高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体地说,涉及一种病毒的重组质粒和遗传工程疫苗,更具体地说,涉及一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),又称蓝耳病,是一种由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病。PRRSV基因组为大小约15kb、不分节段的单股正链RNA。由于RNA病毒易于发生遗传及抗原突变,近年来在世界各地出现了致病力增强的PRRSV变异株,另外,因为PRRSV靶细胞为免疫系统重要成员之一的肺泡巨噬细胞,感染猪大多呈现免疫抑制而致继发感染和混合感染。
为了更深入的了解PRRSV的生物学特性和不断变化的现状,最有效的方法之一就是利用反向遗传操作系统对其基因组结构和生物学特性进行相应的研究,从而获取其结构与基因的直接证据。早在1998年Meulenberg就成功构建起欧洲株LV(Lelystad Virus)的重组质粒,而后世界各国的科学家也纷纷构建起不同病毒株的重组质粒,而且试验证据也在不断证明,拯救出来的病毒一般都具有与野毒株相类似的生物学特性,但是这些野毒株和构建的重组质粒大多属于经典PRRSV株,感染率和致死率均不高,不能有效区分强毒株与弱毒株对动物体致病力的差异。
2006年5月以来,中国爆发了高致病性PRRSV引发的所谓“猪高热综合征”,该病以传播迅猛、高致死率为特征,死亡率竟然高达80%-100%。尤其令人吃惊的是,高致病性PRRSV与典型株不同,表现于不仅仅感染仔猪死亡率可达100%,而且77日龄成年感染猪死亡率也高达57%。因此,很有必要构建出高致病性病毒重组质粒株,以便于对高致病性的PRRSV的生物学特性进行研究,同时,开发新型高效的蓝耳病疫苗也成为当务之急。
但是,由于PRRSV基因组很长,是大小约15kb、不分节段的单链正股RNA,编码至少9个开放阅读框(ORF),而且这些阅读框两两之间具有重叠区域,因此阅读框中的一个碱基的变化就有可能会影响整个基因组的结构从而导致整个全长质粒不具备感染性;此外,因为RNA病毒自身的特点,其基因组并不稳定,因此,利用传统的方法,很难从cDNA直接获得全长重组质粒,从而成为开发新型高效的蓝耳病疫苗的工作的瓶颈。
PRRSV结构蛋白构成外观圆形有囊膜的病毒颗粒,其中,ORF5、ORF6和ORF7所编码的产物为病毒蛋白必需蛋白,而其他糖蛋白GP2、GP3、GP4等在病毒颗粒组装乃至激发机体内免疫过程中的作用还存在争议。GP5被认为是病毒的细胞结合蛋白,同时也是刺激机体产生中和抗体的主要蛋白,核衣壳蛋白N是免疫原性最强的蛋白,因此,针对这些在病毒感染过程中与激发机体免疫极其相关的这些蛋白,开发猪繁殖与呼吸综合征疫苗成为可能。另一方面,不同病毒株间遗传及抗原差异很大,如何提高疫苗毒株的交叉保护性以及研制针对目前优势流行株的高效疫苗是亟待解决的问题。
利用反向遗传操作技术可以构建不同毒株间的嵌合病毒,使其具备多种病毒的免疫学特性;另外,这种嵌合疫苗是在基因水平上按照理想设计改造病原体,即将两种或多种相似的病原体的基因组或片段用基因工程的方法以不同形式连接或置换,从而可以得到减毒活疫苗。因此,利用嵌合疫苗开发新型高效的猪繁殖与呼吸综合征疫苗具有可行性。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒的构建方法。
本发明还有一个目的在于,提供一种高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗。
本发明还有一个目的在于,提供一种高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗的构建方法。
本发明的从病毒cDNA获得高致病性蓝耳病病毒的重组质粒的方法,为根据蓝耳病病毒相对保守区的序列设计多对引物对,利用高致病性猪蓝耳病病毒cDNA为模板,分段扩增蓝耳病病毒基因序列,然后将扩增出的序列依次连接到合适的载体,从而获得了一种高致病性蓝耳病病毒重组质粒。
本发明的高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗,是编码结构蛋白的序列和3’UTR基因被所述重组质粒的相应的编码结构蛋白的序列以及3’UTR基因所替代的弱毒疫苗株。
本发明的高致病性蓝耳病的遗传工程活疫苗的构建方法包括以下步骤:首先扩增出重组质粒的结构蛋白基因;然后将扩增出的结构蛋白基因和弱毒疫苗株进行酶切,最后将酶切后的结构蛋白基因和弱毒疫苗株进行连接,并转化TOP10,然后通过筛选获得遗传工程活疫苗,从而提供了相应的构建方法。
使用本发明的重组质粒构建方法,可以将基于发病猪场获得的血清中分离出来的病毒构建成全长感染性cDNA质粒pJX143,该病毒及其拯救出来的病毒具有和野生亲本毒相似的生物学特性和动物宿主的感染力和致死率。而且后续的试验证实,该重组质粒确实是引起这次“猪无名高热”的主要致病病原。同时,基于上述重组质粒,构建的一株疫苗株pSX12对猪体具有较好安全性,免疫后可有效诱导产生机体免疫,并提供猪体免疫保护作用,对“猪高致病性蓝耳病”的免疫保护率高达100%,安全有效。
附图说明
图1是不同PRRS-F/PRRS-R引物对扩增PRRSV全基因组序列PCR产物电泳检测结果,其中,泳道1为由引物SF1392和SR6589获得的长度约为5kb的PCR片段,泳道2为由引物SF4344和SR9033获得的长度约为5kb的PCR片段,泳道3为由引物SF7682和SR13334获得的长度约为5.5kb的PCR片段,泳道4为引物STL和SR2573获得的长度约为2.5kb的PCR片段,泳道5为由引物SF11422和Qst获得的长度约为2.5kb的PCR片段。
图2是PRRSV基因组全长cDNA质粒构建策略示意图。
图3是全基因组质粒构建示意图。
图4是用重组质粒转染细胞后出现的细胞病变结果。
图5是拯救病毒的N蛋白免疫荧光照片,其中,A是被拯救病毒vJX143的N蛋白免疫荧光照片;B是被拯救病毒vJX143-M的N蛋白免疫荧光照片;C为阴性对照。
图6是对照弱毒株、拯救病毒株与野毒株病毒滴度比较结果。
图7是拯救病毒株、野毒株和阴性对照对猪的体温影响的结果。
图8是嵌合质粒构建示意图。
图9是嵌合病毒构建过程中结构蛋白扩增的电泳结果。
图10是SmaI酶切嵌合质粒pSX12、p5NX12和p56N12的电泳结果,其中,泳道1是SmaI酶切的pSX12,泳道2是SmaI酶切的p5NX12,泳道3是SmaI酶切的p56N12,泳道4是SmaI酶切的阳性对照pAPRRS。
图11是试验及对照组猪在PRRSV SX12株病毒接种及PRRSV JX143株病毒攻毒后每天体温变化。
图12是在vSX12株病毒接种后第0,3,5,7,10,14,21,28天抗体变化图。
具体实施方式
在本发明中,所述猪蓝耳病病毒或猪繁殖与呼吸综合征病毒株指的是,猪繁殖与呼吸综合征病毒vJX143株。
在本发明中,所述重组质粒指的是,利用反向遗传操作技术,由上述野毒株获得的cDNA质粒pJX143。
在本发明中,所述嵌合病毒指的是,利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pSX12、p5NX12和p56N12。
在本发明中,所述的反向遗传操作指的是:相对于经典遗传学而言的,是在获得高致病性蓝耳病基因组全部序列(JX143)的基础上,通过对病毒基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等,再按组成顺序构建全长病毒基因组,让其装配出具有生物活性的病毒粒子,研究高致病性蓝耳病基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。
在本发明中,所述北美株和欧洲株代表株指的分别是,北美株经典毒株VR2332(Genbank accession#DQ217415)和欧洲株经典毒株LV(Genbankaccession#M96262)。
在本发明中,所述弱病毒株pAPRRS指的是,参考文献孙志,王金勇,张建武,秦爱健,袁世山,猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒3’UTR的反向遗传操作.微生物学报[J],2007,47(5):774-778.的方法,利用系列传代获得的一株弱毒株的感染性克隆。
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件进行。
在本发明的实施例中,使用的病毒和细胞:Marc-145细胞(美国细胞保藏中心ATCC,保存号为:CRL-2378.1);高致病性的PRRSV病毒vJX143株(中国普通微生物保藏管理中心保存号为:CGMCC No.1964),利用其感染正常猪仔7~10天后取血清待用。
在本发明的实施例中,使用的质粒与菌株:pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司,pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。
在本发明的实施例中,使用的其他试剂:QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司,DNA胶回收试剂盒和Quant Reverse Transcriptase购自TIANGENE公司,rTaq DNA聚合酶,dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司,质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司,DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司,Opti-MEM购自Invitrogen公司。
在本发明的实施例中,Marc-145单层细胞采用以下方法制备:
Marc-145细胞在含有6%FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后,弃培养基,PBS洗两遍后加入维持液(2%FBS的DMEM)培养基,37℃5%CO2培养箱中培养。
在本发明的实施例中,细胞回归试验过程如下:利用试验猪体内各组织脏器的病料研磨匀浆上清感染单层Marc-145细胞,然后进行传代,以观察是否可以出现细胞病变,如出现,则证明猪体内各组织脏器中含有具有生物活性的病毒粒子。
实施例1、高致病性蓝耳病病毒重组质粒的构建
根据GenBank登录号为EF488048的高致病性蓝耳病病毒基因JX143的碱基序列,设计出5对引物,分别作为PCR扩增的引物;然后将从使用PRRSV病毒vJX143株感染的猪仔的血清中提取高致病性病毒RNA,反转录合成为野毒株cDNA,以其作为PCR的模板,进行PCR扩增,获得野毒株cDNA的5条特异性片段1-5,并将第5条特异性片段进行突变,获得特异性片段5’;然后将特异性片段1-5或特异性片段1-4+5’依次插入到pBlueScriptII SK(+)载体中,构建获得重组质粒pJX143和pJX143-M,过程如图3所示,然后分别通过细胞实验和动物体实验,验证了获得的重组质粒具有高致病性,具体过程如下:
1.1、引物设计
