、碳酸酯或硫羟封端的水溶性聚合物的组合物。当使用含有胺端基水溶性聚合物的组合物时，氨基甲酸乙酯封端的水溶性聚合物得以形成。当使用含有羟端基水溶性聚合物时，碳酸酯封端的水溶性聚合物得以形成。当使用硫羟端基水溶性聚合物的组合物时，硫代碳酸酯封端的水溶性聚合物得以形成。这些如本文提供的方法的一部分制备而成的水溶性聚合物(即，氨基甲酸乙酯封端的水溶性聚合物、碳酸酯封端的水溶性聚合物和硫代碳酸酯封端的水溶性聚合物)的每一种将被称为水溶性聚合物的活性碳酸酯。
本发明的方法被示意性提供如下，其中含有羟端基水溶性聚合物mPEG-OH的组合物被使用，活化碳酸酯试剂是二(1-苯并三唑)碳酸酯，所得到的活性碳酸酯是mPEG-BTC，而反应性分子是水。
Figure S2006800302363D00171
因此，在示例性的方法中，该方法包括：
a)混合含有羟端基水溶性聚合物的组合物和含有二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下列结构：POLY-(X)a-OH，其中POLY是水溶性聚合物，X(当存在时)是任选的间隔部分，(a)是零或一[优选地，POLY-(X)a-OH是CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH]，其中所述含有二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物被添加，使得存在相对于羟端基水溶性聚合物过量的二(1-苯并三唑)碳酸酯，从而得到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯(和释放的羟基苯并三唑)的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下列结构：
Figure S2006800302363D00172
其中POLY、X和(a)如上所定义，优选
Figure S2006800302363D00173
其中(n)是2至约4000的整数；
b)将水添加到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，其中所述添加水，使得基本上所有未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗。
该方法可有利地以“一锅”法合成进行。此外，该方法不要求如在美国专利6,624,246所要求的沉淀步骤来除去活化碳酸酯试剂。然而，如果该活化碳酸酯试剂是需要的试剂，其可通过沉淀被分离。
任选地，该方法进一步包括使水溶性聚合物的活性碳酸酯(例如mPEG-BTC)在一个或多个反应中进行反应，形成不同的聚合物试剂。在形成聚合物试剂后，可能的是，在偶联条件下使聚合物试剂与活性剂反应，从而得到水溶性聚合物-活性剂偶联物。尽管水溶性聚合物的活性碳酸酯(例如mPEG-BTC)可被用作形成聚合物试剂的中间体，但是使用活性碳酸酯(例如mPEG-BTC)本身作为偶联反应中的聚合物试剂也是可能的。
为了回收水溶性聚合物的活性碳酸酯，通常加入过量的非溶剂。示例性的非溶剂包括异丙醇、乙醚、MTBE、庚烷、THF、己烷和它们的组合。
在本发明的一个或更多个实施方式中，水溶性聚合物的活性碳酸酯将具有下列式子的结构：
POLY-O-(C＝O)-O-R
其中：
POLY是水溶性聚合物；和
R是有机基团，
限制性条件是，当POLY是线性甲基封端聚(乙二醇)时，该线性甲基封端聚乙二醇具有至少103的分子量。
用于该方法的示例性反应性分子包括亲核分子例如水、低碳烷基一元醇(例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等等)、低碳烷基一元胺、和带有结合的反应性羧酸酯、羟基、硫羟基或胺基的树脂(例如，经由胺凝胶，如Duolite A-7胺凝胶)。有利地，这类树脂可形成柱子的一部分，带有非反应的活化碳酸酯试剂的组合物可以经过该柱子，以实现步骤“将含有反应性分子的组合物添加到含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物”。然而，优选的是，所述反应性分子是水。水可以被直接添加。此外，水可通过释放水的部分添加，例如水合盐。
在该方法的一个或更多个实施方式中，形成于未反应的活化碳酸酯上的二氧化碳基本上被消耗。
该混合步骤需要，含有胺端基、羟端基、或硫羟端基水溶性聚合物的组合物。如此处所使用，“胺端基、羟端基、或硫羟端基水溶性聚合物”是带有至少一个胺基(″-NH2″)、或羟基(″-OH″)或硫羟基(″-SH″)的任何水溶性聚合物，无论胺基、羟基或硫羟基是否确实位于该水溶性聚合物的末端。事实上，胺基(-NH2)或羟基(″-OH″)或硫羟基(″-SH″)可以结合于芳香基团。
该混合步骤还需要含有活化碳酸酯试剂的组合物。用在本方法中的活化碳酸酯试剂通常——尽管并不必须——选自二(1-苯并三唑)碳酸酯(BTC)、二琥珀酰亚胺碳酸酯(″DSC″)、对硝基苯基氯甲酸酯、三氯苯基氯甲酸酯、对硝基苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基1-苯并三唑碳酸酯、五氟苯基氯甲酸酯、1，1′-羰基二咪唑、二琥珀酰亚胺草酸酯和三光气。在某些情况下，活化碳酸酯试剂具有下列式子之一的结构：R-O(C＝O)-OR；R-O(C＝O)-OR′；和R-O(C＝O)X，其中R是有机基团，R′是R以外的有机基团，而X是Cl、Br或I。
相对于胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂表示下列情况之一或更多种：过量至少约5mol％，过量至少约50mol％，过量至少约二倍摩尔浓度；过量至少约四倍摩尔浓度；以及过量至少约8倍摩尔浓度。
制备水溶性聚合物的活性碳酸酯的方法具有有用性：除了其它，提供在聚合物试剂形成中有用的中间体，如在例如美国专利6,624,246和5,932,462中所述。
混合步骤通常在基本上非含水的条件下进行。此外，基非质子溶剂的组合物被用于该合成方法。此外，通常在惰性气氛如氩下进行全部合成方法。
该方法的一个或更多个步骤在有机溶剂中进行。尽管任何有机溶剂可被使用且本发明在这点上不受限制，但是示例性的有机溶剂包括选自卤化脂族烃、醇、芳香烃、卤化芳香烃、醚、环醚和它们的组合的那些溶剂。优选的有机溶剂的例子包括选自二氯甲烷(methylene chloride或dichloromethane)、氯仿、辛醇、甲苯、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、乙酸乙酯、碳酸二乙酯、丙酮、乙腈、DMF、DMSO、二甲基乙酰胺、N-环己基吡咯烷酮(N-cyclohexylpyrrolidinone)、环己烷和它们的组合。
含偶联物的组合物的制备方法
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了含偶联物的组合物的制备方法，该方法包括混合活性剂和水溶性聚合物的活性碳酸酯(或使用这类水溶性聚合物的活性碳酸酯制备的聚合物试剂)，从而得到含偶联物的组合物。因此，制备含偶联物的组合物的方法包括在本发明之内。
含偶联物的组合物
在本发明的一个或更多个实施方式中，提供了含偶联物的组合物，所述组合物产生自本文所提供的方法，该方法包括混合活性剂和水溶性聚合物的活性碳酸酯(或使用这类水溶性聚合物的活性碳酸酯制备的聚合物试剂)。
因此，含偶联物的组合物包括在本发明之内。组合物(偶联物组合物和试剂组合物)被认为比已知方法具有更高的纯度并且还被更有效地制备。
水溶性聚合物(″POLY″)
如本文所使用，术语“水溶性聚合物”包括那些生物相容的且非免疫原性的水溶性聚合物，并且具体排除任何不是生物相容且非免疫原性的水溶性聚合物片断。对于生物相容性，如果与一种物质单独或和另一物质(例如活性剂)一起连同活组织加以使用(例如，施用给患者)有关的有益效应超过任何有害效应，如临床医生如内科医生所评价，则这种物质被认为是生物相容的。对于非免疫原性，如果一种物质的目标体内应用不产生不期望的免疫应答(例如，抗体的形成)，或者产生了这样的免疫应答，其不被认为是临床上显著的或重要的，如临床医生所评价，则这种物质被认为是非免疫原性的。特别优选的是，本文所描述的水溶性聚合物链段以及偶联物是生物相容性的且非免疫原性的。
