CN101205524B - 微生物处理工业废弃物的方法和发酵生产微生物油脂的方法及其专用菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用工业废弃物发酵生产微生物油脂的方法及其专用菌株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)Rh.g CGMCC No.2258。该方法是一种利用工业废弃物(如淀粉、味精、造纸等工业生产废水和/或酱渣等发酵工业废渣)为培养基，发酵粘红酵母生产微生物油脂的方法；还可以本发明方法获得的微生物油脂为原料油脂制备生物柴油，转化率可达80-99％。本发明微生物油脂的生产方法具有操作简单、成本低廉和实用价值高的优点，既能减少淀粉、味精、造纸、酱油等发酵行业排放的高浓度废弃物对环境的污染，又能变废为宝生产当前市场上的紧缺产品油脂，达到了废弃物资源化利用的目的。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用领域，特别是涉及一种微生物处理工业废弃物的方法，以及利用工业废弃物(如淀粉、味精、造纸等工业生产废水和/或酱渣等发酵工业废渣)发酵生产微生物油脂的方法及其专用菌株。
背景技术
随着工业现代化进程的加速发展，工业废水的排放量也在不断增加，并造成严重的环境污染。目前，我国淀粉废水每年的产量约达2400万吨，高浓度味精废水的产量每年达2500万吨以上，其中，2005年造纸工业废水的排放量达36.7亿吨。这些工业废水的共同特点是含有大量有机物质，因而COD很高，一般可达几万。如果将这些废水用污水处理系统进行处理，不但负担重，而且会造成有机糖质资源的浪费。
目前，国内外对工业废水的主要处理方法有：絮凝沉淀法、生物法、结合法、光合细菌降解有机物和多种微生物协同处理法等。如岑超平对木薯淀粉黄浆水，先用石灰乳中和，再用进口高分子絮凝剂N-OP、650BC、AN絮凝，该法的COD去除率能达到60.0～99.3％(岑超平，木薯淀粉废水的絮凝法处理.上海环境科学，2001，20(1)：31～32)；南开大学公开了“高效絮凝处理淀粉废水的复合菌制剂及其制备”的方法(专利申请号ZL 200510014582.X)；桂林工学院公开了“木薯淀粉生产废水生物处理组合工艺”(专利申请号：ZL 200510113154.2)；席淑淇等把淀粉废水酸化后，调节pH，添加Fe3+，用该法处理的废水可作为光合细菌的培养液，COD去除率达70％以上(席淑淇等，利用废水生产光合细菌提取天然色素的研究.污染防治技术，1997，10(2)：65～67)。目前，上述废水处理方法在实际中都有应用，并取得了一些成果，但也都存在一些问题，如絮凝沉淀法去除效率较低；生物处理法占地面积大，能耗大，投资费用和运行费用高，且受废水的水温、pH和有毒物质等环境条件影响较大；光合细菌法对温度变化敏感，运行费用较高，且管理不便。
另外，也有人提出利用某种发酵废弃物或综合利用多种混合废弃物生产饲料蛋白、膳食纤维和醋等的方法，如Yang等利用味精废水混合培养粘红酵母和假丝酵母发酵生产饲料蛋白(J.Z.Yang，etl.Production of microbial protein feedfrom monosodium glutamate wastewater by fermentation，Techniq EquipEnviron Pollut Control 2002，3：21-24)；2005年，日本熊本县工业技术中心成功地从酱油渣中提取出膳食纤维，纤维含量达80％；甘肃省科学院生物研究所公开了“利用淀粉、柠檬酸的生产废水、废渣进行食醋生产的方法”(专利申请号ZL 200510041889.9)。诸如此类的方法比较符合可持续发展的社会策略，但是因其所得产品属于食品级，因而有可能涉及到潜在的食用安全问题。
