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CN101218497B - 利用瞬逝光的物质信息获取方法和物质信息测量装置、以及碱基序列确定方法和装置 - Google Patents

利用瞬逝光的物质信息获取方法和物质信息测量装置、以及碱基序列确定方法和装置 Download PDF

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CN101218497B CN2006800247633A CN200680024763A CN101218497B CN 101218497 B CN101218497 B CN 101218497B CN 2006800247633 A CN2006800247633 A CN 2006800247633A CN 200680024763 A CN200680024763 A CN 200680024763A CN 101218497 B CN101218497 B CN 101218497B
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Abstract

本发明提供利用瞬逝光照明技术的物质的位置信息、位移信息。利用瞬逝光(PE)的强度随着离界面(S)的距离(Z)的增加而按指数函数急速衰减的性质，事先将待测物质(T)固定在可产生瞬逝光(PE)的界面(S)，根据由上述瞬逝光(PE)激发而产生的、来自上述待测物质T的荧光强度(I)，获取上述待测物质(T)的位置信息(Z)、位移信息(Δz)。使用该位置信息(Z)、位移信息(Δz)，捕捉物质的结构或其变化、碱基序列、物质间的相互作用的有无或进行状况等。

Description

利用瞬逝光的物质信息获取方法和物质信息测量装置、以及碱基序列确定方法和装置
技术领域
本发明涉及一种利用瞬逝光(evanescent light)的物质信息的获取技术。更详细地说，涉及一种将瞬逝光作为荧光激发光来利用、从而测量或确定固定在界面的物质的结构、形态、相互作用、碱基序列等的技术。 
背景技术
测量物质的位置变化(位移)的方法根据其对象物的大小而多种多样。微米级以上的物质能够用光学显微镜等测量其长度、位移。然而，光学显微镜的水平分辨率的极限是数百纳米，不能捕捉纳米级物质受到物理、化学作用时大小等的变化。 
电子显微镜等由于在真空中测量、需要蒸镀等问题而不能测量任意状态下的动态变化，例如不能观察溶液中的蛋白质、DNA伴随结构变化的位移。只有原子力显微镜(AFM：AtomicForce Microscope)可以观察上述位移，但是存在测量准备和操作难、测量准确度依赖于各个探针等问题。另外，在想要捕捉时间尺度短的动态变化的情况下，得到一个图像需要数十分钟单位的测量时间的AFM并不适用。 
在此，已知在临界角以上的入射角条件(全反射条件)下，光从折射率较大的介质向折射率较小的介质入射时，在入射光的相反侧界面的近场中产生瞬逝光。该瞬逝光的强度随着离界面的距离的增加而按指数函数急速衰减。 
在日本特开2003-294631号公报、日本特开平10-221339号公报中公开了利用该瞬逝光解析物质的行为、状态的技术。更 详细地说，在日本特开2003-294631号公报中，公开了如下的技术：事先在细胞中的待测物质中进行荧光标记，一边进行瞬逝照明一边随时间在多个时间点检测从上述待测物质发出的荧光信号，根据该荧光信号的变化来解析待测物质的每个分子的行为、状态。在日本特开平10-221339号公报中公开了向进行荧光标记的染色体照射瞬逝光等来观察染色体的结构、染色体上的基因排列及其状态的技术。 