根据GenBank登录号为EF488048的JX143碱基序列,设计在PRRSV基因组中的相对保守区引物,分别命名为:STL,SF1392,SR2573,SF4344,SR6589,SF7682,SR9033,SF11422,SR13334和Qst,其中,STL和SR2573,SF1392和SR6589,SF4344和SR9033,SF7682和SR13334,SF11422和Qst分别构成相应的引物对,其序列分别如下所示:
STL:5’-ACATGCATGCTAATACGACTCACTATAGGTATGACGTATAGGTGTTGGC-3’
SF1392:5’-GCCGCGCTTTGCCCGTTCGT-3’
SR2573:5’-CTGCCCAGGCCATCATGTCCGAAGTC-3’
SF4344:5’-GCCCCGTCGGTCTCAGTCTTGCCATTTTT-3’
SR6589:5’-ACCGAGGCTGTAAAAGGCAAGTGACC-3’
SF7682:5’-CTTTCCGTTGAGCAGGCCCTTGGTATGA-3’
SR9033:5’-GGCGGCAAACCAGCGGACAA-3’
SF11422:5’-TTTATAAGGCCACTGCCACC-3’
SR13334:5’-TTGCCGCCGTCGACTTGATGCTGGTAAT-3’
Qst:5’-GAGTGACGAGGACTCGAGCGCATGCTTTTTTTTTTTTTT-3’
1.2、高致病性病毒重组质粒的构建
1.2.1、血清样品中病毒RNA的提取
使用vJX143株感染仔猪,然后取发病猪的血清样品140μl,参照QIAamp Viral RNAMini Kit中病毒细胞培养上清的方法,提取病毒的RNA。
1.2.2、高致病性病毒cDNA的合成
取上述获得的病毒RNA 12.5μl,加入dNTP(2.5mM)4μl,10×Buffer 2μl,Qst反转录引物(10mM)0.5μl,Quant Reverse Transcriptase(购自Invitrogen公司)1μl,混合均匀后置37℃水浴1小时,获得高致病性病毒cDNA。
1.2.3、高致病性病毒cDNA片段的PCR扩增
以上述合成的cDNA为模板,每次以一对实施例1.1中相应的上下游引物对作为引物,分别进行PCR扩增,其反应体系如下:
cDNA模板1μl,上下游引物对(10μM)各1μl,10×Buffer 2μl,2.5mM dNTP2μl,rTaq DNA聚合酶5 units,加水至20μl。
PCR反应完成后,将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图1所示,根据图1的结果,分别获得了大小为2.5Kb、2.5Kb、5.1Kb、5.3Kb、5.2Kb的目的条带。
然后参照说明书,使用胶回收试剂盒回收目的片段,获得5条特异性片段,然后对上述5条特异性片段测序,其序列分别如SEQ ID NO:1-5所示。
1.2.4、特异性片断的克隆
将上步获得的各特异性片断,参照pBS-T Mini Kit(TIANGEN公司)中片段连接的方法,分别克隆到pBS-T载体中,通过蓝白斑筛选及其琼脂糖凝胶电泳,获得重组质粒,分另命名为pBS-IN1、pBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5。
获得的5个重组质粒经测序验证,克隆进去的5条特异性片段正确。
1.2.5、病毒全长cDNA重组质粒的构建
利用生物医学软件DNASTAR(http://enfull.com/china/Profession/{E37D28C4-9991-4AA1-B76A-016A046CD62D}.htm),对pBS-IN1、pBS-IN2、pBS-IN3、pBS-IN4、pBS-IN5中目的片段的重叠区域进行分析后,选取合适的酶切位点(分别为SphI、MfeI、AflII、AgeI、AscI和NotI)进行酶切,如图2所示,使用SphI和MfeI双酶切pBS-IN1,MfeI和AflII双酶切pBS-IN2,AflII和AgeI双酶切pBS-IN3,AgeI和AscI双酶切pBS-IN4,AscI和NotI双酶切pBS-IN5,然后将上述酶切后的片段按照pBS-IN1~pBS-IN5的顺序依次插入到经相同酶切的pBlueScriptIISK(+)载体中,构建成为全长重组质粒。
获得的全长重组质粒用BamH I鉴定,出现了预期大小的片断,然后将该片段测序,结果显示序列如SEQ ID NO:6所示,表明重组质粒构建成功。
同时,还将pBS-IN5上的特异性片段(即SEQ ID NO:5)上对应全长的第14680位的碱基A突变为G,获得pBS-IN5-M片段,然后采用上述相同的方法,将pBS-IN5-M替代pBS-IN5片段插入到pBlueScript II SK(+)载体中,构建了重组质粒pBLJX-5-M。
1.3、病毒RNA的制备
1.3.1、质粒的Not I线性化
于37℃,用Not I分别对质粒pBLJX-5和pBLJX-5-M进行线性化酶切(反应体系为:突变质粒30μL,Not I 2μL,ddH2O 13μL,10xNEB Buffer2 5μL),酶切过夜。参考说明书的方法,用QIAquick PCR Purification Kit纯化酶切产物,分别获得纯化的线性化质粒。
1.3.2、体外转录
参考说明书的方法,使用T7 mMESSAGE High Yield Capped RNA Transcription Kit(购自Ambion公司)体外转录纯化后的线性化质粒,并采用RNA电泳鉴定,根据鉴定结果,获得了vJX143和vJX143-M RNA。
1.4、高致病性蓝耳病病毒重组质粒的检测
1.4.1、RNA的转染
接种Marc-145细胞(罗猴肾细胞系,购自美国ATCC)于六孔板中培养,待细胞密度为80-90%时,向每孔中分别加入2μl vJX143和vJX143-M RNA和2μl DMRIE-C转染试剂,在1ml的Opti-MEM中振荡混匀,然后根据转染试剂说明书的方法,转染Marc-145细胞,并且逐日观察细胞病变。
待出现如图4所示的细胞病变(CPE)后,收取上清并传代,上清收取及传代过程具体如下:
Marc-145细胞在含有6%FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后,弃培养基,PBS洗两遍,吸取转染过后五天的上清液,将其与维持液(含2%FBS的DMEM)按照1∶10的比例接种上清液200μl,置37℃继续培养并采用上述方法继续传代,并收取第五代的病毒上清,然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA,获得病毒vJX143和vJX143-M。
根据上述结果,获得的重组质粒pJX143和pJX143-M具有感染性,能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。
1.4.2、间接免疫荧光检测
按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤,分别以纯化后1000倍稀释的病毒vJX143和vJX143-M,感染单层Marc-145细胞,然后于感染36h后弃去培养基,用冰甲醇固定10min,1%BSA室温封闭30min,PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗(1∶800稀释)室温孵育2h,再加入FITC标记的羊抗鼠的二抗室温孵育1h,PBS洗五遍后,在荧光显微镜下观察,结果如图5所示。
根据图5的结果:pJX143和pJX143-M于转染后第5天出现了明显的CPE,以无限稀释法传代纯化嵌合病毒vJX143和vJX143-M,并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒vJX143或vJX143-M 36h后的Marc-145细胞,出现了特异性荧光。
同时,利用RT-PCR技术检测原代(P0)和子代(P5)病毒,结果显示,分子标记依然稳定存在。
上述结果说明:利用反向遗传操作系统获得了和野毒具有相似生长特性的全长重组质粒,而且同时说明在ORF5下游插入的遗传标记并不影响整个病毒的生长,是可行的。
1.4.3、病毒细胞半数感染量(TCID50)测定
参照Pizzi,M.,Sampling variation of the fiftypercent end-point,determinedby the Reed-Muench(Behrens)method,Hum Biol,1950.22(3):p 151-90.中的方法,用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液(2%FBS的DMEM)作10倍系列稀释后,将10-3-10-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞,每稀释度接种4孔,每孔0.20ml,再设2孔对照(即用维持液代替病毒液),置37℃5%的二氧化碳培养箱中培养,逐日观察感染细胞,记录出现细胞病变的孔数,当停止出现细胞病变后,停止观察,并按Reed-Muench法计算TCID50,
1.4.4、病毒多步生长曲线的绘制
分别以低剂量(0.1MOI)病毒(野毒、vJX143和vJX143-M)感染MARC-145细胞,分别在感染后不同的时间段(6h、12h、24h、36h、48h、72h、84h、96h、108h、120h)收取细胞上清,并进行病毒滴度的测定,收取的每个时间点病毒用TCID50计算滴度,并根据不同时间点病毒的滴度,绘制病毒多步生长曲线,结果如图6所示,根据该图,在感染10h后病毒形成第一个复制高峰期,随后在第50h出现第二个复制高峰期;野毒株vJX143与嵌合病毒vJX143及vJX143-M之间的差异不显著。结果说明利用反向遗传操作技术,获得的全长重组质粒质粒拯救出来的病毒和野生毒株在病毒的复制,增值,各个时间的病毒滴度等及其平台期,指数增长期,平台期等生长曲线方面具有相似的生物活性。
1.4.5、动物回归试验
将12头35日龄PRRSV血清阴性猪分成4组,每组三头,以鼻腔接种分别接种野毒(A组)、嵌合病毒vJX143(B组)和vJX143-M(C组)及生理盐水(D组),每头接种1ml(TCID50105/ml),同时肌肉注射1ml,隔离饲喂,每天测量体温并进行临床症状的观察,结果如图7所示。攻毒25天后,扑杀试验猪,采取肺、肾脏、脾、肠、淋巴结及血清,利用RT-PCR及细胞回归试验检测上述各组织器官中的病毒组分,实验结果如下:
A组和B组试验猪在攻毒5天后体温升高,攻毒猪均见消瘦,腹式呼吸,食欲不振,精神沉郁,有部分猪发现水样稀粪,并伴有咳嗽症状,死亡猪尤其可见消瘦,腹式呼吸。A组猪分别在第13天和第16天死亡,B组猪分别在第14和15天死亡。对死亡猪剖检可见肺部症状明显,淋巴结出血明显,部分猪肾脏有出血点,少数猪伴有整个消化道广泛性出血、水肿,肠内容物为红色,含有大量气泡和粘液。C组猪体温、精神状况均正常,剖检未见上述变化。具体体温变化如图7所示。
上述实验结果,说明拯救出来的病毒与野毒具有相似的生物学特性,而且在动物试验中也证实,这次猪高热综合症的病原确实是由vJX143为代表的病毒。
在实施例1中,通过分子操作技术获得了正在中国大面积爆发的“猪高热综合征”的主要病原-高致病性PRRSV的全长序列,而且在此基础之上成功构建了高致病性全长重组质粒pJX143,并证实拯救出来的病毒与原毒具有相类似的生物学特性,更重要的是在动物回归试验中,该重组质粒pJX143呈现出与亲本毒相似的高致死率。此外,加入了遗传标记MluI的全长质粒具有相似的特征,而且在传代之后依然能够稳定存在,可以成为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标记,从而证实该株PRRSV是引起“猪高热综合征”的主要病原,而且也是中国这次大面积暴发的代表株;同时,根据反向遗传操作系统构建的该重组质粒可以为后续试验及其应用提供有效的操作平台。