目前，国内外有关微生物油脂的研究主要集中在以下方面：开发利用微生物油脂进行功能性油脂的生产(如利用深黄被孢霉生产γ-亚麻酸)以及利用高浓度葡萄糖生产微生物油脂(Papanikolaou S，etl.Single cell oil(SCO)productionby Mortierella isabellina grown on high-sugar content media.BioresTechnol 2004，95：287-91；赵宗保等，圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究，生物工程学报，2006，22(4)：650-656)。另外，微生物油脂也被认为是供给生物柴油的潜力原料油脂(赵宗保.加快微生物油脂研究为生物柴油产业提供廉价原料.中国生物工程杂志，2005，25(2)：8-11)，如清华大学张建安等公开了以1-20％的葡萄糖为底物，微生物发酵油脂及其用于制备生物柴油的方法(专利申请号：CN200610113582.X)。
生物柴油是可再生燃油脂肪酸短链酯，如脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯等，属于清洁能源。但是，目前生物柴油的生产原料多采用植物油脂和少量动物油脂，如李搏公开了以动植物油脂、酸败了的动植物油脂、回收的各种煎炸油或潲水油为原料生产生物柴油的方法(专利申请号200510200025.7)；梁杉垣公开了按重量百分比由菜籽油60～85、松节油10～30、链烷烃4～10及添加剂二茂铁0.2～0.5制成生物柴油的方法(专利申请号200410026584.6)。但是，以动、植物油为原料生产生物柴油的成本太高，占生产总成本的75％以上，而且大量种植含油植物也存在和农业争地的问题。微生物油脂虽然解决了与农业争地这一问题，但是若仍然以高浓度葡萄糖等为发酵原料的话，成本问题还不能够得到有效解决。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株可利用工业废弃物(如淀粉、味精、造纸等工业生产废水和/或酱渣等发酵工业废渣)发酵生产微生物油脂，且产量较高的粘红酵母菌株。
本发明所提供的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)为以下菌株之一：
1)粘红酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)经一次或多次微波诱变得到的菌株；
2)粘红酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)经UV、EMS、或LiCl与微波诱变复合诱变得到的菌株；和
3)粘红酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)CGMCC No.2258。该菌株已于2007年11月22日保藏于位于中国北京市朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.2258。
粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258菌株具有以下特征：菌落呈粘质状，细胞为圆形或卵形，因培养条件变化有时还会呈长形甚至假丝状，外壁光滑，其特点是有明显的红色或偏黄色。该菌株在麦芽汁培养基(MEA)上生长较快，在酵母培养基(葡萄糖：20％，酵母膏：0.4％，尿素：0.2％，琼脂：2％，pH＝4.5-5.0)生长较有利于产脂。该菌株生长的温度范围为8-45℃，最佳为25-30℃。该菌株在pH 1-11之间均可以生长，适宜pH值为5-8。此外，该菌株具有耐盐性高(30-50g/L)，油脂含量高(30-70％)，以及降解废水COD能力较强(40-90％)的特性。
本发明的第二个目的是提供一种利用工业废弃物(如淀粉、味精、造纸等工业生产废水和/或酱渣等发酵工业废渣)发酵生产微生物油脂的方法。
本发明所提供的发酵生产微生物油脂的方法，包括以下步骤：
1)将以上粘红酵母菌株接种到种子液培养基中，在25-30℃下培养24-30小时，得到种子液；所述种子液培养基配方为：葡萄糖3-5g，(NH4)2SO4 0.1-0.3g，KH2PO40.5-0.9g，Na2SO4 0.1-0.3g，MgSO4·7H2O 0.1-0.2g，酵母粉0.1-0.2g，用水定容至100mL，pH 5-6；
2)将步骤1)获得的粘红酵母种子液接种到发酵培养基中，在25-40℃下培养48-180小时；所述发酵培养基的制备方法为：先去除工业生产废水中的不溶性颗粒，再调节pH值至5-6，灭菌，得到发酵培养基；
3)发酵后处理：收集步骤2)经发酵的粘红酵母菌体细胞，再将菌体细胞烘干和粉碎后，提取油脂，得到微生物油脂。