目前逐渐开始开发根据晶振原理、表面等离子共振原理、激发荧光检测原理等检测原理检测或测量与物质间的相互作用、物质的状态(例如结构、碱基序列等)、动态(例如结构变化、反应进行情况等)有关的信息。然而，这些技术都还处于其检测精确度有改进余地的阶段，不能说是实现了能够在纳米级水平下，准确地获取物质的上述信息的技术。 
因此，本发明的主要目的在于提供一种利用了瞬逝光照明技术获取与物质的位置、位移有关的信息，特别是与纳米级水平的位置、位移有关的信息的新技术，而且提供利用这些信息正确地检测或测量物质的相互作用、状态、动态等的新技术。 
发明内容
在临界角以上的入射角条件(全反射条件)下，光从折射率较大的介质向折射率较小的介质入射时，在入射光前进侧的相反侧的界面的近场中产生瞬逝光(瞬逝波)。本发明利用该瞬逝光的强度随着离界面的距离的增加而按指数函数衰减的性质。 
本发明提供如下的物质信息获取方法：首先使待测物质存在于可产生瞬逝光的界面区域，根据由上述瞬逝光激发而产生的、来自上述待测物质的荧光强度，获取上述待测物质的位置 信息。 
即，本发明的主要特征在于：(1)事先使待测物质存在于作为瞬逝光的照射范围的界面(入射光侧的相反侧的界面)附近；(2)将该界面中产生的瞬逝光用作荧光激发光；(3)用瞬逝光激发人为标记在待测物质上的荧光色素所具有的荧光、该待测物质本身所具有的荧光，根据该激发荧光的强度获取待测物质的位置信息。该位置信息能够在纳米级水平获取，成为用于调查物质间的相互作用、物质的状态、变化的有用信息。 
此外，在本发明中“待测物质”是指作为物质信息获取对象的物质，以在一定时间内或暂时地存在于产生瞬逝光的界面区域的状态、例如固定或保持在该界面的状态来使用。“位置信息”包括人为地标记在待测物质上的荧光色素、待测物质的荧光产生部位所在的位置(以下称为“荧光产生位置”)和界面之间的距离信息、与该距离信息的变化有关的信息两者。 
在本发明中，在待测物质所在的反应场的物理或化学条件发生变化的情况(例如通过人为的操作而改变的情况)下，获取这种条件变化前后的待测物质的荧光强度信息，由此可获知该待测物质的位移信息、更详细地说是待测物质的荧光产生位置离界面的距离的变化程度。在这种位移由于物质的一级结构、二级结构、三级结构、高级结构等结构或形态变化而产生的情况下，该位移信息成为与物理或化学条件变化对物质的结构、形态产生的影响有关的信息。 
另外，在本发明中，通过实时地监视激发荧光的强度，可追踪该待测物质的位置信息随时间的变化。由此，可获取例如与待测物质本身由于外部条件变化而引起的动态信息、该待测物质所涉及的相互作用的进行有关的信息等。 
并且，在本发明中，也可以通过根据预先获取的标准数据 对所测得的与上述荧光强度有关的数据进行校正，确定物质的位置信息，由此提高测量数据的可靠性。标准数据是指，例如事先按分子长度的差异准备所需数量的正确确定了分子长度的荧光标记物质，根据这些荧光标记物质离界面的距离的差异而发生变化的荧光强度数据。该荧光强度数据正确地反映与离界面的距离相应的荧光强度。 
接着，本发明提供物质信息测量装置，该物质信息测量装置至少具备：光源；界面，来自该光源的出射光在该界面可产生瞬逝光；荧光检测部，其检测由上述瞬逝光激发而产生的、从存在于上述界面上的待测物质发出的荧光强度；以及解析部，其根据上述荧光强度信息和与离界面的距离相关的上述瞬逝光的衰减率信息，自动解析待测物质在上述反应场中的位置或/以及位移。并且在该装置中，也可以设置反应场条件控制部，该反应场条件控制部可改变来自光源的出射光与前进侧相反一侧的界面所面向的反应场的物理或化学条件。 
