CN101195032A - 聚天冬酰胺衍生物与阿霉素偶联物的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向高分子药物载体的合成以及与抗癌药物阿霉素偶联后高分子药物前体的合成。这种载体是α，β－聚－(2－羟乙基)－L－天冬酰胺的衍生物，它在羟基上修饰了靶向基团半乳糖基和活性基团琥珀酰基，是一种具有肝脏靶向性的安全的药物载体。与抗癌药物阿霉素偶联制成的高分子前体药物，保留了阿霉素的抗肿瘤作用，降低了阿霉素对机体的毒副作用，可以发展成一种有肝靶向性的阿霉素前体药物。
Description
一、技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种聚天冬酰胺的衍生物的制备方法，以及它与抗癌药物阿霉素偶联物的制备方法及应用。
二、背景技术
近年来，靶向给药系统越来越受到人们的关注，它是将药物选择性分布于病变部位，降低药物对正常组织的毒副作用，从而提高药物利用率。大分子前体药物(macromolecular prodrugs)是靶向给药系统的一种，其设计模型包含了聚合物载体、与载体相连接的小分子活性药物、定位基团(targeting group)，有时也有用于连接载体和小分子药物的连接基(spacer groups)。其特点是具有控释作用和靶向性。
阿霉素(DOX，doxorubicin)是一种广谱、强效的蒽环类抗肿瘤药物，对急性白血病、恶性淋巴瘤及多种实体瘤都有很好的疗效，但它又有骨髓抑制、心脏毒性、消化道反应等毒副作用。研究阿霉素的新剂型，降低其副作用，发挥它的抗癌活性一直人们研究的一大目标。阿霉素的大分子前药就是其中一种新剂型，阿霉素与合成大分子聚-N-2-羟丙基甲基丙烯酰胺(pHPMA)偶联的前药(商品名PK1，PK2)已进入临床研究[E.Gianasi等人，“International Journal ofPharmaceutics”，148卷第139-148页，(1997年)]。但是pHPMA在体内不可降解，探索阿霉素新载体的工作一直在不断进行。
α，β-聚-(2-羟乙基)-D，L-天冬酰胺(α，β-Poly-(hydroxyethyl)-D，L-aspartamide，PHEA)是一种聚氨基酸衍生物，具有优良的生物相容性、可生物降解性、无毒副作用以及易于大规模制备等优点，最初提出用作血浆膨胀剂[P.Neri等人，“Journal of medicinal chemistry”，16卷，第893-897页(1973年)]，近年来研究用作前体药物的载体，比如偶联上抗癌药物紫杉醇(paclitaxel)[G.Cavallaro等人，“European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics”58卷第151-159页(2004年)]、抗HIV感染药物齐多夫定(zidovudine)[G.Giammona等人，“Advanced Drug Delivery Reviews”，39卷，第153-164页(1999年)]等后可以控制药物的释放速度，还可以通过连接Oxytocin等靶向基团把药物带到特定部位[G.Cavallaro等人，“European Journal of Pharmaceutics andBiopharmaceutics”66卷第182-192页(2007年)]。PHEA在体内的降解速度与其构型有关，L型(α，β-Poly-(hydroxyethyl)-L-aspartamide)比D，L型(α，β-Poly-(hydroxyethyl)-D，L-aspartamide)更容易在体内酶解，可以作为药物的载体。
将PHEA的侧链用琥珀酸酐来修饰(suc-PHEA)，琥珀酸基一方面可以充当载体与药物之间的连接基，提供-COOH活性基团与药物偶联，并且改变药物的释放速度，另一方面又可以改变PHEA主链的性质，进而改变其在生物体内的性质。suc-PHEA与药物偶联时，药物只参与了一步反应，反应过程简单方便，减少了药物的用量和活性丧失。之前有人把药物先与琥珀酸酐反应，再与PHEA偶联[G.Giammona等人，“Journal of Controlled Release”，54卷第321-331页(1998年)]，琥珀酸基仅起连接基作用，在此过程中药物参与了两步反应，容易造成药物的损失和失活。