上述发酵生产微生物油脂的方法中所用的发酵菌株可为任意诱变后的粘红酵母菌株，特别是粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725或CICC No.1691经微波诱变或复合诱变后菌株，优选为本发明的粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258菌株。
所述诱变是指对普通的粘红酵母进行一次或多次微波诱变，或UV、EMS、或LiCl与微波诱变结合进行复合诱变。
步骤1)中优选的粘红酵母种子液培养基配方为：葡萄糖4g，(NH4)2SO40.2g，KH2PO40.7g，Na2SO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.15g，酵母粉0.15g，用水定容至100mL，pH 5.5。
步骤2)中粘红酵母种子培养液的接种量优选为10-15％(V/V)。所述制备发酵培养基所用的工业生产废水的选择是多种多样的，如淀粉、味精和造纸等废水中的一种或几种的混合液，混合比例可根据实际需要任意选择。可用离心沉降的方法去 除工业生产废水中的不溶性颗粒。
此外，所述发酵培养基中还可再添加发酵工业废渣至其质量/体积(g/dL)百分浓度达1-4％；所述发酵工业废渣的选择也是多种多样的，如酱渣、高粱秸秆渣汁和甘蔗渣等中的一种或几种的混合物，混合比例可根据实际需要任意选择。所述发酵工业废渣在添加前，最好先将其研磨细碎。
为提高油脂产率，所述发酵培养基中还可再添加淀粉厂葡萄糖废母液至葡萄糖在发酵培养基中质量/体积百分浓度为1-4％的。
为提高提高菌体的生长速率，在上述粘红酵母的发酵培养过程中可对其进行振荡培养，所述步骤1)中种子液培养的振荡速率为100-180rpm，步骤2)中发酵培养的振荡速率为150-400rpm。
此外，为获得更好的培养效果，步骤1)中在对粘红酵母菌种进行种子液培养前可先对其进行活化，具体方法为：将保藏的斜面粘红酵母菌种在28-30℃下活化3-12小时。
步骤3)中对菌体细胞进行烘干和粉碎后，可用常规方法提取油脂。
用上述方法得到的微生物油脂也属于本发明的保护范围。
本发明另一目的是提供一种处理工业废弃物的方法，是将淀粉、味精、造纸的工业生产废水和/或酱渣作为发酵培养基，将所述粘红酵母菌株接种其上按上述过程进行发酵。
本发明还一目的是通过利用上述得到的微生物油脂来制备生物柴油。制备生物柴油可采用现有文献介绍的方法进行，只是本发明的油脂原料使用的为本发明利用工业废弃物得到的微生物油脂。
本发明主要是利用工业废弃物(如淀粉、味精、造纸等工业生产废水和/或酱渣等发酵工业废渣)为培养基，发酵经诱变的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)来生产微生物油脂。其中淀粉、味精、造纸等工业生产废水中残留的铵盐及氨基酸，以及酱渣等发酵工业废渣中残留的蛋白质可作为供粘红酵母生长所需的氮源；此外，淀粉、味精、造纸等工业生产废水，以及酱渣等发酵工业废渣中含有的还原糖和木质、纤维素等可作为粘红酵母合成油脂及生长所需的碳源。用本发明的方法发酵生产微生物油脂，既可以获得较高的油脂含量，并可以获得较高的废水COD降解率，从而对发酵用废水起到净化作用，实践证明：利用粘红酵母单独处理味精废水和淀粉废水的COD降解率均能达到40-90％，生物量可达10-40g/L，油脂含量达20-30％；利用酱渣和造纸废水的混合液在补加葡萄糖母液的条件下的生物量可达30-80g/L，油脂含量达到30-70％，COD降解率达40-80％；利用味精废水和造纸废水的混合液在流加葡萄糖母液的条件下的生物量达30-100g/L，油脂含量达30-50％，COD降解率达40-80％。此外，还可以本发明方法获得的微生物油脂为原料油脂制备生物柴油，转化率可达80-99％。本发明微生物油脂的生产方法具有操作简单、成本低廉和实用价值高的优点，既能减少淀粉、味精、造纸、酱油等发酵行业排放的高浓度废弃物(废水、废渣)对环境的污染，又能变废为宝生产当前市场上的紧缺产品一油脂，达到了废弃物资源化利用的目的，具有重大的经济和社会效益。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明发酵生产微生物油脂方法的工艺流程简图。