实施例2、蓝耳病嵌合病毒构建及检测
2.1、引物设计
根据pJX143株的序列,设计引物SPEF,NDE5F,Qst,SRSOE6,SFSOE7,SF12670,SR14365,SF14413和SR15497,其序列及序列说明如表1所示:
表1、克隆以及测序所用引物
名称 |
序列(5’-3’) |
用途 |
SPEF |
GCCACTTGACTAGTGTTTACG |
位于ORF3末段,含SpeI位点,克隆上游引物,用于构建pSX12、p56N12 |
名称 |
序列(5’-3’) |
用途 |
NDE5F |
CTGTTGGCAGTTTGACATATGTTTAAGTATG |
位于ORF4和ORF5之间,含Nde I位点,克隆上游引物,用于构建p5NX12 |
Qst |
GAGTGACGAGGACTCGAGCGCATGCTTTTTTTTTTTTT |
反转录引物;克隆下游引物,含XhoI位点 |
SRSOE6 |
TGTTATTTGGCATATTTAACAAGGTTTACCACTCCCTGCT |
SOE PCR内引物,用于构建p56N12 |
SFSOE7 |
TTGTTAAATATGCCAAATAACAACGGCAAACAGCAG |
SOE PCR内引物,用于构建p56N12 |
SF12670 |
CTCTCGGCTACCCATGCTACAC |
RT-PCR以及测序引物,用于vSX12、v5NX12、v56N12的鉴定 |
SR14365 |
ACCGCCAACGATAGAGTCTGCCCTTAGTGTCC |
RT-PCR以及测序引物,用于vSX12、v5NX12、v56N12的鉴定 |
SF14413 |
CTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTG |
RT-PCR以及测序引物,用于v56N12的鉴定 |
SR15497 |
CAATTAAATCTTACCCCCACACGGTCG |
RT-PCR以及测序引物,用于v56N12的鉴定 |
2.2、结构蛋白嵌合质粒的构建
以pJX143重组质粒的结构蛋白为对象,通过PCR扩增出pJX143的结构蛋白基因GP4-GP5-M-N和GP5-M-N,然后分别使用SpeI/XhoI和NdeI/XhoI进行双酶切,再与经过相应的内切酶切过的弱病毒株pAPRRS的大片段通过T4 DNA连接酶连接,经测序鉴定后筛选出阳性克隆,获得pSX12和pSNX12,构建策略如图8所示,具体构建步骤如下:
2.2.1、扩增结构蛋白GP4-GP5-M-N基因
以pJX143作为模板,引物SPEF和Qst分别作为上游引物和下游引物,PCR扩增结构蛋白GP4-GP5-M-N基因,具体如下:
PCR反应体系为:pJX143模板1μl,上下游引物对(10μM)各1μl,10×pfu Buffer5μl,2.5mM dNTP 2μl,PFU Turbo DNA聚合酶5 units,加水至50μl。
PCR反应参数为:95℃预变性2min,94℃变性45s,62℃退火45s,72℃延伸2min30s,共进行35个循环,然后72℃延伸10min。
取PCR反应产物,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图9所示,根据检测结果,获得的目的片段大小为2.4kb。
2.2.2、扩增结构蛋白GP5-M-N基因
以pJX143作为模板,引物NDE5F和Qst分别作为上游引物和下游引物,PCR扩增结构蛋白GP5-M-N基因,具体如下:
PCR反应体系为:pJX143模板1μl,上下游引物对(10μM)各1μl,10×pfu Buffer5μl,2.5mM dNTP 2μl,PFU Turbo DNA聚合酶5units,加水至50μl。
PCR反应参数为:95℃预变性2min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,进行6个循环,再95℃预变性2min,94℃变性45s,62℃退火45s,72℃延伸2min,进行25个循环,再72℃延伸10min。
取PCR反应产物,用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果如图9所示,根据检测结果,获得的目的片段大小为1.6kb。
2.2.3、扩增结构蛋白基因的酶切
利用小量胶回收试剂盒分别纯化实施例2.3.1和2.3.2中获得的PCR产物,然后分别以Spe I/Xho I双酶切GP4-GP5-M-N基因的PCR产物,以Nde I/Xho I双酶切GP5-M-N基因PCR产物,将获得的酶切产物分别用1%琼脂糖凝胶电泳后,使用胶回收试剂盒纯化酶切产物,获得大小分别为2.4kb的GP4-GP5-M-N基因片段和1.6kb的GP5-M-N基因片段。
2.2.4、载体pAPRRS、p5NDE的双酶切
分别以Spe I/Xho I双酶切pAPRRS,以Nde I/Xho I双酶切p5NDE。再将酶切产物分别以1%琼脂糖凝胶电泳,并用胶回收试剂盒纯化,分别获得大小分别为16kb的pAPRRS双酶切片段和17kb的p5NDE双酶切片段。
2.2.5、嵌合质粒的连接和鉴定
将回收的PCR双酶切产物和相应的质粒双酶切产物,以T4 DNA连接酶连接,然后转化TOP10,筛选大小合适的阳性质粒,测序鉴定。具体步骤如下:
将PCR产物和相应的载体片段以摩尔比3∶1的比例,以T4 DNA连接酶连接,转化TOP10,挑取独立的菌落进行纯培养,提取质粒DNA,1%凝胶电泳,挑取大小为18kb的质粒进行测序,结果分别如SEQ ID NO:7和8所示。
将GP4-GP5-M-N嵌合的全长质粒(即SEQ ID NO:7对应的质粒)命名为pSX12,GP5-M-N嵌合的全长质粒(即SEQ ID NO:8对应的质粒)命名为p5NX12。
2.3、GP5-M的嵌合质粒质粒的构建及鉴定
参考Karin L Heckman et al.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlapextension.NATURE PROTOCOLS.2007 VOL.2 NO.4,通过SOE PCR法,把p5NX12的N蛋白以及3’UTR基因置换成弱毒疫苗株全长重组质粒pAPRRS的相应部分,从而获得GP5-M的嵌合质粒,具体步骤如下:
在M蛋白和N蛋白基因重叠区域设计SOE PCR内引物(即SRSOE6和SFSOE7),外引物采用SPEF和Qst。
以p5NX12为模板,SPEF和SRSOE6为上下游引物,采用SOE PCR扩增,其中:
PCR反应体系为:p5NX12模板1μl,上下游引物对(10μM)各1μl,10×pfu Buffer5μl,2.5mM dNTP 2μl,PFU Turbo DNA聚合酶5 units,加水至50μl。
PCR反应参数为:95℃预变性2min,94℃变性45s,62℃退火45s,72℃延伸2min,共进行35个循环,然后72℃延伸10min。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图9所示,然后用胶回收试剂盒回收,获得大小为1.9kb目的片段。
然后,以pAPRRS为模板,SFSOE7和Qst为上下游引物,PCR扩增,其中:
PCR反应体系为:pAPRRS模板1μl,上下游引物对(10μM)各1μl,10×pfu Buffer5μl,2.5mM dNTP 2μl,PFU Turbo DNA聚合酶5 units,加水至50μl。
PCR反应循环参数为:95℃预变性2min,94℃变性45s,68℃退火延伸2min,共进行35个循环,然后72℃延伸10min。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图9所示,然后用胶回收试剂盒回收,获得大小为0.5kb目的片段。
最后,以上述两个PCR产物为模板,SPEF和Qst为上下游引物,PCR扩增,其中:
PCR反应体系为:模板各1μl,上下游引物对(10μM)各1μl,10×pfu Buffer5μl,2.5mM dNTP 2μl,PFU Turbo DNA聚合酶5 units,加水至50μl。
PCR反应循环参数为:95℃预变性2min,94℃变性45s,62℃退火45s,72℃延伸2min 45s,共进行35个循环,然后72℃延伸10min。
将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果如图9所示,然后用胶回收试剂盒回收,获得大小约为2.5kb目的片段。
将回收获得的PCR产物和pAPRRS经Spe I/Xho I双酶切后连接,通过1%凝胶电泳筛选,将获得的大小约为18kb的质粒,命名为p56N12并进行测序,结果如SEQ ID NO:9所示,根据该结果,p56N12构建成功。
pSX12,p5NX12,p56N12以SmaI酶切鉴定,结果如图10所示,根据该结果,这三个嵌合质粒的SmaI酶切图谱与预期的一致,没有发生结构缺失。
根据上述实验结果,通过反向遗传操作,以pJX143株重组质粒pAPRRS质粒为基础构建了把JX143株GP4-GP5-M-N基因置换入pAPRRS而得到三个嵌合质粒的pSX12、p5NX12和p56N12。经SmaI酶切鉴定,与pAPRRS比较,无缺失;经测序分析显示质粒SX12的序列为SEQ ID NO:7,质粒5NX12的序列为SEQ ID NO:8,质粒56N12的序列为SEQ ID NO:9,根据该结果成功获得了3个变异株结构蛋白嵌合的嵌合质粒。
2.5、嵌合质粒的拯救
2.5.1、嵌合质粒转染细胞
将MARC-145细胞传代至六孔板上,使每孔细胞数达到2×105个,当细胞密度达到60%~80%左右时即可进行转染。将pSX12,p5NX12,p56N12按Roche公司FUGene HD转染试剂的方法转染MARC-145细胞,然后置37℃,5%CO2培养箱中培养,并观察细胞病变,待细胞病变达80%时,收集细胞上清。
2.5.2、转染上清的传代与RNA的提取
MARC-145细胞在含有10%FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后,弃培养基,PBS洗两遍,将细胞病变上清与维持液(2%FBS的DMEM)按照1∶10的比例接种上清液200μL,置37℃继续培养。传代5次以后,待产生80%CPE后,吸取病毒上清,按照QIAgen公司Viral RNA mini Kit说明书的方法,提取病毒RNA。
2.5.3、RT-PCR鉴定
将提取的3个嵌合病毒上清RNA模板,按AMV(购自Takara公司)和rTaq(购自Takara公司)说明书进行RT-PCR反应,获得病毒cDNA序列,其中,cDNA第一链合成引物是Qst,PCR引物是SX12以SF12670、SR14365为上下游引物、5NX12以SF14413、SR15497为上下游引物、56N12分别以SF12670、SR14365和SF14413、SR15497为上下游引物进行PCR扩增,并测序鉴定,根据测序结果,3个嵌合病毒构建成功。
