CN101210235B - 肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法，其制备方法的步骤是(1).在种子培养基上制备肉色曲霉菌种；(2).肉色曲霉菌种在发酵培养基上制备发酵液，纸板过滤形成过滤酶液；(3).过滤酶液脱色，纸板精滤形成脱色过滤酶液；(4).脱色过滤酶液进行超滤浓缩，即得到浓缩碱性脂肪酶。用本发明菌株肉色曲霉生产脂肪酶的最适pH值为10.0，最适温度为30℃，pH和热稳定性好，可抗表面活性剂和漂白剂，能够成为一种新型的应用于常温和低温洗涤剂的酶制剂。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法。
背景技术
碱性脂肪酶是一种新型洗涤剂用酶，主要用途是作为洗涤剂的新酶种。它的特性能分解衣物油污成甘油二脂、甘油单脂及脂肪酸等较易溶于水的物质，从而显著提高洗衣粉的洗涤效果，尤其是去除黄斑的效果。我们常用各种含酶洗衣粉，其中的酶制剂主要有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。碱性蛋白酶用于分解蛋白质类污物，如汗渍、血渍等。碱性脂肪酶则主要作用于脂肪酸及其酯类污物，也就是我们通常所指的油污类。酶作为一种生物制剂，无毒并能完全生物降解，对环境的生态平衡起良性的作用。
目前，国内外报道的微生物脂肪酶产生菌已多达65个属，其中：细菌28个属；丝状真菌23个属；酵母菌10个属；放线菌4个属。丝状真菌在细胞外分泌酶，是一种优异的脂肪酶产生菌种。但是国内未见有通过肉色曲霉菌种生产脂肪酶的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法。
本发明实现目的的技术方案是：
一种肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法，其生产方法的步骤是：
(1).在种子培养基上制备肉色曲霉菌种；
(2).肉色曲霉菌种在发酵培养基上制备发酵液，纸板过滤形成过滤酶液；
(3).过滤酶液脱色，经纸板精滤形成脱色过滤酶液；
(4).脱色过滤酶液进行超滤浓缩，即得到浓缩碱性脂肪酶。
而且，所述的种子培养基为土豆斜面培养基，肉色曲霉菌种的制备方法是：菌株肉色曲霉在土豆斜面培养基上27～29℃温度条件下培养72～96小时；
而且，所述的发酵培养基的构成及其重量百分比分别为：黄豆粉2；玉米粉1；糊精1；柠檬酸钠0.1；NaNO3 0.5；K2HPO4 0.5；FeSO4 0.006；大豆油0.2～0.5；蔗糖1；NH4NO3 0.5；培养基的pH＝8.0，培养温度为28～37℃，培养时间为95～97h，酶活为10.21～14.18U/ml。
而且，所述的过滤酶液脱色采用中颗粒活性炭，加入量为0.5～1.0％，脱色时间为20～30min。
而且，所述的脱色过滤酶液进行超滤浓缩采用醋酸纤维膜，操作温度为10～20℃，压力为0.05～0.1Mpa。
而且，所述的肉色曲霉菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.3.3919。
本发明的优点和积极效果是：
本发明的菌株采用肉色曲霉(Aspergillus carneus)，经过斜面培养、发酵培养及提取工艺获得浓缩酶，并对该脂肪酶进行酶学性质研究。用本发明菌株肉色曲霉生产脂肪酶的最适pH值为10.0，最适温度为30℃，pH和热稳定性好，可抗表面活性剂和漂白剂，能够成为一种新型的应用于常温和低温洗涤剂的酶制剂。
附图说明
图1为本发明的PH值对酶活性影响的曲线图；
图2为本发明温度对酶活性影响的曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明所使用的肉色曲霉菌种是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的一种肉色曲霉，保藏编号为CGMCC No.3.3919。
一种肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法，其生产方法的步骤是：
(1).在种子培养基上制备肉色曲霉菌种，以下提供三个实例：
a..种子培养基采用土豆斜面培养基：PDA+2％的蔗糖；培养条件：28℃温度下培养72小时。
b.种子培养基采用土豆斜面培养基：PDA+2％的蔗糖；培养条件：28℃温度下培养84小时。
c.种子培养基采用土豆斜面培养基：PDA+2％的蔗糖；培养条件：28℃温度下培养96小时。
(2).肉色曲霉菌种在发酵培养基上制备发酵液，经纸板过滤形成过滤酶液，以下提供三个实例：
a.发酵培养基(％)：黄豆粉2；玉米粉1；糊精1；柠檬酸钠0.1；NaNO3 0.5；K2HPO4 0.5；FeSO4 0.006；大豆油0.5(mL)；蔗糖1；NH4NO3 0.5；pH8.0。接种与培养条件：孢子悬浮液的浓度为6.2×106，接种量106/ml，培养37℃，培养时间为96h，测得的酶活为10.21U/ml。
b.发酵培养基(％)：黄豆粉2；玉米粉1；糊精1；柠檬酸钠0.1；NaNO30.5；K2HPO4 0.5；FeSO4 0.006；大豆油0.5(mL)；蔗糖1；NH4NO3 0.5；pH8.0。接种与培养条件：孢子悬浮液的浓度为6.2×106，接种量106/ml，培养温度28℃，培养时间为96h，测得的酶活为12.68U/ml。