当提及聚合物，应当理解，聚合物可以是许多水溶性和非肽类聚合物的任何一种，例如本文描述的、适于用于本发明的那些聚合物。优选地，聚(乙二醇)(即，PEG)是所述聚合物。术语PEG包括具有许多几何形状或形式的任何一种的聚(乙二醇)，包括线型、支化或多臂形式(例如，叉化PEG或连接于多元醇核心的PEG)、侧链PEG、或其中具有可降解键的PEG，其将在下面更充分描述。
聚合物所携带的官能团的数目和官能团的位置可以变化。通常，聚合物将包括1至约25个官能团，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。线型聚合物，例如PEG聚合物，将通常包括位于聚合物链末端的一个或两个官能团。如果PEG聚合物是单官能的(即，mPEG)，则聚合物将包括单个官能团。如果PEG聚合物是双官能的，则聚合物可以含有两个独立选择的官能团，在聚合物链的每一端各有一个。如将被理解，多臂或支化聚合物可包括更大量的官能团。
多臂或支化PEG分子，例如美国专利5,932,462——其通过引用被全部并入于此——中描述的那些，也可被用作PEG聚合物。一般而言，多臂或支化聚合物具有两个或更多个从中心支化点伸出的聚合物“臂”。例如，示例性支化PEG聚合物具有结构：
Figure S2006800302363D00211
其中PEG1和PEG2是具有本文所描述的任何形式或几何形状的PEG聚合物，并且其可以相同或不同，而L′是水解稳定的键。示例性的支化PEG具有结构：
Figure S2006800302363D00212
其中polya和polyb是PEG骨架，例如甲氧基聚(乙二醇)；R″是非反应性部分，例如H、甲基或PEG骨架；以及P和Q是非反应性键。在优选的实施方式中，支化PEG聚合物是甲氧基聚(乙二醇)二取代赖氨酸。为了本文的目的，多臂结构将包括三个或更多个支链，而支化结构将仅包括两个支链。
支化PEG结构可以连接到第三寡聚体或聚合物链上，如下所示：
Figure S2006800302363D00221
其中PEG3是第三PEG寡聚体或聚合物链，其可与PEG1和PEG2不同或相同。
PEG聚合物可选地可包括叉化PEG。一般而言，具有叉化结构的聚合物的特征在于聚合物链通过共价键连接于两个或更多个官能团，该共价键从聚合物中的水解稳定支化点伸出。叉化PEG的例子由PEG-YCHZ2表示，其中Y是连接基团，Z是活化端基，用于共价连接到生物活性剂。Z基团通过具有限定长度的原子链被连接于CH。美国专利6,362,254公开了能够用于本发明的多种叉化PEG结构。将Z官能团(例如，羟基)连接到支化碳原子的原子链用作束缚基团(tetheringgroup)并可包括例如烷基链、醚键、酯键、酰胺键或它们的组合。
PEG聚合物可包括侧链PEG分子，其沿着PEG骨架而不是在PEG链末端共价连接有反应性基团(例如，羟基)。侧链反应性基团可以直接或通过连接部分如亚烷基连接到PEG骨架。
除了上述形式的PEG，聚合物还可以用聚合物骨架中的一个或更多个水解稳定或可降解的键加以制备，包括任一上述聚合物。例如，PEG可以用聚合物骨架中的酯键加以制备，所述酯键经受水解。如下所示，该水解导致聚合物切割成较低分子量的链段：
-PEG-CO2-PEG-+H2O—→-PEG-CO2H+HO-PEG-
其它水解可降解的键——可用作聚合物骨架中的可降解的键，包括碳酸酯键；亚胺键，其例如由胺和醛反应得到(见，例如Ouchi等，Polymer Preprints，38(1)：582-3(1997))；磷酸酯键，其例如由醇与磷酸基团反应得到；腙键，其通常由肼和醛的反应形成；乙缩醛键，其通常由醛和醇之间的反应形成；原酸酯键，其例如通过酸衍生物和醇之间的反应形成；以及寡核苷酸键，其例如由如在聚合物末端的氨基磷酸和寡核苷酸的5′羟基形成。许多上述可降解的键的使用是较不优选的，原因在于许多具有胺基团的不稳定键的亲核反应性。
本领域普通技术人员应当理解，术语聚(乙二醇)或PEG代表或包括所有上述形式的PEG。
各种含有其它非肽类和水溶性聚合物链的其它聚合物的任何一种也可用于本发明。聚合物可以是线型的，或可以是前述形式的任何一种(例如，支化、叉化等等)。合适聚合物的例子包括但不限于其它聚烷撑二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟烷基甲基丙烯酰胺、聚羟烷基甲基丙烯酸酯、多糖、聚(α-羟基乙酸)、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚
Figure 2006800302363_3
唑啉(polyoxazolines)、聚(N-丙烯酰吗啉)，例如描述于美国专利5,629,384，以及它们的共聚物、三元共聚物和混合物。
尽管水溶性聚合物的分子量可根据期望应用、聚合物结构的构型、支化程度等而变化，但分子量将满足下列值的一个或更多个：100道尔顿以上；200道尔顿以上；400道尔顿以上；500道尔顿以上；750道尔顿以上；900道尔顿以上；1,000道尔顿以上；1,400道尔顿以上；1,500道尔顿以上；1,900道尔顿以上；2,000道尔顿以上；2,200道尔顿以上；2,500道尔顿以上；3,000道尔顿以上；4,000道尔顿以上；4,900道尔顿以上；5,000道尔顿以上；6,000道尔顿以上；7,000道尔顿以上；7,500道尔顿以上；9,000道尔顿以上；10,000道尔顿以上；11,000道尔顿以上；14,000道尔顿以上；15,000道尔顿以上；16,000道尔顿以上；19,000道尔顿以上；20,000道尔顿以上；21,000道尔顿以上；22,000道尔顿以上；25,000道尔顿以上；和30,000道尔顿以上。应当理解，本文中给定的水溶性聚合物链段的分子量的最高限在约30,000道尔顿以下。
聚合物的分子量将通常落入下列范围的至少一个：从约100道尔顿至约100,000道尔顿；从约200道尔顿至约60,000道尔顿；从约300道尔顿至约40,000道尔顿。
水溶性聚合物链段的示例性分子量包括约100道尔顿、约200道尔顿、约300道尔顿、约350道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿、约550道尔顿、约600道尔顿、约700道尔顿、约750道尔顿、约800道尔顿、约900道尔顿、约1,000道尔顿、约2,000道尔顿、约2,200道尔顿、约2,500道尔顿、约3,000道尔顿、约4,000道尔顿、约4,400道尔顿、约5,000道尔顿、约6,000道尔顿、约7,000道尔顿、约7,500道尔顿、约8,000道尔顿、约9,000道尔顿、约10,000道尔顿、约11,000道尔顿、约12,000道尔顿、约13,000道尔顿、约14,000道尔顿、约15,000道尔顿、约20,000道尔顿、约22,500道尔顿、约25,000道尔顿、约30,000道尔顿、约35,000道尔顿、约40,000道尔顿、约50,000道尔顿、约60,000道尔顿和约75,000道尔顿。
对于支化形式的聚合物，聚合物的总分子量(基本上基于两个水溶性聚合物部分的合量)的合适大小的示例性范围包括下列：从约200道尔顿至约100,000道尔顿；从约1,000道尔顿至约80,000道尔顿；从约2,000道尔顿至约50,000道尔顿；从约4,000道尔顿至约25,000道尔顿；以及从约10,000道尔顿至约40,000道尔顿。更具体而言，本发明聚合物的支化形式的总重均分子量对应于下列之一：400；1,000；1,500；2,000；3000；4,000；10,000；15,000；20,000；30,000；40,000；50,000；60,000；或80,000。
对于PEG——其中含有重复环氧乙烷单体例如″-(CH2CH2O)n-″或″-(OCH2CH2)n″的结构可被提供，优选的(n)值是包括：从约3至约3,000；从约10至约3,000；从约15至约3,000；从约20至约3,000；从约25至约3,000；从约30至约3,000；从约40至约3,000；从约50至约3,000；从约55至约3,000；从约75至约3,000；从约100至约3,000；和从约225至约3,000。
间隔部分(″X″)