将嵌合病毒在MARC-145细胞上连续传代5次后,取细胞上清用于抽提病毒基因组,并进行RT-PCR扩增重组质粒与弱毒重组质粒的嵌合交叉区域。经1%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像分析系统可见并测序,采用DNAstar软件与亲本重组质粒pAPRRS序列进行比对,结果显示3个嵌合病毒变异株序列都能稳定存在。
根据实施例2,本发明在高致病性蓝耳病重组质粒和经典弱毒蓝耳病重组质粒的基础之上,将高致病蓝耳病病毒的GP4-GP5-M-N,GP5-M,GP5-M-N基因分别替换到经典弱毒蓝耳病重组质粒中,从而构建出3个嵌合质粒,经病毒拯救,获得了活病毒,经RT-PCR鉴定,嵌合病毒能够稳定的传代而不发生缺失,因此,上述3个嵌合病毒,可作为新型蓝耳病疫苗。
从上述三个嵌合病毒中,任取一个进行动物实验,以验证其对蓝耳病具有免疫作用,在本发明的实施例3中,使用的是pSX12。
实施例3、蓝耳病嵌合病毒免疫保护性试验
3.1试验猪的选择及分组
选取29日龄健康仔猪10头,经采集血清进行PRRSV抗体及抗原检测,确定为PRRSV抗体阴性和抗原阴性,称重后随机将其分为2组,5头/组,隔离饲养。
3.2蓝耳病嵌合病毒接种
选取TCID50为106.0的PRRSV SX12株病毒的Marc-145细胞培养物,用灭菌PBS液做100倍稀释后,颈部肌肉接种一组5头试验仔猪,104.0TCID50/ml,2ml/头;另一组5头猪颈部肌肉接种灭菌PBS液作为对照,2ml/头。
3.3蓝耳病嵌合病毒免疫后的攻毒
试验组仔猪在PRRSV SX12株病毒接种后28天,接种PRRSV vJX143株病毒用灭菌PBS液做10倍稀释的Marc-145细胞培养物,104.7TCID50/ml,颈部肌肉接种3ml/头。对照组5头猪也做同样剂量和途径的接种。
3.4试验猪的体温测定
试验及对照组猪在PRRSV SX12株病毒接种后至用PRRSV vJX143株病毒攻毒14天后,每天进行体温测定,测定结果如图11所示。
根据测定结果,试验组在接种PRRSV SX12株病毒后未出现可观察到的体温反应;PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接种组出现一过性体温升高,而对照组则出现明显的体温升高,并且比SX12株病毒接种组的高体温水平持续更长的时间。
3.5试验猪血清抗体的测定
在PRRSV SX12株病毒接种后第0,3,5,7,10,14,21,28天对SX12株病毒接种组采集血清,并利用IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒(购自美国Herd Chek IDEXX)进行抗体检测,同时对未免疫组定期采集血清,并进行抗体检测作为对照,结果如图12所示,根据该结果,试验组在接种PRRSV SX12株病毒后第10天抗体开始产生,14天达到阳性值(ELISA S/P≥≥0.4),攻毒后抗体继续升高并达到峰值,到剖杀时(免疫后52天),抗体一直维持在高水平(ELISA S/P≥3),说明PRRSV SX12株有良好的免疫原性,可刺激机体产生很强的免疫反应。
在PRRSV vJX143株病毒接种后第0,2,4,6,8,10,14天对SX12株病毒接种组和未免疫攻毒组采集血清并利用IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒进行抗体检测,结果如图12所示,根据该结果,PRRSV vJX143株攻毒后,可有效刺激机体的免疫记忆细胞,使机体产生更高水平的抗体。
3.6试验猪攻毒后的症状观察
试验及对照组猪在PRRSV SX12株病毒接种后至用PRRSV vJX143株病毒攻毒后21天,每天进行症状观察。
根据观测结果,试验组在接种PRRSV SX12株病毒后未出现可观察到的症状反应;PRRSVvJX143株病毒攻毒后SX12株病毒接种组5头中有两头出现轻微的呼吸症状和咳嗽,未出现典型的腹式呼吸;而对照组5头猪则出现严重的呼吸症状和咳嗽,呈现典型的腹式呼吸;并有一头猪在攻毒后14天死亡。
3.7试验猪的各组织器官的病理学观察
在PRRSV vJX143株病毒攻毒后21天,剖杀试验组和对照组的仔猪,其中对照组5头猪均出现肺脏水肿,部分猪出现有坏死;其中2头猪出现心、肺粘连和腹膜炎;全部猪腹股沟淋巴结和扁桃体淋巴结出现不同程度的出血;部分猪肝脏出现有黄白色的坏死灶;部分猪脾脏出现边缘性梗死;肾脏很少见到出血点,部分猪脑有出血,但未见肠道等消化系统的病变。而试验组仔猪,除2头仔猪出现轻微的肺部水肿外,未见到其他组织器官眼观病理变化。
同时,观察其肺部病变,根据Halbur P G,Paul P S,Frey M L,et al,Comparisonof the pathogenicity of two US porcine reproductive and respiratory syndrome virusisolates with that of the Lelystad virus.Vet Pathol,1995,32:648-660.的方法,对肺部的肺炎病变进行评估,结果如表2所示。
表2、PRRSV SX12株肺脏的病理学评价
组别 |
攻毒后时间(天) |
14 |
21 |
SX株免疫组 |
ND |
12.00±8.37<sup>a</sup> |
未免疫组 |
80.00<sup>b</sup> |
55.00±12.91<sup>c</sup> |
注:表中数据为肺炎病变部位占整个肺脏比例百分比的平均数±标准差;其中,“ND”指没有评价,a为SX12株免疫攻毒后5头猪的肺脏的病理学评价,b为未免疫组攻毒后14天死亡猪的肺脏的病理学评价,c为未免疫组攻毒后21天剖杀其余4头猪的肺脏的病理学评价。
根据表2的评价结果,PRRSV SX12株免疫组肺部病变得分为12.00±8.37,远低于未免疫对照组的肺部病变得分(55.00±12.91),说明PRRSV SX12株对成活猪保护性也很高,肺部病变轻微,说明该毒株对强毒的攻击有良好的保护作用。
在实施例3中,对构建的蓝耳病嵌合病毒SX12株对29日龄仔猪进行了免疫保护性试验,其中SX12株病毒接种组在接种SX12后,未出现明显的体温反应和呼吸症状,说明该PRRSV SX12对猪致病力很低,PRRSV抗体在SX12株免疫后10天开始上升,14天达到并超过阳性水平(ELISA S/P>0.4),说明该PRRSV SX12对猪有良好的免疫原性,能刺激机体产生很强的免疫反应。在攻毒PRRSV vJX143株后,SX12株病毒接种组出现一过性体温升高,出现轻微的呼吸症状,剖检各组织脏器未出现明显的病理变化;而未免疫攻毒组则持续更长时间的体温升高,出现严重的呼吸症状和咳嗽,呈现典型的腹式呼吸;剖检可见典型的肺部病理变化,其他组织脏器部分可见典型的损伤,说明PRRSV SX12株免疫后可抗击强毒PRRSV vJX143株的攻击,具有明显的保护作用。
综上所述,基于发病猪场获得的血清中分离出来的病毒构建的全长感染性cDNA质粒pJX143及其拯救出来的病毒具有和野生亲本毒相似的生物学特性和动物宿主的感染力和致死率。而且后续的试验证实,该重组质粒确实是引起这次“猪无名高热”的主要指病病原。基于上述重组质粒,构建了数株疫苗候选株(pSX12,p5NX12,p56N12),其中的一株疫苗株pSX12对猪体具有较好安全性,免疫后可有效诱导产生机体免疫,并提供猪体免疫保护作用,对“猪高致病性蓝耳病”的免疫保护率高达100%,安全有效。
序列表
<110>中国农业科学院上海兽医研究所
<120>高致病性猪蓝耳病病毒重组质粒和遗传工程疫苗
<130>P5071073
<160>9
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2600
<212>DNA
<213>蓝耳病病毒
<400>1
atgacgtata ggtgttggct ctatgccacg gcatttgtat tgtcaggagc tgtgaccatt 60
ggcacagccc aaaacttgct gcacgggaac accctcctgt gacagccctc ttcaggggga 120
ttaggggtct gtccctaaca ccttgcttcc ggagttgcac tgttttacgg tctctccacc 180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc tggggtgttt 240
gtggcggagg gccaggtcta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcctctg 300
aatctccaag ttcctgagct tggggtgttg ggtttttttt ataggcccga agagccactc 360
cggtggacgt tgccacgtgc tttccccact gtcgagtgct cccccgccgg ggcctgttgg 420
ttttctgcga tttttccgat tgcacgaatg actagtgaaa acctgaactt tcaacaaaga 480
atggtgcggg tcgcagctga aatctacaga cccggccaac tcacccctac agttctaaag 540
actctacaag tttatgaacg gggttgtcgc tggtacccca ttgtcgggcc cgtccctggg 600
gtgggcgttt acgccaactc cctgaatgtg agtgacaaac ctttcccggg agcaactcat 660
gtgttaacca acttgccgct cccgcagagg cccaaacctg aggacttttg cccttttgag 720
tgtgctatgg ctgacgtcta tgacattggt cgtggcgctg tcatgtatgt ggccggagga 780
aaggtctctt gggcccctcg tggtgggaat gaagtgaaat ttgaacctgt tcccaaggag 840
ttgaagttgg ttgcgaaccg actccacacc tccttcccgc cccatcacgt agtggacatg 900
tccgagttta ccttcatgac ccctgggagt ggtgtctcca tgcgggttga gtaccaatac 960
ggctgcctcc ctgctgacac tgtccctgaa ggaaactgct ggtggcgctt gtttgactcg 1020
ctcccaccgg aagttcagta caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctatcaaacc 1080
aagcatggtg tccctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tcttcgggca 1140
gtgaccgaca cacatggacc tatcgtcata cagtacttct ctgttaagga gagttggatc 1200
cgccacctga agttggtgga agaacccagc ctccccgggt ttgaggatct cctcagaatc 1260
agggttgagc ccaatacgtc accactggct agaaaggatg agaagatttt ccggtttggc 1320
agtcataagt ggtacggtgc cggaaagaga gcaaggaaaa cacgctctgg tgcgactact 1380