大分子载体常常通过修饰靶向基团，将药物主动带向需要发挥治疗作用的靶部位，以便提高药物的疗效，减轻对全身的毒副作用。半乳糖基就是这样一种靶向配体。由于哺乳动物的肝实质细胞表面具有大量的去唾液酸糖蛋白受体(ASGR)，它可以与半乳糖基末端结合，人们常用半乳糖的衍生物(如乳糖酸)来修饰载体，赋予所载药物的肝脏靶向功能[Shuying Gao，“International Journal ofPharmaceutics”，255卷第57-68页，(2003年)]。乳糖酸可以与suc-PHEA主链的-OH偶联，形成较为稳定的酯键。
PHEA是一种优良的生物材料，把它用琥珀酸酐和乳糖酸修饰后又赋予了其新的功能。阿霉素与PHEA，尤其是与这种半乳糖化的PHEA的偶联尚未见报导。
三、发明内容
本发明需要解决的问题：
(1)提供一种α，β-聚-(2-羟乙基)-L-天冬酰胺的衍生物Gal-PHEA-suc，它含有靶向基团半乳糖基和活性基团琥珀酰基，可用作具有肝脏靶向性的药物载体。其结构为：
制备方法为：将PHEA与琥珀酸酐反应，以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，得到琥珀酰化的PHEA(PHEA-suc)；将PHEA-suc与乳糖酸反应，在N，N’-羰基二咪唑(CDI)作用下，以无水DMF做溶剂，三乙胺做催化剂，使PHEA-suc的羟基与乳糖酸的羧基偶联，得到半乳糖化的聚天冬酰胺衍生物Gal-PHEA-suc。
(2)提供阿霉素与所述聚天冬酰胺衍生物的偶联物Gal-PHEA-DOX，用以改善阿霉素的药效，降低毒副作用。所述偶联物Gal-PHEA-DOX的结构为：
制备方法为在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作用下，以DMF为溶剂，将阿霉素的氨基与所述聚天冬酰胺衍生物的羧基偶联得到Gal-PHEA-DOX。
(3)提供聚天冬酰胺阿霉素偶联物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明所提供的Gal-PHEA-suc载体以聚-(2-羟乙基)-L-天冬酰胺为主链，具有生物降解性和生物相容性等特点；在主链上连接琥珀酸基，引入了活性基团羧基，便于修饰具有氨基的药物，如阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素等；在主链上连接半乳糖基，可以跟肝实质细胞的去唾液酸糖蛋白受体相结合，把药物导向肝脏；原材料易得，合成方法简单易行。
本发明制备的Gal-PHEA-DOX偶联物水溶性好，具有肝靶向性，保留了阿霉素的抗癌活性，降低了阿霉素的毒副作用，可制备成治疗肿瘤的药物。
四、附图说明
图1是Gal-PHEA-suc的红外图谱(a：PHEA；B：PHEA-suc；C：Gal-PHEA-suc)。
图2是PHEA和Gal-PHEA-suc对Hela的细胞毒性结果。
图3是PHEA和Gal-PHEA-suc对HepG2的细胞毒性结果。
图4是Gal-PHEA-DOX对Hela的细胞毒性结果。
图5是Gal-PHEA-DOX对HepG2的细胞毒性结果。
图6是Gal-PHEA-DOX在小鼠体内的分布图。
图7是Gal-PHEA-DOX对S180小鼠的肿瘤体积的影响。
图8是Gal-PHEA-DOX对S180小鼠的生存期的影响。
图9是Gal-PHEA-DOX对S180小鼠的体重的影响。
五、具体实施方式
本发明通过以下实施例做进一步描述。
实施例1：聚天冬酰胺衍生物(Gal-PHEA-suc)的制备
称取2.5克PHEA溶于100ml DMF，加入2.5克琥珀酸酐，反应在室温下进行6小时，然后用蒸馏水透析，冻干，得到PHEA-Suc。红外光谱分析见图1，产物具有特征峰νc＝o：1738.5cm-1，νas c-o-c：1164.7cm-1，元素分析得琥珀酸基的取代度为43％。
称取2克N，N’-羰基二咪唑(CDI)和1.5克乳糖酸分别溶于30ml无水DMF，在0℃下，逐滴将CDI溶液加入乳糖酸溶液，并保持4小时；称取1克PHEA-suc，溶于20ml无水DMF，逐滴加入前述溶液，在0℃下反应15分钟，加入数滴三乙胺做催化剂，在室温条件下搅拌反应四天。然后用蒸馏水透析，冷冻干燥，得到Gal-PHEA-Suc。由红外光谱分析，产物具有特征峰νc＝o：1797.1cm-1，νc＝o：1734.4cm-1，νas c-o-c：1166.2cm-1，元素分析得半乳糖基的取代度为7.6％。
实施例2：聚天冬酰胺的衍生物-阿霉素偶联物(Gal-PHEA-DOX)的制备