图2为本发明发酵生产微生物油脂方法的COD降解率及生物量和油脂含量统计结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1、粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258菌株的获得
通过UV、EMS、LiCl及微波等多种诱变手段和各种诱变技术复合使用得到系列诱变粘红酵母菌(Rhodotorula glutinis)菌株，其中筛选出最优一株命名为粘红酵母Rh.g，具体诱变过程包括以下方法和步骤：
1)UV诱变：将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725(购买于中国食品发酵工业研究所)的种子液培养24-30h后稀释105倍后，涂布于酵母固体平板培养基(葡萄糖：20％，酵母膏：0.4％，尿素：0.2％，琼脂：2％，pH4.5)后，分别在功率为15W、照射距离为30cm的紫外灯管下照射10-600s时间后，在28-30℃下避光培养3-5天后检查菌落生长情况并进一步摇瓶发酵筛选较优菌株。
2)EMS诱变：将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725(购买于中国食品发酵工业研究所)种子液培养24-30h浓缩2-5倍，无菌水洗涤后，在5mL的0.2M磷酸缓冲液(pH7.2)体系中加入0.1-0.5mol/L剂量的EMS反应10-60min时间后用硫代硫酸钠终止反应，然后稀释105-106涂布于酵母固体平板培养基(葡萄糖：20％，酵母膏：0.4％，尿素：0.2％，琼脂：2％，pH4.5)上，在28-30℃下培养3-5天后检查菌落生长情况并进一步摇瓶发酵筛选较优菌株。
3)LiCl诱变：将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725(购买于中国食品发酵工业研究所)种子液培养24-30h后稀释105倍后，涂布于已经含有0.2-0.6％剂量LiCl的酵母固体平板培养基(葡萄糖：20％，酵母膏：0.4％，尿素：0.2％，琼脂：2％，pH4.5)后，在28-30℃下培养3-5天后检查菌落生长情况并进一步摇瓶发酵筛选较优菌株。
4)微波诱变：将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725(购买于中国食品发酵工业研究所)种子液培养24h后稀释105倍后，涂布于酵母固体平板培养基(葡萄糖：20％，酵母膏：0.4％，尿素：0.2％，琼脂：2％，pH4.5)后，在220V/50Hz额定电压和额定频率、1200W/750W额定输入和输出功率、或2450MHz额定微波频率的微波炉里处理5～60s，或多次微波组合处理(总时间不超过60s)后，在28℃下培养3-5天后检查菌落生长情况并进一步摇瓶发酵筛选较优菌株。
5)复合诱变：任意将前述1)、2)、3)、4)的2-4种诱变方法依次应用，即将某一方法诱变筛选出的较优菌株使用另一种方法再次诱变，或多次使用其它方法多次诱变，每次诱变后再在28℃下培养3-5天后检查菌落生长情况并进一步摇瓶发酵得到系列更优中间菌株。
从以上中间菌株中进一步筛选，最终获得一株粘红酵母菌菌株，该菌株为依次经过1)、2)和4)三种方法复合诱变得到的最优菌株。该最优的粘红酵母菌(Rhodotorula glutinis)菌株，命名为粘红酵母Rh.g，该株菌已于2007年11月22日保藏于位于中国朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.2258。经鉴定，该菌株具有以下特征：菌落呈粘质状，细胞为圆形或卵形，因培养条件变化有时还会呈长形甚至假丝状，外壁光滑，其特点是有明显的红色或偏黄色。该菌株生长的温度范围为8-45℃，最佳为25-30℃。该菌株在pH 1-11之间均可以生长，适宜pH值为5-8。此外，该菌株还具有耐盐性高(30-50g/L)，油脂含量高(30-70％)，降解废水COD能力较强(40-90％)的特性。
需要说明的是，本实施例在筛选菌株时，基本以油脂含量以及降解废水COD能力为评判标准，检测数值越高则菌株评价越好。该实施例获得了最优的粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258菌株，同时也获得了一系列较好的中间菌株，尤其是本发明独创的使用微波诱变的中间菌株，无论是其单独诱变还是与其它诱变手段组合诱变，获得的中间菌株也具有非常好的应用效果。这些中间菌株也属于本发明。