atggtcgctc atcacgcttc gtccgctcat gaaacccggc aggccacgaa gcacgagggt 1440
gccggcgcta acaaggccga gcatctcaag cgctactctc cgcctgccga agggaactgt 1500
ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaactt tgagaccacc 1560
cttcctgaaa gggtaaggcc ttcagatgac tgggccactg acgaggatct tgtgaacacc 1620
atccaaatcc tcaggctccc tgcggccttg gacaggaacg gcgcttgcgg tagcgccaag 1680
tacgtgctta aactggaggg tgagcattgg actgtctctg tgatccctgg gatgtcccct 1740
actttgctcc cccttgaatg tgttcagggt tgttgtgagc ataagggcgg tcttgtttcc 1800
ccggatgcgg tcgaaatttc cggatttgat cctgcctgcc ttgaccgact ggctaaggta 1860
atgcacttgc ctagcagtac catcccagcc gctctggccg aattgtccga cgactccaac 1920
cgtccggttt ccccggccgc tactacgtgg actgtttcgc aattctatgc tcgtcataga 1980
ggaggagatc atcatgacca ggtgtgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaagttatt 2040
gaggattgct gctgccatca gaataaaacc aaccgggcta ctccggaaga ggtcgcggca 2100
aagattgatc agtacctccg tggtgcaaca agtcttgagg aatgcttggc caaacttgag 2160
agagtttccc cgccgagcgc tgcggacacc tcctttgatt ggaatgttgt gcttcctggg 2220
gttgagccgg cgaatcagac aaccgaacaa cctcacgtca actcatgctg caccctggtc 2280
cctcccgtga ctcaagagcc tttgggcaag ggctcggtcc ctctgaccgc cttctcactg 2340
tccaattgct attaccctgc acaaggtgac gaggttcatc accgtgagag gttaaattcc 2400
gtactctcta agttggaaga ggttgtcctg gaagaatatg ggctcatgtc cactggactt 2460
ggcccgcgac ccgtgctgcc gagcgggctc gacgagctta aagaccagat ggaggaggat 2520
ctgctaaaac tagccaacac ccaggcgaat tcagaaatga tggcctgggc agctgagcag 2580
gtcgatttaa aagcttgggt 2600
<210>2
<211>4881
<212>DNA
<213>蓝耳病病毒
<400>2
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ctactacgtg gactgtttcg caattctatg ctcgtcatag aggaggagat catcatgacc 120
aggtgtgctt agggaaaatc atcagccttt gtcaagttat tgaggattgc tgctgccatc 180
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gatccgattg cggcagcccg gttttgatgg gcgacaatgt ccctaacggt tcggaagaaa 900
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acctcgtcct tggtacgggg gactttgccc agctgaatgg actaaagatc aggcaaattt 2940
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cgttacacat gcttgctggt gtttatgtaa ctgcagtggg gtcctgcggt accggtacca 3060
acgatccgtg gtgcactaac ccgtttgccg tccctggcta cggacctggc tctctttgca 3120
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gattcggcct tcaagagatt gccttggtcg ttttgatttt tgtctccatc ggaggcatgg 3240
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tttgggtacc tcttacctgg ttgctttgtg tgtttccttg ttggttgcgc tgtttctctt 3360t gcaccccct caccatccta tggttggtgt ttttcttgat ttctgtaaat ataccctcag 3420
gagtcttggc cgtggtgttg ttgatttctc tctggctttt aggtcgttat actaacgttg 3480
ctggtcttgt cactccctat gacattcatc attacaccag tggcccccgc ggtgttgccg 3540
ccttggctac cgcaccagat gggacctact tggccgctgt ccgccgcgct gcgctgactg 3600
gtcgtaccat gctgttcacc ccgtctcagc tcgggtccct ccttgagggc gctttcagaa 3660
ctcaaaagcc ctcactgaac accgttaatg tggtcgggtc ctccatgggc tctggcggag 3720
tgttcactat tgacgggaaa atcaagtgcg tgactgccgc acatgtcctt acgggtaact 3780
cagctagggt ttccggggtc ggcttcaatc aaatgcttga ctttgatgta aaaggggact 3840
tcgccatagc tgattgcccg aattggcaag gggttgctcc caaggcccag ttctgcgagg 3900
atgggtggac tggtcgcgcc tattggctga catcctctgg cgttgaaccc ggtgttattg 3960
ggaatgggtt cgccttctgc ttcaccgcgt gtggcgactc tggatcccca gtgattaccg 4020
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ttaggggtct gtccctaaca ccttgcttcc ggagttgcac tgttttacgg tctctccacc 180
cctttaacca tgtctgggat acttgatcgg tgcacgtgta cccccaatgc tggggtgttt 240
gtggcggagg gccaggtcta ctgcacacga tgtctcagtg cacggtctct ccttcctctg 300
aatctccaag ttcctgagct tggggtgttg ggtttttttt ataggcccga agagccactc 360
cggtggacgt tgccacgtgc tttccccact gtcgagtgct cccccgccgg ggcctgttgg 420
ttttctgcga tttttccgat tgcacgaatg actagtgaaa acctgaactt tcaacaaaga 480
atggtgcggg tcgcagctga aatctacaga cccggccaac tcacccctac agttctaaag 540
actctacaag tttatgaacg gggttgtcgc tggtacccca ttgtcgggcc cgtccctggg 600
gtgggcgttt acgccaactc cctgaatgtg agtgacaaac ctttcccggg agcaactcat 660
gtgttaacca acttgccgct cccgcagagg cccaaacctg aggacttttg cccttttgag 720
tgtgctatgg ctgacgtcta tgacattggt cgtggcgctg tcatgtatgt ggccggagga 780
aaggtctctt gggcccctcg tggtgggaat gaagtgaaat ttgaacctgt tcccaaggag 840
ttgaagttgg ttgcgaaccg actccacacc tccttcccgc cccatcacgt agtggacatg 900
tccgagttta ccttcatgac ccctgggagt ggtgtctcca tgcgggttga gtaccaatac 960
ggctgcctcc ctgctgacac tgtccctgaa ggaaactgct ggtggcgctt gtttgactcg 1020
ctcccaccgg aagttcagta caaagaaatt cgccatgcta accaatttgg ctatcaaacc 1080
aagcatggtg tccctggcaa gtacctacag cggaggctgc aagttaatgg tcttcgggca 1140
gtgaccgaca cacatggacc tatcgtcata cagtacttct ctgttaagga gagttggatc 1200
cgccacctga agttggtgga agaacccagc ctccccgggt ttgaggatct cctcagaatc 1260
agggttgagc ccaatacgtc accactggct agaaaggatg agaagatttt ccggtttggc 1320
agtcataagt ggtacggtgc cggaaagaga gcaaggaaaa cacgctctgg tgcgactact 1380
atggtcgctc atcacgcttc gtccgctcat gaaacccggc aggccacgaa gcacgagggt 1440
gccggcgcta acaaggccga gcatctcaag cgctactctc cgcctgccga agggaactgt 1500
ggttggcact gcatttccgc catcgccaac cggatggtga attccaactt tgagaccacc 1560
cttcctgaaa gggtaaggcc ttcagatgac tgggccactg acgaggatct tgtgaacacc 1620
