CN101242837A

CN101242837A - 用氨基嘧啶激酶调节剂和法尼基转移酶抑制剂协同调节flt3激酶

Info

Publication number: CN101242837A
Application number: CNA2006800293453A
Authority: CN
Inventors: C·A·鲍曼; M·D·高尔
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2006-06-07
Publication date: 2008-08-13
Also published as: AU2006258033A1; EP1901745A2; WO2006135713A2; WO2006135713A3; BRPI0611673A2; US20060281755A1; KR20080038298A; CA2611481A1; JP2008543771A

Abstract

本发明涉及抑制细胞或患者中FLT3酪氨酸激酶活性或表达，或减少FLT3激酶活性或表达的方法，该方法包括给予法尼基转移酶抑制剂和FLT3激酶抑制剂，FLT3激酶抑制剂选自式I′氨基嘧啶化合物；其中R₃、B、Z、r和R₁定义同本文。本发明还包括治疗具有(或易感)细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症发生风险的患者的预防性和治疗性方法。

Description

用氨基嘧啶激酶调节剂和法尼基转移酶抑制剂协同调节FLT3激酶

相关申请交叉参考

本申请要求2005年6月10日提交的美国专利临时申请号60/689,721的优先权，其全部内容通过引用整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及用法尼基转移酶抑制剂与FLT3酪氨酸激酶抑制剂联合治疗细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症。

发明背景

Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)配体(FLT3L)是影响多造血细胞谱系发育的细胞因子中的一种。这些作用通过FLT3L与又称为胎肝激酶-2(flk-2)的FLT3受体和STK-1结合产生，STK-1是在造血干细胞和始祖细胞上表达的受体酪氨酸激酶(RTK)。FLT3基因编码跨膜蛋白组IIIRTK，在正常血细胞生成期间，跨膜蛋白组III RTK在细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用。FLT3基因主要通过早期骨髓和淋巴始祖细胞表达。参见McKenna，Hilary J.等Mice lacking flt3 ligand havedeficient hematopoiesis affcting hematopoietic progenitor cells，dendriticcells，and natural killer cells(缺乏flt3配体的小鼠的造血作用不足，影响造血始祖细胞、树突细胞和天然杀伤细胞).Blood.Jun 2000；95：3489-3497；Drexler，H.G.and H.Quentmeier(2004).″FLT3：receptorand ligand.″(FLT3：受体和配体)Growth Factors 22(2)：71-3。

FLT3的配体由骨髓基质细胞和其它细胞表达，并协同其它生长因子刺激干细胞、始祖细胞、树突细胞和天然杀伤细胞增殖。

造血障碍是这些系统癌变前病症，并包括例如骨髓增生障碍，例如血小板增多、特发性血小板增多(ET)、特发性髓样化生、骨髓纤维变性(MF)、骨髓纤维变性合并髓样化生(MMM)、慢性特发性骨髓纤维变性(IMF)和真性红细胞增多(PV)、细胞减少症和癌变前骨髓增生异常综合征。参见Stirewalt，D.L and J.P.Radich(2003).″The role of FLT3in haematopoietic malignancies.″(FLT3在血癌中的作用)Nat RevCancer 3(9)：650-65；Scheijen，B.and J.D.Griffin(2002).″Tyrosinekinase oncogenes in normal hematopoiesis and hematological disease.″(在正常血细胞生成和血液病中的酪氨酸激酶致癌基因)Oncogene21(21)：3314-33。

血癌是身体血液形成和免疫系统、骨髓和淋巴组织的癌症。然而在正常骨髓中，FLT3表达限于早期始祖细胞；在血癌中，FLT3的表达水平高，或FLT3突变造成FLT3受体和下游分子途径诱发失控，可能激活Ras。血癌包括白血病、淋巴瘤(非霍奇金氏淋巴癌)、霍奇金病(又称为霍奇金淋巴癌)和骨髓瘤-例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞性白血病(CNL)、急性未分化性白血病(AUL)、退化发育性大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞性白血病(PML)、青少年粒单核细胞白血病(JMML)、成人T细胞ALL、AML合并三谱系(trilineage)脊髓发育不良(AML/TMDS)、混合谱系白血病(MLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生障碍(MPD)、多发性骨髓瘤(MM)和髓样肉瘤。参见Kottaridis，P.D.，R.E.Gale等，(2003).″Flt3 mutations and leukaemia.″(Flt3突变和白血病)Br J Haematol 122(4)：523-38。髓样肉瘤还与FLT3突变有关。参见Ansari-Lari，Ali等，FLT3 mutations in myeloidsarcoma.(髓样肉瘤中FLT3突变)British Journal of Haematology.2004Sep.126(6)：785-91。

急性髓细胞性白血病(AML)是成人白血病中最流行的形式，且占儿童白血病15-20％。在美国，2002年诊断为AML的新病例为约11,000例，估计8,000名患者死于AML。参见National Cancer Institute SEER数据库-http://seer.cancer.gov/。尽管传统上根据组织学技术和血液白细胞计数诊断AML，但细胞遗传学和遗传学分析的最新发展表明，AML是不同疾病的混合体，它们在它们的遗传畸形、临床特征和对治疗的反应方面各不相同。近来的研究重点开始使化疗适应不同亚型的AML(根据对与蛋白表达有关的疾病进行细胞遗传学分析和免疫组织学分析，确定亚型)，取得一些成果。AML治疗通常分两期：诱导和诱导后治疗。诱导治疗通常由3个剂量的蒽环类药物例如道诺霉素组成，然后i.v.一次性大剂量输注细胞毒阿糖胞苷7-10天。该方案有效诱导70-80％60岁以下患者和～50％60岁以上患者缓解。参见Burnett，A.K.(2002).″Acute myeloid leukemia：treatment of adults under60years.″(急性髓细胞性白血病：60岁以下的成人治疗)Rev Clin Exp Hematol 6(1)：26-45；Buchner T.，W.Hiddemann等(2002).″Acute myeloid leukemia：treatment over60.″(急性髓细胞性白血病：60岁以上的成人治疗)RevClin Exp Hematol.6(1)：46-59。诱发缓解后，有几种诱发后选择，它们包括另一周期的化疗或骨髓移植。诱发后治疗选择和成功取决于患者的年龄和AML亚型。在过去十年，尽管AML的诊断和治疗有进步，但5年无疾病存活期内的65岁以下患者仅为40％，生存5年无疾病的65岁以上患者小于10％。因此，对于AML，尤其65岁以上患者，明显仍未满足临床需要。随着对不同亚型AML机制了解增加，新的适合治疗该疾病的方法开始出现，并取得了一些积极成果。

在复发和顽固性AML治疗中，最新的一个成果是开发和使用了用于诱导后治疗的法尼基转移酶抑制剂(FTI)。法尼基转移酶抑制剂是一类有效的和选择性细胞内法尼基蛋白转移酶(FPT)的抑制剂。FPT催化宿主细胞内蛋白的脂质修饰，这些蛋白包括Ras和Rho家族的小GTP酶和核纤层蛋白，引导它们定位到细胞内的质膜或膜室。

起初开发FTI是为了防止翻译后的法尼基化和Ras癌蛋白质激活(Prendergast G.C.and Rane，N.(2001)″Farnesyl Transferase Inhibtors：Mechanism and Applications″(法尼基转移酶抑制剂：机制和应用)Expert Opin Investig Drugs.10(12)：2105-16)。最新研究还证实，通过抑制依赖Ras的Nf-κB激活，FTI诱导的Nf-κB激活抑制导致对诱导凋亡和下调炎性基因表达的敏感性增加。参见Takada，Y.等(2004)。″Protein farnesyltransferase inhibitor(SCH66336)abolishes NF-kappaBactivation induced by various carcinogens and inflammatory stimulileading to suppression of NF-kappaB-regulated gene expression andup-regulation of apoptosis.″(蛋白法尼基转移酶抑制剂(SCH66336)抵消各种致癌原和炎性刺激诱发的NF-κB激活，导致NF-κB-调节基因表达抑制和凋亡上调)J Biol Chem279，26287-99。

在肿瘤学上尤其有意义的是，FTI抑制Ras和Rho家族的致癌基因导致体外和体内肿瘤细胞生长抑制和凋亡。参见Haluska P.，G.K.Dy，A.A.Adjei.(2002)″Farnesyl transferase inhibitors as anticancer agents.″(作为抗癌药物的蛋白法尼基转移酶抑制剂)Eur J Cancer.38(13)：1685-700。按照临床观点，骨髓癌，尤其AML表示FTI疗法有明显机会。

如前所述，AML是长期存活率极低的疾病，且化疗引起的毒性和抗性(尤其＞60岁患者)比率高。另外，AML细胞增殖机制还取决于Ras和Rho家族的小GTP酶。由于多血症的临床前数据支持FTT治疗AML的功效，从而启动了几个使用FTI的临床实验，它们包括；Tipifarnib(Zarnestra^TM，Johnson and Johnson)；BMS-214662；CP-60974(Pfizer)和Sch-663 6(lonafarnib，Schering-Plough)。

ZARNESTRA_(又称为R115777或Tipifarnib)是最新的和有希望的FTI类化合物。在复发和顽固性AML患者的临床研究中，Tipifarnib治疗产生～30％应答率，有2个患者完全缓解。参见Lancet J.E.，J.D.Rosenblatt，J.E.Karp.(2003)″Farnesyltransferase inhibitots and myeloidmalignancies：phase I evidence of Zarnestra activity in high-riskleukemias.″(法尼基转移酶抑制剂和骨髓癌：Zarnestra治疗高风险白血病活性的I期临床证据)Semin Hematol.39(3Suppl2)：31-5。这些反应发生与患者Ras突变状态无关，因为试验中的患者无一发生Ras突变，该突变有时在AML患者中出现。但是，在治疗开始时，患者的反应与他们的MAP激酶激活水平(Ras和Rho蛋白活性的下游靶)有直接相关性，提示通过其它机制激活的Ras/MAP激酶途径的活性可能是患者反应的好的预测指标。参见Lancet J.E.，J.D.Rosenblatt，J.E.Karp.(2003)″Farnesyltransferase inhibitors and myeloid malignancies：phase Ievidence of Zarnestra activity in high-risk leukemias.″(法尼基转移酶抑制剂和骨髓癌：Zarnestra治疗高风险白血病活性的I期临床证据)Semin Hematol.39(3Suppl 2)：31-5。另外，最新的复发性AML患者多中心II期试验证实，在50名患者中，有17人出现完全反应(骨髓胚细胞＜5％)，在50名患者中，有31人骨髓胚细胞减少＞50％。参见Gotlib，J(2005)″Farnesyltransferase inhibitor therapy in acutemyelogenous leukemia.″(用法尼基转移酶抑制剂治疗急性髓细胞性白血病)Curr.Hematol.Rep.；4(1)：77-84中的综述。对在该试验中，反应者通过FTI治疗调节的基因的初步分析还证实对MAP激酶途径中的蛋白有作用。这个积极结果在本领域具有特殊的意义，预示在不久的未来，Tipifarnib将进入临床。

近来，出现了治疗AML和一部分患有MDS和ALL患者的另一个靶。已鉴别受体酪氨酸激酶FLT3和FLT3突变是AML发展的关键因素。Gilliland，D.G.和J.D.Griffin(2002)对FLT3活性与疾病相关的许多研究进行了全面综述总结。″The ro1es of FLT3 in hematopoiesis andleukemia.″(FLT3在造血和白血病中的作用)Blood 100(5)：1532-42和Stirewalt，D.L.和J.P.Radich(2003).″The role of FLT3 inhaematopoietic malignancies.″(FLT3在血癌中的作用)Nat Rev Cancer3(9)：650-65。90％以上的AML患者具有在胚细胞中表达的FLT3。现已知，约30-40％AML患者具有FLT3激活突变，致使FLT3突变成为AML患者中最常见的突变。有两种已知类型的FLT3激活突变。一种是受体近膜域中的4-40氨基酸重复(ITD突变)(25-30％患者)，另一种是激酶域中点突变(5-7％患者)。这些受体突变造成多信号传导途径组成型激活，这些途径包括Ras/MAP激酶、PI3激酶/AKT和STAT途径。另外，FLT3ITD突变还证实减少早期骨髓细胞分化。更重要的是，ITD突变患者的缓解诱导率下降、缓解次数减少和整体预后较差。在MLL基因重排的ALL和MDS患者的亚群中，也发现出现FLT3ITD突变。在MDS和ALL中存在FLT3ITD突变还与这些患者的疾病发展加速和较差预后有关。参见Shih L.Y.等，(2004)″Internal tandemduplication of fms-like tyrosine kinase 3 is associated with poor outcomein patients with myelodysplastic syndrome.″(fms样酪氨酸激酶3的内串联重复与骨髓增生异常综合征患者的不良结果有关)Cancer，101；989-98；和Armstrong，S.A.等，(2004)″FLT3 mutations in childhoodacute lymphoblastic leukemia.″(在儿童急性成淋巴细胞白血病中的FLT3突变)Blood.103：3544-6。迄今为止，尚无强有利的数据支持激酶域点突变或过度表达的野生型受体是疾病的原因，但FLT3表达可能是疾病发展的因素。由此构成的临床前和临床证据导致开发出大量FLT3抑制剂，目前正在临床前和临床环境中评价它们。

正在出现的治疗AML的策略是在诱导和/或诱导后治疗期间靶向治疗药物一起联用，或靶向治疗药物与常规细胞毒药物联用。已公布概念数据的最新证据，这些证据证明细胞毒药物(例如阿糖胞苷或道诺霉素)和FLT3抑制剂联用可抑制表达FLT3ITD的AML细胞生长。参见Levis，M.，R.Pham等(2004).″In vitro studies of a FLT3 inhibitorcombined with chemotherapy：sequence of administration is important

synergistic cytotoxic effects.″(FLT3抑制剂与化疗联合的体外研究：给药顺序对于实现协同细胞毒作用很重要)Blood 104(4)：1145-50和Yee KW，Schittenhelm M，O′Farrell AM，Town AR，McGreevey L，Bainbridge T，Cherrington JM，Heinrich MC.(2004)″Synergistic effect of SU11248 with cytarabine or daunorubicin onFLT3ITD-positive leukemic cells.″(SU11248和阿糖胞苷或道诺霉素联用对FLT3ITD阳性白血病细胞的协同作用)Blood.104(13)：4202-9。

因此，本发明提供协同治疗方法，该方法包括联合(同时或序贯)给予本文中所述新的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂，该法尼基转移酶抑制剂用于治疗表达FLT3的细胞增殖性病症。

目前已知多种FT酶抑制剂。适用于本发明的FTI有以下FTI：WO-97/21701和美国专利号6,037,350，其通过引用整体结合到本文中，其中阐述了抑制某种法尼基转移酶的式(I)、(II)和(III)(咪唑基-5-基)甲基-2-喹啉酮衍生物的制备；制剂和药学性质；以及在体内代谢为式(I)化合物的式(II)和(III)的中间体。式(I)、(II)和(III)化合物、其药学上可接受的酸或碱加成盐和立体化学异构体形式由下式代表

其中

虚线代表任选的键；

X为氧或硫；

R¹为氢、C_1-12烷基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、喹啉基C_1-6烷基、吡啶基C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基，

或式-Alk¹-C(＝O)-R⁹、-Alk¹-S(O)-R⁹或-Alk¹-S(O)₂-R⁹基团，其中Alk¹为C_1-6烷二基，

R⁹为羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、C_1-8烷基氨基或被C_1-6烷氧基羰基取代的C_1-8烷基氨基；

R²、R³和R¹⁶各自独立为氢、羟基、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、羟基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基C_1-6烷氧基、氨基C_1-6烷氧基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷氧基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、Ar²氧基、Ar²C_1-6烷氧基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、三卤甲基、三卤甲氧基、C_2-6烯基、4，4-二甲基_唑基；或

当在相邻位上时，R²和R³可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (a-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (a-2)，

-O-CH＝CH- (a-3)，

-O-CH₂-CH₂- (a-4)，

-O-CH₂-CH₂-CH₂- (a-5)或

-CH＝CH-CH＝CH- (a-6)；

R⁴和R⁵各自独立为氢、卤基、Ar¹、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、氨基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基或C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基；

R⁶和R⁷各自独立为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、Ar²氧基、三卤甲基、C_1-6烷硫基、二(C_1-6烷基)氨基，或

当在相邻位上时，R⁶和R⁷可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (c-1)或

-CH＝CH-CH＝CH- (c-2)；

R⁸为氢、C_1-6烷基、氰基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、羧基C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、咪唑基、卤代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、氨基羰基C_1-6烷基或下式基团

-O-R¹⁰ (b-1)，

-S-R¹⁰ (b-2)，

-N-R¹¹R¹² (b-3)，

其中R¹⁰为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基或式-Alk²-OR¹³或-Alk²-NR¹⁴R¹⁵基团；

R¹¹为氢、C_1-12烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、天然氨基酸、Ar¹羰基、Ar²C_1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、羟基、C_1-6烷氧基、氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷基羰基氨基，或式-Alk²-OR¹³或-Alk²-NR¹⁴R¹⁵基团；

其中Alk²为C_1-6烷二基；

R¹³为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、羟基C_1-6烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹⁴为氢、C_1-6烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹⁵为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹⁷为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、Ar¹；

R¹⁸为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤基；

R¹⁹为氢或C_1-6烷基；

Ar¹为苯基或被以下基团取代的苯基：C_1-6烷基、羟基、氨基、C_1-6烷氧基或卤基；且

Ar²为苯基或被以下基团取代的苯基：C_1-6烷基、羟基、氨基、C_1-6烷氧基或卤基。

通过引用整体结合到本文中的WO-97/16443和美国专利号5,968,952阐述了式(IV)化合物的制备、制剂和抑制法尼基转移酶的药学性质，和在体内代谢为式(IV)化合物的式(V)和(VI)中间体。式(IV)、(V)和(VI)化合物、其药学上可接受的酸或碱加成盐和立体化学异构体形式由下式代表

其中

虚线代表任选的键；

X为氧或硫；

R²和R³各自独立为氢、羟基、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、羟基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基C_1-6烷氧基、氨基C_1-6烷氧基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷氧基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、Ar²氧基、Ar²C_1-6烷氧基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、三卤甲基、三卤甲氧基、C_2-6烯基；或

当在相邻位上时，R²和R³可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (a-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (a-2)，

-O-CH＝CH- (a-3)，

-O-CH₂-CH₂- (a-4)，

-O-CH₂-CH₂-CH₂- (a-5)或

-CH＝CH-CH＝CH- (a-6)；

R⁴和R⁵各自独立为氢、Ar¹、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、氨基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基或C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基；

R⁶和R⁷各自独立为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或Ar²氧基；

R⁸为氢、C_1-6烷基、氰基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、羟基羰基C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、卤代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、氨基羰基C_1-6烷基、Ar¹、Ar²C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷硫基C_1-6烷基；

R¹⁰为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤基；

R¹¹为氢或C_1-6烷基；

Ar¹为苯基或被以下基团取代的苯基：C_1-6烷基、羟基、氨基、C_1-6烷氧基或卤基；

通过引用整体结合到本文中的WO-98/40383和美国专利号6,187,786公开了式(VII)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体化学异构体形式的制备、制剂和抑制法尼基转移酶的药学性质，

其中

虚线代表任选的键；

X为氧或硫；

-A-为下式二价基团

-CH＝CH- (a-1)， -CH₂-S- (a-6)，

-CH₂-CH₂- (a-2)， -CH₂-CH₂-S- (a-7)，

-CH₂-CH₂-CH₂- (a-3)， -CH＝N- (a-8)，

-CH₂-O- (a-4)， -N＝N- (a-9)或

-CH₂-CH₂-O- (a-5)， -CO-NH- (a-10)；

其中任选一个氢原子可被C_1-4烷基或Ar¹置换；

R¹和R²各自独立为氢、羟基、卤基、氰基、C_1-6烷基、三卤甲基、三卤甲氧基、C_2-6烯基、C_1-6烷氧基、羟基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基羰基、氨基C_1-6烷氧基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷氧基、Ar²、Ar²-C_1-6烷基、Ar²-氧基、Ar²-C_1-6烷氧基；或

当在相邻位上时，R¹和R²可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (b-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (b-2)，

-O-CH＝CH- (b-3)，

-O-CH₂-CH₂- (b-4)，

-O-CH₂-CH₂-CH₂- (b-5)或

-CH＝CH-CH＝CH- (b-6)；

R³和R⁴各自独立为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、Ar³-氧基、C_1-6烷硫基、二(C_1-6烷基)氨基、三卤甲基、三卤甲氧基，或当在相邻位上时，R³和R⁴可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (c-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (c-2)或

-CH＝CH-CH＝CH- (c-3)；

R⁵为下式基团

其中R¹³为氢、卤基、Ar⁴、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、氨基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基或C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基；

R¹⁴为氢、C_1-6烷基或二(C_1-4烷基)氨基磺酰基；

R⁶为氢、羟基、卤基、C_1-6烷基、氰基、卤代C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷硫基C_1-6烷基、氨基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基-C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、Ar⁵、Ar⁵-C_1-6烷氧基C_1-6烷基；或下式基团

-O-R⁷ (e-1)，

-S-R⁷ (e-2)，

-N-R⁸R⁹ (e-3)，

其中R⁷为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar⁶、Ar⁶-C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基，或式-Alk-OR¹⁰或-Alk-NR¹¹R¹²基团；

R⁸为氢、C_1-6烷基、Ar⁷或Ar⁷-C_1-6烷基；

R⁹为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、Ar⁸、Ar⁸-C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基-C_1-6烷基、Ar⁸-羰基、Ar⁸-C_1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、羟基、C_1-6烷氧基、氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷基羰基氨基，或式-Alk-OR¹⁰或-Alk-NR¹¹R¹²基团；

其中Alk为C_1-6烷二基；

R¹⁰为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、羟基C_1-6烷基、Ar⁹或Ar⁹-C_1-6烷基；

R¹¹为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹⁰或Ar¹⁰-C_1-6烷基；

R¹²为氢、C_1-6烷基、Ar¹¹或Ar¹¹-C_1-6烷基；且

Ar¹-Ar¹¹各自独立选自苯基；或被以下基团取代的苯基：卤基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或三氟甲基。

通过引用整体结合到本文中的WO-98/49157和美国专利号6,117,432涉及式(VIII)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体化学异构体形式的制备、制剂和抑制法尼基转移酶的药学性质，

其中

虚线代表任选的键；

X为氧或硫；

R¹和R²各自独立为氢、羟基、卤基、氰基、C_1-6烷基、三卤甲基、三卤甲氧基、C_2-6烯基、C_1-6烷氧基、羟基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基羰基、氨基C_1-6烷氧基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷氧基、Ar¹、Ar¹-C_1-6烷基、Ar¹-氧基或Ar¹-C_1-6烷氧基；

R³和R⁴各自独立为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、Ar¹-氧基、C_1-6烷硫基、二(C_1-6烷基)氨基、三卤甲基或三卤甲氧基；

R⁵为氢、卤基、C_1-6烷基、氰基、卤代C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷硫基C_1-6烷基、氨基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基-C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、Ar¹、Ar¹-C_1-6烷氧基C_1-6烷基；或下式基团

-O-R¹⁰ (a-1)，

-S-R¹⁰ (a-2)，

-N-R¹¹R¹² (a-3)，

其中R¹⁰为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹、Ar¹C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基，或式-Alk-OR¹³或-Alk-NR¹⁴R¹⁵基团；

R¹¹为氢、C_1-6烷基、Ar¹或Ar¹C_1-6烷基；

R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、Ar¹、Ar¹C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基-C_1-6烷基、Ar¹羰基、Ar¹C_1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、羟基、C_1-6烷氧基、氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷基羰基氨基，或式-Alk-OR¹³或-Alk-NR¹⁴R¹⁵基团；

其中Alk为C_1-6烷二基；

R¹³为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、羟基C_1-6烷基、Ar¹或Ar¹C_1-6烷基；

R¹⁴为氢、C_1-6烷基、Ar¹或Ar¹C_1-6烷基；

R¹⁵为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹或Ar¹C_1-6烷基；

R⁶为下式基团

其中R¹⁶为氢、卤基、Ar¹、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、氨基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷硫基C_1-6烷基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基或C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基；

R¹⁷为氢、C_1-6烷基或二(C_1-4烷基)氨基磺酰基；

R⁷为氢或C_1-6烷基，条件是虚线不代表键；

R⁸为氢、C_1-6烷基或Ar²CH₂或Het¹CH₂；

R⁹为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤基；或

R⁸和R⁹结合在一起形成下式二价基团

-CH＝CH- (c-1)，

-CH₂-CH₂- (c-2)，

-CH₂-CH₂-CH₂- (c-3)，

-CH₂-O- (c-4)或

-CH₂-CH₂-O- (c-5)；

Ar¹为苯基；或被1或2个取代基取代的苯基，所述取代基各自独立选自卤基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或三氟甲基；

Ar²为苯基；或被1或2个取代基取代的苯基，所述取代基各自独立选自卤基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或三氟甲基；且

Het¹为吡啶基；被1或2个取代基取代的吡啶基，所述取代基各自独立选自卤基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或三氟甲基。

通过引用整体结合到本文中的WO-00/39082和美国专利号6,458,800阐述了式(IX)化合物或其药学上可接受的酸加成盐和立体化学异构体形式的制备、制剂和抑制法尼基转移酶的药学性质，

其中

＝X¹-X²-X³-为下式三价基团

＝N-CR⁶＝CR⁷- (x-1)，＝CR⁶-CR⁷＝CR⁸- (x-6)，

＝N-N＝CR⁶- (x-2)，＝CR⁶-N＝CR⁷- (x-7)，

＝N-NH-C(＝O)- (x-3)，＝CR⁶-NH-C(＝O)- (x-8)或

＝N-N＝N- (x-4)，＝CR⁶-N＝N- (x-9)；

＝N-CR⁶＝N- (x-5)，

其中R⁶、R⁷和R⁸各自独立为氢、C_1-4烷基、羟基、C_1-4烷氧基、芳氧基、C_1-4烷氧基羰基、羟基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基C_1-4烷基、一或二(C_1-4烷基)氨基C_1-4烷基、氰基、氨基、硫基(thio)、C_1-4烷硫基、芳硫基或芳基；

＞Y¹-Y²-为下式三价基团

＞CH-CHR⁹- (y-1)，

＞C＝N- (y-2)，

＞CH-NR⁹- (y-3)或

＞C＝CR⁹- (y-4)；

其中各R⁹独立为氢、卤基、酰卤、氨基羰基、羟基C_1-4烷基、氰基、羧基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_1-4烷氧基C_1-4烷基、C_1-4烷氧基羰基、一或二(C_1-4烷基)氨基、一或二(C_1-4烷基)氨基C_1-4烷基、芳基；

r和s各自独立为0、1、2、3、4或5；

t为0、1、2或3；

R¹和R²各自独立为羟基、卤基、氰基、C_1-6烷基、三卤甲基、三卤甲氧基、C_2-6烯基、C_1-6烷氧基、羟基C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、C_1-6烷氧基C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基羰基、氨基C_1-6烷氧基、一或二(C_1-6烷基)氨基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷氧基、芳基、芳基C_1-6烷基、芳氧基或芳基C_1-6烷氧基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、氨基羰基、氨基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基羰基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基；或

苯环上彼此相邻的两个R¹或R²取代基可独立结合形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (a-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (a-2)，

-O＝CH＝CH- (a-3)，

-O-CH₂-CH₂- (a-4)，

-O-CH₂-CH₂-CH₂- (a-5)或

-CH＝CH-CH＝CH- (a-6)；

R³为氢、卤基、C_1-6烷基、氰基、卤代C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷硫基C_1-6烷基、氨基羰基_C1-6烷基、羟基羰基、羟基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、芳基、芳基C_1-6烷氧基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基；或下式基团

-O-R¹⁰ (b-1)，

-S-R¹⁰ (b-2)，

-NR¹¹R¹² (b-3)，

其中R¹⁰为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、芳基、芳基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基，或式-Alk-OR¹³或-Alk-NR¹⁴R¹⁵基团；

R¹¹为氢、C_1-6烷基、芳基或芳基C_1-6烷基；

R¹²为氢、C_1-6烷基、芳基、羟基、氨基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基氨基、一或二(C_1-6烷基)氨基、C_1-6烷基羰基、氨基羰基、芳基羰基、卤代C_1-6烷基羰基、芳基C_1-6烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、一或二(C_1-6烷基)氨基羰基，其中烷基部分可任选被一个或多个取代基取代，所述取代基独立选自芳基或C_1-3烷氧基羰基、氨基羰基羰基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基，或式-Alk-OR¹³或-Alk-NR¹⁴R¹⁵基团；

其中Alk为C_1-6烷二基；

R¹³为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、羟基C_1-6烷基、芳基或芳基C_1-6烷基；

R¹⁴为氢、C_1-6烷基、芳基或芳基C_1-6烷基；

R¹⁵为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、芳基或芳基C_1-6烷基；

R⁴为下式基团

其中R¹⁶为氢、卤基、芳基、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷硫基、氨基、一或二(C_1-4烷基)氨基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷硫基C_1-6烷基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基或C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基；

R¹⁶也可与式(c-1)或(c-2)咪唑环中氮原子之一连接，在与氮连接的情况中，R¹⁶的含义限于氢、芳基、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基或C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基；

R¹⁷为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、芳基C_1-6烷基、三氟甲基或二(C_1-4烷基)氨基磺酰基；

R⁵为C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤基；

芳基为苯基、萘基或被1个或多个取代基取代的苯基，所述取代基各自独立选自卤基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或三氟甲基。