称取0.5g EDC溶于20ml DMF，0.125g DOX，搅拌溶解。将0.5gGal-PHEA-suc溶于10ml DMF，然后与上述阿霉素溶液混合，室温条件下避光搅拌24小时。反应产物用双蒸水透析4天，冻干，得到Gal-PHEA-DOX，此过程也是避光进行。紫外可见光检测Gal-PHEA-DOX的阿霉素含量为9.7wt％。
实施例3：Gal-PHEA-suc和Gal-PHEA-DOX对人宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2生长的抑制
按1×104/孔的密度将处于对数生长期的Hela及HepG2细胞分别传至96孔板上，加100μl 1640培液(10％血清+双抗)，贴壁培养24h；取PHEA、Gal-PHEA-suc、DOX和Gal-PHEA-DOX，分别用培液稀释成预先设定的浓度梯度，每孔加入100μl，置37℃孵箱培养；设定时间后终止培养，用MTT法测定细胞活性。图2和图3表明，经过24h作用后，PHEA、Gal-PHEA-suc在浓度低于0.75mg/ml时对Hela及HepG2没有毒性，浓度上升到1mg/ml时，细胞毒性仍然很小。图4和图5表明，与细胞一起培育48h后，Gal-PHEA-DOX对Hela及HepG2都有抑制作用，其细胞毒性低于DOX，而当浓度达100μg/ml时，其毒性与DOX相当。这是因为阿霉素是从Gal-PHEA-DOX逐步释放出来的，因而浓度低时Gal-PHEA-DOX对细胞的毒性不如DOX，而当浓度高达100μg/ml时，Gal-PHEA-DOX中阿霉素的释放量也足以杀灭大部分癌细胞。
实施例4：Gal-PHEA-DOX在小鼠体内的靶向性
将小鼠肉瘤Sarcoma 180细胞以2.4×106个/只接种到18-22克ICR小鼠腋窝皮下，七天后由尾静脉注射2mg/ml DOX和Gal-PHEA-DOX，4小时后杀鼠，取血、肝、肺、肾、心、脾、瘤，匀浆，荧光分析阿霉素含量。结果如图6所示，Gal-PHEA-DOX在肝、瘤中的分布都比DOX多，并且血浆中停留时间更长些。
实施例5：Gal-PHEA-DOX的抗肿瘤活性
将肉瘤Sarcoma 180细胞以2.4×106个/只接种到18-22克ICR小鼠腋窝皮下，一周后实体瘤尺寸约达到300mm3，此时把小鼠随机分组，每组十只。一次性在瘤内注射DOX和Gal-PHEA-DOX，剂量为5mg DOX/kg，阴性对照组注射等量的生理盐水。用游标卡尺测量各只小鼠瘤体的长短径，按公式V＝1/2*a*b2(其中a和b分别代表肿瘤的长径和短径)计算肿瘤的体积。通过测量瘤体尺寸、体重和存活数来评价抗肿瘤作用。
如图7所示，注射药物20天后，与阴性对照组相比，DOX和Gal-PHEA-DOX对小鼠的抑瘤率分别是41％和47％。Gal-PHEA-DOX比阳性对照组DOX具有更好的抑瘤作用。如图8所示，Gal-PHEA-DOX比阳性对照DOX组的存活时间延长了，平均存活时间约延长了六天。如图9所示，Gal-PHEA-DOX组小鼠的体重稳步增长，比阳性对照DOX组的体重增长快。
可见，Gal-PHEA-DOX比DOX对Sarcoma 180肉瘤的抑制作用有所增大，而对荷瘤小鼠的副作用则减小了。
Claims (5)
1.一种聚天冬酰胺衍生物，其特征是含有靶向基团半乳糖基和活性基团琥珀酰基，结构式如下：
2.根据权利要求1所述的聚天冬酰胺衍生物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将α，β-聚-(2-羟乙基)-L-天冬酰胺，即PHEA，溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入琥珀酸酐反应6小时，溶液经透析冻干得到PHEA-suc；
(2)将PHEA-suc溶于无水N，N-二甲基甲酰胺，以N，N’-羰基二咪唑作为偶联剂，三乙胺作为催化剂，使PHEA-suc的羟基与乳糖酸的羧基偶联，得到半乳糖化的聚天冬酰胺衍生物Gal-PHEA-suc。
3.根据权利要求1所述的聚天冬酰胺衍生物与抗癌药物阿霉素的偶联物，其特征是具有如下结构式：
4.根据权利要求3所述的偶联物的制备方法，其特征是用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐作为偶联剂，将阿霉素的氨基与所述聚天冬酰胺衍生物的羧基偶联。
5.权利要求3所述的聚天冬酰胺阿霉素偶联物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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