本装置的反应场条件控制部是能够人为地控制反应场的物理或化学条件的单元，例如可举例能够自由地操作温度、pH、压力、物质浓度、盐浓度、溶剂种类等的条件的单元、对上述反应场施加电场的单元、能够选择性地自由操作这些单元的单元等。 
接着，本发明提供一种确定碱基序列的方法，该方法通过进行如下的步骤来确定单链核酸或双链核酸的碱基序列：事先将与核酸链的碱基或碱基对结合时发生结构变化的蛋白质保持在可产生瞬逝光的界面区域的步骤；使上述核酸链与上述蛋白质结合的步骤；按时间序列连续测量由上述瞬逝光激发而产生的、来自上述蛋白质的荧光强度的步骤；以及将该测量得到的荧光强度数据和与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质的荧 光强度数据库进行自动对照的步骤。在本方法中可采用的蛋白质可以从具有通过与核酸链结合而发生结构变化的性质的物质中选择，例如可采用以多个碱基或碱基对为识别单位发生结构变化的蛋白质。此外，检测来自蛋白质的荧光强度，能够根据目的适当地采用事先对该蛋白质标记(标签)荧光物质并检测来自该荧光物质的荧光强度的方法、或检测来自构成该蛋白质本身的氨基酸的荧光强度的方法等。 
另外，本发明提供碱基序列确定装置，该装置至少具备如下部分：界面，其保持荧光标记的、与核酸链的碱基或碱基对结合时结构发生变化的蛋白质，并用于产生瞬逝光；荧光检测部，其能够根据上述瞬逝光的荧光激发，连续测量来自上述蛋白质的荧光强度；数据库保持部，其事先保持与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质的荧光强度数据库；以及数据处理部，其通过将上述测量得到的荧光强度数据和上述荧光强度数据库进行自动对照，确定核酸链的碱基序列。 
即，这些与碱基序列确定有关的方法、装置的特征在于，当保持(例如固定)在界面区域的蛋白质沿着单链核酸链或双链核酸链移动时，通过将荧光强度数据和预先获取的与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质的荧光强度数据库进行自动对照，确定核酸链的碱基序列，其中，所述荧光强度数据是通过连续追踪根据碱基或碱基对的种类发生结构变化时荧光强度的变化(荧光物质的位置变化)而得到的数据。 
在本发明中，通过瞬逝光照明，可获取固定在界面的物质的位置信息、位移信息，特别是纳米级水平的位置信息、位移信息。更详细地说，能够非接触地、高精确度地将作为对象的待测物质的纳米级水平的位置信息、位移信息进行数值化。由此，可检测或测量物质间的相互作用的有无、进行状况、物质 的结构、碱基序列等的状态、动态。 
附图说明
图1是用于说明本发明所涉及的物质信息获取方法、物质信息测量装置中所使用的瞬逝光照射的基本原理的图。 
图2是用于说明该原理的其它图。 
图3是表示作为本发明的应用例的、检测核酸链向伸展状态的变化的检测方法的概念的一例的图。 
图4是表示作为本发明的应用例的、检测杂交的方法的概念的一例的图。 
图5是示意性地表示本发明所涉及的碱基序列确定方法或装置的一个实施方式例的概念的图。 
图6是表示实施例1所涉及的实验结果的附图代用图表。 
图7是表示实施例2所涉及的实验结果的附图代用图表。 
图8是示意性地表示实施例2所涉及的ssDNA的结构变化的情形的图。 
具体实施方式
下面参照附图说明用于实施本发明的最佳方式。此外，附图中示出的各实施方式表示本发明的代表性的实施方式的一个例子，并不是由此限定性地解释本发明的范围。 
首先，图1、图2是用于说明在本发明所涉及的方法、装置中所使用的瞬逝光照射的基本原理的图。 