除以上式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)法尼基转移酶抑制剂外，本领域中已知的其它法尼基转移酶抑制剂包括：在WO-98/28303(NuOncology Labs)中阐述的Arglabin(即1(R)-10-表氧-5(S)，7(S)-愈创-3(4)，11(13)-二烯-6，12-内酯(olide)；在WO-99/45912(Wisconsin Genetics)中阐述的紫苏醇(perrilyl alcohol)；美国专利号5874442(Schering)中阐述的SCH-66336，即(+)-(R)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-5，6-二氢-11H-苯并[5，6]环庚三烯并[1，2-b]吡啶-11-基)哌啶-1-基]2-氧代乙基]哌啶-1-甲酰胺；在WO-00/01691(Merck)中阐述的L778123，即1-(3-氯苯基)-4-[1-(4-氰基苄基)-5-咪唑基甲基]-2-哌嗪酮；在WO-94/10138(Merck)中阐述的2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巯基]丙基氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯基丙酰基-蛋氨酸砜化合物；和在WO97/30992(Bristol Myers Squibb)中阐述的BMS 214662，即(R)-2，3，4，5-四氢-1-(1H-咪唑-4-基甲基)-3-(苯基甲基)-4-(2-噻吩基磺酰基)-1H-1，4-苯并二氮杂_-7-甲腈；以及在WO-00/12498和WO-00/12499中阐述的Pfizer化合物(A)和(B)：

本领域中已知的FLT3激酶抑制剂包括：AG1295和AG1296；Lestaurtinib(又称为CEP701，前称KT-5555，Kyowa Hakko，许可给Cephalon)；CEP-5214和CEP-7055(Cephalon)；CHIR-258(ChironCorp.)；EB-10和IMC-EB10(ImClone Systems Inc.)；GTP14564(MerkBiosciences UK)；Midostaurin(又称为PKC412Novartis AG)；MLN608(Millennium USA)；MLN-518(前称CT53518，COR Therapeutics Inc.，许可给Millennium Pharmaceuticals Inc.)；MLN-608(MillenniumPharmaceuticals Inc.)；SU-11248(Pfizer USA)；SU-11657(Pfizer USA)；SU-5416和SU5614；THRX-165724(Theravance Inc.)；AMI-10706(Theravance Inc.)；VX-528和VX-680(Vertex Pharmaceuticals USA，许可给Novartis(Switzerland)，Merck & Co USA)；和XL999(ExelixisUSA)。

另参见Levis，M.，K.F.Tse等(2001)″A FLT3 tyrosine kinaseinhibitor is selectively cytotoxic to acute myeloid leukemia blastsharboring FLT3 internal tandem duplication mutations.″(FLT3酪氨酸激酶抑制剂对潜在FLT3内串联重复突变的急性髓细胞性白血病胚细胞具有选择性细胞毒性)Blood 98(3)：885-7；Tse KF等(2001)Inhibition ofFLT3-mediated transformation by use of a tyrosine kinase inhibitor(通过使用酪氨酸激酶抑制剂抑制FLT3介导的转化)。Leukemia.Jul；15(7)：1001-10；Smith，B.Douglas等Single-agent CEP-701，a novel FLT3inhibitor，shows biologic and clinical activity in patients with relapsed orrefractory acute myeloid leukemia(单一药物CEP-701，新的FLT3抑制剂证实在复发或顽固性急性髓细胞性白血病患者中具有生物和临床活性)Blood，May 2004；103：3669-3676；Griswold，Ian J.等Effects ofMLN518，A Dual FLT3 and KIT inhibitor，on Normal and MalignantHematopoiesis(FLT3和KIT双重抑制剂MLN518对正常和恶性血细胞生成的作用)，Blood，Jul 2004；[印刷前Epub]；Yee，Kevin W.H.等SU5416 and SU5614 inhibit kinase activity of wild-type and mutant FLT3receptor tyrosine kinase(SU5416和SU5614抑制野生型和突变FLT3受体酪氨酸激酶的活性).Blood，Sep 2002；100：2941-294；O′Farrell，Anne-Marie等SU11248 is a novel FLT3 tyrosine kinase inhibitor withpotent activity in vitro and in vivo.(SU11248是一种新的体外和体内活性很强的酪氨酸激酶抑制剂)Blood，May 2003；101：3597-3605；Stone，R.M.等PKC412 FLT3 inhibitor therapy in AML：results of a phase IItrial.(用于治疗AML的PKC412 FLT3抑制剂：II期试验结果)AnnHematol.2004；83 Suppl1：S89-90；和Murata，K.等Selective cytotoxicmechanism of GTP-14564，a novel tyrosine kinase inhibitor in leukemiacells expressing a constitutively active Fms-like tyrosine kinase 3(FLT3).(GTP-14564，一种新的酪氨酸激酶抑制剂在表达组成型活性Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)的白血病细胞中的选择性细胞毒性机制)JBiol Chem.2003 Aug 29；278(35)：32892-8；Levis，Mark等Novel FLT3tyrosine kinase inhibitors(新的FLT3酪氨酸激酶抑制剂).Expert Opin.Investing.Drugs(2003)12(12)1951-1962；Levis，Mark等SmallMolecule FLT3 tyrosine kinase inhibitors(小分子FLT3酪氨酸激酶抑制剂).Current Pharmaceutical Design，2004，10，1183-1193。

发明概述

本发明包括抑制细胞或患者中FLT3酪氨酸激酶活性或表达，或减少FLT3激酶活性或表达的方法，该方法包括给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。本发明包括处理处于(或易感)细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症发生风险的患者的预防和治疗性方法，该方法通常包括给予患者预防有效量的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。可通过含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的单位药用组合物，给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂，或通过以下独立的药用组合物给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂：(1)含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物。

本发明还包括治疗或抑制患者细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症发作的多成分疗法(multiple component therapy)，该方法包括给予患者治疗或预防有效量的FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和一种或多种其它抗细胞增殖疗法，这些疗法包括化疗、放疗、基因疗法和免疫疗法。

参考附图，根据下文详细的描述，本发明的其它实施方案、特征、优点和方面将是显而易见的。

附图描述

图1.经口给予本发明化合物，对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物生长的影响。

图2.经口给予本发明化合物，对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物最终重量的影响。

图3.在用本发明化合物治疗的小鼠中得到的MV4-11肿瘤中FLT3磷酸化。

图4.有意省略图4。

图5.测试依赖FLT3的增殖抑制的化合物。

图6.1-6.8.单一药物对依赖FLT3的AML细胞增殖的剂量反应。

图7a-c.低剂量FLT3抑制剂在依赖FLT3的细胞中显著改变Tipifarnib的活性。

图8a-d.FLT3抑制剂化合物(A)和Tipifarnib或阿糖胞苷的单剂量联合协同抑制依赖FLT3的细胞系生长。

图9a-b.FLT3抑制剂化合物B和D与Tipifarnib或阿糖胞苷的单剂量联合协同抑制MV4-11细胞生长。

图10.1.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib协同抑制依赖FLT3的细胞增殖。

图10.2.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib协同抑制依赖FLT3的细胞增殖。

图10.3.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物C和Tipifarnib协同抑制依赖FLT3的细胞增殖。

图10.4.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib协同抑制依赖FLT3的细胞增殖。

图10.5.通过Chou和Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物H和Tipifarnib协同抑制MV4-11细胞增殖。

图10.6.通过Chou和Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物E和Zarnestra协同抑制MV4-11细胞增殖。

图10.7.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物F和Tipifarnib协同抑制依赖FLT3的MV4-11细胞增殖。

图10.8.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物G和

协同抑制依赖FLT3的MV4-11细胞增殖。

图11a-c.FLT3抑制剂和FTI联合协同诱导MV4-11细胞凋亡。

图12a-d.单一药物诱导胱冬酶3/7激活和依赖FLT3的MV4-11细胞凋亡的剂量反应。

图13.1.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib协同诱导依赖FLT3的MV4-11细胞中胱冬酶3/7的激活。

图13.2.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物C和Tipifarnib协同诱导依赖FLT3的MV4-11细胞中胱冬酶3/7的激活。

图13.3.通过Chou ad Talalay方法，测量FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib协同诱导依赖FLT3的MV4-11细胞中胱冬酶3/7的激活。

图14.Tipifarnib增加FLT3抑制剂化合物A在MV4-11细胞中抑制FLT3和Map激酶磷酸化的活性。

图15.单独和联合经口给予FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib，随时间对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积的影响。

图16.在研究结束时，单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib，对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积的影响。

图17.在研究结束时，单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib，对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤重量的影响。

图18.经口给予FLT3抑制剂本发明化合物D，对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物生长的影响。

图19.经口给予FLT3抑制剂本发明化合物D，对裸小鼠中MV4-11肿瘤异种移植物最终重量的影响。

图20.经口给予FLT3抑制剂本发明化合物D，对小鼠体重的影响。

图21.在用FLT3抑制剂本发明化合物D治疗的小鼠中得到的MV4-11肿瘤中FLT3磷酸化。

图22.单独和联合经口给予FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib，随时间对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积的影响。

图23.单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib，对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积的影响。

图24.单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib，对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物最终重量的影响。

本发明和优选实施方案的详述

在本文中，术语“包含”、“包括”和“含有”按它们的开放、非限制性含意使用。

本发明包括抑制细胞或患者中FLT3酪氨酸激酶活性或表达，或减少FLT3激酶活性或表达的方法，该方法包括给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。

本发明的一个实施方案包括减少或抑制患者中FLT3酪氨酸激酶活性的方法，该方法包括给予患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。

本发明的一个实施方案包括治疗患者与FLT3酪氨酸激酶活性或表达有关的病症的方法，该方法包括给予患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。

本发明的一个实施方案包括减少或抑制细胞中FLT3酪氨酸激酶活性的方法，该方法包括使细胞与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂接触的步骤。

本发明还提供减少或抑制在患者中FLT3酪氨酸激酶表达的方法，该方法包括给予患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的步骤。

本发明还提供在细胞中抑制细胞增殖的方法，该方法包括使细胞与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂接触的步骤。

可通过本领域熟知的方法例如本文中所述FLT3激酶测定，测定细胞或患者中FLT3的激酶活性。

本文中使用的术语“患者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物，优选哺乳动物，最优选人。

本文中使用的术语“接触”是指将化合物加入细胞，以使该细胞吸收化合物。

在该方面的其他实施方案中，本发明提供治疗具有(或易感)细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症发生风险的患者的预防和治疗性方法。

在一个实例中，本发明提供预防患者细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症的方法，该方法包括给予患者预防有效量的(1)含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物。

在一个实例中，本发明提供预防患者细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症的方法，该方法包括给予患者预防有效量的药用组合物，所述组合物含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体。

可在细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症的症状特征显露之前，给予一种或多种所述预防性药物，以预防疾病或病症，或者延缓其发展。

在另一个实例中，本发明涉及治疗患者细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的(1)含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物。

在另一个实例中，本发明涉及治疗患者细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症的方法，该方法包括给予患者治疗有效量的药用组合物，该组合物含有FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体。

可在病症的症状特征显露的同时，给予一种或多种所述治疗性药物，以使所述治疗性药物作为抵消细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症的疗法使用。

可通过含FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的单位药用组合物，给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂，或通过以下独立的药用组合物给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂：(1)含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物。在后一种情况中，可同时(虽然在独立的组合物中)、按任何顺序序贯、基本上同时或按独立的给药方案给予两种药用组合物。按照不同的给药方案，按足以保证达到有利的或协同作用的量和方式及时间内，给予两种组合物。

应认识到，优选的方法、给药顺序、联合药物中各成分的相应剂量和给药方案取决于给予的药物、它们的给药途径、所治疗的具体肿瘤和所治疗的具体宿主。

如本领域普通技术人员理解的那样，用常规方法和借鉴本文中给出的信息，本领域技术人员可容易地确定给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的最佳方法、顺序、剂量和给药方案。

通常，FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的剂量和给药方案小于或类似于在临床治疗中已经采用的那些，在该临床治疗中这些药物单独或与其它化疗药物联合给药。

术语“预防有效量”是指研究人员、兽医、医师或其它临床人员正在寻找，抑制或延迟患者病症发作的活性化合物或药物的量。

本文中使用的术语“治疗有效量”是指研究人员、兽医、医师或其它临床人员正在寻找，引起患者生物或医学反应的活性化合物或药物的量，所述反应包括缓解所治疗疾病或病症的症状。

在本领域中，确定本发明药用组合物的治疗和预防有效剂量的方法是已知的。

本文中使用的术语“组合物”应包括含指定量的指定成分的产品，和由指定量的指定成分的组合直接或间接产生的任何产品。

本文中使用的术语“与FLT3有关的病症”或“与FLT3受体有关的病症”或“与FLT3受体酪氨酸激酶有关的病症”应包括涉及或与FLT3活性例如FLT3过度活跃有关的疾病，和伴随这些疾病的病症。术语“FLT3过度活跃”是指：1)FLT3表达在通常不表达FLT3的细胞中；2)通常不表达FLT3的细胞表达FLT3；3)导致不需要细胞增殖的FLT3表达增加；或4)导致FLT3组成型激活突变。“与FLT3有关的病症”的实例包括因异常大量FLT3或FLT3突变导致过度刺激FLT3引起的疾病，或者因异常大量FLT3或FLT3突变导致异常高的FLT3活性量引起的疾病。已知FLT3过度活跃涉及多种疾病的发病机制，这些疾病包括下列细胞增殖性病症、肿瘤性病症和癌症。

术语“细胞增殖性病症”是指在多细胞生物体中对多细胞生物体造成损害(即不适或寿命缩短)的一种或多种细胞亚型不需要的细胞增殖。细胞增殖性病症可在不同种动物和人中发生。例如，本文中使用的“细胞增殖性病症”包括肿瘤性病症和其它细胞增殖性病症。

本文中使用的“肿瘤性病症”是指由异常或失控细胞生长产生的肿瘤。肿瘤性病症的实例包括但不限于造血障碍例如骨髓增殖性病症，例如血小板增多、特发性血小板增多症(ET)、特发性髓样化生、骨髓纤维变性(MF)、骨髓纤维变性合并髓样化生(MMM)、慢性特发性骨髓纤维变性(IMF)和真性红细胞增多(PV)、细胞减少症和癌变前骨髓增生异常综合征；癌症例如神经胶质瘤癌、肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌、前列腺癌、胃癌、食管癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌；和血癌，包括脊髓发育不良、多发性骨髓瘤、白血病和淋巴瘤。血癌的实例包括例如白血病、淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、霍奇金病(又称为霍奇金淋巴瘤)和骨髓瘤-例如急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、急性前髓细胞性白血病(APL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性中性粒细胞性白血病(CNL)、急性未分化性白血病(AUL)、退化发育性大细胞淋巴瘤(ALCL)、幼淋巴细胞性白血病(PML)、青少年粒单核细胞白血病(JMML)、成人T细胞ALL、AML合并三谱系脊髓发育不良(AML/TMDS)、混合谱系白血病(MLL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增生障碍(MPD)和多发性骨髓瘤(MM)。

在该方面的再一个实施方案中，本发明包括治疗或抑制患者细胞增殖性病症或与FLT3有关的病症发作的多成分疗法，该疗法包括给予患者治疗或预防有效量的FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和一种或多种其它抗细胞增殖疗法，这些疗法包括化疗、放疗、基因疗法和免疫疗法。

本文中使用的“化疗”是指涉及化疗药物的疗法。各种化疗药物可用于本文中公开的多成分治疗方法。作为实例考虑的化疗药物包括但不限于：铂化合物(例如顺铂、卡铂、奥沙利铂)；紫杉烷类化合物(例如紫杉醇、多西他赛(docetaxol))；喜树碱(campotothecin)化合物(伊立替康、托泊替康)；长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨)；抗肿瘤核苷衍生物(例如5-氟尿嘧啶、亚叶酸、吉西他滨、卡培他滨)；烷化剂(例如环磷酰胺、卡莫司汀、洛莫司汀、塞替派)；表鬼臼毒素/鬼臼毒素(例如依托泊苷、替尼泊苷)；芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、依西美坦)；抗雌激素化合物(例如他莫昔芬、氟维司群)、抗叶酸剂(例如培美曲塞(premetrexed)二钠)；去甲基化(hypomethylating)药物(例如阿扎胞苷)；生物制剂(例如吉姆单抗(gemtuzamab)、西妥昔单抗、利妥昔单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥单抗、贝伐单抗、埃罗替尼(erlotinib))；抗生素/蒽环霉素(例如伊达比星、放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、多柔比星、丝裂霉素C、放线菌素D、去甲柔红霉素、道诺霉素)；抗代谢药(例如氨基蝶呤、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷、甲基蝶呤)；微管蛋白结合剂(例如考布他汀、秋水仙碱、诺考达唑)；拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱)。其它有效药物包括钙拮抗剂维拉帕米，发现它与抗肿瘤药物联用后可在对公认化疗药物耐药的肿瘤细胞中引起化学敏感性，且加强此类化合物在药物敏感性恶性肿瘤中的效力。参见Simpson WG，The calcium channel blockerverapamil and cancer chemotherapy(钙通道阻断剂维拉帕米与癌症化疗)。Cell Calcium.1985 Dec；6(6)：449-67。另外，预计新的化疗药物和本发明化合物联用也有效。

在另一个本发明实施方案中，可联合给予FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和放疗。本文中使用的“放疗”是指包括使有需要的患者暴露于辐射的疗法。本领域技术人员已知这种疗法。放疗的合适方案与已在临床治疗中应用的那些类似，其中放疗单独使用或与其它化疗药物联合使用。

在另一个本发明实施方案中，可联合给予FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和基因疗法。本文中使用的“基因疗法”是指靶向涉及肿瘤发生的特定基因的疗法。可行的基因疗法策略包括修复缺陷的癌-抑制性基因、细胞用对应于编码生长因子及其受体的基因的反义DNA转导或转染；基于RNA的策略例如核酶、RNA诱杀剂、反义信使RNA和小干扰RNA(siRNA)分子以及所谓的′自杀基因′。

在其它本发明实施方案中，可联合给予FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和免疫疗法。本文中使用的“免疫疗法”是指通过对这种蛋白具有特异性的抗体，靶向涉及肿瘤发生的特定蛋白的疗法。例如，抗血管内皮生长因子的单克隆抗体已用于治疗癌症。

当一种或多种其它化疗药物与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂联用时，可同时(例如在独立或单位组合物中)、按任何顺序序贯、基本上同时或按不同的给药方案给予其它化疗药物、FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。在后一种情况中，应按足以保证达到有利和协同作用的量和方式和时间内给药。应认识到，一种或多种其它化疗药物的优选方法、给药顺序、各自的剂量和给药方案应取决于与FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂联合给予的一种或多种具体化疗药物、它们的给药途径、所治疗的具体肿瘤和具体宿主。如本领域普通技术人员理解的那样，一种或多种其它化疗药物的合适剂量通常类似于或小于已在临床治疗中使用的那些剂量，其中这些化疗药物可单独或与其它化疗药物联合给予。

本领域技术人员可用常规方法和鉴于本文中提供的信息，容易地确定给药的最佳方法和顺序以及剂量和方案。

仅作为实例，最好可按剂量1-500mg/米²(mg/m²)体表面积例如50-400mg/m²给予铂化合物，尤其对于顺铂，每治疗疗程按约75mg/m²剂量给药，对于卡铂，按约300mg/m²给药。顺铂不能口服吸收，因此必须通过静脉内、皮下、肿瘤内或腹膜内注射释药。

仅作为实例，最好可按剂量50-400mg/米²(mg/m²)体表面积例如75-250mg/m²给予紫杉烷类化合物，尤其对于紫杉醇，每治疗疗程按约175-250mg/m²剂量给药，对于多西他赛，按约75-150mg/m²给药。

仅作为实例，可最好按剂量0.1-400mg/米²(mg/m²)体表面积例如1-300mg/m²给予喜树碱化合物，尤其对于伊立替康，每治疗疗程按约100-350mg/m²剂量给药，对于托泊替康，按约1-2mg/m²给药。

仅作为实例，最好可按剂量2-30mg/米²(mg/m²)体表面积给予长春花生物碱，尤其对于长春碱，每治疗疗程按约3-12mg/m²剂量给药，对于长春新碱，按约1-2mg/m²剂量给药，对于长春瑞滨，按剂量约10-30mg/m²给药。

仅作为实例，最好可按剂量200-2500mg/米²(mg/m²)体表面积例如700-1500mg/m²给予抗肿瘤核苷衍生物。在5-氟尿嘧啶(5-FU)使用时，通常按200-500mg/m²(优选3-15mg/kg/日)剂量静脉内给药。每治疗疗程最好按约800-1200mg/m²剂量给予吉西他滨，最好按剂量约1000-2500mg/m²给予卡培他滨。

仅作为实例，最好可按剂量100-500mg/米²(mg/m²)体表面积例如120-200mg/m²给予烷化剂，尤其每治疗疗程按约100-500mg/m²剂量给予环磷酰胺，对于苯丁酸氮芥，按剂量约0.1-0.2mg/kg体重给药，对于卡莫司汀，按约150-200mg/m²剂量给药，对于洛莫司汀，按剂量约100-150mg/m²给药。

仅作为实例，最好可按剂量30-300mg/米²(mg/m²)体表面积例如50-250mg/m²给予鬼臼毒素衍生物，尤其对于依托泊苷，每治疗疗程按约35-100mg/m²剂量给药，对于替尼泊苷，按约50-250mg/m²给药。

仅作为实例，最好可按剂量10-75mg/米²(mg/m²)体表面积例如15-60mg/m²给予蒽环类衍生物，尤其对于多柔比星，每治疗疗程按约40-75mg/m²剂量给药，对于柔红霉素，按约25-45mg/m²剂量给药，对于伊达比星，按剂量约10-15mg/m²给药。

仅作为实例，最好可按每日约1-100mg剂量给予抗雌激素化合物，取决于具体的药物和所治疗的病症。最好按5-50mg，优选10-20mg剂量，每日两次，通过口服给予他莫昔芬，连续治疗足够时间以达到和维持疗效。最好按约60mg剂量，每日一次，口服给予托瑞米芬，连续治疗足够时间以达到和维持疗效。最好按约1mg剂量，每日一次，通过口服给予阿那曲唑。最好按约20-100mg剂量，每日一次，通过口服给予曲洛昔芬。最好按约60mg剂量，每日一次，通过口服给予雷洛昔芬。最好按约25mg剂量，每日一次，通过口服给予伊西美坦。

仅作为实例，最好可按剂量约1-5mg/米²(mg/m²)体表面积，或如有不同，按本领域中已知剂量给予生物制剂。例如，每治疗疗程最好按剂量1-5mg/m²，尤其2-4mg/m²给予曲妥单抗。

每治疗疗程可给予例如1个、2个或多个剂量，例如可按每7、14、21或28日重复给药。

可例如经静脉内、口服、皮下、肌内、皮内或肠胃外全身给予患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。也可局部给予患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。局部递药系统的非限定性实例包括使用腔内医疗装置，包括血管内递药导管、线、药理学支架(stents)和腔内涂膜术(endoluminal paving)。FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂还可与靶向药物组合给予患者，以使在靶部位获得高局部浓度的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。另外，还可将FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂配制成速释或维持药物或药剂与靶组织接触数小时至数星期目的的缓释制剂。

含与药学上可接受的载体组合的FLT3激酶抑制剂，和与药学上可接受的载体组合的法尼基转移酶抑制剂的独立的药用组合物可含有约0.1mg-1000mg，优选约100-500mg相应的药物化合物，且可组成适合所选择给药模式的任何形式。

含与药学上可接受的载体组合的FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂的单位药用组合物可含约0.1mg-1000mg，优选约100-500mg化合物，且可组成适合所选择给药模式的任何形式。

短语“药学上可接受的”是指当适当时给予动物或人时不产生不良的、过敏或其它不适当的反应的分子实体和组合物。兽医用途同样包括在本发明内，“药学上可接受的”制剂包括临床和/或兽用制剂。

载体包括必要的和惰性药物赋形剂，包括但不限于粘合剂、悬浮剂、润滑剂、矫味剂、甜味剂、防腐剂、染料和包衣剂。适合口服给药的组合物包括固体形式例如丸剂、片剂、胶囊形片剂、胶囊剂(各自包括即释、定时释放和缓释制剂)、颗粒剂和散剂；和液体形式例如溶液剂、糖浆、酏剂、乳剂和混悬剂。可用于肠胃外给药的形式包括无菌溶液剂、乳剂和混悬剂。

无论是独立的还是单位组合物形式，本发明药用组合物均可配制用于缓慢释放FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。这种单位或独立的组合物包含缓释载体(通常为聚合物载体)和FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂之一，或在单位组合物形式中，包含FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂两者。

在本领域中熟知可生物降解的缓释载体。它们是可形成将一种或多种活性化合物捕获在其中的颗粒，并在合适的环境(例如水性、酸性、碱性等)下缓慢降解/溶解；并因此在体液中降解/溶解，从而将一种或多种活性化合物释放在其中的材料。颗粒优选为纳米颗粒(即直径约1-500nm，优选直径约50-200nm，最优选直径约100nm)。

法尼基转移酶抑制剂

可用于本发明方法或治疗的法尼基转移酶抑制剂的实例包括以上式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)法尼基转移酶抑制剂(″FTI″)。

优选的FTI包括式(I)、(II)或(III)化合物、其药学上可接受的酸或碱加成盐和立体化学异构体形式：

其中

虚线代表任选的键；

X为氧或硫；

R¹为氢、C_1-12烷基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、喹啉基C_1-6烷基、吡啶基C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基或式-Alk¹-C(＝O)-R⁹、-Alk¹-S(O)-R⁹或-Alk¹-S(O)₂-R⁹基团，其中Alk¹为C_1-6烷二基，

当在相邻位上时，R²和R³可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (a-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (a-2)，

-O-CH＝CH- (a-3)，

-O-CH₂-CH₂- (a-4)，

-O-CH₂-CH₂-CH₂- (a-5)或

-CH＝CH-CH＝CH- (a-6)；

当在相邻位上时，R⁶和R⁷可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (c-1)或

-CH＝CH-CH＝CH- (c-2)；

R⁸为氢、C_1-6烷基、氰基、羟基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、羧基C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、咪唑基、卤代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、氨基羰基C_1-6烷基，或下式基团

-O-R¹⁰ (b-1)，

-S-R¹⁰ (b-2)，

-N-R¹¹R¹² (b-3)，

其中R¹⁰为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基，或式-Alk²-OR¹³或-Alk²-NR¹⁴R¹⁵基团；

R¹¹为氢、C_1-12烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-16烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、天然氨基酸、Ar¹羰基、Ar²C_1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、羟基、C_1-6烷氧基、氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷基羰基氨基，或式-Alk²-OR¹³或-Alk²-NR¹⁴R¹⁵基团；

其中Alk²为C_1-6烷二基；

R¹⁴为氢、C_1-6烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹⁵为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹⁷为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、Ar¹；

R¹⁸为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤基；

R¹⁹为氢或C_1-6烷基；

在式(I)、(II)和(III)中，R⁴或R⁵还可与咪唑环上的一个氮原子连接。如果氮上的氢被R⁴或R⁵置换，则与氮连接时R⁴和R⁵的含意限于氢、Ar¹、C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基S(O)C_1-6烷基、C_1-6烷基S(O)₂C_1-6烷基。

优选式(I)、(II)和(III)中的取代基R¹⁸位于喹啉酮部分的5或7位，当R¹⁸位于7位时，取代基R¹⁹位于8位。

优选的FTI的实例是其中X为氧的那些式(I)化合物。

优选的FTI的实例也是那些式(I)化合物，其中虚线代表键，以形成双键。

另一组优选的FTI是那些式(I)化合物，其中R¹为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基或式-Alk¹-C(＝O)-R⁹基团，其中Alk¹为亚甲基，R⁹为被C_1-6烷氧基羰基取代的C_1-8烷基氨基。

又另一组优选的FTI是那些式(I)化合物，其中R³为氢或卤基；R²为卤基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_1-6烷氧基、三卤甲氧基或羟基C_1-6烷氧基。

再一组优选的FTI是那些式(I)化合物，其中R²和R³在相邻位置上，且结合在一起形成式(a-1)、(a-2)或(a-3)二价基团。

又再一组优选的FTI是那些式(I)化合物，其中R⁵为氢，R⁴为氢或C_1-6烷基。

再另一组优选的FTI是那些式(I)化合物，其中R⁷为氢；R⁶为C_1-6烷基或卤基，优选氯，尤其4-氯。

另一示范组优选的FTI是那些式(I)化合物，其中R⁸为氢、羟基、卤代C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、咪唑基或式-NR¹¹R¹²基团，其中R¹¹为氢或C_1-12烷基，且R¹²为氢、C_1-6烷基；C_1-6烷氧基、羟基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基，或式-Alk²-OR¹³基团，其中R¹³为氢或C_1-6烷基。

优选的化合物还是那些式(I)化合物，其中R¹为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基或式-Alk¹-C(＝O)-R⁹基团，其中Alk¹为亚甲基，R⁹为被C_1-6烷氧基羰基取代的C_1-8烷基氨基；R²为卤基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_1-6烷氧基、三卤甲氧基、羟基C_1-6烷氧基或Ar¹；R³为氢；R⁴为与咪唑3位上的氮连接的甲基；R⁵为氢；R⁶为氯；R⁷为氢；R⁸为氢、羟基、卤代C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、咪唑基或式-NR¹¹R¹²基团，其中R¹¹为氢或C_1-12烷基，R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基或式-Alk²-OR¹³基团，其中R¹³为C_1-6烷基；R¹⁷为氢，R¹⁸为氢。

尤其优选的FTI为：

1)4-(3-氯苯基)-6-[(4-氯苯基)羟基(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；

2)6-[氨基(4-氯苯基)-1-甲基-1H-咪唑-5-基甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；

3)6-[(4-氯苯基)羟基(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-乙氧基苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；

4)6-[(4-氯苯基)(1-甲基-1H)咪唑-5-基)甲基]-4-(3-乙氧基苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮一盐酸盐一水合物；

5)6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-乙氧基苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；

6)6-氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-1-甲基-4-(3-丙基苯基)-2(1H)-喹啉酮；其立体异构体形式或药学上可接受的酸或碱加成盐；和

7)(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮(tipifarnib；WO97/21701表1中的化合物75)；及其药学上可接受的酸加成盐和立体化学异构体形式。

Tipifarnib或ZARNESTRA^_是尤其优选的FTI。

进一步优选的FTI包括式(IX)化合物，其中适用一个或多个以下条件：

·＝X¹-X²-X³为式(x-1)、(x-2)、(x-3)、(x-4)或(x-9)三价基团，其中各R⁶独立为氢、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基羰基、氨基或芳基，R⁷为氢；

·＞Y¹-Y²-为式(y-1)、(y-2)、(y-3)或(y-4)三价基团，其中各R⁹独立为氢、卤基、羧基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基羰基；