atccaaatcc tcaggctccc tgcggccttg gacaggaacg gcgcttgcgg tagcgccaag 1680
tacgtgctta aactggaggg tgagcattgg actgtctctg tgatccctgg gatgtcccct 1740
actttgctcc cccttgaatg tgttcagggt tgttgtgagc ataagggcgg tcttgtttcc 1800
ccggatgcgg tcgaaatttc cggatttgat cctgcctgcc ttgaccgact ggctaaggta 1860
atgcacttgc ctagcagtac catcccagcc gctctggccg aattgtccga cgactccaac 1920
cgtccggttt ccccggccgc tactacgtgg actgtttcgc aattctatgc tcgtcataga 1980
ggaggagatc atcatgacca ggtgtgctta gggaaaatca tcagcctttg tcaagttatt 2040
gaggattgct gctgccatca gaataaaacc aaccgggcta ctccggaaga ggtcgcggca 2100
aagattgatc agtacctccg tggtgcaaca agtcttgagg aatgcttggc caaacttgag 2160
agagtttccc cgccgagcgc tgcggacacc tcctttgatt ggaatgttgt gcttcctggg 2220
gttgagccgg cgaatcagac aaccgaacaa cctcacgtca actcatgctg caccctggtc 2280
cctcccgtga ctcaagagcc tttgggcaag ggctcggtcc ctctgaccgc cttctcactg 2340
tccaattgct attaccctgc acaaggtgac gaggttcatc accgtgagag gttaaattcc 2400
gtactctcta agttggaaga ggttgtcctg gaagaatatg ggctcatgtc cactggactt 2460
ggcccgcgac ccgtgctgcc gagcgggctc gacgagctta aagaccagat ggaggaggat 2520
ctgctaaaac tagccaacac ccaggcgaat tcagaaatga tggcctgggc agctgagcag 2580
gtcgatttaa aagcttgggt caaaagctac cctcggtgga cacctccacc ccctccacca 2640
agagttcaac ctcgcagaac aaagtctgtc aaaagcttgc cagaggacaa gcctgtccct 2700
gctccgcgca ggaaggtcag atccgattgc ggcagcccgg ttttgatggg cgacaatgtc 2760
cctaacggtt cggaagaaac tgtcggtggt cccctcaatt ttccgacacc atccgagccg 2820
atgacaccta tgagtgagcc cgtacttgtg cccgcgtcgc gacgtgtccc caagctgatg 2880
acacctttga gtgggtcggc accagttcct gcaccgcgta gaactgtgac aacaacgctg 2940
acgcaccagg atgagcctct ggatttgtct gcgtcctcac agacggaata tgaggctttc 3000
cccctagcac cgtcgcagaa catgggcatc ctggaggcgg gggggcaaga agctgaggaa 3060
gtcctgagtg aaatctcgga tatactaaat gacaccaacc ctgcacctgt gtcatcaagc 3120
agctccctgt caagttttaa gatcacacgc ccaaaatact cagctcaagc catcaccgac 3180
tctggcgggc cttgcagtgg gcatctccaa aaggaaaaag aagcatgcct cagcatcatg 3240
cgtgaggctt gtgatgcgtc caagcttagt gatcctgtta cgcaggagtg gctctctcgc 3300
atgtgggata gggttgacat gctgacttgg cgcaacacgt ctgcttacca ggcgtttcgc 3360
atcttaaatg gcaggtttga gtttctccca aagatgattc tcgagacacc gccgccccac 3420
ccgtgcgggt ttgtgatgtt acctcacacg cctgcacctt ccgtgagtgc agagagtgat 3480
ctcaccattg gttcagtggc caccgaggtt gttccacgca tcctcgggaa aataggagac 3540
actgacgagc tgcttgaccg gggtccctcg gcaccctcca agggagaacc ggtctgtgac 3600
caacctgcca aagatccccg gatgtcgccg cgggagtctg acgagagcat aatagctccg 3660
cccgcagata caggtggtgt cggctcattc actgatttgc cgtcttcaga tggtgtggat 3720
gtggacgggg gggggccgtt aagaacggta aaaacaaaag caggaaggct cttagaccaa 3780
ctgagctgcc aggtttttag cctcgtttcc catctcccta ttttcttctc acacctcttc 3840
aaatctgaca gtggttattc tccgggtgat tggggttttg cagcttttac tctattttgc 3900
ctctttctat gttacagtta cccattcttc ggttttgctc ccctcttggg tgtattttct 3960
gggtcttctc ggcgtgtgcg aatgggggtt tttggctgct ggttggcttt tgctgttggt 4020
ctgttcaagc ctgtgtccga cccagtcggc actgcttgtg agtttgactc gccagagtgt 4080
aggaacgtcc ttcattcttt tgagcttctc aagccttggg accctgtccg cagccttgtt 4140
gtgggccccg tcggtctcgg ccttgccatt cttggcaggt tattgggcgg ggcacgctac 4200
atctggcact ttttgcttag gcttggcatt gttgcagact gtatcttggc tggagcttat 4260
gtgctttctc aaggtaggtg taaaaagtgc tggggatctt gtgtaagaac tgctcctaat 4320
gagatcgcct tcaacgtgtt cccttttaca cgtgcgacca ggtcgtcact catcgacctg 4380
tgcgatcggt tttgcgcacc aaaaggcatg gaccccattt ttctcgccac tgggtggcgt 4440
gggtgctgga ccggccggag tcccattgag caaccttctg aaaaacccat cgcgttcgcc 4500
cagctggatg agaagaggat tacggctaga actgtggtcg ctcagcctta tgatcccaac 4560
caggccgtaa agtgcttgcg ggtattacag gcgggtgggg cgatggtggc cgaggcagtc 4620
ccaaaagtgg tcaaagtttc cgctattcca ttccgagctc ctttctttcc cgctggagtg 4680
aaagttgatc ctgagtgcag aatcgtggtt gatcccgata cttttactac agccctccgg 4740
tctggctatt ccaccgcgaa cctcgtcctt ggtacggggg actttgccca gctgaatgga 4800
ctaaagatca ggcaaatttc caagccttca gggggaggcc cacacctcat tgctgccttg 4860
catgttgcct gctcgatggc gttacacatg cttgctggtg tttatgtaac tgcagtgggg 4920
tcctgcggta ccggtaccaa cgatccgtgg tgcactaacc cgtttgccgt ccctggctac 4980
ggacctggct ctctttgcac gtctagattg tgcatctccc aacacggcct caccttgccc 5040
ttgacagcac ttgtggcggg attcggcctt caagagattg ccttggtcgt tttgattttt 5100
gtctccatcg gaggcatggc tcataggttg agttgtaagg ctgacatgtt gtgcatctta 5160
ctcgcaatcg ctagttatgt ttgggtacct cttacctggt tgctttgtgt gtttccttgt 5220
tggttgcgct gtttctcttt gcaccccctc accatcctat ggttggtgtt tttcttgatt 5280
tctgtaaata taccctcagg agtcttggcc gtggtgttgt tgatttctct ctggctttta 5340
ggtcgttata ctaacgttgc tggtcttgtc actccctatg acattcatca ttacaccagt 5400
ggcccccgcg gtgttgccgc cttggctacc gcaccagatg ggacctactt ggccgctgtc 5460
cgccgcgctg cgctgactgg tcgtaccatg ctgttcaccc cgtctcagct cgggtccctc 5520
cttgagggcg ctttcagaac tcaaaagccc tcactgaaca ccgttaatgt ggtcgggtcc 5580
tccatgggct ctggcggagt gttcactatt gacgggaaaa tcaagtgcgt gactgccgca 5640
catgtcctta cgggtaactc agctagggtt tccggggtcg gcttcaatca aatgcttgac 5700
tttgatgtaa aaggggactt cgccatagct gattgcccga attggcaagg ggttgctccc 5760
aaggcccagt tctgcgagga tgggtggact ggtcgcgcct attggctgac atcctctggc 5820
