CN101230356A

CN101230356A - 拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列及其克隆方法

Info

Publication number: CN101230356A
Application number: CNA2008100706531A
Authority: CN
Inventors: 叶海辉; 刘元婧; 杨玉荣; 黄辉洋
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2008-02-20
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2008-07-30

Abstract

拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列及其克隆方法，涉及一种cDNA序列。提供一种拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列及其克隆方法。拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列是从拟穴青蟹脑组织中得到的PDI_a_PDI_a′_C保守区域的cDNA序列，它具有SEQ ID NO 1所示的序列。从拟穴青蟹克隆PDI_a_PDI_a′_C保守区域cDNA的方法包括：从拟穴青蟹的脑组织中提取总RNA；以拟穴青蟹脑组织总RNA为模板进行cDNA第一链合成；利用保守区域特异性引物和3'RACE引物进行RT－PCR反应；PDI保守区域的基因克隆和测序：cDNA片段的序列分析。

Description

拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列及其克隆方法

技术领域

本发明涉及一种cDNA序列，尤其是涉及一种拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域基因及其克隆方法。

背景技术

蛋白二硫键异构酶(PDI)是真核生物中广泛存在的一类蛋白，主要集中于内质网中，在大部分组织和器官中以组成型表达。细胞内粗面内质网越多，结构越复杂，分布越密集，PDI的含量及活性也就越高。PDI能通过催化分泌蛋白二硫键的形成、断裂和重排以帮助底物获得正确的构象，但同时也发现该蛋白没有底物特异性，并且对那些不具备二硫键的蛋白也能指导其正确折叠和分泌，所以PDI兼具分子伴侣和酶的特性(见文献：1、Noiva R，Lennarz WJ.Protein disulfide isomerase.A multifunctional protein resident in the lumen of the endoplasmicreticulum[J].Biologlcal Chemistry，1992，267(6)：3553-3556；2、Freedman RB，Hirst TR，TuiteMF.Protein disulphide isomerase：building bridges in protein folding.Trends Biochem Sci，1994，19(8)：331-336)。象这样的一类分子被称为折叠酶(foldase)，PDI是目前发现仅有的两种折叠酶之一，故而有着较高的研究价值。除了在酶化学、分子伴侣和结构生物学上的研究意义以外，PDI还和包括酵母生孢反应、T细胞抗原呈递、前胶原成熟加工等多种生物过程有关，甚至还构成了另一些酶的亚基，如人脯氨酰-4-羟化酶β亚基(见文献：3、Taina P，Tarja H，KaisaT，et al.Molecular cloning of the β-subunit of human prolyl 4-hydroxylase.This subunit and proteindisulphide isomerase are products of the same gene[J].The EMBO Journal，1987，6(3)：643-649)。此外由于二硫键的形成是许多蛋白折叠途径中的限速步骤，PDI在应用开发方面也极具价值，如在抗体突变研究中，作为无细胞翻译体系的添加物，PDI蛋白可以极大地改善反应效率和实验效果。又如在酵母中表达外源分泌蛋白时，通过提高PDI的表达水平，可望将目的蛋白的表达和分泌提高数十倍，这一点尤其具有经济价值(见文献：4、RobineonA，HinesV，Wittrup K.Protein disulfide isomerase over expression increases secretion of foreign proteins inSac-charomyces cerevisiae.Biotechnology，1994，12：381-384)。

PDI由6个保守区域(a，e，b，b′，a′，c)组成，其中a和a’区与硫氧还蛋白家族同源(见文献：5、Edman JC，Ellis L，Blacher RW，et al.Sequence of protein disulphide isomerase andimplications of its relationship to thioredoxin.Nature，1985，317：267-270)，都含有独立的具有异构酶活性的催化位点-CGHC-(见文献：6、Vuori K，Pihlajaniemi T，Myllyla R，et al.Site-directedmutagenesis of human protein disulphide isomerase：effect on the assembly，activity andendoplasmic reticulum retention of human prolyl 4-hydroxylase in Spodoptera frugiperda insectcells.The EMBO Journal，1992，11(11)：4213-4217；7、Reiko U，Tsuneyuki O，Hiroshi I，et al.Functions of Characteristic Cys-Gly-His-Cys(CGHC)and Gln-Glu-Asp-Leu(QEDL)Motifs ofMicrosomal ER-60 Protease.Biochem.1997，122：834-842)。