·r为0、1或2；

·s为0或1；

·t为0；

·R¹为卤基、C_1-6烷基，或位于苯环上彼此邻位的两个R¹取代基可一起独立形成式(a-1)二价基团；

·R²为卤基；

·R³为卤基或式(b-1)或(b-3)基团，其中

R¹⁰为氢或式-Alk-OR¹³基团。

R¹¹为氢；

R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、羟基、C_1-6烷氧基或一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基；

Alk为C_1-6烷二基，R¹³为氢；

·R⁴为式(c-1)或(c-2)基团，其中

R¹⁶为氢、卤基或一或二(C_1-4烷基)氨基；

R¹⁷为氢或C_1-6烷基；

·芳基为苯基。

另一组优选的FTI为式(IX)化合物，其中＝X¹-X²-X³为式(x-1)、(x-2)、(x-3)、(x-4)或(x-9)三价基团，＞Y1-Y2为式(y-2)、(y-3)或(y-4)三价基团，r为0或1，s为1，t为0，R¹为卤基、C_(1-4)烷基或形成式(a-1)二价基团，R²为卤基或C_1-4烷基，R³为氢或式(b-1)或(b-3)基团，R⁴为式(c-1)或(c-2)基团，R⁶为氢、C_1-4烷基或苯基，R⁷为氢，R⁹为氢或C_1-4烷基。

R¹⁰为氢或-Alk-OR¹³，R¹¹为氢，R¹²为氢或C_1-6烷基羰基，R¹³为氢；

优选的FTI为那些式(IX)化合物，其中＝X¹-X²-X³为式(x-1)或(x-4)三价基团，＞Y1-Y2为式(y-4)三价基团，r为0或1，s为1，t为0，R¹为卤基，优选氯，最优选3-氯，R²为卤基，优选4-氯或4-氟，R³为氢或式(b-1)或(b-3)基团，R⁴为式(c-1)或(c-2)基团，R⁶为氢，R⁷为氢，R⁹为氢，R¹⁰为氢，R¹¹为氢，R¹²为氢。

其它优选的FTI为那些式(IX)化合物，其中＝X¹-X²-X³为式(x-2)、(x-3)或(x-4)三价基团，＞Y1-Y2为式(y-2)、(y-3)或(y-4)三价基团，r和s为1，t为0，R¹为卤基，优选氯，最优选3-氯或R¹为C_1-4烷基，优选3-甲基，R²为卤基，优选氯，最优选4-氯，R³为式(b-1)或(b-3)基团，R⁴为式(c-2)基团，R⁶为C_1-4烷基，R⁹为氢，R¹⁰和R¹¹为氢，R¹²为氢或羟基。

尤其优选的式(IX)FTI化合物为；

1)7-[(4-氟苯基)(1H-咪唑-1-基)甲基]-5-苯基咪唑并[1，2-a]喹啉；

2)α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-5-苯基咪唑并[1，2-a]喹啉-7-甲醇；

3)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-咪唑并[1，2-a]喹啉-7-甲醇；

4)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)咪唑并[1，2-a]喹啉-7-甲胺；

5)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹啉-7-甲胺；

6)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-1-甲基-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-1，2，4-三唑并[4，3-a]喹啉-7-甲醇；

7)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹啉-7-甲胺；

8)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲醇；

9)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-4，5-二氢-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲醇；

10)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲胺；

11)5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-N-羟基-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四氢[1，5-a]喹啉-7-甲胺；和

12)α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-5-(3-甲基苯基)四唑并[1，5-a]喹啉-7-甲胺；及其药学上可接受的酸加成盐和立体化学异构体形式。

5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲胺，尤其(-)对映体及其药学上可接受的酸加成盐是尤其优选的FTI。

上文中所述药学上可接受的酸或碱加成盐应包括式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物能够形成的有治疗活性的无毒酸和无毒碱加成盐形式。可通过用合适的酸处理碱形式，将具有碱性的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物转化为它们的药学上可接受的酸加成盐。合适的酸包括例如无机酸，例如氢卤酸例如盐酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸和类似的酸；或有机酸例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基水杨酸、扑酸和类似的酸。

可通过用合适的有机或无机碱处理酸形式，将具有酸性的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物转化为它们的药学上可接受的碱加成盐。

合适的碱盐形式包括例如铵盐；碱金属和碱土金属盐例如锂、钠、钾、镁、钙盐等；有机碱的盐例如笨乍生、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺青霉素G(hydrabamine)盐；和氨基酸例如精氨酸、赖氨酸等的盐。

酸和碱加成盐还包括优选的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物能够形成的水合物和溶剂加合物形式。此类形式的实例是例如水合物、醇化物等。

前文中使用的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物包括所示结构式的所有立体化学异构体形式(由相同连接顺序结合，但具有不可互变的不同三维结构的相同原子组成的所有可能的化合物)。除另外说明或指明外，应理解FTI化合物的化学命名包括该化合物可能具有的所有可能立体化学异构体形式的混合物。这种混合物可含有化合物碱性分子结构的所有非对映体和/或对映体。纯形式或相互混合的式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物的所有立体化学异构体形式应包括在所描绘式的范围内。

某些式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)FTI化合物还可存在其互变异构形式。尽管未在上式中明确表明，但此类形式应包括在其范围内。

因此，除下文中另外说明外，术语“式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)化合物”和“式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或(IX)法尼基转移酶抑制剂”还应包括药学上可接受的酸或碱加成盐和所有的立体化学异构和互变异构形式。

可用于本发明的其它法尼基转移酶抑制剂包括：Arglabin、紫苏醇、SCH-66336、2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巯基]丙基氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯基丙酰基-蛋氨酸砜(Merck)；L778123、BMS214662、上述Pfizer化合物A和B。化合物Arglabin(WO98/28303)、紫苏醇(WO99/45712)、SCH-66336(US 5,874,442)、L778123(WO00/01691)、2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巯基]丙基氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯基丙酰基-蛋氨酸砜(WO94/10138)、BMS214662(WO 97/30992)、Pfizer化合物A和B(WO00/12499和WO00/12498)的合适剂量或治疗有效量在公布的专利说明书中给出，或本领域技术人员已知或可容易地确定。

FLT3激酶抑制剂

本发明FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基(其中所述杂芳基优选为吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吡啶基-N-氧化物或吡咯基-N-氧化物，最优选吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基)，或9元-10元苯并稠合杂芳基(其中所述9元-10元苯并稠合杂芳基优选为苯并噻唑基、苯并_唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基或苯并[b]噻吩基)；

R₁为

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、苯氧基、苯基、任选被R₅取代的杂芳基(其中所述杂芳基优选为吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、嘧啶基、三唑基、吡嗪基、吡啶基-N-氧化物或吡咯基-N-氧化物，最优选吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡啶基、嘧啶基、三唑基或吡嗪基)、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的哌啶酮基、任选被R₅取代的环杂二酮基、任选被R₅取代的杂环基(其中所述杂环基优选为吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、咪唑烷基、噻唑烷基、_唑烷基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、硫代吗啉基、硫代吗啉基-1，1-二氧化物、哌啶基、吗啉基或哌嗪基)、-COOR_y、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SR_y、-SOR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y、-NR_wSO₂R_x、-SO₃R_y、-OSO₂NR_wR_x或-SO₂NR_wR_x；

R_w和R_x独立选自：氢、烷基、烯基、芳烷基(其中所述芳烷基的芳基部分优选为苯基)，或杂芳烷基(其中所述杂芳烷基的杂芳基部分优选为吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吡啶基-N-氧化物或吡咯基-N-氧化物，最优选吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基)，或R_w和R_x可任选结合在一起形成5元-7元环，所述环任选含有选自以下的杂部分：O、NH、N(烷基)、SO₂、SO或S，优选选自：

(烷基)，

和

R_y选自：氢、烷基、烯基、环烷基(其中所述环烷基优选为环戊烷基或环己烷基)、苯基、芳烷基(其中所述芳烷基的芳基部分优选为苯基)、杂芳烷基(其中所述杂芳烷基的杂芳基部分优选为吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吡啶基-N-氧化物或吡咯基-N-氧化物，最优选吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基)，或杂芳基(其中所述杂芳基优选为吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吡啶基-N-氧化物或吡咯基-N-氧化物，最优选吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基)；

R₅为独立选自以下的1、2或3个取代基：卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基、C_(1-4)烷基-OH或烷基氨基；且

R₃为独立选自以下的一个或多个取代基：氢、烷基、烷氧基、卤素、烷氧基醚、羟基、硫基(thio)、硝基、任选被R₄取代的环烷基(其中所述环烷基优选为环戊烷基或环己烷基)、任选被R₄取代的杂芳基(其中所述杂芳基优选为吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡喃基、噻喃基、吡啶基、嘧啶基、三唑基、吡嗪基、吡啶基-N-氧化物或吡咯基-N-氧化物；最优选吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噻唑基、_唑基、吡啶基、嘧啶基、三唑基或吡嗪基)、烷基氨基、任选被R₄取代的杂环基(其中所述杂环基优选为四氢吡啶基、四氢吡嗪基、二氢呋喃基、二氢_嗪基、二氢吡咯基、二氢咪唑基、氮杂环庚烯基(azepenyl)、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、咪唑烷基、噻唑烷基、_唑烷基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶基、吗啉基或哌嗪基)、-O(环烷基)、任选被R₄取代的吡咯烷酮基、任选被R₄取代的苯氧基、-CN、-OCHF₂、-OCF₃、-CF₃、卤代烷基、任选被R₄取代的杂芳氧基、二烷基氨基、-NHSO₂烷基、硫烷基或-SO₂烷基；其中R₄独立选自卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-CO₂烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或烷基氨基。

下文中使用的术语“式I′化合物”将也包括其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物和立体化学异构体。

式I′FLT3抑制剂-缩写和定义

在与式I′FLT3抑制剂有关的应用中，下列术语将具有以下含意：

ATP 三磷酸腺苷

Boc 叔丁氧羰基

DCM 二氯甲烷

DMF 二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

DIEA 二异丙基乙胺

DTT 二硫苏糖醇

EDC 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

EDTA 乙二胺四乙酸

EtOAc 乙酸乙酯

FBS 胎牛血清

FP 荧光偏振

GM-CSF 粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子

HBTU 六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲_

Hex 己烷

HOBT 1-羟基苯并三唑水合物

HPβCD 羟丙基β-环糊精

HRP 辣根过氧化物酶

i-PrOH 异丙醇

LC/MS(ESI) 液相色谱/质谱(电喷雾电离)

MeOH 甲醇

NMM N-甲基吗啉

NMR 核磁共振

PS 聚苯乙烯

PBS 磷酸缓冲盐溶液

RPMI Rosewell Park Memorial Institute

RT 室温

RTK 受体酪氨酸激酶

NaHMDS 六甲基二硅烷基氨基化钠

SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

TEA 三乙胺

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱

(在本说明书全文中有需要的地方，提供其它缩写)。

定义

在与式I′FLT3抑制剂有关的使用中，以下术语具有以下含意(在本说明书全文中，如果需要会提供其它定义)：

无论单独或作为取代基一部分使用的术语“烯基”例如“C_1-4烯基(芳基)”是指具有至少一个碳-碳双键的部分不饱和的支链或直链单价烃基，其中通过从母体烷基分子中两相邻碳原子每一个上除去一个氢原子衍生双键，通过从一个碳原子上除去一个氢原子衍生该基团。关于双键的原子可按顺(Z)或反(E)构象取向。典型的烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、烯丙基(2-丙烯基)、丁烯基等。实例包括C_2-8烯基或C_2-4烯基。

术语″C_a-b″(其中a和b代表指定碳原子数目的整数)是指烷基、烯基、炔基、烷氧基或环烷基，或指基团的烷基部分，其中烷基作为含a-b个碳原子(包括a和b)的前缀词根出现。例如，C_1-4代表含1、2、3或4个碳原子的基团。

无论单独或作为取代基一部分使用的术语“烷基”是指饱和的支链或直链单价烃基，其中通过从一个碳原子上除去一个氢原子衍生该基团。除明确说明外(例如通过使用限定性术语例如“端碳原子”)，取代基变量可位于任何碳链原子上。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基等。实例包括C_1-8烷基、C_1-6烷基和C_1-4烷基。

术语“烷基氨基”是指通过从烷基胺例如丁基胺的氮上除去一个氢原子形成的基团，术语“二烷基氨基”是指通过从仲胺例如二丁基胺的氮上除去一个氢原子形成的基团。在两种情况中，期望与分子其余部分的连接点为氮原子。

无论单独或作为取代基一部分使用的术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的部分不饱和的支链或直链单价烃基，其中通过从母体烷基分子中两相邻碳原子每一个上除去两个氢原子衍生三键，通过从一个碳原子上除去一个氢原子衍生该基团。典型的炔基包括乙炔基、丙炔基、丁炔基等。实例包括C_2-8炔基或C_2-4炔基。

术语“烷氧基”是指饱和或部分不饱和的支链或直链单价烃醇基，通过从母体烷烃、烯烃或炔烃上的氢氧化物氧取代基上除去氢原子衍生该基团。其中应具有具体的饱和度水平，术语“烷氧基”、“烯氧基”和“炔氧基”的用法与烷基、烯基和炔基的定义相同。实例包括C_1-8烷氧基或C_1-4烷氧基。

术语“烷氧基醚”是指饱和支链或直链单价烃醇基，通过从羟基醚上氢氧化物氧取代基上除去氢原子衍生该基团。实例包括1-羟基-2-甲氧基-乙烷和1-(2-羟基-乙氧基)-2-甲氧基-乙烷基团。

术语“芳烷基”是指含芳基取代基的C_1-6烷基。实例包括苄基、苯乙基或2-萘甲基。与分子其余部分的连接点应为烷基。

术语“芳族”是指具有不饱和共轭π电子系统的环烃环系统。

术语“芳基”是指通过从环系统的一个碳原子上除去一个氢原子衍生的芳环烃环基团。典型的芳基包括苯基、萘基、芴基、茚基、甘菊环基、蒽基等。

术语“芳基氨基”是指被芳基例如苯基取代的氨基例如氨。期望与分子其余部分的连接点应通过氮原子。

术语“芳氧基”是指被芳基例如苯基取代的氧原子团。期望与分子的其余部分连接的连接点应通过氧原子。

术语“苯并-稠合环烷基”是指双环稠合的环系统基团，其中一个环是苯基，另一个环是环烷基或环烯基环。典型的苯并-稠合环烷基包括茚满基、1，2，3，4-四氢化萘基、6，7，8，9-四氢-5H-苯并环庚烯基、5，6，7，8，9，10-六氢-苯并环辛烯基等。苯并-稠合环烷基环系统是芳基的子集。

术语“苯并稠合杂芳基”是指双环稠合的环系统基团，其中系统中的一个环是苯基，另一个是杂芳环。典型的苯并稠合杂芳基包括吲哚基、二氢吲哚基、异吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、肉啉基、2，3-二氮杂萘基、喹唑啉基等。苯并稠合杂芳环是杂芳基的子集。

术语“苯并稠合杂环基”是指双环稠合的环系统基团，其中系统中的一个环是苯基，另一个是杂环基环。典型的苯并稠合杂环基团包括1，3-苯并间二氧杂环戊烯基(又称为1，3-亚甲二氧基苯基)、2，3-二氢-1，4-苯并二氧杂环己烯基(又称为1，4-亚乙二氧基苯基)、苯并-二氢呋喃基、苯并-四氢吡喃基、苯并-二氢噻吩基等。

术语“羧基烷基”是指烷化羧基例如叔丁氧基羰基，其中与分子其余部分的连接点是羰基。

术语“环杂二酮基”是指具有两个氧代基取代基的杂环化合物。实例包括噻唑烷二酮基、_唑烷二酮基和吡咯烷二酮基。

术语“环烯基”是指通过除去烃环系统中的一个氢原子衍生的部分不饱和环烷基，该烃环系统含有至少一个碳-碳双键。实例包括环己烯基、环戊烯基和1，2，5，6-环辛二烯基。

术语“环烷基”是指通过除去一个环碳原子上的一个氢原子衍生的饱和或部分不饱和的单环或双环烃环基团。典型的环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。其它实例包括C_3-8环烷基、C_5-8环烷基、C_3-12环烷基、C_3-20环烷基、十氢化萘基和2，3，4，5，6，7-六氢-1H-茚基。

术语“稠环系统”是指其中两个相邻原子存在于两个环部分中每一个的双环分子。可任选存在杂原子。实例包括苯并噻唑、1，3-苯并间二氧杂环戊烯和十氢化萘。

用作环系统前缀的术语“杂”是指至少一个环碳原子用独立选自N、S、O或P的一个或多个原子置换。实例包括其中1、2、3或4个环成员是氮原子；或0、1、2或3个环成员是氮原子且1个成员是氧或硫原子的环。

术语“杂芳烷基”是指含杂芳基取代基的C_1-6烷基。实例包括呋喃基甲基和吡啶基丙基。与分子其余部分的连接点应为烷基。

术语“杂芳基”是指通过除去杂芳环系统中环碳原子上的一个氢原子衍生的基团。典型的杂芳基包括呋喃基、噻吩基、吡咯基、_唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异_唑基、异噻唑基、_二唑基、三唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、中氮茚基、吲哚基、异吲哚基、苯并[b]呋喃基、苯并[b]噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、喹啉基、异喹啉基、肉啉基、phthalzinyl、喹唑啉基、喹喔啉基、1，8-二氮杂萘基、蝶啶基等。

术语“杂芳基-稠合环烷基”是指双环稠合的环系统基团，其中一个环是环烷基，另一个环是杂芳基。典型的杂芳基-稠合环烷基包括5，6，7，8-四氢-4H-环庚三烯并(b)噻吩基、5，6，7-三氢-4H-芳己并(cyclohexa)(b)噻吩基、5，6-二氢-4H-环戊二烯并(b)噻吩基等。

术语“杂芳氧基”是指被杂芳基例如吡啶基取代的氧原子团。期望与分子其余部分连接的连接点应通过氧原子。

术语“杂环基”是指通过除去一个碳或氮环原子上的一个氢原子衍生的饱和或部分不饱和单环环基。典型的杂环基包括2H-吡咯基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吡咯烷基、1，3-二氧杂环戊烷基、2-咪唑啉基(又称为4，5-二氢-1H-咪唑基)、咪唑烷基、2-吡唑啉基、吡唑烷基、四唑基、哌啶基、1，4-二_烷基、吗啉基、1，4-二噻烷基、硫代吗啉基、硫代吗啉基-1，1-二氧化物、哌嗪基、氮杂环庚烷基、六氢-1，4-二氮杂_基等。

术语“氧代基”是指氧原子团；所述氧原子具有两个与同一原子，最优选碳原子键合的开放化合价(open valencies)。氧代基是烷基的合适取代基。例如，具有氧代基取代基的丙烷是丙酮或丙醛。杂环也可被氧代基取代。例如具有氧代基取代基的_唑烷是_唑烷酮。

术语“取代”是指其中一个或多个氢原子被一个或多个官能团部分置换的母核分子。取代不限于母核分子，也可发生在取代基上，因此该取代基变为连接基团。

术语“独立选自”是指选自一组取代基的一个或多个取代基，其中这些取代基可相同或不同。

用于式I′FLT3抑制剂公开的取代基命名通过以下方法获得：先描述具有连接点的原子，然后沿着端链原子的方向从左向右描述连接基团原子，基本上如下所示：

(C_1-6)烷基C(O)NH(C_1-6)烷基(Ph)

或通过先描述端链原子，然后沿着具有连接点的原子的方向描述连接基团原子，基本上如下所示：

Ph(C_1-6)烷基酰氨基(C_1-6)烷基

其中任一个均指下式基团：

另外，从取代基引入环系统中的线表示可与任何合适的环原子连接的键。

在任何变量(例如R₄)在式I′FLT3抑制剂的任何实施方案中出现一次以上时，各定义应独立。

式I′FLT3抑制剂的实施方案

在式I′FLT3抑制剂的实施方案中：N-氧化物任选存在于一个或多个以下原子上：N-1或N-3(参见以下图1a的环编号)。

图1a

图1a说明本说明书中使用的编号为1-8的环原子。

在本发明的实施方案中，5位上的肟(oximine)基(-O-N＝C-)可以为E或Z构型。

优选的式I′FLT3抑制剂实施方案为式I′化合物，其中存在一个或多个以下限制条件：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基或杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、苯氧基、苯基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的哌啶酮基、任选被R₅取代的环杂二酮基、任选被R₅取代的杂环基、-COOR_y、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SR_y、-SOR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y、-NR_wSO₂R_x、-SO₃R_y-OSO₂NR_wR_x或-SO₂NR_wR_x；

R_w和R_x独立选自：氢、烷基、烯基、芳烷基或杂芳烷基，或R_w和R_x可任选结合在一起形成5元-7元环，所述环任选含有选自以下的杂部分：O、NH、N(烷基)、SO₂、SO或S；

R_y选自：氢、烷基、烯基、环烷基、苯基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R₅为独立选自以下的1、2或3个取代基：卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基、-C_(1-4)烷基-OH或烷基氨基；且

R₃为一个或多个独立选自以下的取代基：氢、烷基、烷氧基、卤素、烷氧基醚、羟基、硫基、硝基、任选被R₄取代的环烷基、任选被R₄取代的杂芳基、烷基氨基、任选被R₄取代的杂环基、-O(环烷基)、任选被R₄取代的吡咯烷酮基、任选被R₄取代的苯氧基、-CN、-OCHF₂、-OCF₃、-CF₃、卤代烷基、任选被R₄取代的杂芳氧基、二烷基氨基、-NHSO₂烷基、硫烷基或-SO₂烷基；其中R₄独立选自：卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-CO₂烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或烷基氨基。

其它优选的式I′FLT3抑制剂实施方案是式I′化合物，其中存在一个或多个以下限制条件：

r为1或2；

Z为NH或CH₂；

B为苯基或杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、苯氧基、苯基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的哌啶酮基、任选被R₅取代的环杂二酮基、任选被R₅取代的杂环基、-COOR_y、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SR_y、-SOR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y、-NR_wSO₂R_x、-SO₃R_y、-OSO₂NR_wR_x或-SO₂NR_wR_x；

R₃为独立选自以下的一个或多个取代基：氢、烷基、烷氧基、卤素、烷氧基醚、羟基、任选被R₄取代的环烷基、任选被R₄取代的杂芳基、任选被R₄取代的杂环基、-O(环烷基)、任选被R₄取代的苯氧基、任选被R₄取代的杂芳氧基、二烷基氨基或-SO₂烷基；其中R₄独立选自卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-CO₂烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或烷基氨基。

还其它优选的式I′FLT3抑制剂实施方案是式I′化合物，其中存在一个或多个以下限制条件：

r为1或2；

Z为NH或CH₂；

B为苯基或杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的杂环基、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y或-SO₂NR_wR_x；

尤其优选的式I′FLT3抑制剂实施方案是式I′化合物，其中存在一个或多个以下限制条件：

r为1；

Z为NH或CH₂；

B为苯基或杂芳基；

R₁为

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、杂芳基、任选被R₅取代的杂环基、-CONR_wR_x、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)或-N(R_w)C(O)OR_x；

R_w和R_x独立选自：氢、烷基、烯基、芳烷基或杂芳烷基，或R_w和R_x可任选结合在一起形成5元-7元环，所述环任选含有选自以下的杂部分：O、NH、N(烷基)、SO、SO₂或S；

R₅为独立选自以下的一个取代基：-C(O)烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或-C_(1-4)烷基-OH；且

R₃为独立选自以下的一个取代基：烷基、烷氧基、卤素、环烷基、杂环基、-O(环烷基)、苯氧基或二烷基氨基。

最尤其优选的式I′FLT3抑制剂实施方案是式I′化合物，其中存在一个或多个以下限制条件：

r为1；

Z为NH或CH₂；

B为苯基或吡啶基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、二烷基氨基、任选被R₅取代的杂环基、-CONR_wR_x、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)或-NR_wSO₂R_y；

R_w和R_x独立选自：氢、烷基、烯基、芳烷基、杂芳烷基，或R_w和R_x可任选结合在一起形成5元-7元环，所述环任选含有选自以下的杂部分：O、NH、N(烷基)、SO₂、SO或S；

R_y选自：氢、烷基、烯基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基或杂芳基；

R₅为独立选自以下的一个取代基：-C(O)烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或C_(1-4)烷基-OH；且

R₃为独立选自以下的一个取代基：烷基、烷氧基、杂环基、环烷基或-O(环烷基)。

式I′FLT3抑制剂还可存在药学上可接受的盐形式。

对于药物用途，式I′FLT3抑制剂化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。FDA批准的药学上可接受的盐形式(参见InternationalJ.Pharm.1986，33，201-217；J.Pharm.Sci，1977，Jan，66(1)，p1)包括药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。

药学上可接受的酸性/阴离子盐包括但不限于乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、樟磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、glyceptate、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰阿散酸盐、己基间苯二酚盐、哈胺青霉素G(hydrabamine)、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、甲苯磺酸盐和三乙基碘化物(triethiodide)。有机或无机酸也包括但不限于氢碘酸、高氯酸、硫酸、磷酸、丙酸、乙醇酸(glycolic)、甲磺酸、羟乙磺酸、草酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、糖精酸或三氟乙酸。

药学上可接受的碱性/阳离子盐包括但不限于铝、2-氨基-2-羟基甲基-丙-1，3-二醇(又称为三(羟甲基)氨基甲烷、三羟甲基氨基甲烷(tromethane)或″TRIS″)、氨、苯乍生、叔丁胺、钙、葡糖酸钙、氢氧化钙、氯普鲁卡因、胆碱、胆碱碳酸氢盐、氯化胆碱、环己胺、二乙醇胺、乙二胺、锂、LiOMe、L-赖氨酸、镁、葡甲胺、NH₃、NH₄OH、N-甲基-D-葡糖胺、哌啶、钾、叔丁醇钾、氢氧化钾(水溶液)、普鲁卡因、奎宁、钠、碳酸钠、2-乙基己酸钠(SEH)、氢氧化钠、三乙醇胺(TEA)或锌的盐。

在其范围内，本发明FLT3抑制剂包括式I′化合物的前药。一般而言，此类前药应是这些化合物的官能团衍生物，它们在体内易于转化为活性化合物。因此，在本发明治疗方法中，术语“给药”应包括用具体公开的式I′FLT3抑制剂，或尽管未具体公开某些本发明化合物但显然应包括在本发明范围内的化合物或其前药治疗、缓解或预防本文中所述综合征、病症或疾病的方法。选择和制备合适的前药衍生物的常规方法在例如″Design of Prodrugs″，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985中有描述。

本领域技术人员会认识到，式I′FLT3抑制剂在它们的结构中可具有一个或多个不对称碳原子。在其范围内，本发明将包括式I′ FLT3抑制剂的单一对映体、外消旋混合物及其中存在对映体过量的对映体混合物。

本文中使用的术语“单一对映体”定义为式I化合物及其N-氧化物、加成盐、季胺或生理上的功能衍生物可能具有的所有可能的纯手性形式。

可通过应用已知原理的技术得到立体化学纯异构体形式。可通过物理分离方法例如分级结晶和层析技术，分离非对映体，可通过用旋光性酸或碱选择性地使非对映体盐结晶，或通过手性层析使对映体相互分离。也可通过由合适的立体化学纯原料合成或用立体有择反应，制备纯立体异构体。

术语“异构体”是指具有相同组成和分子量但物理和/或化学性质不同的化合物。此类物质具有相同数目和种类的原子但结构不同。结构差异可以是因组成(几何异构体)或使偏振光平面旋转的能力(对映体)所致。

术语“立体异构体”是指原子空间排列不同的相同组成的异构体。对映体和非对映体是立体异构体的实例。

术语“手性”是指分子的结构特性，该特性使它无法叠加在它的镜像上。

术语“对映体”是指互为镜像但不能叠加的一对分子中的一个。

术语“非对映体”是指不为镜像的立体异构体。

符号″R″和″S″代表一个或多个手性碳原子周围取代基的构型。

术语“外消旋体”或“外消旋混合物”是指由等摩尔量的两个对映体组成的组合物，其中该组合物无光学活性。

术语“纯手性”是指对映体纯的状态。

术语“光学活性”是指纯手性分子或手性分子的非外消旋混合物使偏振光平面旋转的程度。

术语“几何异构体”是指取代基原子关于碳-碳双键、环烷基环或桥双环系统的取向不同的异构体。在碳-碳双键每侧的取代基原子(非H)可以是E或Z构型。在″E″(对侧)构型中，取代基位于碳-碳双键的对侧，在″Z″(同侧)构型中，取代基关于碳-碳双键的同一侧取向。与碳环连接的取代基原子(非氢)可以是顺或反式构型。在“顺式”构型中，取代基在环平面的同侧；在“反式”构型中，取代基在环平面的对侧。具有“顺”和“反”式分子混合物的化合物称为“顺/反”。

可以理解，用于制备本发明化合物的各种取代基立体异构体、几何异构体及其混合物有市售；可由市售原料合成制备，或可制备为异构体混合物，然后用本领域普通技术人员熟知的技术拆分异构体得到。

如本文中描述，异构体标示符″R″、″S″、″E″、″Z″、“顺”和“反”用于说明相对于母核分子的一个或多个原子构型，应按文献(IUPACRecommendations for Fundamental Stereochemistry(E部分)，Pure Appl.Chem.，1976，45：13-30)中定义的使用。

可通过异构体专一性合成或通过拆分异构体混合物，制备式I′FLT3抑制剂的单一异构体。常规拆分技术包括用旋光性盐形成异构体对的各异构体游离碱(然后分级结晶和使游离碱再生)；形成异构体对的各异构体的酯或酰胺(然后层析分离和除去手性助剂)，或用制备TLC(薄层层析)或手性HPLC柱拆分原料或终产物的异构体混合物。

另外，式I′FLT3抑制剂还可具有一种或多种多晶型或无定形结晶形式，并且它们因此将包括在本发明范围内。另外，某些式I′FLT3抑制剂还可与例如普通有机溶剂或水(即水合物)形成溶剂合物。本文中使用的术语“溶剂合物”表示本发明化合物与一个或多个溶剂分子的物理缔合物。该物理缔合涉及包括氢键在内的各种程度的离子和共价键合。在某些情况中，溶剂合物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子结合至结晶固体的晶格中时。术语“溶剂合物”应包括溶液相和可分离的溶剂合物。合适溶剂合物的非限定性实例包括乙醇化物、甲醇化物等。