c.发酵培养基(％)：黄豆粉2；玉米粉1；糊精1；柠檬酸钠0.1；NaNO30.5；K2HPO4 0.5；FeSO4 0.006；大豆油0.5(mL)；蔗糖1；NH4NO3 0.5；pH8.0。接种与培养条件：孢子悬浮液的浓度为6.2×106，接种量106/ml，培养温度30℃，培养时间为96h，测得的酶活为14.18U/ml。
(3).过滤酶液脱色，纸板精滤形成脱色过滤酶液，以下提供三个实例：
a.过滤酶液经纸板精滤后加入中颗粒活性炭进行脱色处理，加入量为0.5％，脱色30min，观察脱色过滤酶液外观，测定酶活力。
b.过滤酶液经纸板精滤后加入中颗粒活性炭进行脱色处理，加入量为0.5％，脱色20min，观察脱色过滤酶液外观，测定酶活力。
c.过滤酶液经纸板精滤后加入中颗粒活性炭进行脱色处理，加入量为1.0％，脱色30min，观察脱色过滤酶液外观，测定酶活力。
结论：采用1％中颗粒活性炭进行脱色处理30min后，脱色过滤液颜色由深褐色变为金黄色，脱色效果最为明显，，酶活收率为92.4％，达到了所需的最佳脱色效果。
(4).脱色过滤酶液进行超滤浓缩，即得到浓缩碱性脂肪酶，以下提供四个实例：
a.将脱色过滤酶液进行超滤浓缩，采用醋酸纤维膜，超滤温度20℃，操作压力0.05MP，超滤2小时后，测定浓缩酶液酶活力以及浓缩倍数。
b.将脱色过滤酶液进行超滤浓缩，采用醋酸纤维膜，超滤温度20℃，操作压力0.10MP，超滤2小时后，测定浓缩酶液酶活力以及浓缩倍数。
c.将脱色过滤酶液进行超滤浓缩，采用醋酸纤维膜，超滤温度10℃，操作压力0.05MP，超滤2小时后，测定浓缩酶液酶活力以及浓缩倍数。
d.将脱色过滤酶液进行超滤浓缩，采用醋酸纤维膜，超滤温度10℃，操作压力0.1MP，超滤2小时后，测定浓缩酶液酶活力以及浓缩倍数。
结论：采用醋酸纤维的超滤膜进行碱性脂肪酶的超滤，超滤温度10℃，操作压力为0.05MP时，单位时间酶的浓缩倍数最高，且酶活回收率最大为96.1％，达到了所需的最佳浓缩效果。
总论：本实验活性炭脱色后用醋酸纤维膜超滤，有效提高脂酶液澄清度，提高液体酶商品性状。每个浓缩工艺阶段酶的回收率都维持在较高的水平，脱色精滤和超滤浓缩工艺酶的回收率分别达到92.4％和96.1％，最终整个工艺流程的总回收率为88.80％(见表1)。
表1提取流程中酶活力检测
| 脱色过滤 | 超滤 | 总回收率 | ||||
| 处理前 | 处理后 | 回收率 | 处理前 | 处理后 | 回收率 | |
| 1167U | 1078U | 92.4％ | 1078U | 1036U | 96.1％ | 88.80％ |
下面对本发明进行酶学性质研究，以进一步论证本发明的先进性。
例1：以对-棕榈酸硝基苯酯为底物，用领域内常规的方法检测PH值对制得的肉色曲霉浓缩酶活性的影响，表明酶作用的PH值范围为：6.0---12.0，最佳pH值为10.0，对碱性环境有极强的耐受性。检测结果见图1。
例2：以对-棕榈酸硝基苯酯为底物，用领域内常规的方法检测温度对制得的肉色曲霉浓缩酶活性的影响，表明所产酶作用的温度范围为：10℃--70℃，最佳温度为30℃。检测结果见图2。
例3以对-棕榈酸硝基苯酯为底物，检测肉色曲霉浓缩酶与表面活性剂(TritonX-100、Tween-80、Tween-20)、漂白剂(过硼酸钠、过氧化氢)按浓度1％于30℃、pH10.0下保温1个小时后脂肪酶活性的变化。结果显示该脂肪酶活力除了与Tri tonX-100共存时大幅度提高，其他均变化不大。该酶具有良好的抗表面活性剂与氧化剂特性。检测结果见表2。
表2清洁剂对酶活的影响
| 清洁剂 | 酶活(U/ml) | 相对酶活(％) |
| 对照(没有清洁剂) | 14.93 | 100 |
| TritonX-100 | 20.12 | 134.78 |
| Tween-80 | 15.47 | 103.62 |
| Tween-20 | 12.89 | 86.31 |
| 过硼酸钠 | 14.24 | 95.38 |
| 过氧化氢 | 13.99 | 93.71 |
Claims (3)
1.一种肉色曲霉(Aspergillus carneus)生产浓缩碱性脂肪酶的方法，其特征在于：所述肉色曲霉菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC No.3.3919；其生产浓缩碱性脂肪酶方法的步骤是：
(1)在种子培养基上制备肉色曲霉菌种，所述种子培养基为土豆斜面培养基，肉色曲霉菌种的制备方法是：菌株肉色曲霉在土豆斜面培养基上27～29℃温度条件下培养72～96小时；
(2)肉色曲霉菌种在发酵培养基上制备发酵液，纸板过滤形成过滤酶液；
(3)过滤酶液脱色，经纸板精滤形成脱色过滤酶液；
(4)脱色过滤酶液进行超滤浓缩，即得到浓缩碱性脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法，其特征在于：所述的过滤酶液脱色采用中颗粒活性炭，加入量为0.5～1.0％，脱色时间为20～30min。
3.根据权利要求1所述的肉色曲霉生产浓缩碱性脂肪酶的方法，其特征在于：所述的脱色过滤酶液进行超滤浓缩采用醋酸纤维膜，操作温度为10～20℃，压力为0.05～0.1Mpa。
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