实施例2、用酱渣和造纸废水的混合液在补加葡萄糖母液的条件下生产微生物油脂
种子液培养基配方：葡萄糖4g，(NH4)2SO4 0.2g，KH2PO4 0.7g，Na2SO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.15g，酵母粉0.15g，用水定容至100mL，pH 5.5。
发酵培养基的制备：将造纸废水(造纸废水含有大量木质素和半纤维素等降解产物、色素、戊糖类、残碱及其它溶出物，废水水质为：COD＝106000～157000mg/L，BOD＝34500～42500mg/L，SS＝23500～27800mg/L，pH＝11～13。)离心沉降去除不溶性颗粒后，添加葡萄糖母液(葡萄糖母液为淀粉厂生产葡萄糖的废液，主要成分为葡萄糖，浓度为400～500g/l)至葡萄糖含量2％(g/dL)，另添加至2％(g湿重/dL，1-4％均可)研磨细碎后的酱渣(酱渣含水量大66.14％，含有粗蛋白含量2-26.4％，粗纤维含量15.14％。)，用盐酸调节pH值至5-6，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，其流程图如图1所示，具体方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
2)用接种针刮一环步骤1)经活化的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258，将其接种于50mL无菌的种子液培养基中，在25℃、140rpm下振荡培养30小时，得到种子液；
3)发酵培养：按10％(V/V)的接种量，将步骤2)获得的粘红酵母Rh.g CGMCCNo.2258种子培养液接种到发酵培养基中，在25℃、150rpm下振荡下培养120小时；
4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法得到的油脂含量占细胞干重的62％，COD降解率达50％以上。
实施例3、用味精废水在添加葡萄糖母液的条件下生产微生物油脂
种子液培养基配方：葡萄糖3g，(NH4)2SO4 0.1g，KH2PO4 0.5g，Na2SO4 0.1g，MgSO4·7H2O 0.1g，酵母粉0.1g，用水定容至100mL，pH 6。
发酵培养基的制备：将味精废水(味精废水母液是一种低酸性高浓度有机废水，废水水质为：COD＝50000～70000mg/L，BOD5＝25000～35000mg/L，N-NH3＝8000～10000mg/L，含谷氨酸约1.5％，pH＝2～3。)离心沉降去除不溶性颗粒后，添加葡萄糖母液至葡萄糖浓度4％，用KOH调节pH值至5-6，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258在30℃下活化6h；
2)用接种针刮一环步骤1)经活化的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258，将其接种于50mL无菌的种子液培养基中，在30℃、100rpm下振荡培养24小时，得到种子液；
3)发酵培养：按12％(V/V)的接种量，将步骤2)获得的粘红酵母Rh.g CGMCCNo.2258种子培养液接种到发酵培养基中，在40℃、400rpm下振荡下培养48小时；
4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法得到的油脂含量占细胞干重的30-50％。每天跟踪监测发酵培养对废水处理的情况，COD降解率达45％以上。
实施例4、用淀粉废水在添加葡萄糖母液的条件下生产微生物油脂
种子液培养基配方：葡萄糖5g，(NH4)2SO4 0.3g，KH2PO4 0.9g，Na2SO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.2g，酵母粉0.2g，用水定容至100mL，pH 5。