在图1中示出了物质信息测量装置，该物质信息测量装置具备：光源Q；界面S，来自该光源Q的出射光P在该界面可产生瞬逝光PE；荧光检测部D，对由上述瞬逝光PE激发而产生的、从存在于上述界面S的近场A中的待测物质(图1中未图示)发出 的荧光f的强度进行检测；以及解析部C，其根据该荧光强度信息和与离界面S的距离相关的上述瞬逝光PE的衰减率信息，自动解析反应场R中的待测物质的位置或/以及位移。 
此外，关于来自待测物质的荧光强度的检测，能够根据目的适当地采用事先对该待测物质标记(标签)荧光物质来检测来自该荧光物质的荧光强度的方法、或采用检测来自构成该待测物质本身的荧光发光性的物质的荧光强度的方法等。 
根据需要，荧光检测部D具备：透镜L1，其对荧光f进行聚光并变换为平行光；光检测器(光电检测器)PD；透镜L2，其向该光检测器PD聚光荧光f；滤镜H，其用于拦截混杂在荧光f中而前进的光P；以及未图示的反射镜(例如分色镜)，其用于改变光前进方向；等。 
解析部C是计算机，作为数据库预先保存荧光强度和与离界面S的距离相关的上述瞬逝光PE的衰减率信息，并且保存计算程序，该计算程序将该数据库和实际测量的荧光强度进行对照，通过自动运算，以离界面S的距离的形式算出作为荧光f的产生源的荧光物质所存在的位置。 
在此，说明瞬逝光照射原理，当光P从光源Q以临界角以上的入射角条件(全反射条件)下从折射率较大的介质M1向折射率较小的介质M2入射时，在该入射光P的相反侧界面S的近场A中产生瞬逝光(瞬逝波)PE。该瞬逝光PE的强度(电场的平方)具有随着离界面S的距离Z的增加而按指数函数急速衰减的性质(参照图2)，可使用下面的式组来具体说明该性质。此外，下面的式组中所示符号的意思将在文章结尾部分汇总记载。 
首先，可用下面的[式1]”来表示电场分布(大津元一著近接埸光の基礎p.26-29)。 
E ( x , z ) = T 0 exp { - iωt + ik 2 x n sin θ 1 } exp { - k 2 z 1 n 2 sin 2 θ 1 - 1 }
已知，通过将瞬逝光PE用于照明源，例如能够只抽取固液界面附近的荧光信息，该方法实际应用在TIRF(Total internalreflection fluorescence：全内反射荧光)显微镜等。在此，荧光强度是瞬逝光PE的线性函数，在考虑其时间平均的情况下，不依赖于位置(x)，因此能够从上述的电场分布的[式1]改写成下面的[式2]。 
I ( z ) = I 0 exp 2 { - k 2 z 1 n 2 sin 2 θ 1 - 1 }
并且，通过如下面的[式3]那样定义d，进一步导出接下来的[式4]。 
d = λ 4 π n 1 2 sin 2 θ 1 - n 2 2
I(z)＝I0exp(-z/d) 
上述式3、4的d依赖于各介质、入射角和波长，它们越小，瞬逝光PE的强度在越短的距离内衰减。在此，在将瞬逝光PE用作荧光激发光的情况下，在相同的瞬逝光场中，若在荧光物质的位置(z)从Z1的状态变化为Z2的状态的现象的前后，能得到荧光强度(＝kI(z))的变化，则能够根据上述的式4，如下面的式5那样算出并解析荧光物质的位置变化(位移)。 
Δz = z 2 - z 1 = d ln I 1 I 2
接着，根据图3、图4具体说明利用如下方法的测量系统的实施方式例：将瞬逝光PE用作荧光激发光，根据上述的式5等测量存在于界面S的近场A中的荧光物质的位置信息。 
首先，在图3所示的实施方式例中，对可形成瞬逝光PE的界面S固定作为核酸链的待测物质T的一端，在该待测物质T的另一端部标记有荧光物质(荧光色素)F。在初始状态(I)下，该待测物质T(T1)随机地互相缠绕成线圈状，荧光物质F存在于接近界面S的位置上。将根据此时的瞬逝光PE得到的荧光强度设为I1。 