任选地，间隔部分存在于水溶性聚合物和本文提供的其它结构中。示例性的间隔部分包括下列：-O-、-S-、-C(O)-、-O-C(O)-、-C(O)-O-、-C(O)-NH-、-NH-C(O)-NH-、-O-C(O)-NH-、-C(S)-、-CH2-、-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-、-O-CH2-、-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-O-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-O-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-O-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-O-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-、-C(O)-O-CH2-、-CH2-C(O)-O-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-O-CH2-、-C(O)-O-CH2-CH2-、-NH-C(O)-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-C(O)-NH-CH2-、-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-CH2-CH2-CH2-、-NH-CH2-、-NH-CH2-CH2-、-CH2-NH-CH2-、-CH2-CH2-NH-CH2-、-C(O)-CH2-、-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-、-CH2-CH2-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-NH-[CH2]0-6-(OCH2CH2)0-2-、-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-NH-C(O)-NH-(CH2)1-6-NH-C(O)-、-O-C(O)-CH2-、-O-C(O)-CH2-CH2-、-O-C(O)-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-、二价环烷基、-CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2-、O-C(O)-NH-[CH2]f-(OCH2CH2)n-、和任何前述的两个或更多的组合，其中(f)是0至6，(n)是0至20(优选0至10，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，更优选4)。此外，前述含碳间隔部分的每一个可以具有连接于其上得支化烷基。二价环烷基(例如，亚环烷基)基团的非限制性例子包括C3-8环烷基，例如环丙二基(cyclopropadiyl)的各种异构体(例如，1，1-、顺式-11，2-或反式-1，2-环丙烯)、环丁二基、环戊二基、环己二基和环庚二基。亚环烷基可用一个或更多个烷基基团取代，优选C1-C6烷基基团。
水溶性聚合物的活性碳酸酯形成后，水溶性聚合物的活性碳酸酯可不加改变就用作聚合物试剂——其可用于与活性剂进行偶联反应，或者可任选地被进一步衍生化，形成带有不同反应基的不同聚合物试剂。优选的反应基选自亲电体或亲核体。示例性的反应基包括羟基(-OH)、酯、原酸酯、碳酸酯、乙缩醛、醛、醛水合物、酮、乙烯酮(vinyl ketone)、酮水合物、硫酮、硫酮水合物、半酮缩醇、硫取代半酮缩醇、酮缩醇、链烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、砜、胺、酰肼、硫醇、二硫化物、硫醇水合物(thiol hydrate)、羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺
Figure S2006800302363D00261
琥珀酰亚胺
Figure S2006800302363D00262
苯丙三唑
Figure S2006800302363D00263
乙烯砜、氯乙基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮类(diones)、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、硫代磺酸酯、三氟乙基磺酸酯(tresylate)和硅烷。优选的反应基的具体例子包括胺、羧酸、酯、醛、乙缩醛、琥珀酰亚胺和马来酰亚胺。
间隔部分和反应基组合的例证性例子包括
Figure S2006800302363D00265
和
Figure S2006800302363D00266
其中r是1-5，r′是0-5，以及R7是芳基或烷基。
例如，水溶性聚合物的活性碳酸酯可以与氨基酸反应，形成氨基酸衍生物。因此，例如，mPEG-BTC酯可与赖氨酸反应，形成聚合赖氨酸衍生物。例如，一种这类赖氨酸[即，H2N(CH2)4CH(NH2)CO2H·HCl]衍生物是双重PEG化的赖氨酸，其中两个PEG通过氨基甲酸酯键被连接到赖氨酸的胺上，如下所示(其中n是2至约4000)。
Figure S2006800302363D00271
这类赖氨酸PEG衍生物可用作用于制备蛋白质PEG衍生物的试剂。这些蛋白质PEG衍生物相对于非PEG化的蛋白质通常提供优势，例如，较长的体内循环寿命、降低的蛋白水解速率以及降低的免疫原性。在另一方面，PEG BTC衍生物可直接用于将PEG通过氨基甲酸酯键连接到蛋白质上，并提供与对于赖氨酸PEG衍生物所描述的那些类似的优势。
因此，例如，上面的“(PEG2 Acid)可与二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺反应，形成PEG2酸的PEG2活性酯(N-羟基琥珀酰亚胺)。然后，在随后的反应中，PEG2活性酯可在叔胺碱的存在下与3-N-马来酰亚胺丙酸的乙二胺单酰胺的三氟乙酸盐反应，形成带有马来酰亚胺基团的聚合物试剂，其能与蛋白质、生物工程所得的生物分子和其它目标治疗性分子上的硫羟基反应。
带有马来酰亚胺基团的聚合物试剂(其中n是2至4000的整数)
通过使上述带有马来酰亚胺基团的聚合物试剂与含硫羟基的活性剂[“(活性剂)-HS”，例如含半胱氨酸的多肽、蛋白质或其它含硫羟基的生物分子]在偶联反应条件下反应，具有下列结构的偶联物得以形成。
Figure S2006800302363D00281
偶联物[其中n是2至4000的整数，“S-(活性剂)”是含硫羟基活性剂的残基]
生物活性偶联物
对于任何给定的聚合物，上面描述的方法有利地提供了进一步转化聚合物(在任何去保护步骤之前或之后)的能力，以便携带具体的反应基。因此，使用本领域中熟知的技术，聚合物可被官能化，以包括反应基(例如，活性酯、硫醇、马来酰亚胺、醛、酮等)。
例如，当聚合物带有作为反应基的羧酸时，使用常规技术可形成相应的酯。例如，羧酸可经历与醇的酸催化缩合，从而提供相应的酯。进行这个过程的方法将采用通常称为Fischer(费歇尔)酯化反应的方法。形成期望的酯的其它技术是本领域普通技术人员已知的。
例如，当聚合物带有作为反应基的羧酸时，使用常规技术可形成相应的酯。例如，羧酸可经历与醇的酸催化缩合，从而提供相应的酯。进行这个过程的方法将采用通常称为Fischer(费歇尔)酯化反应的方法。形成期望的酯的其它技术是本领域普通技术人员已知的。
此外，带有羧酸的聚合物可被修饰，以形成酯以外的有用反应基。例如，羧酸可被进一步延伸化，以形成酰卤，酰类卤(acylpseudohalides)，例如酰腈、酰异氰酸酯和酰叠氮，中性盐，例如碱金属盐或碱土金属盐(例如，钙盐、钠盐和钡盐)，酯，酸酐，胺，亚胺，酰肼等。在优选的实施方式中，羧酸被酯化，形成N-琥珀酰亚胺酯、临-、间-或对硝基苯酯、1-苯并三唑酯、咪唑酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯。例如，通过使羧酸与二环己基碳二亚胺(DCC)或二异丙基碳二亚胺(DIC)在N-羟基琥珀酰亚胺的存在下反应，羧酸可被转化成相应的N-琥珀酰亚胺酯。