在其范围内，本发明将包括本发明式I′FLT3抑制剂的溶剂合物。因此，在本发明的治疗方法中，术语“给药”、 “给予”应包括用具体公开的式I′FLT3抑制剂，或尽管未具体公开某些本发明化合物但显然应包括在本发明范围内的化合物或其溶剂合物治疗、缓解或预防本文中所述综合征、病症或疾病的方法。

可按照将三价氮转化为其N-氧化物形式的已知技术方法，将式I′FLT3抑制剂转化为相应的N-氧化物形式。通常可通过使式I′原料与合适的有机或无机过氧化物反应，进行所述N-氧化反应。合适的无机过氧化物包括例如过氧化氢；碱金属或碱土金属过氧化物例如过氧化钠、过氧化钾；合适的有机过氧化物可包括过氧酸例如过氧苯甲酸或卤代过氧苯甲酸，例如3-氯过氧苯甲酸；过氧链烷酸例如过氧乙酸；烷基氢过氧化物例如叔丁基氢过氧化物。合适的溶剂是例如水；低级醇例如乙醇等；烃例如甲苯；酮例如2-丁酮；卤代烃例如二氯甲烷，和此类溶剂的混合物。

某些式I′FLT3抑制剂还可存在它们的互变异构形式。尽管未在本申请中明确说明，但此类形式应包括在本发明范围内。

式I′FLT3抑制剂的制备

在制备式I′FLT3抑制剂的任何过程中，可能必需和/或需要保护任何有关分子上的敏感或活性基团。可通过常规保护基团例如在Protecting Groups，P.Kocienski，Thieme Medical Publishers，2000；和T.W.Greene & P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，Wiley Interscience，1999中阐述的那些，完成这种保护。可在便利的后续阶段，用本领域已知的方法除去保护基团。

可通过本领域技术人员已知的方法制备式I′FLT3抑制剂。以下反应流程仅用于代表本发明的实例，并不表示对本发明的限制。

通用反应流程

本领域技术人员可通过已知方法制备式I′FLT3抑制剂化合物。以下反应流程仅用于代表本发明的实例，并不表示对本发明的限制。

可通过流程1中所述通用合成路线所示方法合成式I′FLT3抑制剂化合物，其中B、Z、r、R₁和R₃定义同式I′。在Vilsmeier反应条件(DMF/POCl₃)下处理嘧啶-4，6-二酚II′，可得到4，6-二氯-嘧啶-5-甲醛III′，然后用氨处理，可得到关键中间体4-氨基-6-氯-嘧啶-5-甲醛IV’。在25℃-150℃下，在溶剂例如DMSO中，在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用环胺V’处理IV’，可得到嘧啶VI′。在溶剂例如MeOH中，用合适的R₁ONH₂处理VI′，可得到终产物I′。尽管只描绘了反式式I′，但预期顺、反几何异构体均可在最后的反应中形成。异构体可通过柱层析分离，且可通过肟的相应次甲基氢H_a的¹H NMR化学位移，用光谱方法鉴别(图1b)。

“反式”异构体 “顺式”异构体

图1b

发现，主要反式异构体的¹H NMR图谱中次甲基氢H_a特征峰的化学位移位于比顺式异构体次甲基氢H_a化学位移更低的场。反式和顺式肟异构体的H_a氢的¹H化学位移差异可参考本领域已知的相关文献(Biorg.Med.Chem.Lett.2004，14，5827-5830)。

流程1

R₁ONH₂试剂有市售或可通过流程2a中所述反应顺序制备，其中R₁定义同式I′。在溶剂例如DMSO中，用合适的亲电试剂R₁LG和碱例如KOH，其中LG可以是离去基团例如溴或碘，将亚苄基VII′烷基化，可得到亚苄基中间体VIII′，然后在酸性条件例如4N HCl下处理，可得到需要的R₁ONH₂试剂。制备R₁ONH₂试剂的相关方法如流程2b中所述，其中n、R₁和R_a定义同式I′。可在溶剂例如DMSO中，用合适的亲电试剂PGO(CH₂)_nLG，其中PG是已知的醇保护基团，LG可以是离去基团例如溴或碘；和碱例如KOH，将亚苄基VII′烷基化，得到O-烷基化亚苄基。可在标准条件下，脱去本领域技术人员已知的醇保护基团，将醇转化为本领域技术人员已知的合适的离去基团例如甲磺酸酯，然后用合适的亲核性杂环、杂芳基、胺、醇、磺酰胺或硫醇进行SN₂置换反应，然后通过酸催化除去亚苄基，得到R₁ONH₂试剂。如果R_a亲核试剂是硫醇，可进一步将该硫醇氧化，得到相应的亚砜和砜。如果R_a亲核试剂是氨基，则可用合适的酰化试剂或磺化试剂将氮酰化，得到相应的酰胺、氨基甲酸酯、脲和磺酰胺。如果期望的R_a为COOR_y或CONR_wR_x，则可由相应的羟基衍生这些基团。可在本领域中已知条件下，将羟基氧化为酸，然后形成酯或酰胺，得到其中R_a为COOR_y或CONR_wR_x的实例。

流程2a

流程2b

其中：

LG为离去基团

Nuc为亲核试剂

PG为保护基团

可按照流程3a中所述反应顺序，制备胺试剂V’，其中Z为NH或N(烷基)，B、r和R₃定义同式I′。可用合适的其中LG可以是对硝基苯氧基、氯、溴或咪唑的酰化试剂X′将N-Boc二胺IX′酰化，得到酰化中间体XI′。可在酸性条件下，除去N-Boc保护基团，得到需要的胺V’。酰化试剂X′有市售或可按流程3a中所述制备。可在碱例如三乙胺的存在下，用合适的酰化试剂例如羰基二咪唑或氯甲酸对硝基苯酯(其中LG可以是氯、咪唑或对硝基苯氧基)处理合适的R₃BZH，其中Z为NH或N(烷基)，得到X′。许多R₃BZH试剂有市售或可通过多种已知方法制备(例如Tet Lett 1995，36，2411-2414)。流程3b中所示为得到V’的备选方法，其中Z为CH₂，B、r和R₃定义同式I。可用标准偶合试剂例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1-羟基苯并三唑(HOBT)，使环胺IX′与合适的R₃BCH₂CO₂H偶合，得到酰化中间体XI′。可在酸性条件下除去N-Boc保护基团，得到需要的胺V’。

流程3a

流程3b

或者，可按照流程4中所述通用合成路线所示方法，合成式I′FLT3抑制剂化合物，其中B、Z、r、R₁和R₃定义同式I′。可在溶剂例如乙腈中，在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用合适的二胺IX′处理4-氯嘧啶IV’，得到嘧啶XII′。可在溶剂如MeOH中，用合适的R₁ONH₂处理5-甲醛嘧啶XII′，得到中间体XIII′，然后通过酸处理脱去N-Boc保护基团，得到二氨基嘧啶XIV’。在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用合适的试剂X′使XIV’酰化，其中Z为NH或N(烷基)，LG可以是氯、咪唑或对硝基苯氧基，或当Z为CH₂时，可通过用标准偶合试剂例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或1-羟基苯并三唑(HOBT)，使XIV’与合适的R₃BCH₂CO₂H偶合，得到终产物I′。尽管只描绘了反式式I′，但按照该反应顺序，预期可形成顺式和反式两种几何异构体。异构体可通过柱层析分离，并可通过光谱鉴别。

流程4

LG为离去基团

或者，可按照流程5中所述通用合成路线所示方法，合成式I′FLT3抑制剂化合物，其中Z为NH，B、r、R₁和R₃定义同式I。可在溶剂例如乙腈中，在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用合适的二胺IX′处理4-氯嘧啶IV’，得到嘧啶XII′。可在溶剂例如MeOH中，用合适的R₁ONH₂处理5-甲醛嘧啶XII′，得到中间体XIII′，然后可通过酸处理脱去N-Boc保护基团，得到二氨基嘧啶XIV’。在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用合适的R₃BNCO将XIV’酰化，得到终产物I′。尽管只描绘了反式式I′，但按照该反应顺序，预期可形成顺式和反式两种几何异构体。异构体可通过柱层析分离，并可通过光谱鉴别。

流程5

流程6中所述通用合成路线所示为制备式I′FLT3抑制剂化合物的备选方法，其中Z为NH或N(烷基)，B、r、R₁和R₃定义同式I′。可在溶剂例如乙腈中，在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用合适的二胺IX′处理4-氯嘧啶IV’，得到嘧啶XII′。可通过酸处理脱去N-Boc保护基团，得到二氨基嘧啶XV’，然后在碱例如二异丙基乙胺的存在下，用合适的试剂X′酰化，其中LG可以是氯、咪唑或对硝基苯氧基，可得到嘧啶XVI′。可在溶剂例如MeOH中，用合适的R₁ONH₂处理5-甲醛嘧啶XVI′，得到终产物I′。尽管只描绘了反式式I′，但在最后反应中预期可形成顺式和反式两种几何异构体。异构体可通过柱层析分离，并可通过光谱鉴别。

流程6

LG为离去基团

式I′的代表性FLT3抑制剂

下文中提供通过前述方法合成的式I′的代表性FLT3抑制剂。具体化合物的合成实施例在下文中给出。优选的化合物是1、2、7、12、13、16、17、18、19、27号化合物；尤其优选1、2、7、12和17号化合物。

实施例1

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.4，6-二氯-嘧啶-5-甲醛

在0℃下，将DMF(3.2mL)和POCl₃(10mL)的混合物搅拌1h，用4，6-二羟基嘧啶(2.5g，22.3mmol)处理，在室温下搅拌0.5h。将非均匀混合物加热回流3h，将挥发物减压除去。将残渣倾入冰水中，用乙醚萃取6次。将有机相用NaHCO₃水溶液洗涤，经Na₂SO₄干燥，浓缩，得到黄色固体(3.7g，95％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ10.46(s，1H)，8.90(s，1H)，

b.4-氨基-6-氯-嘧啶-5-甲醛

向4，6-二氯-嘧啶-5-甲醛(1g，5.68mmol)的甲苯(100mL)溶液中鼓泡通入氨10min，将溶液在室温下搅拌过夜。将黄色沉淀滤出，用EOAc洗涤，真空干燥，得到纯产物(880mg，99％)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ10.23(s，1H)，8.72(br，1H)，8.54(br，1H)，8.38(s，1H).

方法A：

a.4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯

向4-氨基-6-氯-嘧啶-5-甲醛(446.8mg，2.85mmol)的CH₃CN(2mL)悬浮液中依次加入哌嗪-1-甲酸叔丁酯(583.1mg，3.13mmol)、DIEA(736.7mg，5.7mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌。2h后，将其冷却至室温，将沉淀滤出，用CH₃CN(3×4mL)洗涤，真空干燥，得到标题化合物，为白色粉末(818mg，93.6％)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ9.75(s，1H)，8.28(br，1H)，8.07(s，1H),7.83(br，1H)，3.59(m，4H)，3.43(m，4H)，1.41(s，9H)；

LC/MS(ESI)C₁₄H₂₂N₅O₃(MH)⁺理论值308.2，实测值308.2。

b.4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯

将4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(59.1mg，0.19mmol)和MeONH₂·HCl(52mg，0.62mmol)在MeOH(1.5mL)中的混合物在75℃下搅拌0.5h，将溶剂减压蒸发。粗残渣经硅胶闪柱层析(EtOAc为洗脱液)纯化，得到标题化合物，为白色固体(48mg，74.6％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.19(8，1H)，8.11(s，1H)，3.95(s，3H)，3.53(t，J＝5.10Hz，4H)，3.33(t，J＝5.10Hz，4H)，1.47(s，9H)；

LC/MS(ESI)C₁₅H₂₅N₆O₃(MH)⁺理论值337.2，实测值337.3。

c.4-氨基-6-哌嗪-1-基-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟三氟乙酸盐

将4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(22.1mg，0.066mmol)用50％TFFA/CH₂Cl₂(4mL)处理。14h后，将混合物蒸发，真空干燥，得到标题化合物。

¹H NMR(CD₃OD)δ 8.29(s，1H)，8.15(s，1H)，4.00(s，3H)，3.93(t.J＝5.16Hz，4H)，3.35(t，J＝5.37Hz，4H)；

LC/MS(ESI)C₁₀H₁₇N₆O(MH)⁺理论值237.1，实测值237.2。

d.(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

在短暂冰浴冷却下，搅拌下，在～1min内，向4-异丙氧基苯胺(9.06g，60.0mmol)的CH₂Cl₂(120mL)和吡啶(30mL)溶液中分次加入氯甲酸4-硝基苯酯(10.9g，54.0mmol)。在室温下搅拌1h后，将均相溶液用CH₂Cl₂(300mL)稀释，用0.6MHCl(1×750mL)和0.025MHCl(1×1L)洗涤。将有机层干燥(Na₂SO₄)，浓缩，得到标题化合物，为浅紫色-白色固体(16.64g，98％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.31-8.25(m，2H)，7.42-7.32(m，4H)，7.25-7.20(m，2H)，6.93(br s，1H)，2.90(sep，J＝6.9Hz，1H)，1.24(d，J＝6.9Hz，6H).

LC/MS(ESI)C₁₆H₁₇N₂O₅(MH)⁺理论值317.1，实测值633.2(2MH)⁺。

e.N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

向4-氨基-6-哌嗪-1-基-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟三氟乙酸盐(23mg，0.066mmol)和(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯(22.8mg，0.072mmol)在CH₃CN(1.5mL)中的混合物中加入DIEA(17mg，0.13mmol)。搅拌下，将混合物加热回流3h，将溶剂减压蒸发。黄色残渣经硅胶闪柱层析(EtOAc为洗脱液)纯化，得到标题化合物，为白色固体(12.7mg，46.8％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.19(s，1H)，8.12(s，1H)，7.21(d，J＝8.93Hz，2H)，6.81(d，J＝8.94Hz，2H)，6.45(br，1H)，4.46(m，1H)，3.96(s，3H)，3.58(m，4H)，3.42(m，4H)，1.30(d,J＝6.06Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₀H₂₈N₇O₃(MH)⁺理论值414.2，实测值414.2。

方法B：

f.4-(4-异丙氧基-苯基氨基甲酰基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯

将哌嗪-1-甲酸叔丁酯(267.4mg，1.44mmol)和(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯(432.1mg，1.36mmol)在CH₃CN(2mL)中的混合物加热回流2h，冷却至室温。将沉淀滤出，用CH₃CN(3×3mL)洗涤，真空干燥，得到产物，为白色固体(459mg，93％)。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.20(d，J＝8.81Hz，2H)，6.82(d，J＝8.93Hz，2H)，4.52(sep，J＝6.03Hz，1H)，3.48(m，8H)，1.48(s，9H)，1.27(d，J＝6.04Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₁₉H₃₀N₃O₄(MH)⁺理论值364.2，实测值364.4。

g.N-(4-异丙氧基-苯基)-哌嗪-1-甲酰胺

将4-(4-异丙氧基-苯基氨基甲酰基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(169mg，0.47mmol)用50％TFA/CH₂Cl₂(15mL)处理。2h后，减压蒸发，将残渣用2MNH₃的MeOH溶液中和。将溶剂在高真空下蒸发，得到标题化合物(119mg，97％)。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.22(d，J＝8.83Hz，2H)，6.83(d，J＝8.92Hz，2H)，4.52(sep，J＝6.02Hz，1H)，3.76(t，J＝4.98Hz，4H)，3.24(t，J＝4.99Hz，4H)，1.27(d，J＝6.03Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₁₄H₂₂N₃O₂(MH)⁺理论值264.2，实测值264.3。

h.N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

向N-(4-异丙氧基-苯基)-哌嗪-1-甲酰胺(302.1mg，1.15mmol)和4-氨基-6-氯-嘧啶-5-甲醛(157mg，1.0mmol)在DMSO(2mL)中的混合物中加入DIEA(258.5mg，2.0mmol)。将混合物在100℃下连续搅拌2h，加入MeONH₂.HCl(167mg，2.0mmol)。将得到的混合物在100℃下加热0.5h。将其用水稀释，用CH₂Cl₂萃取。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，减压浓缩。粗油状物经硅胶闪柱层析(EtOAc为洗脱液)纯化，得到标题化合物(45mg，11％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.19(s，1H)，8.12(s，1H)，7.21(d，J＝8.93Hz，2H)，6.81(d，J＝8.94Hz，2H)，6.45(br，1H)，4.46(m，1H)，3.96(s，3H)，3.58(m，4H)，3.42(m，4H)，1.30(d，J＝6.06Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₀H₂₈N₇O₃(MH)⁺理论值414.2，实测值414.4。

实施例2

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

a.4-氨基-6-哌嗪-1-基-嘧啶-5-甲醛三氟乙酸盐

将4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(235mg，0.76mmol)用50％TFA/CH₂Cl₂(10mL)处理，将混合物搅拌过夜。减压蒸发，得到白色固体，其为纯产物，可直接用于下一步反应。

¹H NMR(CD₃OD)δ9.83(s，1H)，8.29(s，1H)，4.22(t，J＝5.23Hz，4H)，3.42(t，J＝5.42Hz，4H)；

LC/MS(ESI)C₉H₁₄N₅O(MH)⁺理论值208.1，实测值208.1。

b.N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺

向4-氨基-6-哌嗪-1-基-嘧啶-5-甲醛三氟乙酸盐(0.76mmol)和(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯(253.7mg，0.80mmol)在CH₃CN中的混合物中加入DIEA(396mg，3.06mmol)。将混合物在100℃下加热2b，冷却至室温。将沉淀过滤，用CH₃CN(2×2mL)和EtOAc(2×1mL)洗涤，真空干燥，得到标题化合物，为浅黄色固体(120mg，41％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ9.88(s，1H)，8.73(br，1H)，8.17(s，1H)，7.22(d，J＝8.97Hz，2H)，6.84(d，J＝8.98Hz，2H)，6.50(br，1H)，6.25(br，1H)，4.49(m，1H)，3.85(m，4H)，3.66(m，4H)，1.31(d，J＝6.06Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₁₉H₂₅N₆O₃(MH)⁺理论值385.2，实测值385.2。

c.二苯基-甲酮O-(2-吗啉-4-基-乙基)-肟

在室温下，将N-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐(2.10g，11mmol)分次加入KOH粉末(1.24g，22mmol)和二苯甲酮肟(1.97g，10mmol)的DMSO(23mL)悬浮液中。将反应混合物在室温下连续搅拌3天，用水稀释，用乙醚萃取。将有机相用盐水洗涤，干燥(Na₂SO₄)，蒸发，得到几乎纯的产物。

¹H NMR(CDCl₃)δ7.32-7.50(m，10H)，4.35(t，J＝5.59Hz，2H)，3.69(t，J＝4.52Hz，4H)，2./4(m，2H)，2.49(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₁₉H₂₃N₂O₂(MH)⁺理论值311.2，实测值311.2。

d.O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺二盐酸盐

搅拌下，将二苯基-甲酮O-(2-吗啉-4-基-乙基)-肟(2.5g，8.06mmol)的6NHCl(13.5mL)悬浮液加热回流。2h后，将混合物冷却至室温，用EtOAc萃取几次。将水相真空蒸发至干，得到标题化合物(740mg，63％)。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ4.45(t，J＝4.49Hz，2H)，3.89(t，J＝4.48Hz，4H)，3.47(t，J＝4.64Hz，2H)，3.29(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₆H₁₅N₂O₂(MH)⁺理论值147.1，实测值147.1。

e.N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

将N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺(20.9mg，0.054mmol)和O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺二盐酸盐(12mg，0.054mmol)在MeOH(1mL)中的混合物在100℃下加热0.5h，将溶剂除去。使残渣在EtOAc和水之间分配。将有机萃取液干燥(Na₂SO₄)，蒸发，残渣经制备TLC(5％MeOH/EtOAc)纯化，得到需要的产物，为白色固体(16.4mg，58.9％)。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.24(s，1H)，8.08(s，1H)，7.21(d，J＝8.79Hz，2H)，6.83(d，J＝9.03Hz，2H)，4.52(m，1H)，4.34(t，J＝5.63Hz，2H)，3.71(t，J＝4.84Hz，4H)，3.63(m，4H)，3.43(m，4H)，2.75(t，J＝5.60Hz，2H)，2.57(t，J＝4.96Hz，4H)，1.28(d，J＝6.05Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₅H₃₇N₈O₄(MH)⁺理论值513.2，实测值513.3。

实施例3

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(3-羟基-丙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

a.二苯基-甲酮O-(3-羟基-丙基)-肟

按照实施例2c的合成方法制备。

¹H NMR(CDCl₃)δ7.30-7.52(m，10H)，4.35(t，J＝5.83Hz，2H)，3.73(t，J＝5.85Hz，2H)，1.95(m，2H).

b.3-氨基氧基-丙-1-醇盐酸盐

按照实施例2d的合成方法制备。

¹H NMR(CD₃OD)δ4.26(t，J＝6.75Hz，2H)，3.66(t，J＝6.11Hz，2H)，2.51(m，2H).

c.N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(3-羟基-丙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

按实施例2e中所述制备，不同之处在于用3-氨基氧基-丙-1-醇代替O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.22(s，1H)，8.08(s，1H)，7.21(d，J＝8.95Hz，2H)，6.83(d，J＝9.01Hz，2H)，4.52(m，1H)，4.28(t，J＝6.48Hz，2H)，3.69(t，J＝6.35Hz，2H)，3.63(m，4H)，3.43(m，4H)，1.94(m，2H)，1.28(d，J＝6.04Hz，6H).

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₂N₇O₄(MH)⁺理论值458.2，实测值458.2。

实施例4

N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]+哌嗪-1-甲酰胺

a.(4-哌啶-1-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

基本上按实施例1d中所述制备，用4-哌啶子基苯胺和甲苯溶剂。经硅胶闪层析(5∶2己烷/EtOAc→EtOAc→9∶1 DCM/MeOH)纯化，得到目标化合物，为灰色粉末(1.416g，73％)。

¹HNMR(CDCl₃)δ8.31-8.25(m，2H)，7.42-7.36(m，2H)，7.34-7.28(m，2H)，6.97-6.90(m，2H)，6.82(br s，1H)，3.17-3.09(m，4H)，1.77-1.66(m，4H)，1.63-1.54(m，2H).

LC/MS(ESI)C₁₈H₁₉N₃O₄(MH⁺)理论值342.1，实测值342.2。

b.N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用(4-哌啶-1-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(8，1H)，8.14(s，1H)，7.29(m，4H)，7.07(br，2H)，6.46(br，1H)，3.97(s，3H)，3.61(m，4H)，3.46(m，4H)，3.15(m，4H)，1.52-1.86(m，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₀H₃₁N₈O₂(MH)⁺理论值439.3，实测值439.2。

实施例5

N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.(4-吗啉-4-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

在通风下，在冰浴上，将4-吗啉代苯胺(1.01g，5.68mmol)和CaCO₃(743mg，7.42mmol)(10微米粉末)的混合物用氯甲酸4-硝基苯酯(1.49g，7.39mmol)的CH₂Cl₂(7.5mL)溶液处理。将该易于搅拌的粘稠反应浆状物在冰浴上搅拌1-2min，然后在室温下搅拌1h。然后将浆状物用9∶1的CH₂Cl₂/MeOH(7.5mL)稀释，直接加载在硅胶闪柱上(95∶5 CH₂Cl₂/MeOH)纯化，得到0.7g物质。通过用热甲苯(25mL)研磨，将该物质进一步纯化，得到标题化合物，为浅橄榄绿色粉末(444mg，23％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.31-8.25(m，2H)，7.42-7.31(m，4H)，6.95-6.85(m，3H)，3.89-3.84(m，4H)，3.16-3.11(m，4H).

b.N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用(4-吗啉-4-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.13(s，1H)，7.22(m，4H)，6.87(br，2H)，6.26(br，1H)，3.97(s，3H)，3.86(t，J＝4.80Hz，4H)，3.60(m，4H)，3.47(t，J＝4.47Hz，4H)，3.10(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₂₉N₈O₃(MH)⁺理论值441.2，实测值441.3。

实施例6

N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.2-环丁氧基-5-硝基-吡啶

在0℃下，将2-氯-5-硝基吡啶(7.12g，45.0mmol)和环丁醇(3.40g，47.2mmol)在THF(30mL)中的混合物剧烈搅拌，同时，在通风下，在～10-20s内，分三次加入NaH(1.18g，46.7mmol)(小心：有大量气体产生)。再用THF(5mL)将反应残渣冲洗下来，然后在冰浴中，在正氩气压下，再搅拌1-2分钟。然后撤去冰浴，将棕色均相溶液搅拌1h。将反应混合物在80℃下减压浓缩，溶于0.75MEDTA(四钠盐)(150mL)，用CH₂Cl₂(1×100mL，1×50mL)萃取。将合并的有机层干燥(Na₂SO₄)，浓缩，溶于MeOH(2×100mL)，在60℃下减压浓缩，得到标题化合物，为稠性深琥珀色油状物，静置后结晶(7.01g，80％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ9.04(dd，J＝2.84和0.40Hz，1H)，8.33(dd，J＝9.11和2.85Hz，1H)，6.77(dd，J＝9.11和0.50Hz，1H)，5.28(m，1H)，2.48(m，2H)，2.17(m，2H)，1.87(m，1H)，1.72(m，1H).

b.6-环丁氧基-吡啶-3-基胺

将含10％w/wPd/C(485mg)的烧瓶用氩气缓慢吹扫，同时沿着瓶壁缓慢加入MeOH(50mL)，然后按～5mL份加入按前一步骤制备的2-环丁氧基-5-硝基-吡啶(4.85g，25mmol)的MeOH(30mL)溶液(小心：在空气的存在下，挥发性有机物大量加入Pd/C可引起燃烧)。然后将烧瓶排空一次，在室温下，在H₂球压力下搅拌2h。然后将反应物过滤，将澄清琥珀色滤液浓缩，溶于甲苯(2×50mL)以除去残余MeOH，并减压浓缩，得到粗标题化合物，为半透明深棕色油状物，带有微弱甲苯气味(4.41g)。

¹H NMR(CDCl₃)δ7.65(d，J＝3.0Hz，1H)，7.04(dd，J＝8.71和2.96Hz，1H)，6.55(d，J＝8.74Hz，1H)，5.04(m，1H)，2.42(m，2H)，2.10(m，2H)，1.80(m，1H)，1.66(m，1H).

LC-MS(ESI)C₉H₁₃N₂O(MH⁺)理论值165.1，实测值165.2。

c.(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

在室温下，将在前一步中制备的6-环丁氧基-吡啶-3-基胺(4.41g，25mmol)和CaCO₃(3.25g，32.5mmol)(10微米粉末)的混合物用氯甲酸4-硝基苯酯(5.54g，27.5mmol)的甲苯(28mL)均相溶液一次性处理，搅拌2h。然后将反应混合物直接加载在硅胶闪柱上(95∶5DCM/MeOH→9∶1DCM/MeOH)纯化，得到5.65g物质，通过用热甲苯(1×200mL)研磨将其进一步纯化，得到标题化合物(4.45g，54％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.32-8.25(m，2H)，8.12(d，1H)，7.81(m，1H)，7.42-7.36(m，2H)，6.85(brs，1H)，6.72(d，1H)，5.19-5.10(m，1H)，2.50-2.40(m，2H)，2.19-2.07(m，2H)，1.89-1.79(m，1H)，1.75-1.61(m，1H).

LC-MS(ESI)C₁₆H₁₅N₃O₅(MH⁺)理论值330.1，实测值330.1。

d.N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.55(s，1H)，8.14(s，1H)，8.12(d，J＝2.74Hz，1H)，8.10(s，1H)，7.73(dd，J＝8.72和2.72Hz，1H)，7,48(br，1H)，6.69(d，J＝8.86Hz，1H)，5.05(m，1H)，3.91(s，3H)，3.54(m，4H)，3.34(m，4H)，2.36(m，2H)，2.00(m，2H，1.75(m，1H)，1.61(m，1H)；

LC/MS(ESI)C₂₀H₂₇N₈O₃(MH)⁺理论值4272，实测值427.2。

实施例7

4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟

向按实施例1c制备的粗4-氨基-6-哌嗪-1-基-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟三氟乙酸盐(45.3mg，0.13mmol)和(4-异丙基-苯基)-乙酸(23mg，0.13mmol)在无水THF(2mL)中的混合物中依次加入HOBT(25.7mg，0.17mmol)、HBTU(63.6mg，0.17mmol)和DIEA(83.4mg，0.65mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，减压浓缩。将粗物质直接加载在制备TLC板上(5％MeOH/EtOAc)纯化(8.6mg，16.7％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.16(s，1H)，8.05(s，1H)，7.17(m，4H)，3.95(s，3H)，3.75(m，2H)，3.73(s，2H)，3.55(t，J＝4.81Hz，2H)，3.38(t，J＝4.98Hz，2H)，3.26(t，J＝4.79Hz，2H)，2.89(sep，J＝6.81Hz，1H)，1.24(d，J＝6.92Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₂₉N₆O₂(MH)⁺理论值397.2，实测值397.3。

实施例8

N-(4-异丙基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.(4-异丙基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

在短暂冰浴冷却下，搅拌下，在～30秒内，向4-异丙基苯胺(3.02g，22.3mmol)的CH₂Cl₂(40mL)和吡啶(10mL)溶液中分次加入氯甲酸4-硝基苯酯(4.09g，20.3mmol)。在室温下搅拌1h后，将均相溶液用CH₂Cl₂(100mL)稀释，用0.6MHCl(1×250mL)、0.025MHCl(1×400mL)、水(1×100mL)和1MNaHCO₃(1×100mL)洗涤。将有机层干燥(Na₂SO₄)，浓缩，得到标题化合物，为浅桃红色固体(5.80g，95％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.31-8.25(m，2H)，7.42-7.32(m，4H)，7.25-7.20(m，2H)，6.93(brs，1H)，2.90(h，J＝6.9Hz，1H)，1.24(d，J＝6.9Hz，6H).

