CN101200758A - 一种检测col7a1基因突变的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测COL7A1基因26311位突变的方法及其用途。该方法采用引物p87F(TGGGCCTGAAATATGAGGAG)和P87R(TAGGCCACTGGAGAGACAGG)对COL7A1基因包含26251－26350的区段进行PCR扩增；产物纯化后进行测序；或用p87Fa(TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG)和P87Ra(TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA)对上述PCR产物进行巢式扩增后用BslI进行酶切检验。其用途是在检测营养不良型大疱性表皮松解症的制剂或基因芯片上的应用。本发明为表皮松解症产前诊断提供了一种新的途径，以及为基因治疗提供了依据。

Description

一种检测COL7A1基因突变的方法及其用途

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测COL7A1基因突变的方法，尤其COL7A1基因突变G26311T的检测方法，本发明还提供了该方法的用途，即在检测人类营养不良型大疱性表皮松解症的基因芯片或制剂上的应用。

背景技术

遗传性大疱性表皮松解症是由一组临床表现相关的疾病组成，按照电镜标准，以水疱在皮肤的位置为标准，可将其分为单纯型大疱性表皮松解症，交界型大疱性表皮松解症和营养不良型大疱性表皮松解症。

VII型胶原最早是由Bebtz等分离出的一种胶原，当时命名为长链胶原(LC)。Ryynanen等通过Northern杂交发现VII型胶原mRNA在角质形成细胞和口腔表皮癌细胞系表达。间接免疫荧光示19周的胎儿基底膜带有VII型胶原基因的表达，提示角质形成细胞也许是VII型胶原最初的细胞来源。1993年Greenspan等通过荧光原位杂交将编码VII型胶原的基因COL7A1定位于人3p21.3区域。Ryynanen等和Hovnanian等分别发现DDEB和RDEB都是由COL7A1基因突变所致。Christiano等检测克隆的VII型胶原cDNA序列发现其有118个外显子，是迄今为止发现的外显子最多的基因，其第一个外显子编码5’非翻译区信号肽，第2至第27外显子编码氨基酸球形NC-1区域，之后的84个外显子编码三螺旋区，113至118个外显子编码NC-2的其余部分。VII型胶原是锚原纤维的主要成分，当发生突变时，甘氨酸被替代，有可能改变了三螺旋结构的稳定性，使VII型胶原分子易被蛋白水解酶降解，使锚原纤维变细或数量减少。

COL7A1基因突变型和DEB表型近年来报道DDEB和RDEB都是由COL7A1发生突变所致。利用单链构象多态性(SSCP)及DNA直接测序等技术，对DEB患者及其家系进行基因突变的检测，取得了很大的进展。

DDEB和局限型RDEB的区别这两型患者在临床上和病理上难以区分。家族史很重要，但由于很少有大的家系或自发性突变(de novel)的DDEB的出现，更使两者难于区分。利用透射电镜也很难将两者区分，从而说明了分子生物学水平上阐明两者区别的重要性。Mallipeddi等通过对两个家系轻中度DEB四个患者直接测序，结果表明：两个患者的两个等位基因都存在突变，患者1的两条等位基因的突变型分别是Arg578 stop(R578X)和Gly2263 Val(G2263V)，其父母是杂合子；患者2的两条等位基因的突变型分别是Arg578 stop(R578X)和Gly2674Asp(G2674D)，无其父母血样，两患者均诊断为RDEB。这进一步证实了甘氨酸替代也见于隐性遗传的DEB，这种突变在杂合子中是显性失活的，只有在另一个等位基因上也存在突变时才有临床表现，而且临床表现的严重程度取决于第二个突变。所以DDEB只要找出一个突变即可，RDEB则要分别找出来源于父母的两个突变才能实现基因诊断。

Hammami-Hauasli等在研究了数例隐性营养不良型大疱性表皮松解症时发现，在73外显子发生的突变G2006D，G2034R，G2015E以显性失活的的方式，干预了VII型胶原的折叠和分泌，利用共焦激光扫描和免疫印迹方法研究，表明营养不良型大疱性表皮松解症的角质形成细胞的粗面内质网，聚集了高于对照组的变异的前VII型胶原。进一步分析表明，此三个突变均接近三螺旋区的绞链区。而显性营养不良型大疱性表皮松解症的突变位置更接近非胶原绞链区。