上述合成方法的步骤在合适的溶剂中进行。本领域普通技术人员可确定任何适宜溶剂是否适于任何给定反应。然而，通常溶剂是非极性溶剂或极性非质子溶剂。非极性溶剂的非限制性例子包括苯、二甲苯、二
Figure 2006800302363_4
烷、四氢呋喃(THF)和甲苯。示例性的极性非质子溶剂包括但不限于乙腈、DMSO(二甲基亚砜)、HMPA(六甲基磷酰胺)、DMF(二甲基甲酰胺)、DMA(二甲基乙酰胺)和NMP(N-甲基吡咯烷酮)。
制备聚合物的方法任选地包括在聚合物形成后将其分离和回收的额外步骤。已知的方法可用于分离聚合物，但特别优选采用色谱法，例如，尺寸排阻色谱法。可选地或者另外，该方法包括在聚合物形成后将其纯化的步骤。此外，本领域已知的标准纯化方法可用于纯化聚合物。通过采用本领域已知的方法蒸馏出溶剂，也可进行水溶性聚合物的活性碳酸酯的分离。
本领域的聚合物可在惰性气氛下储存，例如在氩下或在氮下。以这种方式，与例如大气氧有关的潜在降解过程被减少或完全避免。在一些情况下，为避免氧化降解，抗氧化剂，例如丁化羟基甲苯(BHT)，可在储存前被添加到最终产物中。此外，优选使与储存条件有关的湿气量最小化，以减少与水有关的潜在破坏性反应。而且，优选使储存条件保持黑暗，以防止某些涉及光的降解过程。因此，优选的储存条件包括下列的一个或多个：在氩或另一种干惰性气体下储存；在约-15℃的温度下储存；在无光下储存；以及与合适量(例如，约50至约500份/百万份)的抗氧化剂例如BHT一起储存。
上述的聚合物可用于偶联到含有至少一种适于与聚合物上的反应基反应的基团的生物活性剂或表面上。例如，活性剂或表面上的氨基基团(例如伯胺)、肼、酰肼和醇将与聚合物上的羧基基团反应。此外，聚合物的更“活化”形式的羧酸可被制备，以增强与生物活性剂或表面的反应性。活化羧酸的方法在本领域中是已知的，并包括例如形成上述活性酯的方法。活化羧酸的其它形式是本领域普通技术人员已知的。
通常，聚合物以克分子数相等量(关于适合于与反应基反应的基团的期望数量)或过量克分子数被添加到活性剂或表面。例如，聚合物可以大约1∶1(聚合物∶活性剂)、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1或10∶1的摩尔比被添加到靶活性剂。偶联反应被允许继续进行，直到基本上无进一步的偶联发生，这通常可通过监测反应随时间的进程而加以确定。反应进程可通过在不同时间点从反应混合物取出试样量并利用SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱或任何其它合适的分析方法分析该混合物来加以监测。一旦与所形成的偶联物的量或所剩余的未偶联聚合物的量有关的平台达到，反应被认为已完成。通常，偶联反应进行数分钟到数小时(例如，从5分钟到24小时或更长)不等。所得到的产物混合物优选但不必须被纯化，以分离出过量的试剂、未偶联试剂(例如活性剂)、不期望的多偶联物质和游离或未反应聚合物。然后，所得到的偶联物可采用分析方法例如MALDI、毛细管电泳、凝胶电泳和/或色谱法进一步表征。
对于聚合物-活性剂偶联物，偶联物可被纯化，以获得/分离不同的偶联物质。可选地，并且对于较低分子量(例如，在约20千道尔顿以下，更优选在约10千道尔顿以下)聚合物更优选的，产物混合物可被纯化，以获得每活性剂的水溶性聚合物链段分布。例如，产物混合物可被纯化，获得每活性剂(例如蛋白质)一至五个PEG不等的均值，通常为每活性剂(例如蛋白质)3个PEG的均值。最终反应偶联物的纯化策略将取决于许多因素，包括例如所使用的聚合物的分子量、具体的活性剂、期望的给药方案以及各个偶联物的残留活性和体内性质。
如果期望，具有不同分子量的偶联物可使用凝胶过滤色谱法加以分离。也就是说，凝胶过滤色谱法被用于对差异编号的聚合物-活性剂比(例如，1-mer、2-mer、3-mer等等，其中“1-mer”表示1聚合物比活性剂，“2-mer”表示2聚合物比活性剂)基于它们不同的分子量(其中该差异基本上对应于水溶性聚合物链段的平均分子量)加以分级。例如，在其中100kD蛋白质被随机偶联到分子量约20kD的PEG链烷酸的示例性反应中，所得到的反应混合物将可能含有未修饰的蛋白质(MW 100kD)、单PEG化的蛋白质(MW 120kD)、二PEG化的蛋白质(MW 140kD)等等。尽管该方法可被用于分离PEG和其它具有不同分子量的聚合物偶联物，但是该方法对于分离在蛋白质中具有不同聚合物连接位点的位置异构体通常是无效的。例如，凝胶过滤色谱可用于分离PEG 1-mers、2-mers、3-mers等的混合物，尽管每一回收的PEG-mer组合物可含有连接到活性剂内的不同的反应性氨基基团(例如，赖氨酸残基)。
适于进行这类分离的凝胶过滤柱包括可从AmershamBiosciences(Piscataway，NJ)得到的SuperdexTM和SephadexTM柱。特定柱的选择将取决于需要的分级范围。洗脱通常使用合适的缓冲液进行，例如，磷酸盐、乙酸盐等等。收集的级分可通过许多不同的方法加以分析，例如(i)对于蛋白质含量，在280nm处的光密度(OD)，(ii)牛血清白蛋白(BSA)蛋白质分析，(iii)碘测试PEG含量[Sims etal.(1980)Anal.Biochem，107：60-63]，和(iv)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)，随后用碘化钡染色。
通过使用反相高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱的反相色谱或通过使用离子交换柱例如可得自Amersham Biosciences的SepharoseTM离子交换柱的离子交换色谱，进行位置异构体的分离。每一方法都可用于分离具有相同分子量的聚合物-活性剂异构体(位置异构体)。
在偶联之后，以及任选地在额外的分离步骤之后，偶联物混合物可被浓缩、无菌过滤并在低温储存，通常在约-20℃到约-80℃下。可选地，偶联物可在含有或不合有残留缓冲液的情况下被冻干，并以冻干粉末储存。在一些情况下，优选的是，用挥发性缓冲液如碳酸铵或乙酸铵替换用于偶联的缓冲液，所述挥发性缓冲液可在冻干期间容易除去，以便冻干粉末不存在残留缓冲液。可选地，可采用剂型缓冲液(formulation buffer)进行缓冲液交换步骤，以便冻干的偶联物具有适于重构于制剂缓冲液中并最终施用给哺乳动物的形式。
本发明的聚合物可被共价或非共价连接于许多实体，包括膜、化学分离和纯化表面、固体支持物、金属表面如金、钛、钽、铌、铝、钢、和它们的氧化物、氧化硅、大分子(例如蛋白质、多肽等等)、以及小分子。另外，所述聚合物还可用于生物化学传感器、生物电子开关、和门控。所述聚合物还可用作肽合成的载体、用于制备聚合物涂布表面和接枝聚合物、用于制备用于亲和分配的聚合物-配体偶联物、用于制备交联或非交联的水凝胶、以及用于制备用于生物反应器的聚合物-辅因子加合物。
用于偶联到本文所描述的聚合物的生物活性剂可以是下列的一种或多种：安眠药和镇静剂、精神兴奋剂、安定剂、呼吸系统药物(respiratory drugs)、镇痉剂、肌肉松弛药、抗帕金森症药剂(多巴胺拮抗剂)、麻醉剂、消炎剂、抗焦虑药(anxiolytics)、食欲抑制剂、抗偏头痛剂、肌收缩剂、抗感染剂(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、疫苗)抗风湿药、抗疟药、止吐药、anepileptics、支气管扩张药、细胞因子、生长因子、抗癌剂、抗血栓药、抗高血压药、心血管药物、抗心律不齐药、antioxicants、抗哮喘药、激素类药包括避孕药、拟交感神经剂、利尿剂、脂质调节剂(lipid regulating agents)、抗雄激素物质、抗寄生物药、抗凝血剂、肿瘤药(neoplastics)、抗肿瘤药、降血糖药、营养剂和添加剂(nutritional agents andsupplements)、生长添加剂、抗肠炎药、疫苗、抗体、诊断剂和造影剂。