接着，改变反应场R的物理条件或化学条件。例如，当对反应场R施加电场时，作为核酸链的待测物质T能够在一端被固定的状态下伸展，因此从界面S到荧光物质F的距离变长(参照图3中的符号T2)。根据此时的瞬逝光PE得到的荧光强度I2成为比上述荧光强度I1衰减的值(再次参照图2)。 
在此，将初始状态(I)下得到的荧光强度I1和改变反应场R的物理条件或化学条件之后的荧光强度I2代入到上述式5时，能够对待测物质T上标记的荧光物质F离界面S的距离变化、即位移量(Δz、参照图2)进行数值化。在这种测量系统中，例如可获知外部条件的变化对核酸链的高级结构等物质的结构、形态等产生的影响。 
此外，已知核酸分子在液相中受到电场作用时伸展或移动。该原理认为由构成骨架的磷酸离子(负电荷)和其周围的水电离而成的氢原子(正电荷)形成电子云，由这些负电荷和正电荷产生的极化向量(偶极子)通过高频高电压的施加而整体上朝向一个方向，其结果伸展，此外，在被施加不均匀电场的情况下，向电力线集中的部位移动(Seiichi Suzuki，TakeshiYamanashi，Shin-ichi Tazawa，Osamu Kurosawa and MasaoWashizu：“Quantitative analysis on electrostatic orientation ofDNA in stationary AC electric field using fluorescenceanisotropy”，IEEE Transaction on Industrial Applications，Vol.34，No.1，P75-83(1998))。 
接着，图4是用于说明对存在于界面S的近场A中的荧光物质的位置信息进行测量的其它实施方式例的图，即是应用了本发明的一个例子，是表示检测杂交的情况下的概念的图。 
首先，在该实施方式例中，事先将具有可形成自身环化结构的碱基序列结构的、末端标记有荧光物质(荧光色素)F的探针核酸链X的另一端固定在界面S上。由于图4的(I)所示的状态的探针核酸链X1处于形成自身环化结构的状态，因此荧光物质F存在于接近界面S的位置。将根据此时的瞬逝光PE得到的荧光强度设为I1。 
接着，当对界面S的反应场R导入具备与探针核酸链X互补的碱基序列部位的核酸链Y时，核酸链X(X1)的自身环化结构解开，并与核酸链Y形成双链。此时，核酸链X(X2)的荧光物质F与界面S之间的距离变长(参照图4的(II))。将根据此时的瞬逝光PE得到的荧光强度设为I2(I2＜I1)。 
在此，当将初始状态(I)下得到的荧光强度I1和上述荧光强度I2代入到上述式5时，能够将标记在探针核酸链X上的荧光物质F离界面S的距离变化、即位移量(Δz)具体地进行数值化。在这种测量系统中，例如可检测探针核酸链X的杂交的有无、杂交的进行状况。 
从图3、图4所示的实施方式例可知，根据本发明，可得到与物质的结构变化、物质间的相互作用有关的信息，另外通过 实时地监视测量荧光强度，可获知物质的随时间的动态变化、相互作用的进行状况等。 
接着，图5是示意性地表示本发明所涉及的碱基序列确定方法的一个实施方式例的概念的图。 
在本实施方式中，首先将荧光物质F标记在与核酸链的碱基或碱基对结合时结构发生变化的蛋白质E上，并保持(例如固定)在界面S区域中。此外，能够根据目的等来适当地确定固定等的保持方法。 
蛋白质E具有在与图5中用符号N表示的核酸链结合时该蛋白质E(或核酸链N)如滑动般移动的功能，可适当采用与核酸链N结合时根据其结合的碱基(或碱基对)的种类而伴随特有的结构变化的性质的物质。例如可采用DNA解螺旋酶、聚合酶。 
图5的(I)示出蛋白质E(E1)结合在被导入到界面S上的反应场R中的核酸链N上的某时刻的情形。此时，标记在蛋白质E1上的荧光物质F存在于离界面S距离z1的位置上，通过瞬逝光PE(在图5中未图示。参照图1)产生强度I1的荧光。 