PDI_a_PDI_a′_C保守区域(NCBI编号cd02995)是属于PDIa家族C端硫氧还原蛋白(a’)亚家族。该保守区域除了参与构成PDI还参与构成ERp72，ERp57(或ERp60)和EFP1C端氧化还原活性区域(见文献：8、Walker KW，Lyles MM，Gilbert HF.Catalysis of oxidative proteinfolding by mutants of protein disulfide isomerase with a single active-site cysteine.Biochemistry，1996，35(6)：1972-1980；9、Nrgaard P，Winther J R.Mutation of yeast Euglp CXXS active sites toCXXC results in a dramatic increase in protein disulphide isomerase activity.Biochem，2001，358(1)：269-274；10、Lappi AK，Lensink MF，Alanen HI，et al.A conserved arginine plays a role inthe catalytic cycle of the protein disulphide isomerases.J.Mol.Biol.2004，335(1)：283-295)。早前对PDI及其众多同源蛋白的报道涵盖了从线形动物、节肢动物到鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类，还包括很多植物和真菌(NCBI GenBank)。在节肢动物门中，昆虫纲中果蝇的PDI基因已被深入研究(见文献：11、McKay RR，Zhu L，Shortridge RD.A Drosophila gene that encodesa member of the protein disulfide isomerase/phospholipase C-alpha family.Insect Biochem MolBiol，1995，25(5)：647-654)，但在甲壳纲仅见桡足亚纲的鲑疮痂鱼虱(Lepeophtheirussalmonis)PDI前体的报道(见文献：12、Thomas KW，Alastair RL，Derek JJ.Identification ofcDNAs induced by the organophosphate trichlorphon in the parasitic copepod Lepeophtheirussalmonis.Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，88(1)26-30)，十足目未见报道。

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)，属于节肢动物门(Arthropoda)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，梭子蟹科(Portunidae)，青蟹属(Scylla)，是中国大陆东南沿海4种青蟹中最主要的类群(见文献：13、林琪等.中国东南沿海青蟹属(Scylla)的种类组成.水产学报，2007，31(2)：211-219)。首次在十足目中报道了PDI_a_PDI_a′_C保守区域，本保守区域对于拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶基因全序列的发现，以及拟穴青蟹所有包含PDI_a_PDI_a′_C结构的基因的研究都具有重要的作用。该区域与节肢动物其他物种已知的相应区域具有很高的相似性，这必然为十足目以至节肢动物门更多相关功能蛋白基因的发现提供线索。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列及其克隆方法。

本发明所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列是从拟穴青蟹脑组织中得到的PDI_a_PDI_a′_C保守区域的cDNA序列，它具有SEQ ID NO 1所示的序列：

(1)SEQ ID NO.1的信息

f)序列特征：

^*长度：303碱基对

^*类型：核酸

^*链型：双链

^*拓扑结构：线性

g)分子类型：cDNA

h)假设：否

i)反义：否

j)最初来源：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)

k)序列描述：SEQ ID NO.1

CCTGTTACTGTTGCTGTTGCCAAGAACTTTGAAGAAGTTGTTACAAACTCTGAGAAAGAT 60

GTCTTGATAGAGTTCTATGCTCCTTGGTGTGGCCATTGCAAGAAATTGGCCCCAACCTAC 120

GATGAGTTGGGCGAGGCGATGAAGAATGAGAATGTTGCCATTGTGAAAATGGATGCAACT 180

GCCAATGACGTTCCACCATCCTTCAATGTGAGAGGATTCCCTACAATTTTCTGGAAGCCA 240

GCTGGAGGTTCCCCAGTTTCATATAATGGTGGCCGGGAATTGGATGACTTCATCAAATAT 300

ATT 303

(2)SEQ ID NO.2的信息(由SEQ ID NO.1翻译得到的假想蛋白)