适合用于共价连接到本发明的反应性聚合物的活性剂的例子包括但不限于：降钙素、促红细胞生成素(EPO)、因子VIII、因子IX、ceredase、cerezyme、环孢素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素(elcatonin)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、生长激素、人生长激素(HGH)、生长激素释放激素(GHRH)、肝素、低分子量肝素(LMWH)、α干扰素、β干扰素、γ干扰素、白介素-1受体、白介素-2、白介素-1受体拮抗剂、白介素-3、白介素-4、白介素-6、黄体生成素释放激素(LHRH)、因子IX、胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(例如，美国专利5,922,675中描述的单乙酰化胰岛素)、支链淀粉、C-肽、促生长素抑制剂、促生长素抑制剂类似物包括抑生长肽、血管升压素、促卵泡激素(FSH)、胰岛素样生长因子(IGF)、insulintropin、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、组织生长因子、角质形成细胞生长因子(KGF)、胶质细胞生长因子(GGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、内皮生长因子、甲状旁腺素(PTH)、胰高血糖素样肽胸腺素α1、IIb/IIIa抑制剂、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4抑制剂、双膦酸盐、呼吸道合胞病毒抗体、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因，脱氧核糖核酸酶(Dnase)、杀菌/渗透增强蛋白(BPI)、抗CMV抗体、13-顺式视黄酸、大环内酯类例如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素，罗红霉素、甲红霉素、达发新(davercin)、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、柱晶白霉素、美欧卡霉素、罗吉他霉素、andazithromycin和swinolide A；氟喹诺酮类例如环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲伐沙星、moxifloxicin、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、pefloxacin培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、妥舒沙星、普卢利沙星、伊洛沙星、帕珠沙星、克林沙星、和西他沙星；氨基糖苷类例如庆大霉素、奈替米星、草履虫素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、和链霉素、万古霉素、替考拉宁、雷莫拉宁(rampolanin)、麦地拉宁、多粘菌素E、达普托霉素、短杆菌肽、甲磺酸粘菌素；多粘菌素类例如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯类(penems)；青霉素类，包括青霉素酶敏感剂，如青霉素G、青霉素V，青霉素酶抗性剂，如甲氧西林(methicillin)、苯唑青霉素、氯洒西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林；革兰氏阴性微生物活性剂(gram negative microorganism active agents)，如氨苄西林、阿莫西林和海他西林、cillin、和galampicillin；抗单假孢菌青霉素，如羧苄青霉素、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林；头孢菌素类，如头孢泊肟、头孢丙烯、ceftbuten、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢力新、头孢拉定(cephradrine)、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氧、头孢甘氨酸、头孢呋辛、头孢雷特、头孢噻肟、头孢曲秦、头孢乙氰、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢、和拉氧头孢；单酰胺环类，如噻肟单酰胺菌素；以及碳杂青霉烯例如亚胺培南、美罗培南(meropenem)、羟乙磺酸戊双脒、硫酸舒喘灵、利多卡因、硫酸异丙喘宁、倍氯米松双丙酸酯、乙酰胺去炎松(triamcinolone acetamide)、布地耐德缩酮(budesonideacetonide)、氟替卡松(fluticasone)、异丙托溴铵、氟尼缩松、色甘酸钠、酒石酸麦角胺以及如果可适用，上述的类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂、和药物可接受盐形式。对于肽和蛋白质，本发明意图包括合成的、天然的、糖基化的、未糖基化的、聚乙二醇化的形式其生物活性片段和类似物。
本发明还包括含有本文所提供的偶联物以及药物赋形剂的药物制剂。通常，偶联物本身将是固体形式(例如，沉淀)，其可与可以是固体形式或液体形式的药物赋形剂联合。
示例性的赋形剂非限制性地包括选自碳水化合物、无机盐、杀真菌剂、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂、酸、碱及其组合的那些赋形剂。
碳水化合物例如糖、衍生糖如糖醇、糖酸、酯化糖、和/或糖聚合物可以作为赋形剂存在。具体的碳水化合物赋形剂包括例如单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等等；多糖，例如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡萄糖醇)、吡喃型山梨糖醇、肌醇等等。
赋形剂还可包括无机盐或缓冲剂例如柠檬酸、氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、磷酸氢钠及其组合。
所述制剂还可包括抗微生物剂，用于预防或阻止微生物生长。适于本发明的抗微生物剂的非限制性例子包括苯扎氯铵、苯索氯铵、苯甲醇、十六烷基氯化吡啶
Figure 2006800302363_5
、氯丁醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞、thimersol和它们的组合。
抗氧化剂同样可存在于制剂中。抗氧化剂被用于防止氧化，从而防止偶联物或制剂的其它成分的老化。可用于本发明的合适的抗氧化剂包括例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚、丁化羟基甲苯、次磷酸、硫代甘油单酯、棓酸丙酯、亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、焦亚硫酸钠和其组合。
表面活性剂可作为赋形剂存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯，例如″Tween 20″和″Tween 80″，以及普朗尼克类(pluronics)例如F68和F88(两种都可从BASF，Mount Olive，NewJersey获得)；脱水山梨糖醇酯；脂类，例如磷脂如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺(尽管优选非脂质体形式)、脂肪酸和脂肪酸酯；类固醇，例如胆固醇；以及螯合剂，例如EDTA、锌和其它这类合适的阳离子。
酸或碱在制剂中可作为赋形剂存在。可使用的酸的非限制性例子包括选自盐酸、乙酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、蚁酸、三氯乙酸、硝酸、高氯酸、磷酸、硫酸、富马酸和它们的组合。合适的碱的例子非限制性地包括选自下列的碱：氢氧化钠、乙酸钠、氢氧化铵、乙酸钾、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠、甲酸钠、硫酸钠、硫酸钾、丁烯二酸钾及其组合。