此外，在图5中将核酸链N表示为单链，但是也可以是双链。另外，在本实施方式中，例示了在蛋白质E上标记荧光物质F的方法，但是也可以根据目的，适当地采用检测来自构成该蛋白质E的荧光发光性的氨基酸(例如色氨酸等)的荧光的强度的方法。 
图5的(II)示出核酸链N相对于蛋白质E滑动以一个碱基份或多个碱基单位的状态。此时蛋白质E所结合的碱基种类或碱基的组合(核酸链N为双链时是碱基对的种类、碱基对的组合)不同时，蛋白质E的结构发生变化(参照图5的(II)的符号E2)。此时，标记在蛋白质E上的荧光物质F存在于离界面S距离z2(例如z2＜z1)的位置，通过瞬逝光PE(在图5中未图示。参照图1) 产生比强度I1更增强的强度I2(即I2＞I1)的荧光。 
在进行这种荧光强度测量之前，预先测量与碱基或碱基对的种类、组合相关(在界面S上的)的蛋白质E的荧光强度，将其进行数据库化并保持在计算机(相当于图1的解析部C)的存储部中。然后，在上述计算机的数据处理部中，根据预先保持的计算机程序自动地将上述数据库和所测量的荧光强度I1、I2进行对照，由此自动确定该核酸链N的碱基序列。 
可实施这种碱基序列确定方法的装置例如具备如图1所示的装置结构。首先，该装置具备界面S，该界面S事先保持与核酸链N的碱基或碱基对结合时发生结构变化的、标记有荧光物质F的蛋白质E，并且可产生瞬逝光。 
提供碱基序列确定装置，该碱基序列确定装置还具备荧光检测部D，该荧光检测部D利用上述瞬逝光PE来激发标记在上述蛋白质E上的荧光物质F，并能够根据产生的荧光激发光f来连续地进行测量，还至少具备：数据库保持部，其事先保持与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质E的荧光强度数据库(基础数据库)；以及数据处理部，其通过将由上述测量得到的荧光强度数据和上述荧光强度数据库进行自动对照，确定核酸链的碱基序列。此外，数据库保持部和数据处理部设置在图1所示的解析部C。 
即，在这些与碱基序列确定有关的方法、装置中，在单链核酸链或双链核酸链相对于保持(例如固定)在界面S区域中的蛋白质E移动时，通过将荧光强度数据和预先获取的与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质的荧光强度数据库进行自动对照，能够连续地自动确定核酸链的碱基序列，其中，所述荧光强度数据是通过连续追踪该蛋白质E根据碱基或碱基对的种类而发生结构变化时的荧光强度的变化(荧光物质的位置(离界面的距离)变化)而得到的数据。 
根据上述说明的测量原理、方法，进行对短链DNA施加电场时该DNA的平均长度变化测量实验。 
更具体地说，准备在垂直方向具有相对电极的小室(口径200μm、高度(深度)5μm的反应场)，在该小室的底面产生瞬逝光。利用化学结合将DNA的一端固定在该小室底面，另一端用荧光色素(Cy3)标记。然后，在施加电场前后测量根据该荧光色素的位置而会发生变化的荧光强度。测量是在显微镜下进行。 
在此，认为在仅全反射入射下的测量中，产生如下的问题：无法将由瞬逝光的强度变化引起的荧光强度变化与由施加电场导致的温度变化引起的荧光强度变化进行区分。 
因此，在本实施例中，进一步改变实验测量系统，通过还同时进行垂直全入射光下的测量来区分由温度变化引起的荧光强度的变化。即，由于在垂直入射光引起的激发中，激发光强度不随离基板的高度而发生变化，因此反应场中的荧光色素(Cy3分子)不论位置均发出相同的荧光强度。该荧光强度仅为温度的函数。在图6中示出根据这种测量系统测量依赖于瞬逝光激发光的高度(离界面的距离)的荧光强度变化的结果。 