LCMS(ESI)C₁₆H₁₆N₂O₄(2MH)⁺理论值601.2，实测值601.3。

b.N-(4-异丙基-苯基)-哌嗪-1-甲酰胺

将哌嗪-1-甲酸叔丁酯(186mg，1.0mmol)和(4-异丙基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯(300mg，1.0mmol)在CH₃CN(1.5mL)中的混合物加热回流2h，减压浓缩。将残渣用50％TFA/CH₂Cl₂(5mL)处理，将溶液搅拌过夜。将有机溶剂蒸发，将残渣用2MNH₃的MeOH溶液中和。溶剂蒸发后，使残渣在EtOAc和水之间分配，将有机相干燥，浓缩。得到的物质经硅胶闪柱层析(EtOAc→10％MeOH/EtOAc)纯化，得到标题化合物(126mg，51％)。

¹H NMR(CD₃OD)δ7.25(d，J＝8.53Hz，2H)，7.15(d，J＝8.69Hz，2H)，3.75(t，J＝5.17Hz，4H)，2.85(sep，J＝6.91Hz，1H)，1.21(d，J＝6.93Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₁₄H₂₂N₃O(MH)⁺理论值248.2，实测值248.2。

c.N-(4-异丙基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

按照1h的合成方法制备，用N-(4-异丙基-苯基)-哌嗪-1-甲酰胺代替N-(4-异丙氧基-苯基)-哌嗪-1-甲酰胺。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.20(s，1H)，8.08(s，1H)，7.25(d，J＝8.63Hz，2H)，7.14(d，J＝8.35Hz，2H)，3.96(s，3H)，3.64(m，4H)，3.42(m，4H)，2.85(sep，J＝6.92Hz，1H)，1.22(d，J＝6.93Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₀H₂₈N₇O₂(MH)⁺理论值398.2，实测值398.3。

实施例9

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺(-C＝N-O-反式构型)

a.4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(-C＝N-O-反式构型)

将4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(135.1mg，0.44mmol)和EtONH₂·HCl(128.6mg，1.32mmol)在MeOH(1.5mL)中的混合物在90℃下搅拌0.5h，将溶剂减压除去。使残渣在CH₂Cl₂和水之间分配，将有机相干燥(Na₂SO₄)。将溶剂蒸发，得到白色固体，经¹HNMR(CDCl₃)证实，其为两种异构体(比例2∶1)的混合物。经制备TLC(EtOAc为洗脱液)纯化，得到两种纯异构体。主要的异构体归属为反式异构体(-C＝N-O-构型)(87.7mg，56.9％)。

¹HNMR(CDCl₃)δ8.13(s，1H)，8.04(s，1H)，4.21(q，J＝7.06Hz，2H)，3.54(m，8H)，1.47(s，9H)，1.33(t，J＝7.04Hz，3H)；

LC/MS(ESI)C₁₆H₂₇N₆O₃(MH)⁺理论值351.2，实测值351.3。

b.4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(-C＝N-O-顺式构型)

按实施例9a所述制备。其与次要异构体相对应，归属为顺式异构体(-C＝N-O-构型)(40mg，26％)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.13(s，1H)，7.17(s，1H)，4.33(q，J＝7.17Hz，2H)，3.65(m，4H)，3.53(m，4H)，1.48(s，9H)，1.35(t，J＝7.04Hz，3H)；

LC/MS(ESI)C₁₆H₂₇N₆O₃(MH)⁺理论值351.2，实测值351.3。

c.N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺(-C＝N-O-反式构型)

将4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(反式异构体)(36.8mg，0.105mmol)用50％TFA/CH₂Cl₂(1.3mL)处理2h，将溶剂减压除去。将得到的物质再溶于CH₃CN(2mL)，与(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯(36.5mg，0.12mmol)和DIEA(54.3mg，0.42mmol)混合。将反应混合物在95℃下加热1h，浓缩，残渣经硅胶闪柱层析(EtOAc→5％MeOH/EtOAc)纯化，得到标题化合物，为白色固体(14.4mg，32％)。

¹HNMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.15(s，1H)，7.23(d，J＝8.88Hz，2H)，6.84(d，J＝8.92Hz，2H)，6.30(br，1H)，4.49(sep，J＝6.08Hz，1H)，4.21(q，J＝7.05Hz，2H)，3.61(m，4H)，3.45(m，4H)，1.34(t，J＝7.18Hz，3H)，1.32(d，J＝6.30Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₃₀N₇O₃(MH)⁺理论值428.2，实测值428.3。

实施例10

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺(-C＝N-O-顺式构型)

按实施例9c中所述制备，不同之处在于用4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯的顺式异构体代替其反式异构体。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.24(s，1H)，7.27(s，1H)，7.22(d，J＝8.97Hz，2H，6.84(d，J＝8.96Hz，2H)，6.22(br，1H)，5.60(br，2H)，4.48(sep，J＝6.19Hz，1H)，4.33(q，J＝7.06Hz，2H)，3.57(m，8H)，1.36(t，J＝7.08Hz，3H)，1.31(d，J＝6.05Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₃₀N₇O₃(MH)⁺理论值428.2，实测值428.3。

实施例11

N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

按实施例9c中所述制备，不同之处在于用(4-哌啶-1-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.15(s，1H)，7.27(m，4H)，7.04(br，2H)，6.43(br，1H)，4.21(q，J＝7.07Hz，2H)，3.62(m，4H)，3.45(t，J＝4.82Hz，4H)，3.13(m，4H)，1.54-1.84(m，6H)，1.34(t，J＝7.06Hz，3H)；

LC/MS(ESI)C₂₃H₃₃N₈O₂(MH)⁺理论值453.3，实测值453.3。

实施例12

N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

按实施例9c中所述制备，不同之处在于用(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.15(s，1H)，7.96(d，J＝2.65Hz，1H)，7.73(dd，J＝8.84和2.74Hz，1H)，7.26(br，2H)，6.66(d，J＝9.03Hz，1H)，6.27(br，1H)，5.10(m，1H)，4.21(q，J＝7.05Hz，2H)，3.61(m，4H)，3.47(m，4H)，2.43(m，2H)，2.11(m，2H)，1.82(m，1H)，1.65(m，1H)，1.33(t，J＝7.07Hz，3H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₂₉N₈O₃(MH)⁺理论值441.2，实测值441.3。

实施例13

4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-乙基-肟(-C＝N-O-的反式构型)

将4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酸叔丁酯(反式和顺式异构体的混合物，37mg，0.11mmol)用50％TFA/CH₂Cl₂(1.5mL)处理2h，将有机溶剂减压除去。得到的物质用于以下偶合反应，无需纯化。向以上物质和(4-异丙基-苯基)-乙酸(18.7mg，0.11mmol)在THF(3mL)中的混合物中依次加入HOBT(20.9mg，0.14mmol)、HBTU(51.9mg，0.14mmol)和DIEA(67.9mg，0.53mmol)。将反应溶液在室温下搅拌过夜，浓缩。残渣直接经制备TLC(5％MeOH/EtOAc)纯化，得到两种产物，它们表明为关于-C＝N-O-构型的反式和顺式异构体混合物)。主要的异构体为白色固体(5.3mg，12.3％分离收率)。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.16(s，1H)，8.07(s，1H)，7.18(m，4H)，4.20(q，J＝7.08Hz，2H)，3.75(m，2H)，3.74(s，2H)，3.57(t，J＝5.05Hz，2H)，3.37(t，J＝5.08 Hz，2H)， 3.25(t，J＝5.06Hz，2H)，2.89(sep，J＝7.25Hz1H)，1.32(t，J＝7.05Hz，3H)，1.23(d，J＝6.92Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₁N₆O₂(MH)⁺理论值4112，实测值411.3。

实施例14

4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-乙基-肟(-C＝N-O-顺式构型)

按实施例13中所述制备。次要的异构体为白色固体(1.8mg，4.2％分离收率)。

¹H MR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，7.22(s，1H)，7.18(m，4H)，4.31(q，J＝7.10Hz，2H)，3.74(s，2H)，3.73(m，2H)，3.54(m，2H)，3.39(m，2H)，3.30(m，2H)，2.89(sep，J＝7.08Hz，1H)，1.34(t，J＝7.07Hz，3H)，1.23(d，J＝6.92Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₁N₆O₂(MH)⁺理论值411.2，实测值411.3。

实施例15

N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

按实施例9c中所述制备，不同之处在于用(4-吗啉-4-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(300MHz，CDCl₃)δ8.16(s，1H)，8.10(s，1H)，7.20-7.27(m，4H)，6.85-6.91(br，2H)，6.23(br，1H)，4.22(q，J＝7.08Hz，2H)，3.82-3.89(m，4H)，3.54-3.64(m，8H)，3.06-3.14(m，4H)，1.33(t，J＝7.09Hz，3H).

LC-MS(ESI)C₂₂H₃₁N₈O₃(MH⁺)理论值455.2，实测值455.2。

实施例16

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-2-氧代-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

按实施例2c中所述制备，不同之处在于用2-氨基氧基-1-吗啉-4-基-乙酮盐酸盐代替O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺。

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ8.45(s，1H)，8.24(s，1H)，8.23(s，1H)，7.82(br，2H)，7.31(d，J＝8.95Hz，2H)，6.80(d，J＝8.94Hz，2H)，4.91(s，2H)，4.50(m，1H)，3.55(m，4H)，3.32-3.46(m，8H)，3.31(m，4H)，1.22(d，J＝6.03Hz，6H).

LC-MS(ESI)C₂₁H₃₅N₈O₅(MH⁺)理论值527.3，实测值527.1。

实施例17

N-(6-环戊氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.2-环戊氧基-5-硝基-吡啶

在0℃冰浴冷却下，搅拌下，在～30秒内，向2-氯-5-硝基吡啶(7.01g，44.4mmol)的THF(30mL)和环戊醇(3.9g，45.3mmol)溶液中分次加入氢化钠(1.3g，54.2mmol)。在0℃下搅拌5min后，撤去冰浴，将反应物在室温下搅拌3h。然后真空浓缩，将残渣溶于DCM，用1MNaHCO₃充分洗涤，然后经无水Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩。粗产物经闪柱层析(硅胶，9∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化，得到纯2-环戊氧基-5-硝基-吡啶(0.4g，4％)。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ 9.07(s，1H)，8.32(m，1H)，6.74(d，1H)，5.53(m，1H)，2.00(m，2H)，1.81(m，4H)，1.66(m，2H).

b.6-环戊氧基-吡啶-3-基胺

向2-环戊氧基-5-硝基-吡啶(0.3099g，1.49mmol)的MeOH(2mL)溶液中加入10％Pd/C(90mg)。将溶液脱气，在氢气氛下，连续搅拌过夜。通过硅藻土垫过滤，将滤液蒸发，得到需要的产物，为棕色油状物(248mg，94％收率)。

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)：δ7.69(d，1H)，7.04(m，1H)，6.56(d，1H)，5.25(m，1H)，1.93(m，2H)，1.78(m，4H)，1.60(m，2H).

LC/MS(ESI)C₁₀H₁₄N₂O理论值178.23，实测值[M+41+1]⁺220.0。

c.(6-环戊氧基-吡啶-3-基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

向6-环戊氧基-吡啶-3-基胺(0.248g，1.39mmol)的THF(2mL)溶液中分次加入氯甲酸4-硝基苯酯(0.280g，1.39mmol)。在室温下搅拌1h后，有机层中形成大量沉淀。将有机层过滤，得到标题化合物，为浅粉红色固体(0.368g，77％)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)：δ11.1(s，1H)，9.11(s，1H)，9.04(d，1H)，8.26(d，2H)，7.40(d，2H)，7.14(d，1H)，5.36(m，1H)，2.11(m，2H)，1.97(m，2H)，1.84(m，2H)，1.71(m，2H).

d.N-(6-环戊氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例6d中所述制备，不同之处在于用(6-环戊氧基-吡啶-3-基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.13(s，1H)，7.97(d，J＝2.74Hz，1H)，7.71.(dd，J＝8.87和2.82Hz，1H)，6.65(d，J＝8.87Hz，1H)，6.31(br，1H)，5.30(m，1H)，3.96(s，3H)，3.61(m，4H)，3.45(m，4H)，1.93(m，2H)，1.78(m，4H)，1.60(m，2H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₂₉N₈O₃₍MH)⁺理论值441.2，实测值441.3。

实施例18

N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.(4-吡咯烷-1-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯盐酸盐

在室温下，搅拌下，向4.9g(30.4mmol)4-吡咯烷-1-基-苯胺的70mL无水THF溶液中滴加6.4g(32mmol)氯甲酸4-硝基苯酯的16mL无水THF溶液。加入结束后，将混合物搅拌1h，然后过滤。将沉淀依次用无水THF(2×10mL)、无水DCM(3×10mL)洗涤，真空干燥，得到10g灰白色固体。

¹H-NMR(300MHz，CD₃OD)：10.39(s，1H)，8.32(d，2H)，7.73(d，2H)，7.60(d，2H)，7.48(d，2H)，3.86-3.68(bs，4H)，2.35-2.24(bs，4H).LC/MS(ESI)：328(MH)⁺.

b.N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用(4-吡咯烷-1-基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.20(s，1H)，8.08(s，1H)，7.11(d，J＝8.77Hz，2H)，6.53(d，J＝8.91Hz，2H)，3.96(s，3H)，3.61(m，4H)，3.42(m，4H)，3.24(m，4H)，2.01(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₂₉N₈O₂(MH)⁺理论值425.2，实测值425.1。

实施例19

N-(4-环己基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

a.(4-环己基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯

基本上按实施例8a中所述制备，不同之处在于用4-环己基苯胺代替4-异丙基苯胺。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ10.37(br，1H)，8.30(d，J＝9.30Hz，2H)，7.52(d，J＝9.00Hz，2H)，7.41(d，J＝8.10Hz，2H)，7.18(d，J＝8.70Hz，2H)，1.18-1.82(11H).

b.N-(4-环己基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用(4-环己基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.13(s，1H)，7.24(d，J＝8.55Hz，2H)，7.13(d，J＝8.50Hz，2H)，6.35(br，1H)，3.96(s，3H)，3.60(m，4H)，3.44(m，4H)，2.45(m，1H)，1.83(m，4H)，1.73(m，1H)，1.37(m，4H)，1.24(m，1H)；

LC/MS(ESI)C₂₃H₃₂N₇O₂(MH)⁺理论值438.3，实测值438.3。

实施例20

N-(4-氯-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用异氰酸4-氯苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.13(s，1H)，7.30(d，J＝9.00Hz，2H)，7.25(d，J＝9.00Hz，2H)，6.42(br，1H)，3.96(s，3H)，3.61(m，4H)，3.46(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₁₇H₂₁ClN₇O₂(MH)⁺理论值390.1，实测值390.2。

实施例21

N-(4-苯氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用异氰酸4-苯氧基苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.14(s，1H)，7.31(m，4H)，7.07(m，1H)，6.97(m，4H)，6.35(br，1H)，3.97(s，3H)，3.62(m，4H)，3.47(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₃H₂₆N₇O₃(MH)⁺理论值448.2，实测值448.2。

实施例22

N-(4-二甲基氨基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用异氰酸4-N，N-二甲基氨基苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.14(s，1H)，7.18(d，J＝9.04Hz，2H)，6.70(d，J＝9.06Hz，2H)，6.16(br，1H)，3.97(s，3H)，3.59(m，4H)，3.45(m，4H)，2.91(s，6H)；

LC/MS(ESI)C₁₉H₂₇N₈O₂(MH)⁺理论值399.2，实测值399.3。

实施例23

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用异氰酸4-异丙基苯酯代替(4-异丙氧基-苯基)-氨基甲酸4-硝基-苯酯。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.14(s，1H)，7.25(d，J＝8.44Hz，2H)，7.16(d，J＝8.38Hz，2H)，6.31(br，1H)，3.97(s，3H)，3.61(m，4H)，3.45(m，4H)，2.87(m，1H)，1.22(d，J＝6.92Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₀H₂₈N₇O₂(MH)⁺理论值398.2，实测值398.3。

实施例24

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-[1，4]二氮杂环庚烷-1-甲酰胺

基本上按实施例1e中所述制备，不同之处在于用4-氨基-6-[1，4]二氮杂环庚烷-1-基-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟代替4-氨基-6-哌嗪-1-基-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.09(2H)，7.20(d，J＝8.99Hz，2H)，6.82(d，J＝8.97Hz，2H)，6.29(br，1H)，4.47(m，1H)，3.95(s，3H)，3.79(m，2H)，3.75(m，2H)，3.68(t，J＝5.57Hz，2H)，3.57(t，J＝6.01Hz，2H)，2.06(m，2H)，1.30(d，J＝6.06Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₃₀N₇O₃(MH)⁺理论值428.2，实测值428.3。

实施例25

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例2e中所述制备，不同之处在于用O-(2-氨基-乙基)-羟胺二盐酸盐代替O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺二盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(2H)，7.22(d，J＝8.96Hz，2H)，6.83(d，J＝8.99Hz，2H)，6.32(br，1H)，4.48(m，1H)，4.19(t，J＝5.18Hz，2H)，3.60(m，4H)，3.45(m，4H)，3.04(t，J＝5.17Hz，2H)，1.31(d，J＝6.06Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₃₁N₈O₃(MH)⁺理论值443.2，实测值443.3。

实施例26

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-{[2-(3-乙基-脲基)-乙氧基亚氨基]-甲基}-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺

向N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺(44.7mg，0.101mmol)的CH₃CN(1.5mL)溶液中加入异氰酸乙酯(10.8mg，0.152mmol)。将混合物搅拌1h，将溶剂蒸发。将残渣用水和MeOH洗涤，真空干燥，得到需要的产物，为白色固体。

¹HNMR(DMSO-d₆)δ8.40(br，1H)，8.14(s，1H)，8.08(s，1H)，7.45(br，2H)，7.28(d，J＝9.03Hz，2H)，6.77(d，J＝9.08Hz，2H)，5.92(t，J＝5.99Hz，1H)，5.85(t，J＝5.02Hz，1H)，4.48(m，1H)，4.07(t，J＝5.53Hz，2H)，3.22-3.54(10H)，2.97(m，2H)，1.20(d，J＝6.02Hz，6H)，0.94(t，J＝7.14Hz，3H)；

LC/MS(ESI)C₂₄H₃₆N₉O₄(MH)⁺理论值514.3，实测值514.3。

实施例27

N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-甲磺酰基氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

向N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺(70.8mg，0.16mmol)的CH₂Cl₂(2mL)溶液中加入MsCl(45.8mg，0.4mmol)和DIEA((77.6mg，0.6mmol)。将反应物搅拌1h，使其在CH₂Cl₂和水中分配。将CH₂Cl₂萃取液蒸发，粗残渣经硅胶闪柱层析(5％MeOH/EtOAc为洗脱液)纯化，得到需要的产物。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.16(s，1H)，7.24(d，J＝8.92Hz，2H)，6.83(d，J＝8.99Hz，2H)，6.45(br，1H)，5.23(m，1H)，4.47(m，1H)，4.29(t，J＝5.36Hz，2H)，3.60(m，4H)，3.47(m，4H)，3.32(m，2H)，3.00(s，3H)，1.30(d， J＝6.05Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₃N₈O₄S(MH)⁺理论值521.2，实测值521.3。

实施例28

N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-2-氧代-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例2e中所述制备，不同之处在于用2-氨基氧基-1-吗啉-4-基-乙酮盐酸盐代替O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺二盐酸盐。

¹H NMR(DMSO-d₆)δ8.26(br，1H)，8.20(s，1H)，8.14(s，1H)，7.60(br，2H)，7.19(d，J＝8.97Hz，2H)，6.48(d，J＝9.59Hz，2H)，4.88(s，2H)，3.54(m，8H)，3.30-3.47(8H)，3.16(m，4H)，1.92(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₆H₃₆N₉O₄(MH)⁺理论值538.3，实测值538.3。

实施例29

N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例5b中所述制备，不同之处在于用O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺二盐酸盐代替甲氧基胺盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.18(s，1H)，7.25(d，J＝9.07Hz，2H)，6.88(d，J＝9.07Hz，2H)，6.22(br，1H)，4.30(t，J＝5.84Hz，2H)，3.86(t，J＝4.66Hz，4H)，3.74(t，J＝4.60Hz，4H)，3.60(m，4H)，

LC/MS(ESI)C₂₆H₃₈N₉O₄(MH)⁺理论值540.3，实测值540.3。

实施例30

N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例6d中所述制备，不同之处在于用O-(2-吗啉-4-基-乙基)-羟胺二盐酸盐代替甲氧基胺盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.18(s，1H），7.96(d，J＝2.68Hz，1H)，7.74(dd，J＝8.83和2.79Hz，1H)，6.67(d，J＝9.16Hz，1H)，6.24(br，1H)，5.11(m，1H)，4.30(t，J＝5.64Hz，2H)，3.74(m，4H），3.61(m，4H)，3.45(m，4H)，2.73(t，J＝5.71Hz，2H)，2.54(m，4H)，2.44(m，2H)，2.12(m，2H)，1.59-1.82(2H)；

LC/MS(ESI)C₂₅H₃₆N₉O₄(MH)⁺理论值526.3，实测值526.2。

实施例31

N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例6d中所述制备，不同之处在于用O-(2-氨基-乙基)-羟胺二盐酸盐代替甲氧基胺盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.20(s，1H)，7.96(d，J＝2.26Hz，1H)，7.74(dd，J＝8.83和2.78Hz，1H)，6.67(d，J＝8.86Hz，1Hz)，6.31(br，1H)，5.10(m，1H)，4.20(t，J＝5.22Hz，2H)，3.61(m，4H)，3.45(m，4H)，3.04(m，2H)，2.42(m，2H)，2.11(m，2H)，1.59-1.87(2H)；

LC/MS(ESI)C₂₁H₃₀N₉O₃(MH)⁺理论值456.2，实测值456.2。

实施例32

N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例5b中所述制备，不同之处在于用O-(2-氨基-乙基)-羟胺二盐酸盐代替甲氧基胺盐酸盐。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.20(s，1H)，7.25(d，J＝9.05Hz，2H)，6.87(d，J＝9.05Hz，2H)，6.23(br，1H)，4.20(t，J＝5.25Hz，2H)，3.86(t，J＝4.69Hz，4H)，3.62(m，4H)，3.46(m，4H)，3.11(t，J＝4.86Hz，4H)，3.04（t，J＝5.62Hz，2H)；

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₂N₉O₃(MH)⁺理论值470.3，实测值470.2。

实施例33

N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-{6-氨基-5-[(2-甲磺酰基氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例27中所述制备，不同之处在于用N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺代替N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺。

¹H NMR(CDCl₃)δ8.20(s，1H)，8.16(s，1H)，7.99(d，J＝3.19Hz，1H)，7.74(dd，J＝8.82和2.78Hz，1H)，6.65(d，J＝8.83Hz，1H)，6.57(s，1H)，5.28(br，1H)，5.08(m，1H)，4.30(t，J＝4.68Hz，2H)，3.61(m，4H)，3.45(m，6H)，3.00(s，3H)，2.42(m，2H)，2.11(m，2H)，1.59-1.87(2H)；

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₂N₉O₅S(MH)⁺理论值534.2，实测值534.2。

实施例34

N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

¹H NMR(CDCl₃)δ8.21(s，1H)，8.20(s，1H)，7.16(d，J＝8.85Hz，2H)，6.51(d，J＝8.89Hz，2H)，4.19(t，J＝5.08Hz，2H)，3.58(m，4H)，3.45(m，4H)，3.26(m，4H)，3.04(t，J＝5.30Hz，2H)，1.99(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₂H₃₂N₉O₂(MH)⁺理论值454.3，实测值454.2。

实施例35

N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-甲磺酰基氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例27中所述制备，不同之处在于用N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺代替N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.26(s，1H)，8.08(s，1H)，7.11(d，J＝8.94Hz，2H)，6.53(d，J＝9.00Hz，2H)，4.26(t，J＝5.22Hz，2H)，3.62(m，4H)，3.50(m，2H)，3.44(m，4H)，3.24(m，4H)，2.97(s，3H)，2.00(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₃H₃₄N₉O₄S(MH)⁺理论值532.2，实测值532.1。

实施例36

N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例2e中所述制备，不同之处在于用N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺代替N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.24(s，1H)，8.08(s，1H)，7.11(d，J＝8.96Hz，2H)，6.53(d，J＝8.97Hz，2H)，4.34(t，J＝5.53Hz，2H)，3.71(t，J＝4.86Hz，4H)，3.62(m，4H)，3.43(m，4H)，3.24(m，4H)，2.75(t，J＝5.70Hz，2H)，2.57(m，4H)，2.01(m，4H)；

LC/MS(ESI)C₂₆H₃₈N₉O₃(MH)⁺理论值524.3，实测值5243。

实施例37

N-(4-异丙基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺

基本上按实施例2e中所述制备，不同之处在于用N-(4-异丙基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺代替N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-甲酰基-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺。

¹H NMR(CD₃OD)δ8.25(s，1H)，8.09(s，1H)，7.26(d，J＝8.57Hz，2H)，7.14(d，J＝8.43Hz，2H)，4.37(t，J＝6.36Hz，2H)，3.74(t，J＝4.75Hz，4H)，3.65(m，4H)，3.44(m，4H)，2.84(m，3H)，2.66(m，4H)，1.22(d，J＝6.92Hz，6H)；

LC/MS(ESI)C₂₅H₃₇N₈O₃(MH)⁺理论值497.2，实测值497.3。

式I′FLT3抑制剂的生物活性

用以下代表性测定试验测定式I′FLT3抑制剂的生物活性。按照非限定性方式，给出它们来举例说明本发明。

体外测定

用以下代表性体外测定试验测定本发明范围内的式I′FLT3抑制剂的生物活性。按照非限定性方式，给出它们来举例说明本发明。

用FLT3酶活性、MV4-11增殖和Baf3-FLT3磷酸化的抑制举例说明FLT3酶和依赖于FLT3活性的细胞过程的特异性抑制。用Baf3细胞增殖抑制试验作为本发明范围内化合物的FLT3、c-Kit和TrkB独立细胞毒性试验。本文中所有实施例均显示显著且特异性抑制FLT3激酶和依赖FLT3的细胞反应。在酶活性测定中，本文中实施例也显示特异性抑制TrkB和c-kit激酶。FLT3抑制剂化合物还具有细胞渗透性。

FLT3荧光偏振激酶测定

为在体外激酶测定中测定式I′FLT3抑制剂的活性，用以下荧光偏振(FP)方案，进行人FLT3受体的激酶域(a.a.571-993)分离抑制。FLT3 FP测定使用荧光素-标记的磷酸肽和包含在Panvera磷酸-酪氨酸激酶试剂盒(Green)中的抗磷酸酪氨酸抗体，该试剂盒由Invitrogen提供。当FLT3将聚Glu₄Tyr磷酸化时，通过磷酸化的聚Glu₄Tyr将荧光素-标记的磷酸肽从抗磷酸酪氨酸抗体中置换，因此FP值减少。在以下条件下，将FLT3激酶反应物在室温下温育30分钟：10nMFLT3571-993，20μg/mL聚Glu₄Tyr，150μMATP，5mMMgCl₂，1％化合物的DMSO溶液。加入EDTA终止激酶反应。加入荧光素-标记的磷酸肽和抗磷酸酪氨酸抗体，在室温下温育30分钟。

所有数据点均为三份平行样品的平均值。用GraphPad Prism进行抑制和IC₅₀的数据分析，用多参数、S形剂量-反应(可变斜率)方程进行非线性回归拟合。激酶抑制的IC₅₀代表与DMSO溶媒对照相比，导致50％激酶活性抑制的化合物剂量。

MV4-11和Baf3细胞增殖抑制

为评价式I′FLT3抑制剂的细胞效力，在白血病细胞系MV4-11(ATCC保藏号：CRL-9591)中测量FLT3特异性生长抑制。MV4-11细胞源自具有11q23易位的儿童急性粒单核细胞白血病患者，该易位导致MLL基因重排并含FLT3-ITD突变(AML亚型M4)(参见Drexler HG.The Leukemia-Lymphoma Cell Line Factsbook.Academic Pres：SanDiego，CA，2000和Quentnteier H，Reinhardt J，Zaborski M，Drexler HG.FLT3 mutations in acute myeloid leukemia cell lines.(在急性髓细胞性白血病细胞系中的FLT3突变)Leukemia.2003 Jan；17：120-124.)。如不存在活性FLT3ITD，则MV4-11细胞不能生长和存活。

用IL-3依赖性鼠b-细胞淋巴瘤细胞系Baf3作对照，通过测量FLT3抑制剂化合物的非特异性生长抑制，确证FLT3抑制剂化合物的选择性。

为测量供试化合物的增殖抑制，使用基于荧光素酶的CellTiterGlo试剂(Promega)，该试剂根据总细胞ATP浓度，定量总细胞数。按10,000细胞/孔，将细胞接种在100μl RPMI培养基中，对于MV4-11和Baf3细胞，RPMI培养基分别含青霉素/链霉素，10％FBS和1ng/ml GM-CSF或1ng/mlIL-3。

将化合物稀释液或0.1％DMSO(溶媒对照)加入细胞，在标准细胞生长条件(37℃，5％CO₂)下，让细胞生长72小时。为了用生长在50％血浆中的MV4-11细胞测量活性，按10,000细胞/孔，将细胞接种在生长培养基和人血浆的1∶1混合物中(终体积100μL)。为测量总细胞生长，按照厂商说明书，将等体积的CellTiterGlo试剂加入各孔中，定量发光。根据第0日细胞数目与第3日总细胞数目(72小时生长和/或化合物处理)的发光计数(相对光单位，RLU)差，定量总细胞生长。将100％生长抑制定义为相当于第0日读数的RLU。将0％抑制定义为在第3日DMSO溶媒对照中生长的RLU信号。所有数据点均为三份平行样品的平均值。生长抑制的IC₅₀代表在第3日导致DMSO溶媒对照中总细胞生长50％抑制的化合物剂量。用GraphPad Prism进行抑制和IC₅₀的数据分析，用多参数、S形剂量-反应(可变斜率)方程进行非线性回归拟合。

MV-411细胞表达FLT3内串联重复突变，因而生长完全依赖FLT3活性。预计对MV4-11细胞活性强是本发明需要的性质。相反，Baf3细胞增殖由细胞因子IL-3驱动，这些细胞因此用作供试化合物的非特异性毒性对照。本发明所有实施例化合物在3μM剂量下均显示＜50％抑制(未包括数据)，提示这些化合物无细胞毒性，并对FLT3具有良好的选择性。