所述药物制剂包括各种类型的剂型，特别是那些适于注射的剂型，例如可重构的粉末以及悬浮液和溶液。当组合物储存于单位剂量容器(例如，小瓶)中时，组合物中偶联物(即，活性剂和本文所描述的聚合物之间形成的偶联物)的量将根据许多因素而变化，但最佳是治疗有效剂量。此外，药物制剂可装入注射器中。治疗有效剂量可通过反复施用增加量的偶联物以确定哪个量产生临床期望终点而加以试验确定。
组合物中任何单个赋形剂的量将根据赋形剂的活性和该组合物的具体需要而变化。通常，任何单个赋形剂的最适量通过常规试验加以确定，即通过制备含有变化量的赋形剂(从低到高的范围)的组合物，检验组合物的稳定性和其它参数，然后确定获得最优性能且无明显副作用的范围。
然而，一般而言，赋形剂在组合物中将以按重量计约1％至约99％的量存在，优选按重量计约5％-98％，更优选按重量计约15％-95％，其中浓度在按重量计30％以下是最优选的。
这些前述的药物赋形剂连同其它赋形剂被描述于″Remington：The Science & Practice of Pharmacy″，19th ed.，Williams & Williams，(1995)，the″Physician′s Desk Reference″，52nd ed.，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)以及Kibbe，A.H.，Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd Edition，AmericanPharmaceutical Association，Washington，D.C.，2000中。
本发明的药物制剂通常——尽管非必须——通过注射被施用，从而在施用前通常是液体溶液或悬浮液。该药物制剂也可以采取其它形式，例如糖浆、乳油、软膏、片剂、粉末等等。其它给药模式也被包括在内，例如肺部、直肠、经皮、经粘膜、经口、鞘内、皮下、动脉内等等。
如前所述，偶联物可通过静脉注射进行肠胃外施用，或较不优选地，通过肌肉注射或通过皮下注射进行肠胃外施用。肠胃外施用的合适剂型包括随时可注射的溶液、使用前与溶剂混合的干燥粉末、随时可注射的悬浮液、使用前与载体联合的干燥不可溶组合物、以及施用前用于稀释的乳液和液体浓缩物，等等。
本发明还提供了向患有应答于偶联物治疗的疾病的患者施用本文所提供的偶联物的方法。所述方法包括施用——一般通过注射——治疗有效量的偶联物(优选以药物制剂的一部分加以提供)。该施用方法可用于治疗通过施用具体偶联物可治疗或预防的任何疾病。本领域普通技术人员理解具体偶联物可有效治疗哪种疾病。被施用的确切剂量将根据患者的年龄、体重和总体状况以及待治疗疾病的严重程度、卫生保健专业人员的判断和待施用的偶联物而变化。治疗有效量是本领域普通技术人员已知的和/或描述于相关参考教材和文献中。一般而言，治疗有效量的范围为约0.001mg至100mg，优选从0.01mg/日至75mg/日的剂量，更优选0.10mg/日至50mg/日的剂量。
根据临床医生的判断、患者的需要等等，任何给定的偶联物(同样，优选以药物制剂的一部分加以提供)的单位剂量可以以各种不同给药方案进行施用。具体的给药方案是本领域普通技术人员已知的并且可以利用常规方法加以试验确定。示例性的给药方案非限制性地包括一日施用五次、一日四次、一日三次、每日两次、每日一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月两次、每月一次、以及它们的组合。一旦临床终点达到后，组合物的给药被终止。
应当理解，尽管本发明已经结合其优选的具体实施方式进行了描述，但前述描述以及下面的实施例意图阐述本发明的范围且不意图限制本发明的范围。本发明范围内的其它方面、优势和改变对于本发明所属的领域内的普通技术人员是明显的。尽管具体的术语(或下位概念)在本文中被使用，但是它们仅以一般性和描述性的含义被使用，且不用于限制目的。
                      试验
除非另外说明，本发明的实践将利用有机合成、生物化物、蛋白质纯化等等的常规技术，其在本领域技术人员的范围之内。这类技术在文献中被充分解释。例如，参见，J.March，Advanced OrganicChemistry：Reactions Mechanisms and Structure，4th Ed.(NewYork：Wiley-Interscience，1992)，同上。
在下列的实施方式中，已经尽力确保所使用数字(例如，量、温度等)的准确性，但一些试验误差和偏差应当被考虑。除非另外说明，温度以℃计，压力为海平面处的气压或在其附近。下列实施例的每一个被认为有益于本领域普通技术人员实施本文所描述的一个或多个实施方式。
                     实施例1
             mPEG(5,000Da)-BTC的制备
mPEG(5,000Da)-OH(MW 5,000，15g，0.003摩尔)、二(1-苯并三唑)碳酸酯(4.0g的70％混合物，0.000945摩尔)和吡啶(2.2ml)的乙腈溶液(30ml)在氮气下于室温搅拌过夜。NMR分析表明，所得到的mPEG(5,000Da)-BTC被100％取代并且反应混合物含有0.0012摩尔的残留二(1-苯并三唑)碳酸酯。计算量的蒸馏水(0.025g，计算以提供相对于diBTC过量的量)被加入，混合物被搅拌三小时。连续NMR分析表明，mPEG(5,000Da)-BTC仍被100％取代，但残留的二(1-苯并三唑)碳酸酯被完全水解。通过蒸馏除去溶剂；在室温下真空干燥残留物，得到14.8g产物，1H NMR分析显示其被100％取代。期望1H NMR(d6-DMSO)：3.23ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.62ppm(m，mPEG-O-CH2-OCO2-，2H)，7.41-8.21ppm(complex mult，苯并三唑质子，4H)。
                     实施例2
            mPEG(20,000Da)-BTC的制备
mPEG(20,000Da)-OH(MW 20,000，20g，0.001摩尔)、二(1-苯并三唑)碳酸酯(3.4g的70％混合物，0.00803摩尔)和吡啶(3.0ml)的乙腈溶液(40ml)在氮气下于室温搅拌过夜。NMR分析表明，所得到的mPEG(20,000Da)-BTC被100％取代并且反应混合物含有0.0027摩尔的残留二(1-苯并三唑)碳酸酯。计算量的蒸馏水(0.050g，计算以提供相对于diBTC过量的量)被加入，混合物被搅拌三小时。连续NMR分析表明，mPEG(20,000Da)-BTC仍被100％取代，但残留的二(1-苯并三唑)碳酸酯被完全水解。所得到的混合物被直接用于制备mPEG(20,000Da)-胺。1H NMR(d6-DMSO)：3.23ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.62ppm(m，mPEG-O-CH2-OCO2-，2H)，7.41-8.21ppm(complex mult，苯并三唑质子，4H)。
                     实施例3
     由mPEG(20,000Da)-BTC制备mPEG(20,000Da)-胺
实施例2中制备的mPEG(20,000Da)-苯并三唑碳酸酯(20.0g，0.001摩尔)的乙腈溶液(40ml)被逐滴加入2，2’-(乙二氧撑)双(乙胺)(Sigma-Aldrich；FW＝148.21，3g，0.020摩尔)的乙腈溶液(40ml)中，反应混合物在室温下于氩气氛下搅拌两小时。接着，溶剂被蒸发至干燥。粗产物被溶解在二氯甲烷中并用异丙醇沉淀。湿产物在减压下干燥。产量18.2g。期望1H NMR(d6-DMSO)：2.64ppm(t，-CH2-胺-，2H)，3.11ppm(q，-CH2-NH-，)，3.23ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.04ppm(m，-CH2-O(C＝O)-，2H)，7.11ppm(t，-(C＝O)-NH-，1H)。阳离子交换色谱：mPEG(20,000Da)-胺97.7％。
                     实施例4
      mPEG(20,000Da)-琥珀酰亚胺碳酸酯的制备