该图6示出了对1mer、30mer、90mer三种Cy3修饰的合成寡聚DNA施加6.5Vpp/μm的电场时，瞬逝光激发(与图6中的TIRF对应)和垂直入射激发(与图6中的TRANS对应)的荧光强度的变化。 
在1mer的情况下，瞬逝光激发(TIRF)和垂直入射激发(TRANS)，荧光强度的变化只有噪声水平左右的差异(参照图6中的最下方的曲线)，但是在30mer、90mer的情况下，得到 噪声水平以上的显著的差异(参照图6)。此外，温度上升引起的强度变化分别是2.5～3.0％左右，根据另外进行的荧光强度温度特性的结果计算时，对应于不足1℃的温度上升。 
根据该基线，在30mer、90mer的情况下，在瞬逝光激发(TIRF)时荧光强度进一步分别降低1.7％左右。在根据该结果算出DNA的伸展后的长度时，可知30mer、90mer的DNA两者的平均长度都变化了3nm左右。 
即，根据本实验，在排除了施加电场导致的反应溶液的温度变化所引起的荧光强度的变化的基础上，能够根据由瞬逝光的强度变化引起的荧光强度变化来检测DNA的高级结构变化(电场导致的伸展)。 
在实施例2中，根据上述说明的测量原理、方法，进行关于生物体高分子在盐浓度环境变化中的平均长度变化测量的实验。 
在玻璃底培养皿的玻璃上固定90mer的ssDNA的一端，用荧光色素(Cy3)标记另一端。其中灌满纯水或盐水。满足全反射条件地向玻璃界面入射激发激光，从而产生瞬逝光。 
按时间序列测量纯水环境的(I)、过15秒之后对处于纯水环境的系统滴加10mM的NaCl使最终浓度为2mM的(II)、再过15秒之后对处于2mM NaCl环境的系统滴加2mM的NaCl的(III)的相应于荧光色素的位置而发生变化的荧光强度。在图7中示出结果。 
如图7所示，可知纯水中的标记ssDNA的荧光的强度在滴加盐之后增大。即，可知随着盐的滴加，荧光标记接近玻璃界面。认为该现象是由于：如图8所示，在纯水中，由于构成DNA链的离子彼此间的静电排斥，链为伸展的状态(参照图8的(I))， 通过盐的滴加，充满于在玻璃上的溶液的离子强度增加，由此，构成DNA链的离子被屏蔽，链内的斥力降低，从而结构收缩(参照图8的(II))。 
当根据上述的式5计算荧光强度变化时，标记ssDNA的荧光在滴加盐前后的位移大约是2nm。因而可知，根据本发明所涉及的方法可测量纳米等级的非常微小的位移。另外可知，利用本发明所涉及的方法，可追踪盐浓度等引起的分子结构的变化、例如核酸的高级结构的变化。 
产业上的可利用性
本发明可用于检测物质的结构(例如生物体物质的一级结构、二级结构、三级结构、高级结构等)的变化、形态变化、杂交/抗原抗体反应/蛋白质间相互作用/高分子-高分子间/高分子-低分子/低分子-低分子间的反应等相互作用的产生及其进行情况、蛋白质的单元结构的变化、物质的扩散状态等的检测技术、监视这些变化的监视技术来利用。 
式组中表示的符号的意思如下。 
I荧光强度 
P光(入射光) 
PE瞬逝光(瞬逝照明光) 
S界面 
T待测物质 
Z离界面(S)的荧光物质的位置(距离)信息 
Δz位移信息 
E(x，z)(x，z)处的电场强度 
To电场振幅 
ω角频率 
k2介质2中的波数 
n折射率比 
θ1入射角 
Io荧光强度的基准强度(标准化强度) 
n1介质M1中的折射率 
n2介质M2中的折射率 
d荧光强度(瞬逝光强度的厚度基准) 
z11的状态下的位置(离界面的距离) 
z22的状态下的位置(离界面的距离) 
I11的状态中的荧光强度 
I22的状态中的荧光强度 

Claims (15)