基于细胞的FLT3受体酶联免疫吸附测定

按照以下方式测量FLT配体诱导的野生型FLT3磷酸化特异性细胞抑制：过度表达FLT3受体的Baf3 FLT3细胞得自Dr.MichaelHeinrich(Oregon Health and Sciences University)。通过用野生型FLT3稳定转染亲代Baf3细胞(依赖细胞因子IL-3生长的鼠B细胞淋巴瘤系)，建立Baf3 FLT3细胞系。在无IL-3存在但有FLT3配体存在下，根据其生长能力选择细胞。

在37℃，5％CO₂下，将Baf3细胞维持在含10％FBS、青霉素/链霉素和10ng/mlFLT配体的RPMI1640中。为测量野生型FLT3受体活性和磷酸化的直接抑制，开发了类似于为其它RTK开发的那些方法的夹心ELISA方法(参见Sadick，MD，Sliwkowski，MX，Nuijens，A，Bald，L，Chiang，N，Lofgren，JA，Wong WLT. Analysis ofHeregulin-Induced ErbB2 Phosphorylation with a High-ThroughputKinase Receptor Activation Enzyme-Linked Immunsorbent Assay(用高通量激酶受体激活酶联免疫吸附剂测定分析Heregulin引起的ErbB2磷酸化)，Analytical Biochemistry.1996；235：207-214和Baumann CA，Zeng L，Donatelli RR，Maroney AC.Development of a quantitative，high-throughput cell-based enzyme-linked immunosorbent assay fordetection of colony-stimulating factor-1 receptor tyrosine kinase inhibitors(用于检测集落刺激因子-1受体酪氨酸激酶抑制剂的基于细胞的定量、高通量酶联免疫吸附剂测定方法的开发)，J Biochem Biophys Methods.2004；60：69-79)。在将化合物或DMSO溶媒温育前1小时，将200μlBaf3FLT3细胞(1×10⁶/ml)接种在96孔皿中含0.5％血清和0.01ng/mlIL-3的RPMI1640中，保持16小时。在37℃下，将细胞用100ng/mlFlt配体(R&D Systems Cat#308-FK)处理10min。使细胞沉淀，用100μl补充磷酸酶(Sigma Cat#P2850)和蛋白酶抑制剂(Sigma Cat#P8340)的裂解缓冲液(50mM Hepes，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X-100，10mM NaF，1mM EDTA，1.5mM MgCl₂，10mM焦磷酸钠)洗涤、裂胞。在4℃下，通过在1000×g下离心5分钟，使裂解产物澄清。将细胞裂解产物转移至涂布50ng/孔抗-FLT3抗体(Santa Cruz Cat#sc-480)并用SeaBlock试剂(Pierce Cat#37527)封闭的白色壁96孔微量滴定板(Costar#9018)中。将裂解产物在4℃下温育2小时。将板用200μl/孔PBS/0.1％Triton-X-100洗涤3×。然后在室温下，将板和1∶8000稀释度的HRP-缀合抗-磷酸酪氨酸抗体(Clone 4G10，UpstateBiotechnology Cat#16-105)一起温育1小时。将板用200μl/孔PBS/0.1％Triton-X-100洗涤3×。按照厂商说明书，用Super Signal Pico试剂(Pierce Cat#37070)，用Berthold微量培养板发光计检测信号。所有数据点均为三份平行样品的平均值。将在0.1％DMSO对照存在下Flt配体刺激的FLT3磷酸化的总相对光单位(RLU)定义为0％抑制，基态裂解产物的总RLU定义为100％抑制。用GraphPad Prism进行抑制和IC₅₀的数据分析，用多参数、S形剂量-反应(可变斜率)方程进行非线性回归拟合。

生物学数据

FLT3的生物学数据

代表性FLT3抑制剂化合物的活性列于下表。所有活性均按μM计，且具有以下偏差：FLT3激酶：±10％；MV4-11和Baf3-FLT3：±20％。

编号	化合物	FLT3激酶(μM)	MV4-11(μM)	Baf3 ELISA(μM)
编号	化合物	FLT3激酶(μM)	MV4-11(μM)	Baf3 ELISA(μM)	1	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.05	0.079	0.017
2	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.036	0.177	0.081	1	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.05	0.079	0.017
2		0.036	0.177	0.081	3	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(3-羟基-丙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.26	0.283	0.072
4	N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.05	0.089	0.155	3	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(3-羟基-丙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.26	0.283	0.072
4	N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.05	0.089	0.155	5	N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧	0.34	0.515	0.105

	基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺
	基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺				6	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.075	0.111	0.104
7	4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟	0.014	0.024	0.002	6	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.075	0.111	0.104
7	4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-甲基-肟	0.014	0.024	0.002	8	N-(4-异丙基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.082	0.147	0.189
9	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺(-C＝N-O-反式构型)	0.018	0.077	0.022	8	N-(4-异丙基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.082	0.147	0.189
9		0.018	0.077	0.022	10	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺(-C＝N-O-顺式构型)	0.12	0.075	0.267

编号	化合物	FLT3激酶(μM)	MV4-11(μM)	Baf3ELISA(μM)
编号	化合物	FLT3激酶(μM)	MV4-11(μM)	Baf3ELISA(μM)	11	N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.049	0.058	0.026
12	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.058	0.065	0.063	11	N-(4-哌啶-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.049	0.058	0.026
12	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.058	0.065	0.063	13	4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-乙基-肟(-C＝N-O-反式构型)	0.008	0.013	0.116
14	4-氨基-6-{4-[2-(4-异丙基-苯基)-乙酰基]-哌嗪-1-基}-嘧啶-5-甲醛O-乙基-肟(-C＝N-O-顺式构型)	0.024	0.029	0.158	13		0.008	0.013	0.116
14		0.024	0.029	0.158	15	N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.126	0.35	0.735
16	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-2-氧代-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.486	0.268	0.187	15	N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(乙氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.126	0.35	0.735
16		0.486	0.268	0.187	17	N-(6-环戊氧基-吡啶-3-基)-4-[6-氨基	0.018	0.112	0.068

	-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺
	-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺				18	N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.003	0.099	0.312
19	N-(4-环己基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.099	0.052	0.012	18	N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.003	0.099	0.312
19	N-(4-环己基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.099	0.052	0.012	20	N-(4-氯-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	1.37	＞1	0.11
21	N-(4-苯氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.496	0.086	0.102	20	N-(4-氯-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	1.37	＞1	0.11
21	N-(4-苯氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.496	0.086	0.102	22	N-(4-二甲基氨基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	1.87	0.472	0.058
23	N-(4-异丙基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.015	0.098	0.008	22	N-(4-二甲基氨基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	1.87	0.472	0.058
23	N-(4-异丙基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-哌嗪-1-甲酰胺	0.015	0.098	0.008	24	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-[6-氨基-5-(甲氧基亚氨基-甲基)-嘧啶-4-基]-[1，4]二氮杂环庚烷-1-甲酰胺	0.122	0.66	0.016
25	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	1.15	2.0	nd	24		0.122	0.66	0.016

编号	化合物	FLT3激酶(μM)	MV4-11(μM)	Baf3ELISA(μM)
编号	化合物	FLT3激酶(μM)	MV4-11(μM)	Baf3ELISA(μM)	26	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-(6-氨基-5-{[2-(3-乙基-脲基)-乙氧基亚氨基]-甲基}-嘧啶-4-基)-哌嗪-1-甲酰胺	nd	＞1	nd
27	N-(4-异丙氧基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-甲磺酰基氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.146	0.415	0.028	26		nd	＞1	nd
27		0.146	0.415	0.028	28	N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-2-氧代-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.3	0.458	0.066
29	N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	＞10	3.0	nd	28		0.3	0.458	0.066

30	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	1.74	2.5	nd
30		1.74	2.5	nd	31	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	1.45	1.3	0.206
32	N-(4-吗啉-4-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	5.15	0.79	0.077	31		1.45	1.3	0.206
32		5.15	0.79	0.077	33	N-(6-环丁氧基-吡啶-3-基)-4-{6-氨基-5-[(2-甲磺酰基氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	1.15	2.8	nd
34	N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	1.51	2.5	nd	33		1.15	2.8	nd
34		1.51	2.5	nd	35	N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-甲磺酰基氨基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	0.15	0.554	0 025
36	N-(4-吡咯烷-1-基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	4.04	0.362	0.530	35		0.15	0.554	0 025
36		4.04	0.362	0.530	37	N-(4-异丙基-苯基)-4-{6-氨基-5-[(2-吗啉-4-基-乙氧基亚氨基)-甲基]-嘧啶-4-基}-哌嗪-1-甲酰胺	nd	nd	nd

^*除另有说明外，用本领域技术人员熟知的命名规则，由标准IUPAC命名参考文献例如Nomenclature of Organic Chemistry，SectionsA，B，C，D，E，F and H，(Pergamon Press，Oxford，1979，Copyright1979IUPAC)和A Guide to IUPAC Nomenclature of Organic Compounds(Recommendations1993)，(Blackwell Scientific Publications，1993，Copyright 1993 IUPAC)；或市售软件包例如Autonom(CambridgeSoft.com开发的ChemDraw Ultra^_办公软件提供的命名软件商标)；和ACD/Index Name^TM(Advanced Chemistry Development，Inc.，Toronto，Ontario开发的商业命名软件商标)得到化合物名称。

其它FLT3抑制剂

可用于本发明的其它FLT3激酶抑制剂包括：AG1295和AG1296；Lestaurtinib(又称为CEP701，前称KT-5555，Kyowa Hakko，许可给Cephalon)；CEP-5214和CEP-7055(Cephalon)；CHIR-258(ChironCorp.)；EB-10和IMC-EB10(ImClone Systems Inc.)；GTP14564(MerkBiosciences UK)；Midostaurin(又称为PKC412 Novartis AG)；MLN608(Millennium USA)；MLN-518(前称CT53518，COR Therapeutics Inc.，许可给Millennium Pharmaceuticals Inc.)；MLN-608(MillenniumPharmaceuticals Inc.)；SU-11248(Pfizer USA)；SU-11657(Pfizer USA)；SU-5416和SU5614；THRX-165724(Theravance Inc.)；AMI-10706(Theravance Inc.)；VX-528和VX-680(Vertex Pharmaceuticals USA，许可给Novartis(Switzerland)、Merck & Co USA)；和XL 999(ExelixisUSA)。

制剂

可通过本领域已知的和本文中所述方法制备和配制本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。除本文中所述制备方法和制剂外，还可通过本领域中所述方法例如本文中引用的出版物，将本发明法尼基转移酶抑制剂制备和配制成药用组合物。例如，对于式(I)、(II)和(III)法尼基转移酶抑制剂，可在WO-97/21701找到合适的实例。可用WO 97/16443中所述方法制备和配制式(IV)、(V)和(VI)法尼基转移酶抑制剂。可分别按照WO 98/40383、WO 98/49157和WO 00/39082中所述方法，制备和配制式(VII)、(VIII)和式(IX)法尼基转移酶抑制剂。可通过WO 97/21701中所述方法合成Tipifarnib(Zarnestra^TM，又称为R115777)及其活性较弱的对映体。预计Tipifarnib在不久的未来将以ZARNESTRA^TM上市，目前按要求(通过接触)，可由Johnson & JohnsonPharmaceutical Research & Development，L.L.C.(Titusville，NJ)提供。

当使用单独的药用组合物时，按照常规药物混合技术，将作为活性成分的FLT3激酶抑制剂或法尼基转移酶抑制剂与药物载体充分混合，该载体可采取多种形式，取决于给药所需要的制剂形式，例如口服或肠胃外例如肌内。可类似地制备具有FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂活性成分的单位药用组合物。

在制备独立组合物或单位组合物的口服剂型时，可使用任何常用药物介质。因此对于液体口服制剂例如混悬剂、酏剂和溶液剂，合适的载体和添加剂包括水、二醇、油、醇、矫味剂、防腐剂、着色剂等；对于固体口服制剂例如散剂、胶囊剂、胶囊形片剂、软胶囊和片剂，合适的载体和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于它们易于给药，片剂和胶囊剂代表最佳的口服剂量单位形式，在该情况下，显然使用固体药物载体。如果需要，可通过标准技术给片剂包糖衣或肠溶衣。对于肠胃外制剂，尽管可包含例如用于助溶或防腐目的的其它成分，但载体通常包括无菌水。也可制备注射混悬液，在该情况下，可使用适当的液体载体、悬浮剂等。在制备缓释制剂时，先将缓释载体通常为聚合物载体和本发明化合物溶于或分散于有机溶剂。然后将得到的有机溶液加入水溶液，得到水包油型乳剂。优选，水溶液包含一种或多种表面活性剂。然后将水包油型乳剂中的有机溶剂蒸发，得到含缓释载体和本发明化合物的胶体颗粒悬浮液。

本文中药用组合物的每个剂量单位例如片剂、胶囊剂、散剂、注射剂、一茶匙剂量等应含有释放上述有效剂量所必需活性成分的量。本文中药用组合物的每个剂量单位例如片剂、胶囊剂、散剂、注射剂、栓剂、一茶匙剂量等应含约0.01mg-200mg/kg体重/日。优选，该范围为约0.03-约100mg/kg体重/日，最优选约0.05-约10mg/kg体重/日。可按每日1-5次的方案给予化合物。但是，可根据患者的需要、所治疗病症的严重程度和所使用的化合物改变剂量。可使用每日给药或间歇(post-periodic)给药方法。

优选这些组合物为单位剂型，例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液剂或混悬剂；定量气雾剂或液体喷雾剂、滴剂、安瓿、自动注射器装置或栓剂；用于口服、肠胃外、鼻内、舌下或直肠给药，或用于通过吸入或吹入给药。或者，可提供适合每周一次或每月一次给药的组合物；例如活性化合物的不溶性盐例如癸酸盐可适合提供用于肌内注射的贮库制剂。当制备固体组合物例如片剂时，将主要的活性成分与药物载体例如常规压片成分如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，和其它药物稀释剂例如水混合，形成固体制剂组合物，该组合物含本发明化合物或其药学上可接受的盐的均匀混合物。当称这些制剂组合物为均匀时，表示活性成分均匀地分散在整个组合物中，以使组合物可容易地细分为相同有效的剂量形式，例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体制剂组合物分成含0.1-约500mg本发明活性成分的上述类型的单位剂量形式。可将新组合物的片剂或丸剂包衣，或配制成提供长效作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂可含有内剂量和外剂量组分，后者是包封前者的形式。可通过肠溶层将两种组分分开，肠溶层用于阻止在胃中崩解，且允许内组分完整通过十二指肠或延迟释放。多种物质可用作此类肠溶层或包衣剂，此类物质包括多种聚合物酸和此类物质例如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素。

其中可分别掺入FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂(或二者均为单位组合物的情况)的口服或注射给药的液体形式包括水溶液、适当矫味的糖浆、水或油混悬液；用食用油例如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油矫味的乳剂、酏剂以及类似药用溶媒。用于水混悬液的合适分散剂或悬浮剂包括合成和天然树胶例如黄芪胶、阿拉伯胶、藻酸盐(酯)、右旋糖苷、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。采用适当矫味的悬浮剂或分散剂的液体形式还可包含合成和天然树胶，例如黄芪胶、阿拉伯胶、甲基纤维素等。对于肠胃外给药，需要无菌混悬剂和溶液剂。当需要静脉内给药时，通常使用含合适防腐剂的等渗制剂。

最好，按单个日剂量(独立或为单位组合物)，给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂，或将总日剂量分为每日两次、三次或四次的分剂量给药。另外，可通过局部使用合适的鼻内溶媒给予鼻内形式的本发明化合物(独立或为单位组合物)，或通过本领域普通技术人员熟知的透皮贴剂给予本发明化合物。为按透皮递药系统的形式给药，在整个给药方案中，剂量给药自然是连续的而非间断的。

例如，对于片剂或胶囊剂形式的口服给药，可使活性药物成分(FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂分别或一起为单位组合物的情况)与口服无毒药学上可接受的惰性载体例如乙醇、甘油、水等混合。另外，当需要或必要时，也可将合适的粘合剂；润滑剂、崩解剂和着色剂掺入混合物。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、明胶；天然糖例如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂；天然和合成树胶例如阿拉伯胶、黄芪胶，或油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。

本发明产品的日剂量可在1-5000mg/成年人/日的宽范围内变化。对于口服给药，优选提供片剂形式的组合物，此类片剂含0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、150、200、250和500毫克活性成分，根据所治疗患者的症状调节剂量。通常按约0.01mg/kg-约200mg/kg体重/日剂量水平提供有效量的药物。尤其是，该范围为约0.03-约15mg/kg体重/日，更尤其约0.05-约10mg/kg体重/日。可按照每日高达4次或更多次，优选每日1-2次给药方案，分别或在单位组合物的情况一起给予FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。

本领域技术人员可容易地确定最佳给药剂量，该剂量根据具体使用的化合物、给药模式、制剂浓度、给药模式、病情发展状况变化。另外，与具体治疗的患者有关的因素包括患者年龄、体重、饮食和给药时间会引起调整剂量的必要。

还可按脂质体递药系统的形式例如小单层脂质体、大单层脂质体和多室脂质体，给予本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂(分别或用单位组合物)。可由多种脂质形成脂质体，此类脂质包括但不限于两性脂质，例如磷脂酰胆碱、神经鞘髓磷脂、磷脂酰乙醇胺、卵磷脂(phophatidylcholines)、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二酰基三甲基铵丙烷、二酰基二甲基铵丙烷和硬脂胺；中性脂质例如甘油三酯及其组合。它们可含有胆固醇或可以不含胆固醇。

也可局部给予本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂(分别或用单位组合物)。可利用任何递药装置，例如血管内递药导管、线、药理学支架和腔内涂膜术。这种装置的递药系统可包含按管理者控制的速度释放化合物的局部输注导管。

本发明提供递药装置，该装置含有腔内医疗装置优选支架，和治疗剂量的本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂。或者，通过递药装置，该装置含有腔内医疗装置优选支架，本发明提供治疗剂量的本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂之一或两者的分别给药。

术语“支架”是指能够通过导管递药的任何装置。支架通常用于防止因物理性畸形例如因外科手术创伤导致的多余血管组织向内生长所致血管闭合。它通常具有管状、膨胀性格子型结构，该结构适合置于管腔内以消除梗塞。支架具有腔壁接触表面和腔暴露表面。腔壁接触表面是管的外表面，腔暴露表面是管的内表面。支架可以是聚合物、金属或聚合物加金属支架，且它可任选为生物降解性支架。

可按多种方式和利用任何数目的生物相容性材料，将本发明FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂掺入或附着在支架中(分别或用单位组合物)。在一个示范性实施方案中，将化合物直接掺入聚合物基质例如聚吡咯聚合物，然后涂在支架的外表面。通过在聚合物中的扩散，化合物从基质中洗脱下来。支架和在支架上涂布药物的方法在本领域中有详细论述。在另一个示范性实施方案中，先用含化合物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和聚甲基丙烯酸丁酯的溶液的底层涂布支架。然后，再用只含聚甲基丙烯酸丁酯的外层涂布支架。外层起扩散屏障的作用，阻止化合物过快洗脱下来并进入周围组织。外层或表面涂层的厚度决定化合物从基质洗脱的速度。支架和涂布方法在WIPO公布WO9632907、美国专利公布号2002/0016625和其中公开的参考文献中有详细论述。

为更好地理解和说明本发明及其示范性实施方案，最好可参考以下实验部分。

实验

测试联合的FTI和FLT3抑制剂抑制AML细胞生长。在体外，使用两种FTI，即Tipifarnib和FTI化合物176(″FTI-176)以及8种新的FLT3抑制剂：化合物A、B、C、D、E、F、G和H抑制依赖FLT3的细胞种类的生长(参见图5所示试验化合物)。

用于试验的细胞系包括生长依赖FLT3ITD突变体活性的那些细胞系(MV4-11和Baf3-FLT3ITD)、生长依赖FLT3wt活性的细胞系(Baf3FLT3)和生长不依赖FLT3活性的那些细胞系(THP-1)。MV4-11(ATCC保藏号：CRL-9591)细胞源自具有11q23易位的儿童急性粒单核细胞白血病患者，该易位导致MLL基因重排并含FLT3-ITD突变(AML亚型M4)(参见Drexler HG.The Leukemia-Lymphoma Cell LineFactsbook.Academic Pres：San Diego，CA，2000和Quentmeier H，Reinhardt J，Zaborski M，Drexler HG.FLT3 mutations in acute myeloidleukemia cell lines.(在急性髓细胞性白血病细胞系中的FLT3突变)Leukemia.2003 Jan；17：120-124.)。Baf3-FLT3和Baf3-FLT3ITD细胞系得自Dr.Michael Henrich和the Oregon Health Sciences University。通过用野生型FLT3或含插入受体的近膜域导致其组成型激活的ITD的FLT3，稳定转染亲代Baf3细胞(生长依赖细胞因子IL-3的鼠B细胞淋巴瘤系)，建立Baf3 FLT3细胞系。根据它们在无IL-3但在FLT3配体(Baf3-FLT3)存在下或不依赖任何生长因子(Baf3-ITD)生长的能力，选择细胞。在发生N-Ras突变但无FLT3异常的儿童AML患者中分离THP-1(ATCC保藏号：TIB-202)细胞。尽管这些细胞表达功能性FLT3受体，但THP-1细胞的存活和生长不依赖FLT3活性(数据未显示)。

用标准72小时细胞增殖测定试验，测定各单独化合物的各细胞系剂量反应(参见图6.1-6.8)。在所有的实验中，均用标准化疗药物阿糖胞苷作对照细胞毒药物。FTI Tipifarnib的活性范围为高纳摩尔浓度-高皮摩尔浓度，取决于细胞类型。在生长依赖FLT3的细胞中，FLT3抑制剂化合物A、B、C、D、E、F、G和H分别具有良好的抑制FLT3驱动增殖的活性(亚微摩尔浓度)(与一线细胞毒药物阿糖胞苷和Tipifarnib相比)。这些化学上不同的化合物中每一种化合物均具有单独治疗与FLT3有关的病症例如FLT3阳性AML的潜力。阿糖胞苷抑制增殖(1-2μM)可与先前报道的其MV4-11细胞体外活性相当(Levis，M.等(2004)″In vitro studies of a FLT3 inhibitor combined withchemotherapy：sequence of administration is important to achievesynergistic cytotoxic effects.″(FLT3抑制剂联合化疗的体外研究：给药顺序对完成协同细胞毒性作用很重要)Blood.104(4)：1145-50)。测试的FLT3抑制剂对THP-1增殖无作用。将各细胞系中各化合物的IC₅₀计算值用于随后的联合药物实验，以计算化合物联合对细胞增殖的协同作用(参见图10.1-10.8和下表1-3)。

然后检验单(亚IC₅₀)剂量的FLT3抑制剂化合物A对Tipifarnib活性的影响。用一个剂量的FLT3抑制剂化合物A和不同剂量的Tipifarnib同时处理各细胞系，按照标准72小时细胞增殖方案，评价细胞增殖。然后按照下文生物活性部分中所述方法，计算Tipifarnib的IC₅₀(参见图7a-c所示FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib联用的结果)。测试的细胞系包括生长依赖FLT3ITD突变体活性的那些细胞系(MV4-11和Baf3-FLT3ITD)、生长依赖FLT3wt活性的细胞系(Baf3FLT3)和生长不依赖FLT3活性的那些细胞系(THP-1)。

FLT3抑制剂化合物A显著增强FTI Tipifarnib抑制AML(MV4-11)和依赖FLT3(Baf3-ITD和Baf3-FLT3)的细胞增殖的活性。在(a)MV4-11(50nM)；(b)Baf3-ITD(50nM)和(c)Baf3-FLT3(100nM)细胞中，与单次亚IC₅₀剂量的FLT3抑制剂化合物A一起，Tipifarnib在各测试细胞系中活性增加3倍以上。这表明存在显著协同作用。

然后，在MV4-11、Baf3-ITD和Baf3-FLT3细胞系中，评价FTITipifarnib和FLT3抑制剂化合物A的单剂量联合。该单剂量联合方案更接近表示临床上使用的联合化疗的给药策略。按该方法，用单次亚IC₅₀剂量的各化合物或化合物联合同时处理细胞，监控增殖抑制。用该方法，发现联合的亚IC₅₀剂量的FTI Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A在抑制AML细胞系MV4-11和其它依赖FLT3的细胞生长中，其作用大于加性作用(参见图8a-d)。与Tipifarnib联合的该协同作用未在增殖不依赖FLT3的细胞(THP-1)中发现。发现联合的FLT3抑制剂化合物A和阿糖胞苷也具有该协同作用。

另外，还检测了FLT3抑制剂和FTI的单剂量联合，以确定该活性是否以化合物特异性或机制为基础。测试了单次亚IC₅₀剂量的FLT3抑制剂化合物B或D和Tipifarnib联合对MV4-11增殖的抑制。发现，与联合的Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A相似，FLT3抑制剂化合物B或D与Tipifarnib联合抑制依赖FLT3的MV4-11细胞增殖的效力大于加性效力。由此提示，任何FLT3抑制剂和FTI联合可协同抑制依赖FLT3的AML细胞增殖。该发现为新发现，对本领域技术人员而言不是显而易见的。发现FLT3抑制剂化合物B或D和阿糖胞苷联合也有协同作用。

为按统计学方法评价在依赖FLT3的细胞系中FLT3抑制剂和FTI的协同作用，通过Chou和Talalay方法评价给药组合。参见Chou TC，Talalay P.(1984)″Quantitative analysis of dose-effect relationships：thecombined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.″(剂量-作用关系的定量分析：多药物或酶抑制剂的联合作用)Adv Enzyme Regul.22：27-55。用该方法，按各单独化合物的IC₅₀剂量比例，将多种抑制剂同时加入细胞。采集数据，按Chou和Talalay所述，对固定比例剂量的联合药物进行等效分析。用该分析产生联合指数或CI。CI值1对应于作用为加性的化合物；CI值＜0.9视为有协同性，CI值＞11视为有拮抗性。用该方法，评价了多种FTI和FLT3联合。对于各实验联合药物，计算在依赖FLT3的各细胞系中各单一化合物的IC₅₀(参见图6.1-6.8)，然后在标准细胞增殖测定中，按固定比例(剂量范围包括9、3、1、1/3、1/9×各化合物的IC₅₀)给药。图10.1-10.8归纳了用Calcusyn软件(Biosoft)得到的对按照Chou和Talalay方法固定比例给药进行等效分析的原始数据。用该等效图，可通过图形表达协同作用。在给定剂量作用下，加性联合的数据点沿着等效线存在(CI＝1)。在给定剂量作用下，协同联合的数据点位于等效线的左侧或以下(CI＜0.9)。对于给定剂量作用，拮抗联合的数据点位于等效线的右侧或以上(CI＞1.1)。图10.1a-c归纳了联合的FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib在MV4-11、Baf3-ITD和Baf3-wtFLT3中的等效分析。通过等效分析表明，在所有的试验中测得数据点上均出现协同作用，这些数据点包括导致细胞增殖50％抑制(ED50)、细胞增殖75％抑制(ED75)和细胞增殖90％抑制(ED90)的联合药物剂量。这些点中每个点明显落入等效(或加性)线的左侧，表明显著协同性。在测试的依赖FLT3的各细胞系中，联合的FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib导致显著抑制增殖的协同作用。图10.1a-c中所示等效图中的联合指数见下表1-3。

另外，图10.2a-b还总结了对化学上不同的FLT3抑制剂、FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib联合的等效分析。与联合的FLT3抑制剂化合物A和Tipifarnib相似，在所有测试剂量下和在所有测试的依赖FLT3的细胞系中，联合的FLT3抑制剂化合物H和Tipifarnib协同抑制细胞增殖。图5.2a-c中所示等效图中的联合指数见下表1-3。另外，图5.3a-c还归纳了对Tipifarnib和另一种化学上不同的FLT3抑制剂(FLT3抑制剂化合物E)联合的等效分析。与测试的其它联合药物一样，在所有测试的剂量下，在三种不同的细胞系中，联合的FLT3抑制剂化合物E和Tipifarnib协同抑制依赖FLT3的增殖。图5.3a-c中所示等效图中的联合指数见下表1-3。

为进一步扩展联合药物研究，还将已显示证实和Tipifarnib一起具有协同作用的各FLT3抑制剂与另一种法尼基转移酶抑制剂FII-176联合在一起，进行试验。表1-3归纳了所有联合药物在上述三种依赖FLT3的细胞系中的试验结果。各联合药物的联合指数列于表1-3。

表1

表1：通过联合指数(CI)测量联合的FLT3抑制剂和FTI(所有测试的联合药物)协同抑制MV4-11 AML细胞增殖。各化合物按固定比例进行联合，在下文生物活性测量部分归纳了增殖IC₅₀。按照Chou和Talalay方法，用Calcusyn软件(Biosoft)计算IC₅₀和CI值。CI和IC₅₀值为三个独立实验，并且每个数据点进行三份平行测定的平均值。

MV4-11细胞	CI-ED50	CI-ED75	CI-ED90	FTIIC50(nM)	FLT3抑制剂IC50(nM)
MV4-11细胞	CI-ED50	CI-ED75	CI-ED90	FTIIC50(nM)	FLT3抑制剂IC50(nM)	Tipifarnib	15.41
FTI-176				17.73		Tipifarnib	15.41
FTI-176				17.73		FLT3抑制剂化合物A		92.53
FLT3抑制剂化合物B					31.3	FLT3抑制剂化合物A		92.53
FLT3抑制剂化合物B					31.3	FLT3抑制剂化合物C		18.1
FLT3抑制剂化合物D					13.8	FLT3抑制剂化合物C		18.1
FLT3抑制剂化合物D					13.8	FLT3抑制剂		166.93