mPEG(20,000Da)-OH(MW 20,000，60g，0.003摩尔)、N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯(2.4g，0.00937摩尔)和吡啶(6.5ml)的乙腈溶液(300ml)在氮气下于室温搅拌过夜。NMR分析表明，所得到的mPEG(20,000Da)-琥珀酰亚胺碳酸酯被100％取代并且反应混合物含有0.0034摩尔的残留N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯。计算量的蒸馏水(0.097g，计算以提供相对于diBTC过量的量)被加入，混合物被搅拌四小时。连续NMR分析表明，mPEG(20,000Da)-琥珀酰亚胺碳酸酯仍被100％取代，但残留的N，N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯被完全水解。通过蒸馏除去溶剂；在室温下真空干燥残留物，得到56.8g产物，1H NMR分析显示其被100％取代。1H NMR(d6-DMSO)：2.80ppm(s，二琥珀酰亚胺，4H)，3.23ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.62ppm(m，mPEG-O-CH2-OCO2-，2H)。
                     实施例5
            mPEG(20,000Da)-NPC的制备
mPEG(20,000Da)-OH(MW 20,000，60g，0.003摩尔)、对硝基苯基氯甲酸酯(NPC)(1.9g，0.00943摩尔)和吡啶(6.5ml)的乙腈溶液(300ml)在氮气下于室温搅拌过夜。NMR分析表明，所得到的mPEG(20,000Da)-NPC被100％取代并且反应混合物含有0.0034摩尔的残留对硝基苯基氯甲酸酯。反应混合物通过凝胶柱(Duolite A-7胺凝胶)，该凝胶柱允许小分子流通但很大程度上将高分子物质排除在外。连续NMR分析表明，mPEG(20,000Da)-NPG仍被100％取代，但无残留的对硝基苯基氯甲酸酯。1H NMR(CDCl3)：3.39ppm(s，-OCH3，3H)，3.58ppm(s，聚合物骨架)，4.37ppm(m，mPEG-O-CH2-OCO2-，2H)，7.44ppm(m，芳族质子，2H)，8.27ppm(m，芳族质子，2H)。
                     实施例6
      由mPEG(20,000Da)-NPC制备mPEG(22,000Da)-丙酸
向mPEG(20,000Da)-NPC(60.0g，0.0030摩尔，来自实施例5)的乙腈溶液加入PEG(2,000Da)-a-氨基-w-丙酸(6.6g，0.0033摩尔)和三乙胺(1.8ml)，反应混合物在室温下于氩气氛下搅拌六小时。接着，混合物被过滤，溶剂被蒸发至干燥。粗产物被溶解在二氯甲烷中并用异丙醇沉淀。湿产物在减压下干燥。产量54.3g。1H NMR(d6-DMSO)：2.44ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.11ppm(q，-CH2-NH-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.04ppm(m，-CH2-O(C＝O)-，2H)，7.11ppm(t，-(C＝O)-NH-，1H)。阴离子交换色谱：M-PEG(20,000Da)-丙酸96.5％。
                     实施例7
            mPEG(20,000Da)-BTC的制备
                   大规模合成
mPEG(20,000Da)-OH(28kg)在氩气氛下被溶解于无水乙腈(93kg)。混合物通过如下干燥：通过分子筛筒，然后该筒用50L乙腈洗涤。重复干燥过程，直到水含量在100ppm以下。然后，二(1-苯并三唑)碳酸酯(1285g的42％混合物)与大约2000mL的乙腈在单独的容器中混合，形成浆液，其在氩下被添加到先前制备的混合物。该单独容器用乙腈(用200mL)冲洗两次，增强定量转移。然后，吡啶(200mL)在氩下被添加，随后在31℃±3℃下混合12小时。水(大约20mL)，其用乙腈(1L)稀释，被添加，整个反应混合物在31℃±3℃下混合60分钟。之后，反应混合物在减压下被蒸馏，收集产物并使之冷却。然后，具有低水含量的异丙醇(551kg)被添加。在异丙醇的添加结束后，所得到的沉淀混合最少三十分钟。之后，分离沉淀物，并用异丙醇(约90kg)在氩下洗涤。最后，沉淀物在真空下干燥。产物的收率百分比和总量为22kg(79％收率)。NMR分析表明，产物含有98.6％的期望mPEG(20,000Da)-BTC和1.4％的起始mPEG(20,000Da)-OH。无异丙基苯并三唑碳酸酯被检测到。
                    比较实施例8
             mPEG(20,000Da)-BTC的制备
              大规模合成，无水处理
重复实施例7中所描述的mPEG(20,000Da)-BTC的大规模合成，但水未被加入到反应混合物来水解残留的二(1-苯并三唑)碳酸酯。NMR分析表明，最终产物含有44mol％的异丙基苯并三唑碳酸酯。因此，本试验表明，需要分离和除去活化碳酸酯的大规模生产是可能的。然而，基于比较试验，沉淀损失被预测为10-20％。

Claims (30)

1.合成方法，包括：
(a)混合含有非质子溶剂和胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选地在催化剂或中和酸的碱的存在下，所述活化碳酸酯试剂选自二(1-苯并三唑)碳酸酯、二琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基氯甲酸酯、三氯苯基氯甲酸酯、对硝基苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基1-苯并三唑碳酸酯、五氟苯基氯甲酸酯和1，1′-羰基二咪唑，其中，添加所述含有活化碳酸酯试剂的组合物使得存在相对于所述胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的所述活化碳酸酯试剂，从而得到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；和
(b)将含有反应性分子的组合物添加到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中，添加所述含有反应性分子的组合物，使得基本上所有所述未反应的活化碳酸酯试剂基本上被消耗。
2.权利要求1所述的方法，其中所述水溶性聚合物的所述活性碳酸酯具有下列化学式：
POLY-O-(C＝O)-O-R
其中：
POLY是水溶性聚合物；和
R是有机基团，
限制性条件是，当POLY是线性甲基封端聚(乙二醇)时，所述线性甲基封端聚乙二醇具有至少103的分子量。
3.权利要求1和2中任一项所述的方法，其中所述活性碳酸酯试剂具有下列分子式之一的结构：R-O(C＝O)-OR；R-O(C＝O)-OR′；和R-O(C＝O)X，其中R是有机基团，R′是R以外的有机基团，而X是Cl、Br或I。
4.权利要求1所述的方法，其中所述非质子溶剂选自乙腈、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷和它们的组合。
5.权利要求1所述的方法，进一步包括使所述水溶性聚合物的所述活性碳酸酯在一个或更多个反应中反应，以形成聚合物试剂。
6.权利要求1所述的方法，其中所述水溶性聚合物的所述活性碳酸酯通过蒸馏出所述溶剂加以分离。
7.权利要求1所述的方法，其中所述水溶性聚合物的所述活性碳酸酯通过添加非溶剂而沉淀加以分离。
8.权利要求7所述的方法，其中所述非溶剂选自异丙醇、己烷、乙醚、和它们的组合。
9.权利要求1所述的方法，其中所述胺端基或羟端基水溶性聚合物是带有末端胺基或羟基的水溶性聚合物，其中所述水溶性聚合物选自聚(烷撑二醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)、聚(羟烷基甲基丙烯酸酯)、多糖、聚(α-羟基乙酸)、聚(丙烯酸)、聚磷腈、聚噁唑啉和聚(N-丙烯酰吗啉)。