1.一种物质信息获取方法，使待测物质存在于可产生瞬逝光的界面区域中，利用上述瞬逝光的强度随着离界面的距离的增加而按指数函数衰减的性质，根据由上述瞬逝光激发而产生的来自上述待测物质的荧光强度获取上述待测物质的位置信息，
其中，“位置信息”是下述两者中的至少一者：人为地标记在待测物质上的荧光色素所在的位置或待测物质的荧光产生部位所在的位置和界面之间的距离信息，以及与该距离信息的变化有关的信息。
2.根据权利要求1所述的物质信息获取方法，其特征在于，上述待测物质被固定在上述界面上。
3.根据权利要求1所述的物质信息获取方法，其特征在于，通过获取上述待测物质所存在的反应场的物理或化学条件发生变化前后的荧光强度信息，得到该待测物质的位移信息。
4.根据权利要求3所述的物质信息获取方法，其特征在于，上述位移信息是由物质的结构或形态变化所带来的信息。
5.根据权利要求1所述的物质信息获取方法，其特征在于，实时地监视上述激发荧光的强度。
6.根据权利要求1所述的物质信息获取方法，其特征在于，上述位置信息是纳米级的位置信息。
7.根据权利要求1所述的物质信息获取方法，其特征在于，根据预先获取的标准数据，对测量的与上述荧光强度有关的数据进行校正，由此确定上述位置信息。
8.根据权利要求4所述的物质信息获取方法，其特征在于，
上述待测物质是被固定在上述界面上的待测用核酸，
得到由上述待测用核酸的伸展所带来的上述位移信息。
9.一种物质信息测量装置，至少具备：
光源；
界面，来自该光源的出射光在该界面可产生瞬逝光；
荧光检测部，其对由上述瞬逝光激发而产生的、从存在于上述界面上的待测物质发出的荧光强度进行检测；以及
解析部，其根据上述荧光强度信息和与离界面的距离相关的上述瞬逝光的衰减率信息，自动解析待测物质在反应场中的位置或/以及位移。
10.根据权利要求9所述的物质信息测量装置，其特征在于，具备反应场条件控制部，该反应场条件控制部可改变上述出射光前进侧的相反侧的界面所面向的反应场的物理或化学条件。
11.根据权利要求10所述的物质信息测量装置，其特征在于，上述反应场条件控制部具有针对上述反应场的电场施加单元。
12.根据权利要求9所述的物质信息测量装置，其特征在于，
上述待测物质是被固定在上述界面上的待测用核酸，
当对界面的反应场导入具备与待测用核酸互补的碱基序列部位的核酸链时，待测用核酸的自身环化结构解开，并与上述核酸链形成双链，基于上述反应，解析上述待测用核酸的结构变化。
13.一种确定碱基序列的方法，通过进行如下步骤来确定单链核酸或双链核酸的碱基序列：
事先将在与核酸链的碱基或碱基对结合时发生结构变化的蛋白质保持在可产生瞬逝光的界面区域的步骤；
使上述核酸链与上述蛋白质结合的步骤；
按时间序列连续测量由上述瞬逝光激发而产生的、来自上述蛋白质的荧光强度的步骤；以及
将由该测量得到的荧光强度数据和与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质的荧光强度数据库进行自动对照的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，上述蛋白质将多个碱基或碱基对作为识别单位来发生结构变化。
15.一种碱基序列确定装置，至少具备：
界面，其将与核酸链的碱基或碱基对结合时发生结构变化的蛋白质利用荧光物质标记之后保持，并且产生瞬逝光；
荧光检测部，其能够根据上述瞬逝光的荧光激发，连续测量来自上述蛋白质的荧光强度；
数据库保持部，其事先保持与碱基或碱基对的种类相关的上述蛋白质的荧光强度数据库；以及
数据处理部，其通过将由上述测量得到的荧光强度数据和上述荧光强度数据库进行自动对照，确定核酸链的碱基序列。
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