gttgaacccg gtgttattgg gaatgggttc gccttctgct tcaccgcgtg tggcgactct 5880
ggatccccag tgattaccga agccggtgag cttgtcggcg ttcacacagg atcaaacaaa 5940
caaggaggag gcattgtcac gcgcccctca ggccagtttt gtaatgtgaa gcccatcaag 6000
ctgagcgagt tgagtgaatt cttcgctgga cctaaggtcc cgctcggtga tgtgaaaatt 6060
ggcagtcaca taattaaaga cacatgcgag gtgccttcag atctttgtgc cctgcttgct 6120
gccaaacccg aactggaagg aggcctttcc acagttcaac ttctgtgtgt gtttttcctc 6180
ctgtggagaa tgatggggca tgcttggacg cccttggttg ctgtggggtt tttcatcctg 6240
aatgagattc tcccagctgt cctggttcgg agtgttttct cctttgggat gtttgtgcta 6300
tcttggctca caccatggtc tgcgcaagtc ctgatgatca ggcttctgac agcagccctt 6360
aacagaaaca gatggtctct tggtttttac agccttggtg cagtaaccag ttttgtcgca 6420
gatcttgcgg taactcaagg gcatccgtta caggtggtaa tgaacttaag cacctatgcc 6480
ttcctgcccc ggatgatggt tgtgacctcg ccagtcccag tgatcgcgtg tggtgttgtg 6540
cacctccttg ccataatttt gtacttgttt aagtaccgct gccttcacaa tgtccttgtt 6600
ggcgatgggg tgttctcttc ggctttcttc ttgcgatact ttgccgaggg aaagttgagg 6660
gaaggggtgt cgcaatcctg cgggatgagt catgagtcgc tgactggtgc cctcgccatg 6720
agactcactg acgaggactt ggatttcctt acgaaatgga ctgattttaa gtgctttgtt 6780
tctgcgtcca acatgaggaa tgcagcgggc caatttatcg aggctgctta tgcaaaagca 6840
ctaagaattg aacttgctca gttggtacag gttgataagg tccgaggtac catggccaaa 6900
ctcgaggctt ttgccgatac cgtggcaccc caactctcgc ccggtgacat tgttgttgcc 6960
cttggccaca cgcctgttgg cagcatcttt gacctaaagg ttggtagcac caagcatact 7020
ctccaagcca ttgagactag agtccttgcc gggtccaaaa tgactgtggc gcgtgtcgtt 7080
gacccaaccc ccgcaccccc acccgtacct gtgcccatcc ctctcccacc gaaagttctg 7140
gagaacggtc ccaatgcctg gggggatgag gaccgtttga acaagaaaaa gaggcgcagg 7200
atggaagccg tcggcatttt tgtcatggac gggaagaagt accagaaatt ttgggacaag 7260
aattccggtg atgtgtttta tgaggaggtc catattagca cagacgagtg ggagtgcctt 7320
agaactggcg accctgtcga ctttgatcct gagacaggga ttcagtgtgg gcatatcacc 7380
attgaagaca aggtttacaa tgtcttcacc tccccatctg gtaggagatt cttggtcccc 7440
gccaaccccg agaatagaag agctcagtgg gaagccgcca agctttccgt ggagcaagcc 7500
cttggcatga tgaacgtcga cggcgaactg actgccaaag aactggagaa actgaaaaga 7560
ataattgaca aactccaggg tctgactaag gagcagtgtt taaactgcta gccgccagcg 7620
gcttgacccg ctgtggtcgc ggcggcttag ttgttactga gacagcggta aaaatagtca 7680
aatttcataa ccggaccttc accctaggac ctgtgaactt aaaagtggcc agtgaggttg 7740
agctaaaaga cgcggttgag cacaaccaac atccggttgc cagaccggtt gatggtggtg 7800
ttgtgctcct gcgctctgca gttccttcgc ttatagatgt cttgatctcc ggcgctgatg 7860
catctcctaa gttactcgcc cgccacgggc cgggaaacac tgggattgat ggcacgcttt 7920
gggattttga ggccgaggct actaaagagg aagttgcact cagtgcgcaa ataatacagg 7980
cttgtgatat taggcgcggc gacgcgcctg aaattggtct cccttataag ttgtaccctg 8040
ttaggggcaa ccctgagcgg gtaaaaggag ttttacagaa tacaaggttt ggagacatac 8100
cttacaaaac ccccagtgac actggaagcc cggtgcacgc ggctgcctgc ctcacgccta 8160
atgctactcc ggtgactgat gggcgctccg tcttggctac aaccatgccc tctggctttg 8220
agttgtatgt gccgaccatt ccagcgtccg tccttgatta tcttgattct aggcctgact 8280
gccctaaaca gttaacagag cacggttgtg aggatgctgc attaagagac ctctccaagt 8340
atgatttgtc cacccaaggc tttgttttgc ctggagttct tcgcctcgtg cggaagtacc 8400
tgttcgccca cgtgggtaag tgcccgcccg ttcatcggcc ttccacttac cctgctaaga 8460
attctatggc tggaataaat gggaacaggt ttccaaccaa ggacattcag agcgtccctg 8520
aaatcgacgt tctgtgcgca caggctgtgc gagaaaactg gcaaactgtt accccttgta 8580
ccctcaagaa acagtactgt gggaagaaga agactaggac aatacttggc accaataact 8640
tcattgcgtt ggcccatcgg gcagcgttga gtggtgttac ccagggcttc atgaaaaaag 8700
cgttcaactc gcccatcgcc ctcgggaaaa acaaatttaa ggagctacaa gccccggtcc 8760
taggcaggtg ccttgaagct gatcttgcgt cctgcgatcg atccacacct gcaattgtcc 8820
gctggtttgc cgccaatctt ctttatgaac tcgcctgtgc tgaggagcat ctaccgtcgt 8880
acgtgctgaa ctgctgccac gacttactgg tcacgcagtc cggcgcggtg actaagaggg 8940
gtggcctgtc gtctggcgac ccgattacct ctgtgtcaaa caccatttac agcttagtga 9000
tatatgcaca gcacatggtg ctcagttact tcaaaagtgg tcaccctcat ggccttctgt 9060
ttctgcaaga ccagctaaag tttgaggaca tgctcaaggt tcaacccctg atcgtctatt 9120
cggacgacct tgtgctgtat gccgagtctc cctccatgcc aaactaccac tggtgggttg 9180
aacatctgaa tcttatgctg ggtttccaga cggacccaaa gaagacaacc atcacagact 9240
caccatcatt cctaggttgc aggataataa atgggcgcca gctagtccct aaccgtgaca 9300
ggatcctcgc ggccctcgcc taccacatga aggcaagtaa tgtttctgaa tactacgcct 9360
cggcggctgc aatactcatg gacagctgtg cttgtttaga gtatgatcct gaatggtttg 9420
aagagctcgt ggttgggatg gcgcagtgcg cccgcaagga cggctacagc tttcctggcc 9480
caccgttctt cttgtccatg tgggaaaaac tcaggtccaa tcatgagggg aagaagtcca 9540
gaatgtgcgg gtactgcggg gccccggctc cgtacgccac tgcctgtggt ctcgatgtct 9600
gtgtttacca cacccacttc caccagcatt gtcctgttat aatctggtgt ggccacccgg 9660
cgggttctgg ttcttgtagt gagtgcgaac cccccctagg aaaaggcaca agccctctag 9720
atgaggtgtt agaacaagtt ccgtacaagc ctccgcggac tgtgatcatg catgtggagc 9780
agggtctcac ccctcttgac ccaggtagat atcagactcg ccgcggatta gtctccgtta 9840
ggcgtggcat taggggaaat gaagtcgacc taccagacgg tgattacgct agcaccgcct 9900
tgctccctac ttgtaaagag atcaacatgg tcgctgtcgc ctctaacgtg ttgcgcagca 9960
ggtttatcat cggcccaccc ggtgctggga aaacacactg gcttcttcaa caagtccagg 10020
atggtgatgt catttacacg ccaactcacc agaccatgct cgacatgatt agggctttgg 10080