10.权利要求6所述的方法，其中所述水溶性聚合物是聚(乙二醇)。
11.权利要求10所述的方法，其中所述聚乙二醇是线性聚(乙二醇)。
12.权利要求10所述的方法，其中所述聚乙二醇是支化聚(乙二醇)。
13.权利要求10所述的方法，其中所述聚乙二醇是多臂聚(乙二醇)。
14.权利要求10所述的方法，其中所述聚(乙二醇)具有100至100,000道尔顿的分子量。
15.权利要求1所述的方法，其中所述胺端基或羟端基水溶性聚合物是胺端基水溶性聚合物。
16.权利要求1所述的方法，其中所述胺端基或羟端基水溶性聚合物是羟端基水溶性聚合物。
17.权利要求1所述的方法，其中相对于所述胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的所述活化碳酸酯试剂表示过量至少5mol％。
18.权利要求1所述的方法，其中相对于所述胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的所述活化碳酸酯试剂表示过量至少50mol％。
19.权利要求1所述的方法，其中相对于所述胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的所述活化碳酸酯试剂表示过量至少二倍摩尔浓度。
20.权利要求1所述的方法，其中所述反应性分子选自水、低碳烷基一元醇、硫化氢和低碳烷基一元胺。
21.权利要求20所述的方法，其中所述反应性分子是水。
22.合成方法，包括：
(a)混合含有非质子溶剂和羟端基水溶性聚合物的组合物与含有二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下面的结构：
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)是2至约4000的整数，其中所述含有二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物被添加，使得存在相对于所述羟端基水溶性聚合物过量的所述二(1-苯并三唑)碳酸酯，从而得到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下面的结构：
Figure FSB00000416106300041
其中(n)是2至约4000的整数；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到所述含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯的组合物，其中，添加含有反应性分子的组合物使得基本上所有所述未反应的二(1-苯并三唑)碳酸酯基本上被消耗。
23.权利要求22所述的方法，其中所述反应性分子选自水、低碳烷基一元醇、硫化氢和低碳烷基一元胺。
24.合成方法，包括：
(a)混合含有非质子溶剂和羟端基水溶性聚合物的组合物与含有二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下面的结构：
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)是2至约4000的整数，其中所述含有二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物被添加，使得存在相对于所述羟端基水溶性聚合物过量的二琥珀酰亚胺碳酸酯，从而得到含有所述羟端基水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下面的结构：
Figure FSB00000416106300051
其中(n)是2至约4000的整数；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到所述含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯的组合物，其中添加含有反应性分子的组合物使得基本上所有所述未反应的二琥珀酰亚胺碳酸酯基本上被消耗。
25.权利要求24所述的方法，其中所述反应性分子选自水、低碳烷基一元醇、硫化氢和低碳烷基一元胺。
26.合成方法，包括：
(a)混合含有非质子溶剂和羟端基水溶性聚合物的组合物与含有对硝基苯基氯甲酸酯的组合物，所述羟端基水溶性聚合物具有下面的结构：
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH
其中(n)是2至约4000的整数，其中，添加含有对硝基苯基氯甲酸酯的组合物使得存在相对于所述羟端基水溶性聚合物过量的对硝基苯基氯甲酸酯，从而得到含有所述羟端基水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的对硝基苯基氯甲酸酯的组合物，其中所述水溶性聚合物的活性碳酸酯具有下面的结构：
Figure FSB00000416106300052
其中(n)是2至约4000的整数；
(b)将含有反应性分子的组合物添加到所述含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的对硝基苯基氯甲酸酯的组合物，其中，添加含有反应性分子的组合物使得基本上所有所述未反应的对硝基苯基氯甲酸酯基本上被消耗。
27.权利要求26所述的方法，其中所述反应性分子选自水、低碳烷基一元醇、硫化氢和低碳烷基一元胺。
28.实施权利要求1至27所述方法中任一种方法得到的组合物。
29.合成方法，包括：
使由如下步骤制备的水溶性聚合物的活性碳酸酯与活性剂在偶联条件下反应，从而得到水溶性聚合物-活性剂偶联物：
(i)混合含有非质子溶剂和胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，所述活化碳酸酯试剂选自二(1-苯并三唑)碳酸酯、二琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基氯甲酸酯、三氯苯基氯甲酸酯、对硝基苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基1-苯并三唑碳酸酯、五氟苯基氯甲酸酯和1，1′-羰基二咪唑，其中所述含有活化碳酸酯试剂的组合物被添加，使得存在相对于所述胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；和
(ii)将含有反应性分子的组合物添加到所述含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中，添加含有反应性分子的组合物使得基本上所有所述未反应的活化碳酸酯试剂基本上被消耗。
30.合成方法，包括：
使由如下步骤制备的聚合物试剂与活性剂在偶联条件下反应，从而得到水溶性聚合物-活性剂偶联物：
(i)混合含有非质子溶剂和胺端基或羟端基水溶性聚合物的组合物与含有活化碳酸酯试剂的组合物，任选在催化剂或中和酸的碱的存在下，所述活化碳酸酯试剂选自二(1-苯并三唑)碳酸酯、二琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基氯甲酸酯、三氯苯基氯甲酸酯、对硝基苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、对硝基苯基1-苯并三唑碳酸酯、五氟苯基氯甲酸酯和1，1′-羰基二咪唑，其中，添加含有活化碳酸酯试剂的组合物使得存在相对于所述胺端基或羟端基水溶性聚合物过量的活化碳酸酯试剂，从而得到含有所述水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物；
(ii)将含有反应性分子的组合物添加到所述含有水溶性聚合物的活性碳酸酯和未反应的活化碳酸酯试剂的组合物，其中，添加含有反应性分子的组合物使得基本上所有所述未反应的活化碳酸酯试剂被基本上消耗；和
(c)使所述水溶性聚合物的活性碳酸酯在一个或更多个反应中反应以形成聚合物试剂。
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