发酵培养基的制备：将淀粉废水(淀粉废水主要含淀粉，还富含葡萄糖、果糖和麦芽糖等糖类物质，另外还含有蛋白质、纤维素以及氮、磷等无机物。废水水质为：CODcr＝10000～20000mg/L，BOD5＝5000mg/L，SS＝1000mg/L，pH＝5。)离心沉降去除不溶性颗粒后，添加葡萄糖母液至葡萄糖浓度3％，用KOH调节pH值至5-6，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258在29℃下活化9h；
2)用接种针刮一环步骤1)经活化的斜面粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258，将其接种于50mL无菌的种子液培养基中，在28℃、180rpm下振荡培养28小时，得到种子液；
3)发酵培养：按15％(V/V)的接种量，将步骤2)获得的粘红酵母Rh.gCGMCCNo.2258种子培养液接种到发酵培养基中，在30℃、180rpm下振荡下培养72-120小时；
4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法得到的油脂含量占细胞干重的30％。每天跟踪监测发酵培养对废水处理的情况，结果在发酵72h后COD减少了85％以上。
实施例5、用味精废水和造纸废水混合液在添加葡萄糖母液的条件下生产微生物油脂
种子液培养基配方：葡萄糖4.5g，(NH4)2SO4 0.15g，KH2PO4 0.8g，Na2SO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.18g，酵母粉0.12g，用水定容至100mL，pH 5.5。
发酵培养基的制备：将味精废水和造纸废水按1∶1比例混合后离心沉降去除不溶性颗粒后，添加葡萄糖母液至葡萄糖浓度2％，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258在28℃下活化10h；
2)用接种针刮一环步骤1)经活化的斜面粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258，将其接种于50mL无菌的种子液培养基中，在30℃、120rpm下振荡培养26小时，得到种子液；
3)发酵培养：按15％(V/V)的接种量，将步骤2)获得的粘红酵母Rh.g CGMCCNo.2258种子培养液接种到发酵培养基中，在28℃、200rpm下振荡下培养72-156小时；
4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。
因为味精废水偏酸性，造纸废水偏碱性，因此设想利用二者的混合废水培养粘红酵母可能减少用于调pH值的碱的用量。结果在发酵过程中，pH值一直在6.0附近波动，省去了用碱调节pH值的步骤。每天跟踪监测发酵培养对废水处理的情况(COD降解率)及生物量和油脂含量，如图2所示，发酵84h后，生物量、油脂含量和COD降解率分别为30.6g/L、34.33％和40.39％；发酵156h后，生物量、油脂含量和COD降解率分别为43.18g/L、46.67％和53.04％。
实施例6、用酱渣、高粱秸秆渣汁和味精废水的混合液在补加葡萄糖母液的条件下生产微生物油脂
种子液培养基配方：葡萄糖4g，(NH4)2SO4 0.2g，KH2PO4 0.7g，Na2SO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.15g，酵母粉0.15g，用水定容至100mL，pH 5.5。
发酵培养基的制备：将味精废水离心沉降去除不溶性颗粒后，添加葡萄糖母液至葡萄糖浓度1％和4％(g湿重/dL，1-4％均可)研磨细碎后的酱渣和高粱秸秆渣汁(混合比例1∶2)，用盐酸调节pH值至5-6，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725(购自中国食品发酵工业研究所)在28℃下活化12h；
2)用接种针刮一环步骤1)经活化的斜面粘红酵母菌种(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725，将其接种于50mL无菌的种子液培养基中，在25℃、180rpm下振荡培养30小时，得到种子液；
3)发酵培养：按10％(V/V)的接种量，将步骤2)获得的粘红酵母(Rhodotorula glutinis)CICC No.1725种子培养液接种到发酵培养基中，在25℃、250rpm下振荡下培养140小时；