化合物H
化合物H						FLT3抑制剂化合物E					32.81
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物A	0.58	0.52	0.46	3.96	28.12	FLT3抑制剂化合物E					32.81
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物A	0.58	0.52	0.46	3.96	28.12	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物B	0.79	0.66	0.60	4.48	9.86
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物C	0.78	0.62	0.55	3.65	3.86	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物B	0.79	0.66	0.60	4.48	9.86
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物C	0.78	0.62	0.55	3.65	3.86	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物D	0.67	0.62	0.59	4.19	3.75
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物H	0.56	0.51	0.48	4.39	64.81	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物D	0.67	0.62	0.59	4.19	3.75
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物H	0.56	0.51	0.48	4.39	64.81	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物E	0.67	0.62	0.59	4.19	1.75
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物F	0.69	0.59	0.55	4.23	11.67	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物E	0.67	0.62	0.59	4.19	1.75
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物F	0.69	0.59	0.55	4.23	11.67	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物G	0.75	0.61	0.68	4.84	145.15
FTI176+FLT3抑制剂化合物A	0.62	0.60	0.59	4.63	30.12	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物G	0.75	0.61	0.68	4.84	145.15
FTI176+FLT3抑制剂化合物A	0.62	0.60	0.59	4.63	30.12	FTI176+FLT3抑制剂化合物H	0.66	0.63	0.61	5.81	50.94
FTI176+	0.68	0.64	0.61	5.69	9.37	FTI176+FLT3抑制剂化合物H	0.66	0.63	0.61	5.81	50.94

FLT3抑制剂化合物E
FLT3抑制剂化合物E						FTI176+FLT3抑制剂化合物D	0.71	0.63	0.60	4.72	5.48

表2

表2：按照联合指数(CI)测量，联合的FLT3抑制剂和FTI(所有测试的联合药物)协同抑制用100ng/mlFLT配体刺激的Baf3-FLT3细胞增殖。各化合物按固定比例进行联合，在下文生物活性测量部分归纳了增殖IC₅₀。按照Chou和Talalay方法，用Calcusyn软件(Biosoft)计算IC₅₀和CI值。CI和IC₅₀值为三个独立实验，并且每个数据点进行三份平行测定的平均值。

Baf3-FLT3	CI-ED50	CI-ED75	CI-ED90	FTI IC50(nM)	FLT3抑制剂IC50(nM)
Baf3-FLT3	CI-ED50	CI-ED75	CI-ED90	FTI IC50(nM)	FLT3抑制剂IC50(nM)	Tipifarnib	1.85
FTI-176				1.35		Tipifarnib	1.85
FTI-176				1.35		FLT3抑制剂化合物A		169.77
FLT3抑制剂化合物B					173.1	FLT3抑制剂化合物A		169.77
FLT3抑制剂化合物B					173.1	FLT3抑制剂化合物C		91.3
FLT3抑制剂化合物D					39.90	FLT3抑制剂化合物C		91.3
FLT3抑制剂化合物D					39.90	FLT3抑制剂化合物H		451.37
FLT3抑制					29.40	FLT3抑制剂化合物H		451.37

剂化合物E
剂化合物E						Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物A	0.45	0.40	0.37	0.333	48.24
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物B	0.78	0.67	0.62	0.431	23.26	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物A	0.45	0.40	0.37	0.333	48.24
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物B	0.78	0.67	0.62	0.431	23.26	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物C	0.81	0.71	0.65	0.442	63.41
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物D	0.60	0.53	0.49	0.360	12.31	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物C	0.81	0.71	0.65	0.442	63.41
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物D	0.60	0.53	0.49	0.360	12.31	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物H	0.38	0.36	0.35	0.277	125.28
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物E	0.42	0.39	0.38	0.360	23.26	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物H	0.38	0.36	0.35	0.277	125.28
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物E	0.42	0.39	0.38	0.360	23.26	FTI176+FLT3抑制剂化合物A	0.55	0.40	0.32	0.374	56.33
FTI176+FLT3抑制剂化合物D	0.60	0.56	0.48	0.380	11.61	FTI176+FLT3抑制剂化合物A	0.55	0.40	0.32	0.374	56.33
FTI176+FLT3抑制剂化合物D	0.60	0.56	0.48	0.380	11.61	FTI176+FLT3抑制	0.44	0.34	0.27	0.290	145.11

剂化合物H
剂化合物H						FTI176+FLT3抑制剂化合物E	0.49	0.39	0.33	0.391	25.16

表3

表3：按照联合指数(CI)测量，FLT3抑制剂和FTI联合(所有测试的联合药物)协同抑制Baf3-ITD细胞增殖。各化合物按固定比例进行联合，在下文生物活性测量部分归纳了增殖IC₅₀。按照Chou和Talalay方法，用Calcusyn软件(Biosoft)计算IC₅₀和CI值。CI和IC₅₀值为三个独立实验，并且每个数据点进行三份平行测定的平均值。

Baf3-FLT3细胞	CI-ED50	CI-ED75	CI-ED90	FTI IC50(nM)	FLT3抑制剂IC50(nM)
Baf3-FLT3细胞	CI-ED50	CI-ED75	CI-ED90	FTI IC50(nM)	FLT3抑制剂IC50(nM)	Tipifarnib				547.87
FTI-176				667.86		Tipifarnib				547.87
FTI-176				667.86		FLT3抑制剂化合物A					76.12
FLT3抑制剂化合物D					14.56	FLT3抑制剂化合物A					76.12
FLT3抑制剂化合物D					14.56	FLT3抑制剂化合物H					200.17
FLT3抑制剂化合物E					29.40	FLT3抑制剂化合物H					200.17
FLT3抑制剂化合物E					29.40	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物A	0.72	0.63	0.62	146.83	27.19
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物D	0.68	0.65	0.63	165.60	4.87	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物A	0.72	0.63	0.62	146.83	27.19
Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物D	0.68	0.65	0.63	165.60	4.87	Tipifarnib	0.92	0.87	0.84	172.80	71.49

+FLT3抑制剂化合物H
+FLT3抑制剂化合物H						Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物E	0.82	0.78	0.75	189.10	11.85
FTI-176+FLT3抑制剂化合物A	0.74	0.62	051	224.36	25.37	Tipifarnib+FLT3抑制剂化合物E	0.82	0.78	0.75	189.10	11.85
FTI-176+FLT3抑制剂化合物A	0.74	0.62	051	224.36	25.37	FTI-176+FLT3抑制剂化合物D	0.75	0.69	0.63	231.68	4.12
FTI-176+FLT3抑制剂化合物H	0.62	0.60	0.58	183.38	68.54	FTI-176+FLT3抑制剂化合物D	0.75	0.69	0.63	231.68	4.12
FTI-176+FLT3抑制剂化合物H	0.62	0.60	0.58	183.38	68.54	FTI-176+FLT3抑制剂化合物E	0.51	0.50	0.50	220.80	8.91

在所有使用依赖FLT3的细胞系中，发现测试的所有FTI和FLT3联合药物均具有联合给药的协同作用。联合的FTI和FLT3抑制剂使单一化合物的抗增殖作用减少平均3-4倍。可得出结论，发现的联合的FLT3抑制剂和FTI的协同作用的机制是基于现象的，与各FTI或FLT3抑制剂的具体化学结构无关。因此，FLT3抑制剂和Tipifarnib或任何其它FTI的任何联合应能出现协同生长抑制。

治疗与FLT3有关的病症的最终目标是杀灭病原细胞和促使疾病消退。为检验FTI/FLT3抑制剂联合药物是否协同杀灭依赖FLT3的致病细胞，尤其AML、ALL和MDS细胞，测试联合的Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A在MV4-11细胞中诱导荧光标记的膜联蛋白V染色增加的能力。与由质膜的内小叶易位到质膜的外小叶的磷酰丝氨酸结合的膜联蛋白V是完全公认的测量细胞凋亡的方法。参见van EngelandM.，L.J.Nieland等，(1998)″Annexin V-affinity assay：a review on anapoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure.″(膜联蛋白V-亲和力测定：关于基于磷酰丝氨酸暴露的凋亡检测系统的综述)Cytometry.31(1)：1-9。

在标准细胞培养条件下，将Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A单独或按固定比例(4∶1根据各单独药物的计算EC₅₀)与MV4-11细胞一起温育48小时。在化合物温育后，收获处理的细胞，按照下文生物活性测量部分中的方案，用Guava连接蛋白凋亡试剂盒，用膜联蛋白V-PE和7-AAD染色。因为凋亡晚期细胞开始分解，可视为碎片，所以膜联蛋白V染色峰值为60％。但是，由于其连续的S形动力学性质，故可由该数据计算EC₅₀。根据图11a中归纳的数据，可得出结论，联合的Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A诱导MV4-11细胞凋亡的活性显著强于任一单独药物。FLT3抑制剂FLT3抑制剂化合物A诱导膜联蛋白V染色的EC₅₀改变4倍以上。FTI Tipifarnib诱导膜联蛋白V染色的EC₅₀改变8倍以上。也用上述Chou和Talalay方法进行统计学分析，确定联合药物的协同作用。图11b所示为联合的Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A诱导膜联蛋白V染色的等效分析。所有数据点明显位于等效线的左侧。联合药物的CI值列于图11c中的表中。发现，在膜联蛋白V染色(和诱导凋亡)中的协同作用比联合的FLT3抑制剂和FTI抑制增殖的协同作用更明显。本领域技术人员无法预测联合的FTI和FLT3抑制剂协同诱导MV4-11细胞凋亡的幅度。因此根据增殖数据，任何FLT3抑制剂和FTI联合药物也应协同诱导依赖FLT3的细胞(即FLT3病症，尤其AML、ALL和MDS的病原细胞)凋亡。

为证实FLT3抑制剂和FTI的联合协同激活依赖FLT3的细胞凋亡，测试了几种FLT3抑制剂和FTI Tipifarnib联合药物诱导MV4-11细胞中胱冬酶3/7活性的能力。胱冬酶激活是最终实施程序性细胞死亡过程中的关键步骤，它可由多种细胞刺激诱导，这些细胞刺激包括生长因子撤除或生长因子受体抑制。参见Hengartner，MO.(2000)″Thebiochemistry of apoptosis.″(凋亡的生物化学)Nature 407：770-76和Nunez G，Benedict MA，Hu Y，Inohara N.(1998)″Caspases：the proteasesof the apoptotic pathway.″(胱冬酶：凋亡途径的蛋白酶)Oncogene17：3237-45。可用合成的胱冬酶3/7底物监测细胞胱冬酶激活，胱冬酶3/7底物解离后释放荧光素酶的底物，荧光素酶可将底物转化为发光产物。参见Lovborg H，Gullbo J，Larsson R.(2005)″Screening forapoptosis-classical and emerging techniques.″(传统的凋亡技术和新技术的筛选)Anticancer Drugs 16：593-9。按照下文生物活性测量部分中的方案，用Promega(Madison，WI)的胱冬酶Glo技术监测胱冬酶激活。

测定各化合物的EC₅₀，以建立联合药物协同作用分析的剂量比例。图12a-d归纳了各单独药物EC₅₀测定值。对于联合药物实验，在标准细胞培养条件下，在各种剂量(范围包括9、3、1、1/3、1/9×各化合物EC₅₀)下，按固定比例(根据各单独药物的计算EC₅₀)，使Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物B、C和D与MV4-11细胞一起温育24小时。24小时后，按厂商说明，测量胱冬酶3/7活性，详见下文生物活性测量部分。

图13.1-13.3归纳了Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物B、C和D联合药物在MV4-11细胞中出现胱冬酶激活的协同作用(按照前述Chou和Talalay方法)。在所有测试剂量和在所有测试的联合药物中，均出现协同作用。发现，对胱冬酶激活(和诱导凋亡)的协同作用甚至比联合的FLT3抑制剂和FTI对MV4-11细胞增殖的协同作用更明显。本领域技术人员无法预测联合的FTI和FLT3抑制剂协同诱导MV4-11细胞凋亡的幅度。因此根据增殖数据，任何FLT3抑制剂和FTI的联合也应协同诱导依赖FLT3的细胞(即FLT3病症，尤其AML、ALL和MDS的病原细胞)凋亡。

一致公认FLT3受体的增殖作用需要FLT3受体和下游激酶例如MAP激酶磷酸化。参见Scheijen，B.and J.D.Griffin(2002)″Tyrosinekinase oncogenes in normal hematopoiesis and hematological disease.″(存在于正常血细胞生成和血液病中的酪氨酸激酶癌基因)Oncogene21(21)：3314-33。我们假设FLT3抑制剂和FTI出现的协同作用的分子机制与引起AML细胞增殖和存活所需要的FLT3受体信号减少的化合物有关。为验证该假设，我们观察了FLT3-ITD受体和FLT3受体活性的下游靶的磷酸化状态。用市售试剂，按照下文生物活性测量部分中的详细方案，使MV4-11细胞中的MAP激酶(erk1/2)磷酸化。在标准细胞生长条件下，用设定浓度的FLT3抑制剂化合物A单独或与Tipifarnib联合处理MV4-11细胞48小时。对于FLT3磷酸化分析，收获细胞，使FLT3免疫沉淀，通过SDS-PAGE分离。对于MAP激酶(erk1/2)磷酸化分析，收获细胞，裂胞，通过SDS-Page分离，转移到硝基纤维素膜上进行免疫印迹分析。对于FLT3磷酸化定量分析，用磷酸酪氨酸抗体探测免疫印迹，用Molecular Dynamics Typhoon图像分析定量磷酸FLT3信号。然后将免疫印迹剥离，再探测，以定量总FLT3蛋白信号。用磷酸化与总蛋白信号的该比例计算粗略的化合物剂量反应的IC₅₀。对于MAP激酶(ERK1/2)磷酸化定量分析，用磷酸特异性ERK1/2抗体探测免疫印迹，用Molecular Dynamics Typhoon图像分析定量磷酸ERK1/2信号。然后将免疫印迹剥离，再探测，定量总ERK1/2蛋白信号。用磷酸化与总蛋白信号的该比例计算粗略的化合物剂量反应的IC₅₀。用GraphPad Prism软件计算IC₅₀值。该研究的结果归纳在图14。

发现，联合的Tipifarnib和FLT3抑制剂化合物A使FLT3抑制剂化合物A抑制FLT3磷酸化和MAP激酶磷酸化的活性增加2-3倍。这与化合物抗增殖作用的活性增加相一致。以前未报道过FTI/FLT3抑制剂联合药物具有使FLT3磷酸化的作用。使FLT3磷酸化的该作用的机制尚不得而知，但根据上述增殖抑制实验数据，可以预测任何FTI/FLT3抑制剂联合药物都会出现这种作用。

体外生物活性测量

试剂与抗体

Cell Titerglo增殖试剂源自Promega Corporation。蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物II购自Sigma(St.Louis，MO)。Guava连接蛋白凋亡试剂购自Guava technologies(Hayward，CA)。Superblock缓冲剂和SuperSignal Pico试剂购自Pierce Biotechno1ogy(Rockford，IL)。荧光偏振酪氨酸激酶试剂盒(Green)源自Invitrogen。小鼠抗磷酸酪氨酸(4G10)抗体购自Upstate Biotechnology，Inc(Charlottesville，VA)。抗人FLT3(兔IgG)购自Santa Cruz biotechnology(Santa Cruz，CA)。抗磷酸Map激酶和总p42/44Map激酶抗体购自Cell SignalingTechnologies(Beverly，MA)。碱性磷酸酯酶缀合的山羊-抗兔IgG和山羊-抗小鼠IgG抗体购自Novagen(San Diego，CA)。磷酸DDAO购自Molecular Probes(Eugene，OR)。所有组织培养试剂均购自BioWhitaker(Walkersville，MD)。

细胞系

THP-1(Ras突变、FLT3野生型)和人MV4-11(在具有t15；17易位的AML患者中分离的组成型表达FLT3-内串联重复或ITD突变体)AML细胞)(参见Drexler HG.The Leukemia-Lymphoma Cell LineFactsbook，Academic Pres：San Diego，CA，2000和Quentmeier H，Reinhardt J，Zaborski M，Drexler HG.FLT3 mutations in acute myeloidleukemia cell lines.(在急性髓细胞性白血病细胞系中的FLT3突变)Leukemia.2003 Jan；17：120-124)得自ATCC(Rockville，MD)。表达人野生型FLT3的依赖IL-3的鼠B-细胞始祖细胞系Baf3(Baf3-FLT3)和ITD突变的FLT3(Baf3-ITD)得自Dr.Michael Heinrich(Oregon HealthScience University)。将细胞维持在含青霉素/链霉素、10％FBS单独(THP-1，Baf3-ITD)和2ng/ml GM-CSF(MV4-11)或10ng/ml FLT配体(Baf3-FLT3)的RPMI培养基中。MV4-11、Baf3-ITD和Baf3-FLT3细胞的生长均完全依赖FLT3活性。GM-CSF增加MV4-11细胞中的FLT3-ITD受体活性。

MV4-11、Baf3-ITD、Baf3-FLT3和THP-1细胞增殖测定

为测量试验化合物增殖的抑制，使用基于荧光素酶的CellTiterGlo试剂(Promega)。按10,000细胞/孔，将细胞接种在含青霉素/链霉素、10％FBS单独(THP-1，Baf3-ITD)和0.2ng/ml GM-CSF(MV4-11)或10ng/ml FLT配体(Baf3-FLT3)的100μlRPMI培养基中。将化合物稀释液或0.1％DMSO(溶媒对照)加入细胞，在标准细胞生长条件(37℃，5％CO₂)下，让细胞生长72小时。在联合药物实验中，将试验药物同时加入细胞。根据第0日细胞数目与第3日总细胞数目(72小时生长和/或化合物处理)的发光计数(相对光单位，RLU)差，定量总细胞生长。将100％生长抑制定义为相当于第0日读数的RLU。将0％抑制定义为在第3日DMSO溶媒对照中生长的RLU信号。所有数据点均为三份平行样品的平均值。生长抑制的IC₅₀代表在第3日导致DMSO溶媒对照中总细胞生长50％抑制的化合物剂量。用GraphPad Prism进行IC₅₀的数据分析，用多参数、S形剂量-反应(可变斜率)方程进行非线性回归拟合。

免疫沉淀和定量免疫印迹分析

使MV4-11细胞生长在补充10％胎牛血清，2ng/ml GM-CSF的DMEM中，浓度保持1×10⁵-1×10⁶细胞/ml。对于Map激酶磷酸化的蛋白质印迹分析，在各条件下，使用1×10⁶MV4-11细胞。对于检测FLT3-ITD磷酸化的免疫沉淀实验，在各实验条件下，使用1×10⁷细胞。用化合物处理后，用冷1×PBS洗涤MV4-11细胞一次，用HNTG裂解缓冲液(50mM Hepes，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X-100，10mM NaF，1mM EDTA，1.5mM MgCl₂，10mM焦磷酸钠)+4μl/ml蛋白酶抑制剂混合物(Sigma cat.#P8340)+4μl/ml磷酸酶抑制剂混合物(Sigma Cat#P2850)裂胞。通过离心(在4℃下按5000rpm离心5min.)，除去细胞裂解产物中的细胞核和碎片。在4℃下，用琼脂糖-蛋白质A/G将免疫沉淀的细胞裂解产物澄清30分钟，在4℃下，用3μgFLT3抗体免疫沉淀1小时。然后在4℃下，将免疫复合物与琼脂糖-蛋白质A/G一起温育1小时。将蛋白质A/G免疫沉淀物用1.0ml HNTG裂解缓冲液洗涤三次。将免疫沉淀物和细胞裂解产物(40μg总蛋白)溶于10％SDS-PAGE凝胶上，将蛋白转移到硝基纤维素膜上。对于抗磷酸酪氨酸免疫印迹分析，用SuperBlock(Pierce)封闭膜，依次用抗磷酸酪氨酸(Clone 4G10，Upstate Biotechnologies)、碱性磷酸酯酶缀合的山羊抗小鼠抗体印迹分析2小时。对于抗磷酸MAP激酶蛋白质印迹，将膜用Super封闭液封闭1小时，用初级抗体印迹过夜，然后和AP缀合的山羊抗兔次级抗体一起温育。通过用Molecular Dynamics Typhoon成像系统(Molecular Dynamics，Sunyvale，CA)测量碱性磷酸酯酶与底物磷酸9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)二铵盐(磷酸DDAO)(Molecular Probes)反应的荧光产物，检测蛋白。剥离印迹，用抗FLT3抗体再探测，将磷酸化信号归一化。用Molecular Dynamics ImageQuant和GraphPad Prism软件定量磷酸DDAO信号并确定IC₅₀。

膜联蛋白V染色

为检测白血病MV4-11细胞系凋亡，用Tipifarnib和/或FLT3抑制剂化合物A处理细胞，用Guava连接蛋白测定试剂和Guava个人用移动血细胞计数系统(Guava Technologies；Hayward，CA)监测与凋亡细胞的质膜外小叶上的磷酰丝氨酸结合的膜联蛋白V。按200,000细胞/ml，将MV4-11细胞接种在含各种浓度Tipifarnib和/或FLT3抑制剂化合物A的组织培养基中，在37℃下，5％CO₂下，温育48小时。在4℃下，通过在400xg下离心10分钟，收获细胞。然后用1×PBS洗涤细胞，按1×10⁶细胞/ml，再悬浮于1×连接蛋白缓冲液中。将5μl膜联蛋白V-PE和5μl7-AAD加入40μl细胞悬浮液中，在冰上温育20分钟，避光。将450ml冷1×连接蛋白缓冲液加入各样品中，然后按照厂商说明，在Guava血细胞计数器上采集细胞。将所有膜联蛋白阳性细胞视为凋亡细胞，计算膜联蛋白阳性细胞百分率。

胱冬酶3/7激活测定

使MV4-11细胞生长在含青霉素/链霉素、10％FBS和1ng/mLGM-CSF的RPMI培养基中。使细胞浓度保持在2×10⁵细胞/mL-8×10⁵细胞/mL，每2-3天进行加料/分离。将细胞离心，按2×10⁵细胞/mL，再悬浮于含青霉素/链霉素、10％FBS和0.1ng/mL GM-CSF的RPMI培养基中。在各种浓度的试验化合物或DMSO的存在下，按20,000细胞/孔，将MV4-11细胞接种在100μL含青霉素/链霉素、10％FBS单独和0.1ng/mL GM-CSF(Corning Costar Cat#3610)的RPMI培养基中。在联合药物实验中，将试验药物同时加入细胞中。在37℃下，5％CO₂下，将细胞温育24小时。24小时温育后，按照厂商说明，用Promega胱冬酶Glo试剂(Cat#G8090)测量胱冬酶活性。简而言之，将胱冬酶Glo底物用10mL胱冬酶Glo缓冲液稀释。将1体积稀胱冬酶Glo试剂加入到1体积组织培养基中，在旋转定轨摇床上混合2分钟。在室温下温育60分钟后，在Berthold发光计上，按1秒钟程序测量发射光。将基线胱冬酶活性定义为相当于DMSO溶媒(0.1％DMSO)处理细胞的RLU。用GraphPad Prism完成EC₅₀数据分析，用多参数、S形剂量-反应(可变斜率)方程进行非线性回归拟合。

联合指数分析

为按Chou和Talalay方法(Chou和Talalay，参见Chou TC，TalalayP.(1984)″Quantitative analysis of dose-effect relationships：the combinedeffects of multiple drugs or enzyme inhibitors.″(剂量-作用关系的定量分析：多药物或酶抑制剂的联合作用)Adv Enzyme Regul.22：27-55)检测FTI和FLT3抑制剂联合药物抑制生长的协同作用，按固定比例的药物联合给药，进行等效统计学分析。按各细胞系单独增殖IC50的固定比例，将试验药物混合，按各种浓度包括9、3、1、1/3、1/9×测得的IC50剂量给药。为测量试验联合药物的增殖抑制，使用基于荧光素酶的CellTiterGlo试剂(Promega)。按10,000细胞/孔，将细胞接种在含青霉素/链霉素、10％FBS单独(THP-1，Baf3-ITD)和0.1ng/mLGM-CSF(MV4-11)或100ng/ml FLT配体(Baf3-FLT3)的100μl RPMI培养基中。根据第0日细胞数目与第3日总细胞数目(72小时生长和/或化合物处理)的发光计数(相对光单位，RLU)差，定量总细胞生长。所有数据点均为三份平行样品的平均值。将100％生长抑制定义为相当于第0日读数的RLU。将0％抑制定义为在第3日DMSO溶媒对照中生长的RLU信号。用Calcsyn(BioSoft，Ferguson，MO)和计算的联合指数(C.I.)分析抑制数据。当C.I.值＜0.9时，认为有协同作用。

联合药物体内研究

用FLT3抑制剂化合物B和D检测FLT3抑制剂FLT3抑制剂化合物和Tipifarnib(Zarnestra^TM)对在裸小鼠中MV-4-11人AML肿瘤异种移植物生长的联合处理作用。设计该体内研究为体外观察的延伸，以评价各自一起经口给予具有建立MV-4-11肿瘤异种移植物的裸小鼠Tipifarnib的FLT3抑制剂化合物B和D，产生协同抗肿瘤作用的潜力。

FLT3抑制剂化合物B单独的抗肿瘤作用

雌性无胸腺裸小鼠(CD-1，nu/nu，9-10周龄)得自Charles River实验室(Wilmington，MA)，按照NIH标准管理。在清洁房间条件下，按照12小时光明/黑夜周期，在无菌微型隔离笼中，将所有小鼠分组饲养(5只小鼠/笼)，室温保持在21-22℃下，湿度保持在40-50％。让小鼠自由食用经辐照的标准鼠饲料和水。所有动物均饲养在实验室动物医疗设施中，该设施通过美国实验室动物管理评价和鉴定委员会(AAALAC)全部认证。涉及动物的所有方法均按照NIH实验室动物管理和使用准则操作，所有方案均经过国家动物管理和使用委员会(IACUC)批准。

人白血病MV4-11细胞系得自美国典型培养物保藏中心(ATCC保藏号：CRL-9591)，使其在含10％FBS(胎牛血清)和5ng/mL GM-CSF(R&D Systems)的RPMI培养基中繁殖。MV4-11细胞源自具有11q23易位的儿童急性粒单核细胞白血病患者，该易位导致MLL基因重排并含FLT3-ITD突变(AML亚型M4)(1，2)。因天然产生FLT3/ITD突变，MV4-11细胞组成型表达活性磷酸化FLT3受体。预计在裸小鼠肿瘤异种移植物模型中，对MV4-11肿瘤生长具有强抗肿瘤活性是本发明需要的性质。

在预试生长研究中，确定以下条件可使MV4-11细胞作为皮下实体瘤异种移植物在裸小鼠中生长：临注射前，用PBS洗涤细胞，计数，使其悬浮于1∶1的PBS：Matrigel混合物(BD Biosciences)中，然后装载到配备25号针头的预冷1cc注射器中。按0.2mL释放体积，在重量不超过20-21克的雌性无胸腺裸小鼠大腿的左腹股沟区域皮下接种5×10⁶肿瘤细胞。对于消退研究，在开始给药前，让肿瘤生长至预定大小。接种肿瘤细胞约3周后，将具有大小为106-439mm³(在该范围内有60只小鼠)的皮下肿瘤的小鼠随机分配到处理组，以使所有处理组动物具有相似的～200mm³初始平均肿瘤体积。在周日期间，每日两次(b.i.d.)，在周末，每日一次(q.d.)，给小鼠经口管饲溶媒(对照组)或各种剂量的化合物。根据用溶媒处理的对照小鼠的肿瘤生长动力学和肿瘤大小，继续连续给药11天。如果对照小鼠的肿瘤达到～10％体重(～2.0克)，终止研究。用20％HPβCD/2％NMP/10mM磷酸钠，pH3-4(NMP＝Pharmasolve，ISP Technologies，Inc.)或其它合适的溶媒，每日制备新鲜的FLT3抑制剂化合物的澄清溶液(@1、3和10mg/mL)，按上述经口给药。在研究期间，用电子游标卡尺每周测量肿瘤生长三次(M，W，F)。用式(L×W)²/2计算肿瘤体积(mm³)，其中L＝肿瘤的长度(mm)，W＝肿瘤的宽度(最短距离，以mm表示)。每周测量三次体重，用体重下降＞10％作为化合物缺乏耐受性的指标。不能接受的毒性定义为在研究期间体重下降＞20％。在各剂量下，每日严格检查小鼠出现与药物有关的不良副作用的明显临床体征。

在研究结束当天，得到各动物的肿瘤终体积和终体重。用100％CO2将小鼠无痛处死，立即完整切除肿瘤，称重，将终肿瘤湿重(克)作为初步效力终点。

FLT3抑制剂化合物对MV4-11肿瘤生长的抑制作用的时程说明见图1。数值代表15只小鼠/处理组的平均值(±sem)。计算相对于在研究的最后一天溶媒处理对照组肿瘤生长的肿瘤生长抑制％(％I)。

依次通过方差分析(ANOVA)、Dunnett t-检验确定与对照相比的统计学显著性：^*p＜0.05；^**p＜0.01。

在研究结束时，注意到最终肿瘤重量出现相似下降(参见图2)。除在研究结束时，在高剂量组中，15只小鼠中仅有5只被处死外，数值代表15只小鼠/处理组的平均值(±sem)。计算相对于溶媒处理对照组平均肿瘤重量的抑制％。依次通过ANOVA、Dunnett t-检验确定与对照相比的统计学显著性：^**p＜0.01。

图1：按剂量10、30和100mg/kgb.i.d.，连续11天，通过管饲经口给予FLT3抑制剂化合物B，得到有统计学显著性的剂量依赖性抑制裸小鼠皮下生长的MV4-11肿瘤生长。在治疗的最后一天(第11日)，在剂量10、30和100mg/kg下，相对于溶媒处理组的平均肿瘤体积，平均肿瘤体积按剂量依赖性分别减少44％、84％(p＜0.01)和94％(p＜0.01)。在30mg/kg和100mg/kg剂量下，相对于第1天初始平均肿瘤体积，出现肿瘤消退，分别减少42％和77％，具有显著性统计学意义。在测试的最低剂量10mg/kg下，出现适当的生长延缓(与对照相比44％I)，但该作用无显著性统计学意义。

图2：在连续11天经口给药后，相对于溶媒处理组的平均肿瘤重量，FLT3抑制剂化合物B产生具有统计学显著性的剂量依赖性减少最终肿瘤重量，在10、30和100mg/kg剂量下，分别减少48％、85％(p＜0.01)和99％(p＜0.01)。在一些小鼠中，在高FLT3抑制剂化合物B剂量下，最终肿瘤消退为不明显的无法检测的肿瘤。