a)序列特征：

^*长度：101碱基对

^*类型：氨基酸

^*链型：单链

^*拓扑结构：线性

b)分子类型：肽

c)序列描述：SEQ ID NO.2

Pro Val Thr Val Ala Val Ala Lys Asn Phe Glu Glu Val Val Thr Asn

1 5 10 15

Ser Glu Lys Asp Val Leu Ile Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His

20 25 30

Cys Lys Lys Leu Ala Pro Thr Tyr Asp Glu Leu Gly Glu Ala Met Lys

35 40 45

Asn Glu Asn Val Ala Ile Val Lys Met Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val

50 55 60

Pro Pro Ser Phe Asn Val Arg Gly Phe Pro Thr Ile Phe Trp Lys Pro

65 70 75 80

Ala Gly Gly Ser Pro Val Ser Tyr Asn Gly Gly Arg Glu Leu Asp Asp

85 90 95

Phe Ile Lys Tyr Ile

100

本发明从拟穴青蟹克隆PDI_a_PDI_a′_C保守区域cDNA的方法包括：

1)从拟穴青蟹的脑组织中提取总RNA；

2)以拟穴青蟹脑组织总RNA为模板进行cDNA第一链合成；

3)利用保守区域特异性引物和3’RACE引物进行RT-PCR反应：

正向引物(G23)：5’-TGCAGTGATTGTCGCAGCTTTC-3’

反向引物(3′RACE Outer Primer)：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

4)PDI保守区域的基因克隆和测序：

5)cDNA片段的序列分析：

从拟穴青蟹的脑组织中提取总RNA可采用以下方法：

解剖拟穴青蟹脑，匀浆，提取总RNA。提取总RNA可按TRIzol Reagent(MolecularResearch Center公司)说明书推荐的方法提取。

进行cDNA第一链合成可采用以下方法：

以总RNA为模板，使用3’RACE引物进行逆转录反应合成第一链cDNA。可根据3’端cDNA快速扩增试剂盒(3’Full RACE Core Set，TaKaRa大连宝生物工程有限公司)操作说明进行。

RT-PCR扩增可采用以下方法：

以cDNA第一链产物为模板，以PDI_a_PDI_a′_C保守区域上游特异性引物(G23)：5’-TGCAGTGATTGTCGCAGCTTTC-3’为上游引物，以3′RACE Outer Primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’为下游引物。进行PCR扩增。

PCR产物的克隆及测序可采用以下方法：

回收PCR产物，转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞，涂布氨卞青霉素的LB平板，37℃培养过夜，菌落PCR筛选阳性克隆，并用限制性内切酶EcoRI、HindIII双酶切，37℃2h鉴定阳性克隆。阳性克隆DNA测序。

转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞可按照TA克隆试剂盒(InsTAclone PCR Cloning Kit，Fermentas公司)说明书进行。

阳性克隆送样于上海博亚生物有限公司进行DNA测序。

cDNA序列分析可采用以下方法：

所得cDNA序列(见序列表)用ORF(open reading frame，ORF)finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和DNAssist Version软件，寻找开放阅读框，并将翻译后的假想肽与GenBank数据库中相应序列进行序列同源性比较和分析BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。在ClustalX软件中与各物种相应序列进行比对。

本发明利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、3’端cDNA快速扩增(3’RACE)、基因克隆技术、DNA测序技术对拟穴青蟹PDI_a_PDI_a′_C保守区域的cDNA序列和由其推知的氨基酸序列进行了研究，首次从拟穴青蟹脑组织中得到PDI_a_PDI_a′_C保守区域的cDNA序列，这也是在十足目中首次发现该序列。使对拟穴青蟹PDI及其同源蛋白的进一步研究成为可能。