4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法得到的油脂含量占细胞干重的48％。每天跟踪监测发酵培养对废水处理的情况，COD降解率达55％。
实施例7、用造纸废水生产微生物油脂
种子液培养基配方：葡萄糖5g，(NH4)2SO4 0.3g，KH2PO4 0.9g，Na2SO4 0.3g，MgSO4·7H2O 0.2g，酵母粉0.2g，用水定容至100mL，pH 5。
发酵培养基的制备：将造纸废水用HCl调节pH值至5-6，离心沉降去除不溶性颗粒后，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
1)菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258在28℃下活化9h；
2)用接种针刮一环步骤1)经活化的斜面粘红酵母Rh.g CGMCC No.2258，将其接种于50mL无菌的种子液培养基中，在28℃、180rpm下振荡培养28小时，得到种子液；
3)发酵培养：按15％(V/V)的接种量，将步骤2)获得的粘红酵母Rh.gCGMCCNo.2258种子培养液接种到发酵培养基中，在28℃、300rpm下振荡下培养48-120小时；
4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法得到的油脂含量占细胞干重的25％。每天跟踪监测发酵培养对废水处理的情况，结果在发酵72h后COD减少了80％以上。
实施例8、生物柴油的制备
以实施例2-7获得的微生物油脂为原料油脂制备生物柴油，具体方法参见：FeiyanXue，Tianwei Tan，et a1.A new method for preparing raw material for biodieselproduction.Process Biochemistry，Volume 41，Issue 7，July 2006，Pages1699-1702。结果生物柴油获得的微生物油脂转化生物柴油的转化率达80-99％。
Claims (4)
1.粘红酵母Rh.g(Rhodotorula glutinis)诱变菌株，为保藏号CGMCC No.2258的粘红酵母(Rhodotorula glutinis，简称Rh.g)。
2.一种发酵生产微生物油脂的方法，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的粘红酵母菌株在28-30℃下活化3-12小时，接种到种子液培养基中得到种子液；
2)将步骤1)获得的粘红酵母种子液接种到由工业生产废水制备得到的发酵培养基中，发酵培养得到粘红酵母菌体细胞；
3)收集步骤2)经发酵的粘红酵母菌体细胞，再将菌体细胞烘干和粉碎后，提取油脂，得到微生物油脂；其中，
所述步骤1)中粘红酵母种子液培养基配方为：葡萄糖3-5g，(NH4)2SO4 0.1-0.3g，KH2PO4 0.5-0.9g，Na2SO4 0.1-0.3g，MgSO4·7H2O 0.1-0.2g，酵母粉0.1-0.2g，用水定容至100mL，pH 5-6；种子液培养条件为25-30℃下培养24-30小时；
所述步骤2)中粘红酵母种子液的接种量为10-15％；发酵培养条件为25-40℃下培养48-180小时；所述制备发酵培养基所用的工业生产废水为淀粉、味精和造纸的工业生产废水中的一种或几种的混合液；所述发酵培养基的制备方法为：先去除工业生产废水中的不溶性颗粒，再调节pH值至5-6，灭菌，得到发酵培养基；
在所述步骤1)和步骤2)的培养过程中进行振荡培养，步骤1)中种子液培养的振荡速率为100-180rpm，步骤2)中发酵培养的振荡速率为150-400rpm；所述步骤2)中的发酵培养基中再添加葡萄糖母液至葡萄糖的质量/体积百分浓度为1-4％即1-4g/dL。
3.根据权利要求2所述发酵生产微生物油脂的方法，其特征在于：所述步骤1)中粘红酵母种子液培养基配方为：葡萄糖4g，(NH4)2SO4 0.2g，KH2PO4 0.7g，Na2SO4 0.2g，MgSO4·7H2O 0.15g，酵母粉0.15g，用水定容至100mL，pH 5.5。
4.权利要求1所述粘红酵母菌株在生产生物柴油中的应用。
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