ggacgtgccg gttcaacgtt ccagcaggta caacgctgca attccctgcc ccctcccgta 10140
ccggcccatg ggttcgcatc ttggccggcg gttggtgtcc tggcaagaac tccttcctgg 10200
atgaagcggc gtattgcaat caccttgatg tcttgaggct tctcagtaaa acaactctca 10260
cttgcctagg agact tcaaa caactccacc ctgtgggttt tgactcccat tgctatgtat 10320
ttgacatcat gcctcagacc caattaaaga ccatctggag gttcgggcag aatatctgtg 10380
atgccattca accagattac agggacaaac ttatgtccat ggtcaacacg acccgtgtga 10440
cctacgtgga aaaacctgtc aggtatgggc aagtcctcac cccctaccac agggaccgag 10500
aggacggcgc cattactatc gactccagtc aaggcgccac atttgatgtg gttacactgc 10560
atttgcccac taaagattca ctcaacaggc aaagagctct tgttgctatc accagggcaa 10620
gacatgctat cttcgtgtat gacccacaca ggcaattgca gagcatgttt gatcttcccg 10680
cgaaaggcac acccgtcaac ctcgcagtgc accgtgacga acagctgatc gtattagaca 10740
gaaacaacag agaaatcacg gttgctcagg ctctaggcaa tggagataaa ttcagggcca 10800
cagataagcg cgttgtagat tctctccgcg ctatttgcgc agacctggaa gggtcgagct 10860
ccccgctccc caaggtcgcg cataacttgg gattctattt ctcacctgat ttgactcagt 10920
ttgctaaact cccggcagaa cttgcgcccc actggcccgt ggtgacaacc cagaacaatg 10980
aaaggtggcc agatcggctg gtagccagcc ttcgccctat ccataaatat agccgcgcgt 11040
gcattggtgc cggctatatg gtgggcccct cggtgttttt aggcacccct ggggttgtgt 11100
catactatct cacaaaattt gttagaggcg aggctcaagt gcttccggag acagtcttca 11160
gcaccggccg aattgaggta gattgtcgag agtatcttga tgatcgggag cgagaagttg 11220
ctaagtccct cccacatgcc ttcatcggcg atgtcaaagg taccaccgtt gggggatgtc 11280
atcacgttac ctccaaatac cttccgcgct tccttcccaa ggaatcagtt gcggtggtcg 11340
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cagaccttga agcgtacctc cacccagaga cccagtccag gtgctggaaa gtgatgttgg 11460
actttaagga ggttcgactg atggtatgga aagacaagac ggcctatttt caacttgaag 11520
gccgccattt tacctggtat caacttgcaa gctacgcctc atacatccga gttcctgtta 11580
attctactgt gtacttggac ccctgcatgg gccctgctct ttgcaacaga agggttgtcg 11640
ggtccaccca ttggggagct gacctcgcag tcacccctta tgattacggt gccaaaatta 11700
ttctgtctag tgcataccat ggtgaaatgc ctccaggtta caaaattctg gcgtgcgcgg 11760
agttctcgct tgatgaccca gtaaggtaca aacacacctg gggatttgaa tcggatacag 11820
cgtatctgta cgagtttact ggaaatggtg aggactggga ggattacaat gatgcgtttc 11880
gggcgcgcca gaaagggaaa atttataaag ctaatgccac cagcatgagg tttcattttc 11940
ccccgggccc tgtcattgaa ccaactttag gcctgaattg aaatgaaatg gggtctatgc 12000
aaagcctctt tgacaaaatt ggccaacttt ttgtggatgc tttcacggaa tttctggtgt 12060
ccattgttga tatcatcata tttttggcca ttttgtttgg cttcacaatc gccggttggc 12120
tggtggtctt atgcatcaga ctggtttgct ccgcggtact ccgtgcgcgc tctaccgttc 12180
accctgagca attacagaag atcttatgag gcctttcttt ctcagtgtca ggtggacatt 12240
cccacctggg gcgtcaaaca ccctttgggg gtgctttggc accataaggt gtcaaccctg 12300
attgatgaga tggtgtcgcg tcgaatgtac cgcatcatgg aaaaagcagg gcaggctgcc 12360
tggaaacagg tggtgagcga ggctacattg tctcgcatta gtggtttgga tgtggtggct 12420
cactttcaac atcttgccgc tattgaagcc gagacttgta aatatttggc ctcccggcta 12480
cccatgctgc acaacctgcg cttgacaggg tcaaatgtaa ccatagtgta taatagtact 12540
ttggatcagg tgtttgccat tttcccaacc cctggttccc ggccaaagct tcatgatttt 12600
cagcaatggc taatagctgt acattcctcc atattttctt ccgttgcagc ttcttgtact 12660
ctttttgttg tgctgtggtt gcgaattcca atgctaagtt ctgtttttgg tttccgctgg 12720
ttaggggcaa cttttctttt gaactcatgg tgaattacac ggtatgcccg ctttgcccaa 12780
cccggcaggc agccgctgag atccttgaac ccggcaagtc tttttggtgc aggatagggc 12840
atgaccgatg tagtgagaac gatcatgacg aactagggtt catggttccg cctggccttt 12900
ccagcgaagg ccacttgacc agtgtttacg cctggttggc gttcctgtcc ttcagctaca 12960
cggcccagtt ccatcccgag atatttggga tagggaatgt gagtcaagtt tatgttgaca 13020
tcaagcacca attcatttgc gctgttcacg acggggataa cgccaccttg cctcgccatg 13080
acaatatttc agccgtattt cagacctact accaacacca ggtcgacggc ggcaattggt 13140
ttcacctgga atggctgcgc cctttctttt cctcttggtt ggttttaaat gtttcgtggt 13200
ttctcaggcg ttcgcctgca aaccatgttt cagttcgagt ctttcggaca tcaaaaccaa 13260
caccaccgca gcatcagact tcgttgtcct ccaggacatc agctgcctta ggcatggcga 13320
ctcgtcctct ccgacgattc gcaaaagttc tcagtgccgc acggcgatag ggacgcccgt 13380
gtacatcacc atcactgcca atgtcacaga tgaaaattat ctgcattctt ctgatctcct 13440
catgctttct tcttgccttt tctatgcttc cgagatgagt gaaaagggat tcaaagtggt 13500
gtttggcaat gtgtcaggca tcgtggctgt gtgcgtcaac tttaccagct acgtccaaca 13560
cgtcaaggag ttcacccaac gctccttagt ggtcgatcat gtgcgactgc ttcatttcat 13620
gacacctgag accatgaggt gggcaaccgt tttagcctgt ctttttgcca tcctactggc 13680
aatttgaatg tttaagtatg ttggggaagt gcttgaccgc gtgctgttgc tcgcgattgc 13740
tttttttgtg gtgtatcgtg ccgttttatc ttgctgtgct cgtcaacgcc agcaacaaca 13800
acagctctca tattcagttg atttataact taacgctatg tgagctgaat ggcacagatt 13860
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ctgtgtccac cgccggatat tatcacgggc ggtatgtctt gagtagcatt tacgcagtct 14040
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<212>DNA
<213>蓝耳病病毒
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<212>DNA
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 15572
<210>9
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<212>DNA
<213>蓝耳病病毒
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