COL7A1基因突变的发现开辟了一个新领域。为营养不良型大疱性表皮松解症患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。目前，通过国内外同行的研究发现了多个COL7A1基因突变位点，通过发现新的突变位点有利于进一步认识COL7A1基因对于皮肤组织生理功能意义，更加深入的了解其与疾病的关系。并且有可能存在着突变热点，这将有利于将来在临床上开展患者的COL7A1突变筛查工作，为患者产前诊断和治疗提供服务。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测COL7A1基因突变的方法，该方法可以检测出人类营养不良型大疱性表皮松解症致病基因突变，本发明还提供了该方法的用途。

本发明提供的检测COL7A1基因突变的方法，其步骤包括：

(1)采用引物p87F和P87R对包含COL7A1(GenBank L23982)基因26124-26619位的碱基序列(序列表中序列1)在内区段进行PCR扩增；

p87F的碱基序列为：TGGGCCTGAAATATGAGGAG(序列表中序列2)

P87R的碱基序列为：TAGGCCACTGGAGAGACAGG(序列表中序列3)

(2)PCR产物进行纯化；

(3)采用p87F或P87R引物对PCR产物进行测序。

本发明提供的检测COL7A1基因突变的另一种方法，其步骤包括：

(1)采用p87F和P87R引物对COL7A1基因包含26124-26619的碱基序列在内区段进行PCR扩增；

(2)采用p87Fa和P87Ra对上述PCR产物进行巢式扩增；

p87Fa的碱基序列为：TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG(序列表中序列4)；

P87Ra的碱基序列为：TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA(序列表中序列5)；

(3)对巢式PCR产物使用限制性内切酶BslI进行酶切；

(4)使用1.5％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，检测片断大小。

上述二种方法在检测人类营养不良型大疱性表皮松解症的基因芯片或制剂上的应用。

发明人选取COL7A1基因作为研究对象，通过在一营养不良型大疱性表皮松解症家系9名患者和11名正常家系成员及200名对照组中进行筛查，发现一个营养不良型大疱性表皮松解症的新致病突变点(G26311T)，即87内含子区的第1个碱基)。这一突变位点在11名家系内正常人及200名对照组中均没有发现，说明这一突变位点会导致营养不良型大疱性表皮松解症，这一突变位点位于COL7A1基因一个剪切识别位点。本发明为营养不良型大疱性表皮松解症患者的产前诊断提供了一种新的途径，以及为患者提供了基因治疗的依据。

附图说明

图1为COL7A1测序结果：COL7A1突变测序结果比对：(左图为正常序列，右图为突变序列)

图2为PCR结合限制性酶切检测COL7A1突变位点G26311T。

具体实施方式

正常COL7A1基因的编码区(GenBank/EMBL accession No.L23982)26124-26619的碱基序列如序列表中序列1所示。其第26311位碱基由G突变为T；突变基因的86-88外显子转录的mRNA缺少87外显子。

本发明包括检测COL7A1基因的第26311位碱基(87内含子第1个碱基)的改变，或由该点突变引起的表达产物的相应改变或其互补序列的相应改变。

所述第26311位碱基的改变为G突变为T。

通过扩增人体中全长或部分COL7A1基因以获得扩增序列，然后对扩增序列测序来检测。

在发明人进行的研究中，发明人收集表皮松解症遗传资源，建立表皮松解症遗传资源库。在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。应用酚氯仿的方法提取基因组DNA定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。应用在线引物设计软件primer3设计80对引物，包含COL7A1整个编码区及外显子与内含子交界区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序；测序引物与PCR扩增引物相同，正反向侧序(例如应用ABI公司3100测序仪)。得到的序列与Genebank中的序列比较确定了COL7A1突变位点。发明人还利用一对巢式引物对以上PCR产物创造一个新的酶切位点，通过酶切后电泳确认了突变点碱基的改变。

本发明所述的突变可以通过本领域已知的任何检测方法来进行，例如扩增人体中全长或部分COL7A1基因基因组DNA或cDNA以获得扩增序列，然后对扩增序列测序来检测，或通过将从组织中分离出来的COL7A1基因与COL7A1基因探针杂交来检测，或通过从组织中分离出的COL7A1基因与COL7A1等位基因特异性探针杂交来检测所述碱基的改变，或通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。