在研究期间，每周三次称量小鼠重量(M，W，F)，在给药时，每日检查任何与药物有关不良副作用的明显临床体征。在11天治疗期间，在高达200mg/kg/日剂量下，未发现FLT3抑制剂化合物B产生明显毒性，也未发现对体重产生明显的不良作用。总之，在所有FLT3抑制剂化合物B剂量组中，平均体重下降＜初始体重的3％，表明FLT3抑制剂化合物耐受性良好。

为进一步确定FLT3抑制剂化合物到达肿瘤组织的期望靶，在溶媒和化合物处理小鼠中测定肿瘤组织中FLT3磷酸化水平。FLT3抑制剂化合物B的结果如图3所示。对于该药效学研究，从溶媒处理对照组中抽取10只小鼠的亚组，将它们随机分为两组，每组5只小鼠，然后用另一个剂量的溶媒或化合物(100mg/kg，po)处理。2小时后，收获肿瘤，快速冷冻，通过免疫印迹评价FLT3磷酸化。

按以下方式处理收获的肿瘤，以通过免疫印迹分析FLT3磷酸化：在补充磷酸酯酶(Sigma Cat#P2850)和蛋白酶抑制剂(Sigma Cat#P8340)的裂解缓冲液(50mM Hepes，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X-100，10mM NaF，1mM EDTA，1.5mM MgCl₂，10mM焦磷酸钠)中，用杜恩斯匀浆器将100mg肿瘤组织匀浆。在4℃下，按1000xg离心5分钟，除去不溶碎片。在4℃下，缓慢搅拌下，将澄清的裂解产物(在裂解缓冲液中，15mg总蛋白，10mg/ml)与10μg琼脂糖缀合的抗FLT3抗体、克隆C-20(Santa Cruz cat#sc-479ac)一起温育2小时。然后用裂解缓冲液洗涤肿瘤裂解产物中的免疫沉淀FLT3四次，通过SDS-PAGE分离。将该SDS-PAGE凝胶转移到硝基纤维素膜上，依次用抗磷酸酪氨酸抗体(克隆-4G10，UBI cat.#05-777)、碱性磷酸酯酶缀合的山羊抗小鼠次级抗体(Novagen cat.#401212)进行免疫印迹。通过用Molecular Dynamics Typhoon成像系统(Molecular Dynamics，Sunyvale，CA)测量碱性磷酸酯酶与底物磷酸9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)二铵盐(磷酸DDAO)(Molecular Probes cat.#D 6487)反应的荧光产物，检测蛋白。然后剥离印迹，用抗FLT3抗体再探测，使磷酸化信号归一化。

按照图3说明，相对于溶媒处理小鼠中的肿瘤，在100mg/kg下，单剂量的FLT3抑制剂化合物B使MV4-11肿瘤中的FLT3磷酸化水平降低，具有显著生物学意义(总FLT3如底图所示)。这些结果进一步证明，本发明化合物事实上在肿瘤中与期望的FLT3靶相互作用。

按前述体内评价FLT3抑制剂化合物B的口服抗肿瘤效力，如前述制备具有MV-4-11肿瘤的裸小鼠。

FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib一起给药的抗肿瘤作用

按前述体内评价FLT3抑制剂化合物B的单独的口服抗肿瘤效力，如前述制备具有MV-4-11肿瘤的裸小鼠。

将15只具有MV-4-11肿瘤的裸小鼠随机分入5个处理组，各处理组中各小鼠的平均肿瘤大小相等。用式(L×W)²/2计算肿瘤体积(mm³)，其中L＝肿瘤的长度(mm)，W＝肿瘤的宽度(最短距离，按mm计)。各处理组的初始平均肿瘤体积为约250mm³。

在周日期间，每日两次(bid)；在周末，每日一次(qd)，经口给予小鼠溶媒(20％HPβCD/2％NMP/10mM磷酸钠，pH3-4(NMP＝Pharmasolve，ISP Technologies，Inc.)、亚有效剂量的FLT3抑制剂化合物B(10mg/kg)、有效剂量的FLT3抑制剂化合物B(20mg/kg)和单独或与各剂量的FLT3抑制剂化合物B联合的Tipifarnib(50mg/kg)。继续连续给药9天。在研究期间，用电子游标卡尺测量肿瘤生长三次。研究期间测量体重三次，用体重下降＞10％作为化合物缺乏耐受性的指标。

用FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib单独和联合处理对MV-4-11肿瘤生长影响的时程说明见图15。如图所示，相对于肿瘤体积达到约800mm³的溶媒处理组，按10mg/kg剂量bid给予FLT3抑制剂化合物B，产生肿瘤生长边际显著性抑制。相对于溶媒处理组，按20mg/kg剂量bid给予FLT3抑制剂化合物B显著抑制肿瘤生长，与对照相比较，完全控制肿瘤生长。发现该剂量导致肿瘤生长停滞，但未引起肿瘤消退(定义为肿瘤大小小于研究开始时的肿瘤大小)。按图15说明，在处理的最后一天(第9天)，与对照相比，Tipifarnib(50mg/kg)单独未显著减少肿瘤体积。数值代表15只小鼠/处理组的平均值(±sem)。计算相对于研究最后一天溶媒处理对照组中肿瘤生长的肿瘤生长抑制百分率。依次通过ANOVA、Dunnett t-检验确定与对照相比的统计学显著性：^*p＜0.01。

再如图15所示，按50mg/kg剂量，Tipifarnib单一药物给药无效。但是，当联合口服给予两种药物时，相对于按10或20mg/kg给予FLT3抑制剂化合物B时第1天平均初始肿瘤体积，肿瘤体积消退具有统计学显著性。在第9天，相对于溶媒处理对照组，该组的平均肿瘤体积抑制为95％。因此，联合药物处理产生抑制作用(即肿瘤消退)，该作用比单独给予任一药物强得多。实际上，尽管联合在一起显著得到肿瘤基本上完全消退的作用，但Tipifarnib(50mg/kg)和10mg/kg、单独的FLT3抑制剂化合物B基本上无效。

图15说明单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积影响。

图16说明单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对在最后研究日裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物终体积的影响。如图16所示，在研究结束时，除最终肿瘤重量具有统计学显著性外，当对比各处理组的最终肿瘤体积时，发现联合药物处理出现协同作用。

图17说明单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib对在研究结束日裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物最终肿瘤重量的影响。如图17所示，在研究结束时，当与给予单独药物的适当处理组的最终肿瘤重量比较时，通过测量10mg/kg FLT3抑制剂化合物B/50mg/kg Tipifarnib联合药物处理组的肿瘤重量，证明具有协同作用。

在用药物单独或联合处理9天中，未发现明显的毒性和对体重的显著不良作用。总之，用FLT3抑制剂化合物B和Tipifarnib联合药物处理，显著产生比单独给予FLT3抑制剂化合物B或Tipifarnib更强的肿瘤生长抑制作用。

FLT3抑制剂化合物D单独的抗肿瘤作用

按照前文所述体内评价FLT3抑制剂化合物B的口服抗肿瘤效力的方法，用裸小鼠的MV4-11人肿瘤异种移植物消退模型，在无胸腺裸小鼠体内评价本发明FLT3抑制剂化合物D的口服抗肿瘤效力。

按照前文所述体内评价FLT3抑制剂化合物B的单独口服抗肿瘤效力的方法，制备具有MV-4-11肿瘤的裸小鼠。

按0.2mL释放体积，在重量不超过20-21克的雌性无胸腺裸小鼠大腿的左腹股沟区域皮下接种5×10⁶肿瘤细胞。对于消退研究，在开始给药前，让肿瘤生长至预定大小。接种肿瘤细胞约3周后，将具有大小为100-586mm³(在该范围内有60只小鼠；均值288±133mm³(SD)皮下肿瘤的小鼠随机分配到处理组，以使所有处理组动物具有统计学上相似的初始平均肿瘤体积(mm³)。在周日期间，每日两次(b.i.d.)；在周末，每日一次(q.d.)，给小鼠经口管饲溶媒(对照组)或各种剂量的化合物。根据溶媒处理的对照小鼠的肿瘤生长动力学和肿瘤大小，继续连续给药11天。如果对照小鼠的肿瘤达到～10％体重(～2.0克)，终止研究。用20％HPβCD/D5W，pH3-4或其它合适的溶媒，每日制备新鲜的FLT3抑制剂化合物D的澄清溶液(@1、5和10mg/mL)，按上述经口给药。在研究期间，用电子游标卡尺每周测量肿瘤生长三次(M，W，F)。用式(L×W)²/2计算肿瘤体积(mm³)，其中L＝肿瘤的长度(mm)，W＝肿瘤的宽度(最短距离，以mm表示)。每周测量体重三次，用体重下降＞10％作为化合物缺乏耐受性的指标。不能接受的毒性定义为在研究期间体重下降＞20％。在各剂量下，每日严格检查小鼠出现的与药物有关的不良副作用的明显临床体征。

在研究结束当天(第12天)，各动物得到最终肿瘤体积和最终体重。用100％CO₂将小鼠无痛处死，立即完整切除肿瘤，称重，将最终肿瘤湿重(克)作为初级效力终点。

本发明FLT3抑制剂化合物D对MV4-11肿瘤生长的抑制作用的时程说明见图18。数值代表15只小鼠/处理组的平均值(±sem)。在研究的最后一天，计算相对于溶媒处理对照组肿瘤生长的肿瘤生长抑制％(％I)，依次通过方差分析(ANOVA)、Dunnett t-检验确定与对照相比的统计学显著性：^*p＜0.05；^**p＜0.01。

如图18所示，按10、50和100mg/kg剂量，b.i.d.，连续11天经口管饲给予本发明FLT3抑制剂化合物D，产生具有统计学显著性的剂量依赖性抑制裸小鼠皮下生长的MV4-11肿瘤生长。在处理最后一天(第11天)，在50和100mg/kg剂量下，相对于溶媒处理组的平均肿瘤体积，平均肿瘤体积剂量依赖性减少接近100％抑制(p＜0.001)。在50mg/kg和100mg/kg剂量下，本发明FLT3抑制剂化合物D产生肿瘤消退作用，相对于第1天初始平均肿瘤体积，分别减少98％和93％，均具有统计学显著性。在最低试验剂量10mg/kg下，相对于溶媒处理对照组，未出现显著生长延缓。在100mg/kg剂量处理组中，当在第12天停止给药，让肿瘤再生长，在研究第34天，仅有6/12小鼠出现明显可测量的肿瘤。

在研究结束时，通过无可测量的残余肿瘤表明，本发明FLT3抑制剂化合物D产生使肿瘤实质几乎完全消退的作用(参见图19)。图19中柱状图代表15只小鼠/处理组的平均值(±sem)。如图所示，在10mg/kg剂量下，最终肿瘤重量未显著减少，与图18中肿瘤体积数据一致。在50mg/kg剂量下，在图中无代表的柱状图，因为在结束时，在这些小鼠中无可测量的肿瘤实质，与图18中所示肿瘤体积完全消退相一致。在该图中，无代表100mg/kg剂量组的柱状图，因为让这些小鼠停药，按上述让残余肿瘤再生长。

在连续11天经口给药后，相对于溶媒处理组的平均肿瘤重量，本发明FLT3抑制剂化合物D产生剂量依赖性减少最终肿瘤重量，在50mg/kg剂量下，注意到肿瘤实质完全消退(参见图19)。

在研究期间，每周称量小鼠重量三次(M，W，F)，在给药时，每日检查与药物有关的任何不良副作用的明显临床体征。在11天处理期间，在高达200mg/kg/日剂量下，未发现本发明FLT3抑制剂化合物D出现明显毒性，也未发现对体重产生显著不良作用(参见图20)。总之，在所有剂量组中，相对于初始体重，体重未显著下降，表明本发明FLT3抑制剂化合物D耐受性良好。

为进一步确定本发明FLT3抑制剂化合物D到达肿瘤组织的期望靶，在溶媒和化合物处理小鼠中测定得到肿瘤组织中FLT3磷酸化水平。本发明FLT3抑制剂化合物D的结果如图21所示。对于该药效学研究，从溶媒处理对照组中抽取6只小鼠亚组，将它们随机分为3组，每组2只小鼠，然后用另一个剂量的溶媒或化合物(10和100mg/kg，po)处理。6小时后，收获肿瘤，快速冷冻，通过蛋白质印迹评价FLT3磷酸化。

将收获的肿瘤冷冻，处理，按以下方式通过免疫印迹分析FLT3磷酸化：在补充磷酸酯酶(Sigma Cat#P2850)和蛋白酶抑制剂(SigmaCat#P8340)的裂解缓冲液(50mM Hepes，150mM NaCl，10％甘油，1％Triton-X-100，10mM NaF，1mM EDTA，1.5mM MgCl₂，10mM焦磷酸钠)中，用杜恩斯匀浆器将200mg肿瘤组织匀浆。在4℃下，按1000xg离心5分钟，除去不溶碎片。在4℃下，缓慢搅拌下，将澄清的裂解产物(在裂解缓冲液中15mg总蛋白，10mg/ml)与10μg琼脂糖缀合的抗FLT3抗体、克隆C-20(Santa Cruz cat#sc-479ac)一起温育2小时。

然后用裂解缓冲液洗涤肿瘤裂解产物中的免疫沉淀FLT3四次，通过SDS-PAGE分离。将该SDS-PAGE凝胶转移到硝基纤维素膜上，依次用抗磷酸酪氨酸抗体(克隆-4G10，UBI cat.#05-777)、碱性磷酸酯酶缀合的山羊抗小鼠次级抗体(Novagen cat.#401212)进行免疫印迹。通过使用Molecular Dynamics Typhoon成像系统(Molecular Dynamics，Sunyvale，CA)测量碱性磷酸酯酶与底物磷酸9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)二铵盐(磷酸DDAO)(Molecular Probes cat.#D6487)反应的荧光产物，检测蛋白。然后剥离印迹，用抗FLT3抗体再探测，使磷酸化信号归一化。

按图21中说明，相对于溶媒处理小鼠的肿瘤(肿瘤1和2)，在100mg/kg下，单剂量的本发明FLT3抑制剂化合物D产生使MV4-11肿瘤中FLT3磷酸化水平生物学显著性降低(上图，肿瘤5和6)(总FLT3显示于下图中)。在用10mg/kg化合物处理的动物中，也部分减少磷酸化(肿瘤3-4)。这些结果进一步证明，本发明化合物实际上与肿瘤中预计的FLT3靶相互作用。

FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib一起给药的抗肿瘤作用

为证明联合的FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib在MV-4-11异种移植模型中的体内协同作用，按前文所述体内评价FLT3抑制剂化合物B的单独口服抗肿瘤效力的方法，制备具有肿瘤的裸小鼠。

将具有MV-4-11肿瘤的裸小鼠随机分入4个处理组，每组10只小鼠，各处理组的平均肿瘤大小相等。用式(L×W)²/2计算肿瘤体积(mm³)，其中L＝肿瘤的长度(mm)，W＝肿瘤的宽度(最短距离，按mm计)。各处理组的初始平均肿瘤体积为约250mm³。

在周日期间，每日两次(bid)；在周末，每日一次(qd)，经口给予小鼠溶媒(20％HPβCD，pH3-4)或单独或联合的亚有效剂量的FLT3抑制剂化合物D(25mg/kg)或Tipifarnib(50mg/kg)。继续连续给药16天。用电子游标卡尺测量肿瘤生长，每周3次(星期一、星期三、星期五)，每周3次测量体重，用体重下降＞10％作为化合物缺乏耐受性的指标。

FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib单独和联合处理对MV-4-11肿瘤生长的影响时程说明见图22。如图所示，按25mg/kg剂量，bid给予FLT3抑制剂化合物D，相对于肿瘤体积达到约1500mm³的溶媒处理组产生肿瘤生长停滞。按图22中说明，在最后处理日(第16天)，相对于溶媒处理对照组，肿瘤体积显著抑制达76％。数值代表10只小鼠/处理组的平均值(±sem)。计算在最后研究日相对于溶媒处理对照组肿瘤生长的肿瘤生长抑制％。依次通过ANOVA、Dunnett t-检验确定与对照相比的统计学显著性：^*p＜0.01。

如图22所示，按50mg/kg剂量，Tipifarnib单一药物给药无效。但是，经口联合给予两种药物，相对于第1天平均初始肿瘤体积，出现肿瘤体积消退，具有显著性统计学意义。在第16天，相对于溶媒处理对照组，该组平均肿瘤体积抑制达95％。因此，联合药物处理产生抑制作用(即肿瘤消退)，该作用是各药物单独给药加性作用的约1.3倍，表明具有协同作用(参见图22)。

图23说明单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib对在裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物生长的肿瘤体积影响。图24说明单独或联合经口给予FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib对裸小鼠中MV-4-11肿瘤异种移植物最终重量的影响。如图24所示，在研究结束时，当对比各处理组的最终肿瘤重量时，发现联合药物处理组具有相似的协同作用。

在16天的药物单独或联合处理期间，未发现出现明显毒性，也未发现对体重产生显著不良作用。在给予最后剂量的化合物2小时后，采集血浆和肿瘤样品，测定药物水平。总之，用FLT3抑制剂化合物D和Tipifarnib联合药物处理，产生比单独给予FLT3抑制剂化合物D或Tipifarnib显著更强的肿瘤生长抑制作用。

结论

我们在本文中提供FTI和FLT3抑制剂联合药物在体内和体外协同抑制依赖FLT3的细胞(例如源自具有FLT3-ITD突变患者的AML细胞)生长和诱导其死亡的明显证据。在体外研究中，在多种依赖FLT3的细胞系中，通过Chou和Talalay的联合指数法和半数作用法(medianeffect method)，用联合的单次亚最佳剂量的各化合物，证明FTI/FLT3抑制剂联合药物可协同抑制AML细胞增殖。另外，联合的FTI和FLT3抑制剂还在依赖FLT3的AML细胞中诱导突然的细胞死亡。该凋亡诱导作用显著强于单独的任一药物。在多种结构不同的FLT3抑制剂和两种不同的FTI中发现FTI/FLT3抑制剂联合的该协同作用。因此，任何FLT3抑制剂/FTI联合均会出现该协同抑制增殖和诱导凋亡作用。有意义的是，联合的FTI Tipifarnib和FLT3抑制剂显著增加FLT3抑制剂介导的FLT3受体信号减少的活性。另外，在体内肿瘤模型中，用依赖FLT3的AML细胞(MV4-11)和联合的FTI Tipifarnib和两种化学上不同的FLT3抑制剂(FLT3抑制剂化合物B和D)，概括性重复了用体外方法发现的协同作用。因此，在任何FLT3抑制剂/FTI联合中，均会出现该作用。据我们所知，这是联合的FTI和FLT3抑制剂协同杀灭AML细胞的首次发现。另外，基于以前的数据，在该联合药物中出现的协同作用对本领域技术人员而言不是显而易见的。发现的该协同作用很可能与以下因素有关：已知的FTI抑制小GTP酶(Ras和Rho)、NfkB驱动的增殖和存活以及FLT3抑制剂通过FLT3受体减少增殖和存活信号的能力。另外，FTI/FLT3抑制剂联合药物对FLT3受体本身的活性具有显著作用。尽管该作用机制目前尚不得而知，但在FLT3抑制剂/FTI联合药物中发现的抑制细胞增殖和激活细胞死亡中很可能具有重要作用。总之，这些研究为FLT3病症，尤其表达野生型或突变型FLT3的血癌提供了新的治疗范例，和为测试FTI和FLT3抑制剂联合药物治疗FLT3病症，尤其AML、ALL和MDS的临床试验设计提供了基础。

虽然前述说明书通过举例说明目的提供的实施例，教授了本发明原理，但可以理解，本发明的实施包括落入权利要求及其等同权利要求范围内的所有通常变化、改变和/或修改。

Claims

1.一种减少或抑制患者中FLT3酪氨酸激酶表达或活性的方法，所述方法包括给予所述患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为

其中n为1、2、3或4；

R₃为独立选自以下的一个或多个取代基：氢、烷基、烷氧基、卤素、烷氧基醚、羟基、硫基、硝基、任选被R₄取代的环烷基、任选被R₄取代的杂芳基、烷基氨基、任选被R₄取代的杂环基、-O(环烷基)、任选被R₄取代的吡咯烷酮基、任选被R₄取代的苯氧基、-CN、-OCHF₂、-OCF₃、-CF₃、卤代烷基、任选被R₄取代的杂芳氧基、二烷基氨基、-NHSO₂烷基、硫烷基或-SO₂烷基；其中R₄独立选自卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-CO₂烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或烷基氨基。

2.一种治疗患者与FLT3酪氨酸激酶表达或活性有关的病症的方法，所述方法包括给予所述患者FLT3激酶抑制剂和法尼基转移酶抑制剂，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、苯氧基、苯基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的哌啶酮基、任选被R₅取代的环杂二酮基、任选被R₅取代的杂环基、-COOR_y、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SR_y、-SOR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y；-NR_wSO₂R_x、-SO₃R_y、-OSO₂NR_wR_x或-SO₂NR_wR_x；

R₃为独立选自以下的一个或多个取代基：氢、烷基、烷氧基、卤素、烷氧基醚、羟基、硫基、硝基、任选被R₄取代的环烷基、任选被R₄取代的杂芳基、烷基氨基、任选被R₄取代的杂环基、-O(环烷基)、任选被R₄取代的吡咯烷酮基、任选被R₄取代的苯氧基、-CN、-OCHF₂、-OCF₃、-CF₃、卤代烷基、任选被R₄取代的杂芳氧基、二烷基氨基、-NHSO₂烷基、硫烷基或-SO₂烷基；其中R₄独立选自：卤素、氰基、三氟甲基、氨基、羟基、烷氧基、-C(O)烷基、-CO₂烷基、-SO₂烷基、-C(O)N(烷基)₂、烷基或烷基氨基。

3.一种预防患者细胞增殖性病症的方法，所述方法包括给予所述患者预防有效量的(1)包含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)包含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物，其中所述FLT3-激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、苯氧基、苯基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的哌啶酮基、任选被R₅取代的环杂二酮基、任选被R₅取代的杂环基、-COOR_y、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x) 、-N(R_y)CON(R_w)(R_x) 、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SR_y、-SOR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y、-NR_wSO₂R_x、-SO₃R_y、-OSO₂NR_wR_x或-SO₂NR_wR_x；

4.权利要求3的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的化疗。

5.权利要求3的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的放疗。

6.权利要求3的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的基因疗法。

7.权利要求3的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的免疫疗法。

8.一种预防患者细胞增殖性病症的方法，所述方法包括给予所述患者预防有效量的药用组合物，所述组合物包含FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

9.权利要求8的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的化疗。

10.权利要求8的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的放疗。

11.权利要求8的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的基因疗法。

12.权利要求8的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的免疫疗法。

13.一种预防患者与FLT3有关的病症的方法，所述方法包括给予所述患者预防有效量的(1)包含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)包含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

14.权利要求13的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的化疗。

15.权利要求13的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的放疗。

16.权利要求13的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的基因疗法。

17.权利要求13的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的免疫疗法。

18.一种预防患者与FLT3有关的病症的方法，所述方法包括给予所述患者预防有效量的药用组合物，所述组合物包含FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

19.权利要求18的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的化疗。

20.权利要求18的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的放疗。

21.权利要求18的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的基因疗法。

22.权利要求18的方法，所述方法还包括给予所述患者预防有效量的免疫疗法。

23.一种治疗患者细胞增殖性病症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的(1)包含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)包含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

R_a为氢、烷氧基、苯氧基、苯基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的哌啶酮基、任选被R₅取代的环杂二酮基、任选被R₅取代的杂环基、-COOR_y、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SR_y、-SOR_y、-SO₂Ry、-NR_wSO₂R_y；-NR_wSO₂R_x、-SO₃R_y、-OSO₂NR_wR_x或-SO₂NR_wR_x；

24.权利要求23的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的化疗。

25.权利要求23的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的放疗。

26.权利要求23的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的基因疗法。

27.权利要求23的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的免疫疗法。

28.一种治疗患者细胞增殖性病症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的药用组合物，所述组合物包含FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

29.权利要求28的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的化疗。

30.权利要求28的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的放疗。

31.权利要求28的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的基因疗法。

32.权利要求28的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的免疫疗法。

33.一种治疗患者与FLT3有关的病症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的(1)包含FLT3激酶抑制剂和药学上可接受的载体的第一药用组合物，和(2)包含法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体的第二药用组合物，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

34.权利要求33的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的化疗。

35.权利要求33的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的放疗。

36.权利要求33的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的基因疗法。

37.权利要求33的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的免疫疗法。

38.一种治疗患者与FLT3有关的病症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的药用组合物，所述组合物包含FLT3激酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂和药学上可接受的载体，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物及其N-氧化物、药学上可接受的盐、溶剂合物、几何异构体和立体化学异构体：

式I′

其中：

r为1或2；

Z为NH、N(烷基)或CH₂；

B为苯基、杂芳基或9元-10元苯并稠合杂芳基；

R₁为：

其中n为1、2、3或4；

39.权利要求38的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的化疗。

40.权利要求38的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的放疗。

41.权利要求38的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的基因疗法。

42.权利要求38的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的免疫疗法。

43.权利要求38的方法，所述方法还包括给予所述患者治疗有效量的化疗。

44.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物、其立体异构体形式、药学上可接受的酸或碱加成盐：

其中

虚线代表任选的键；

X为氧或硫；

R¹为氢、C_1-12烷基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、喹啉基C_1-6烷基、吡啶基C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基、氨基C_1-6烷基，或式-Alk¹-C(＝O)-R⁹、-Alk¹-S(O)-R⁹或Alk¹-S(O)₂-R⁹基团，其中Alk¹为C_1-6烷二基，R⁹为羟基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、C_1-8烷基氨基或被C_1-6烷氧基羰基取代的C_1-8烷基氨基；

当在相邻位上时，R²和R³可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (a-1)，

-O-CH₂-CH₂-O- (a-2)，

-O-CH＝CH- (a-3)，

-O-CH₂-CH₂- (a-4)，

-O-CH₂-CH₂-CH₂- (a-5)或

-CH＝CH-CH＝CH- (a-6)；

R⁶和R⁷各自独立为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、Ar²氧基、三卤甲基、C_1-6烷硫基、二(C_1-6烷基)氨基，或当在相邻位上时，R⁶和R⁷可结合在一起形成下式二价基团

-O-CH₂-O- (c-1)或

-CH＝CH-CH＝CH- (c-2)；

-O-R¹⁰ (b-1)，

-S-R¹⁰ (b-2)，

-N-R¹¹R¹² (b-3)，

R¹¹为氢、C_1-12烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-16烷基羰基、C_1-6烷氧基羰基、C_1-6烷基氨基羰基、Ar¹、Ar²C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基C_1-6烷基、天然氨基酸、Ar¹羰基、Ar²C_1-6烷基羰基、氨基羰基羰基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、羟基、C_1-6烷氧基、氨基羰基、二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基羰基、氨基、C_1-6烷基氨基、C_1-6烷基羰基氨基，或式-Alk²-OR¹³或-Alk²-NR¹⁴R¹⁵基团；其中Alk²为C_1-6烷二基；R¹³为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、羟基C_1-6烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；R¹⁴为氢、C_1-6烷基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；R¹⁵为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷基羰基、Ar¹或Ar²C_1-6烷基；

R¹⁷为氢、卤基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基、Ar¹；

R¹⁸为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基或卤基；

R¹⁹为氢或C_1-6烷基；

45.权利要求44的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物，其中X为氧，且虚线代表键。

46.权利要求44的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物，其中R¹为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基-C_1-6烷基或一或二(C_1-6烷基)氨基C_1-6烷基；R²为卤基、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_1-6烷氧基、三卤甲氧基或羟基C_1-6烷氧基；且R³为氢。

47.权利要求44的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂包括式(I)化合物，其中R⁸为氢、羟基、卤代C_1-6烷基、羟基C_1-6烷基、氰基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基羰基C_1-6烷基、咪唑基或式-NR¹¹R¹²基团，其中R¹¹为氢或C_1-12烷基，且R¹²为氢、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基羰基、羟基或式-Alk²-OR¹³基团，其中R¹³为氢或C_1-6烷基。

48.权利要求44的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

49.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中

R_w和R_x独立选自：氢、烷基、烯基、芳烷基或杂芳烷基，或R_w和R_x可任选结合在一起形成5元-7元环，所述环选自：

(烷基)，

和

50.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中B为苯基或杂芳基。

51.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中B为苯基或杂芳基，且R_w和R_x独立选自：氢、烷基、烯基、芳烷基或杂芳烷基，或R_w和R_x可任选结合在一起形成5元-7元环，所述环选自：

(烷基)，

和

52.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中

Z为NH或CH₂；且

R₃为独立选自以下的一个或多个取代基：氢、烷基、烷氧基、卤素、烷氧基醚、羟基、任选被R₄取代的环烷基、任选被R₄取代的杂芳基、任选被R₄取代的杂环基、-O(环烷基)、任选被R₄取代的苯氧基、任选被R₄取代的杂芳氧基、二烷基氨基或-SO₂烷基。

53.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中

R_a为氢、烷氧基、任选被R₅取代的杂芳基、羟基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、任选被R₅取代的_唑烷酮基、任选被R₅取代的吡咯烷酮基、任选被R₅取代的杂环基、-CONR_wR_x、-N(R_w)CON(R_y)(R_x)、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)、-N(R_w)C(O)OR_x、-N(R_w)COR_y、-SO₂R_y、-NR_wSO₂R_y或-SO₂NR_wR_x。

54.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中

r为1；

55.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，其中

B为苯基或吡啶基；

R_a为氢、二烷基氨基、任选被R₅取代的杂环基、-CONR_wR_x、-N(R_y)CON(R_w)(R_x)或-NR_wSO₂R_y；且

56.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，所述化合物选自：

57.权利要求1-43中任一项定义的方法，其中所述FLT3激酶抑制剂包括式I′化合物，所述化合物选自：

58.权利要求49的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

59.权利要求50的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

60.权利要求51的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

61.权利要求52的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

62.权利要求53的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

63.权利要求54的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

64.权利要求55的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

65.权利要求56的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。

66.权利要求57的方法，其中所述法尼基转移酶抑制剂是(+)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮；或其药学上可接受的酸加成盐。