附图说明

图1为本发明实施例的拟穴青蟹PDI_a_PDI_a′_C保守区域与模式生物相应区域比对。

图2为本发明实施例的拟穴青蟹PDI_a_PDI_a′_C保守区域cDNA序列及其推知的氨基酸序列特征。在图2中，划线部分为特异性引物G23序列，方框部分为氧化还原活性位点，CGHC为PDI的保守结构域。

具体实施方式

1、总RNA的提取和cDNA第一链的合成

取拟穴青蟹脑两个用预冷的匀浆器彻底匀浆，按TRIzol Reagent(Molecular ResearchCenter公司)说明书推荐的方法提取总RNA。将所得总RNA溶解于经DEPC处理的水中，用1％甲醛琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，-80℃保存。以总RNA为模板，根据3’端cDNA快速扩增试剂盒(3’Full RACE Core Set，TaKaRa大连宝生物工程有限公司)操作说明使用3’RACE引物进行逆转录反应合成第一链cDNA。反应条件：总RNA和引物的混合物70℃变性10min；冰上急冷；加入反转录反应的其余试剂；42℃60min；70℃15min。

2、RT-PCR扩增

以cDNA第一链产物为模板，以PDI_a_PDI_a′_C保守区域上游保守区域特异性引物(G23)和3′RACE引物进行PCR，得到拟穴青蟹PDI_a_PDI_a′_C保守区域cDNA片段。

正向引物(G23)：5’-TGCAG TGATTGTCGCAGCTTTC-3’

反向引物(3′RACE Outer Primer)5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

聚合酶链式反应(PCR)的试剂与条件：

模板cDNA 0.8μl

1×cDNA稀释缓冲液II 9.2μl

10×LA PCR缓冲液 4μl，

25mmol MgCl2 3μl，

TaKaRa LA DNA聚合酶(5U/μl) 0.25μl，

引物G23(10μM) 2μl，

3’RACE Outer Primer(10μM) 2μl

无菌水 28.75μl

总体积 50μl，

反应条件：94℃热变性3min；94℃变性30s，50.2℃退火30s，72℃延伸2min，36个循环；最后72℃延伸10min。产物电泳前4℃保存。反应产物在1％琼脂糖凝胶中电泳并观察结果。

3、PCR产物的克隆和测序

PCR产物分别经小量胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit，上海华舜生物工程有限公司)回收，按照TA克隆试剂盒(InsTAclone PCR Cloning Kit，Fermentas公司)说明书进行连接：

质粒载体pTZ57R/T DNA 1μl

纯化PCR产物片段 5μl

10×连接缓冲液 1μl

PEG4000溶液 1μl

去离子水 1μl

T4 DNA连接酶 1μl

总体积 10μl

22℃下连接过夜。连接产物转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞，涂布含50μg/ml氨卞青霉素的LB平板，37℃培养过夜。菌落PCR筛选阳性克隆，用灭菌牙签挑取单个菌落作为模板进行PCR反应，并同时在另一块平板上划线以保存阳性菌落。

菌落PCR的试剂与条件：

2.5mM脱氧核苷酸混合物(dNTP Mix) 16μl

10×LA PCR缓冲液 10μl，

25mM MgCl2 10μl，

TaKaRa LA DNA聚合酶(5U/μl) 1μl，

引物G23(10μM) 4μl，

3’RACE Outer Primer(10μM) 4μl

无菌水 55μl

总体积 100μl，

提质粒用EcoRI和HindIII双酶切进一步鉴定阳性克隆，所得片段与实际相符。

酶切试剂：

10×酶切缓冲液(R) 3μl

无菌水 13.2μl

限制性内切酶EcoRI 0.8μl

限制性内切酶HindIII 1μl

重组质粒 12μl

总体积 30μl

恒温培养箱中37℃温浴2h。

阳性克隆送样于上海博亚生物有限公司进行DNA测序，所用测序仪为ABI377自动测序仪。

5、阳性克隆的测序以及DNA序列分析

假象肽与模式生物PDI中PDI_a_PDI_a’_C保守区域比对结果如(图1)，该区域与其他动物相应区域对比相似性在79％～64％。并且其中包括一个氧化还原活性位点-APWCGHCK-，其中-CGHC-为PDI的保守结构域(图2)。由此鉴定该假想肽为拟穴青蟹PDI_a_PDI_a’_C保守区域。