所用的杂交探针可以是与正常的COL7A1核酸序列杂交，或与突变的核酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素，发色物质或荧光物质标记。在进行探针检测前，优选PCR扩增目标基因。尤其；利用等位基因特异探针，可以筛查已被确定的突变是否存在。

另外，还可以通过检测该基因的表达产物；如蛋白和mRNA来检测该基因的突变。

本发明还提供一种检测导致营养不良型大疱性表皮松解症基因COL7A1(G26311T)突变位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测COL7A1(G26311T)突变的一种或多种成分，同时提供经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中COL7A1基因G26311T突变位点的试剂盒。含有扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的；例如，所述的引物可以依据已知的核着酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-55％左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。并说明使用方法如下：

PCR扩增

PCR反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度60℃30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。

PCR产物纯化

将含有PCR产物的Multiscreen-PCR板抽真空，加入去离于水，静置，随后将Multiscreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后至另一洁净的96孔板中。

测序反应及验证

以PCR引物之一作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABIPRISM3100DNA序列分析仪。将所得到的图谱进行分析。与Genebank中的标准序列比较可以发现突变位点。该试剂盒可简便快捷地检测COL7A1(G26311T)突变位点，从而应用于营养不良型大疱性表皮松解症基因的检测和治疗方法中。例如，在检测为发生了突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可进行基因治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应说明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列事实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring harbor Labortory Press，1989)，分子克隆实验室指南：(第三版，科学出版社，2002)中所述的条件，或按照生产厂商所建议的条件。

实施例1

下面通过基因测序检测COL7A1基因突变。

一、COL7A1基因编码区的PCR扩增

对象：门诊收集的营养不良型大疱性表皮松解症家系包括9例患者，11位健康人，正常对照200例。对所有参加者详细进行体格检查，在签署知情同意书以后每人采集血样5ml。

基因组DNA提取：采用酚氯仿抽提法。

1、抗凝血用PBS作1倍稀释。

2、在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积己稀释的血液，室温离心1000*g 20分。

3、吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5ml Ep管中，5000g，10分钟，然后用PBS洗一次。5000*g 10分。

4、将细胞悬于2ml TE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(10μl)，蛋白酶100-200μl(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。

5、用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，离心5000g 10分钟。

6、吸上清至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚：氯仿混合物，混匀，5000*g 10分钟。

7、吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿：异戊醇混合物，混匀，5000*g 10分钟。

8、吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。

9、加入2.5倍体积的无水乙醇。

10、20℃沉淀DNA过夜。

11、高速离心，10000*g，10分钟，4℃。

12、弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000*g，5分钟。

13、弃上清，吹干。

14、用TE缓冲液溶解，(400μl TE/5ml全血，600-800TE/10ml全血)

15、分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。

COL7A1基因扩增--PCR反应条件

引物序列：p87F：TGGGCCTGAAATATGAGGAG

P87R：TAGGCCACTGGAGAGACAGG

反应体系：25μl

名称      原液浓度     加样量(μl)    体系终浓度

Buffer    10*          2.5            1*

dNTP      2.5mM        3.0            400μM

Primers   10μM        1.0            7.5pmol

AmpliTaq  5units/μl   1.0            1U/μl

Template      25ng/μl      1.0      10ng/μl

ddHO补齐至25μl。

其中Buffer、dNTP、Primers、Taq酶为上海生工公司提供。

反应条件：反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度55℃30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。

二、PCR产物直接测序

首先进行PCR产物纯化

1、向装有PCR产物的96孔板中加入50微升洗涤缓冲液，混匀。

2、将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。

3、向纯化板中再次加入50微升的洗涤缓冲液，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。

4、将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20微升的去离子水，静置15分钟。

5、再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。

测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。

6、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。

7、反应体系为5μl，各种试剂加入量如下：PCR产物3-10ng，BigDyev3.10.25μl，5*BigDye buffer 0.875μl，引物p87F 1.6pmol