序列表

Claims

1.拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列，其特征在于

CCTGTTACTGTTGCTGTTGCCAAGAACTTTGAAGAAGTTGTTACAAACTCTGAGAAAGAT 60

GTCTTGATAGAGTTCTATGCTCCTTGGTGTGGCCATTGCAAGAAATTGGCCCCAACCTAC 120

GATGAGTTGGGCGAGGCGATGAAGAATGAGAATGTTGCCATTGTGAAAATGGATGCAACT 180

GCCAATGACGTTCCACCATCCTTCAATGTGAGAGGATTCCCTACAATTTTCTGGAAGCCA 240

GCTGGAGGTTCCCCAGTTTCATATAATGGTGGCCGGGAATTGGATGACTTCATCAAATAT 300

ATT 303

a)序列特征：

^*长度：303碱基对

^*类型：核酸

^*链型：双链

^*拓扑结构：线性

b)分子类型：cDNA

c)假设：否

d)反义：否

e)最初来源：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)。

2.如权利要求1所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：

1)从拟穴青蟹的脑组织中提取总RNA；

2)以拟穴青蟹脑组织总RNA为模板进行cDNA第一链合成；

3)利用保守区域特异性引物和3’RACE引物进行RT-PCR反应：

正向引物(G23)：5’-TGCAG TGATTGTCGCAGCTTTC-3’

反向引物(3′RACE Outer Primer)：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

4)PDI保守区域的基因克隆和测序：

5)cDNA片段的序列分析。

3.如权利要求2所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列的克隆方法，其特征在于从拟穴青蟹的脑组织中提取总RNA采用以下方法：

解剖拟穴青蟹脑，匀浆，提取总RNA，提取总RNA按TRIzol Reagent说明书推荐的方法提取。

4.如权利要求2所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列的克隆方法，其特征在于进行cDNA第一链合成采用以下方法：

以总RNA为模板，使用3’RACE引物进行逆转录反应合成第一链cDNA，根据3’端cDNA快速扩增试剂盒操作说明进行。

5.如权利要求2所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列的克隆方法，其特征在于RT-PCR扩增采用的方法如下：

以cDNA第一链产物为模板，以PDI_a_PDI_a′_C保守区域上游特异性引物(G23)：5’-TGCAGTGATTGTCGCAGCTTTC-3’为上游引物，以3′RACE Outer Primer：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’为下游引物，进行PCR扩增。

6.如权利要求2所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列的克隆方法，其特征在于PCR产物的克隆及测序采用的方法如下：

回收PCR产物，转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞，涂布氨卞青霉素的LB平板，37℃培养过夜，菌落PCR筛选阳性克隆，并用限制性内切酶EcoRI、HindIII双酶切，37℃2h鉴定阳性克隆；

转化大肠杆菌(DH5α)感受态细胞可按照TA克隆试剂盒(InsTAclone PCR Cloning Kit，Fermentas公司)说明书进行；

阳性克隆送样于上海博亚生物有限公司进行DNA测序。

7.如权利要求2所述的拟穴青蟹蛋白二硫键异构酶保守区域cDNA序列的克隆方法，其特征在于cDNA序列分析采用的方法如下：

所得cDNA序列用ORF(open reading frame，ORF)finder软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和DNAssist Version软件，寻找开放阅读框，并将翻译后的假想肽与GenBank数据库中相应序列进行序列同源性比较和分析BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在ClustalX软件中与各物种相应序列进行比对。