8、样品放于PCR仪上做如下反应

步骤	作用
		1	95℃，5分
2	重复以下程序30个循环95℃，10秒60℃，4分
		3	4℃保持直到准备纯化

9、在每个孔中加入20μl 80％乙醇，4,000rpm离心30min

10、将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率1000rpm，

11、在每孔中加入30μl 70％乙醇，4000rpm离心10min，倒甩；

12、重复第11步的操作2次：

13、将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；

14、加人5μl甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中：

15、上测序仪前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。

测序结果如图1所示。突变存在于第26311位碱基G-T。

实施例2

下面通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。

一、COL7A1基因内含子86/外显子87的PCR扩增

1、对于样品DNA使用引物p87F和p87R及其他试剂PCR扩增86/外显子87，步骤见实施例1中第一部分。

2、PCR产物经稀释200倍后取1μl作为模板进行第二轮PCR，引物如下p87Fa：5’-TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG-3’和p87Ra：5’-TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA-3’，其他试剂及步骤见实施例1中第一部分。

3、PCR产物纯化，步骤见实施例1中第二部分1-5步。

4、20μl PCR产物加Bsl I(NEB公司)1U，10*buffer 2.5μl，加水补齐25μl，55℃保温2小时。

5、电泳使用1.5％琼脂糖凝胶，1*TAE电泳缓冲液，电压5V/cm，电泳30分钟，在紫外灯下观测，患者样品会呈现123bp和104bp两条带，而正常对照只有104bp一条带。(如图2所示)

实施例3

检侧营养不良型大疱性表皮松解症致病基因COL7A1点突变位G26311T试剂盒及其应用

1试剂盒含有：

扩增用引物：p87F：TGGGCCTGAAATATGAGGAG

P87R：TAGGCCACTGGAGAGACAGG

PCR扩增用Taq酶5u/ul

10*缓冲液(含15ml MgCl₂。)

dNTP2mM

BigDyemix

2使用方法：

主要包括如下步骤：

A.提取DNA，利用上述引物，进行PCR反应；

B：PCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genebank中的标准序列比较确定突变位点的存在。

具体方法参见实施例1。

还可以通过从组织中分离出的COL7A1基因与COL7A1等位基因特异性探什杂交来检测所述碱基的改变。

应理解，在阅读了本发明的上述内容以后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本发明所限定的范围内。

                                  序列表

<110>华中科技大学

<120>一种检测COL7A1基因突变的方法及其用途

<160>5

<170>PatentIn Version 3.1

<210>1

<211>496

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>1

tgggcctgaa atatgaggag tggggcagca ggggtggtgg tggagaggca ctgagttcct  60

cacgctgctc tgccataggg gtcaccaggt ctgcctggcc ctgtcggacc taaaggagaa 120

cctggcccca cgggggcccc tggacaggtg atctttgacc ctgacttcca ccccctgcag 180

caactcctct gcctcaccca caagcctgtt tccaaatgcc atgggggtgg cagggtgggg 240

gcgggggagg aggaggaaac tcactagcat tccccacagg ctgtggtcgg gctccctgga 300

gcaaagggag agaaggtgag tgtgtgtggg gctgccagtg agggggggtc aactggtggg 360

ggccaaggaa tcccactgac ctctccccct taccagggag cccctggagg ccttgctgga 420

gacctggtgg gtgagccggt aagtagggaa cttctgacag cagatgttct gggggtcctg 480

tctctccagt ggccta                                                 496

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>2

tgggcctgaa atatgaggag

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>3

taggccactg gagagacagg

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>4

tcccacgggg gcccctggac ag

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>5

tcccccgccc ccaccctgcc a

Claims (3)

1.一种检测COL7A1基因突变的方法，其步骤包括：

(1)采用引物p87F和P87R对COL7A1基因包含26124-26619的碱基序列在内区段进行PCR扩增；

p87F的碱基序列为：TGGGCCTGAAATATGAGGAG

P87R的碱基序列为：TAGGCCACTGGAGAGACAGG

(2)PCR产物进行纯化；

(3)采用p87F或P87R引物对PCR产物进行测序。

2.一种检测COL7A1基因突变的方法，其步骤包括：

(1)采用p87F和P87R引物对COL7A1基因包含26124-26619的碱基序列在内区段进行PCR扩增；

(2)采用p87Fa和P87Ra对上述PCR产物进行巢式扩增；

p87Fa的碱基序列为：TCCCACGGGGGCCCCTGGACAG；

P87Ra的碱基序列为：TCCCCCGCCCCCACCCTGCCA；

(3)对巢式PCR产物使用限制性内切酶Bsl I进行酶切；

(4)使用1.5％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，检测片断大小。

3.上述权利要求1或2所述方法的用途，其特征在于：在检测人类营养不良型大疱性表皮松解症的制剂或基因芯片上的应用。

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