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CN101189018A - 新的益生菌 - Google Patents

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CN101189018A
CN101189018A CNA2006800193366A CN200680019336A CN101189018A CN 101189018 A CN101189018 A CN 101189018A CN A2006800193366 A CNA2006800193366 A CN A2006800193366A CN 200680019336 A CN200680019336 A CN 200680019336A CN 101189018 A CN101189018 A CN 101189018A
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dna
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animal
bacterium
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CNA2006800193366A
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English (en)
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S·R·康斯坦丁诺夫
H·斯米特
P·伯西
W·M·德福斯
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Wageningen Universiteit
Original Assignee
Wageningen Universiteit
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Abstract

本发明涉及新的革兰氏阳性菌种，其分离自猪肠道。本发明的革兰氏阳性细菌具有前所未有的性质，该性质与其在动物体外和体内在广泛范围的工业饲料包括寡糖碳水化合物上生长的能力相关。本发明的革兰氏阳性细菌可单独用作益生菌或与寡糖碳水化合物组合用作合益素。具体的应用包括在单胃动物中促进健康，生长性能，以及建群抗性。

Description

新的益生菌
技术领域
本发明涉及革兰氏阳性细菌。具体地，其涉及可用作益生菌的革兰氏阳性细菌。
背景技术
将益生菌添加到饮食中，定义为活微生物饲料补充(livemicrobial feed supplements)(Fuller，R.1989.Probiotics in man andanimals.Journal of Applied Bacteriology 66：365-378)，是替代抗生素用以预防和治疗人和动物中一些感染性肠疾病的方法。所述饮食干预部分基于这样的观点，即选自健康胃肠道微生物丛(gut microbiota)的特定菌株具有强的病原体抗性和抗炎性，因此提供对肠疾病的抗性(Isolauri et al.2002.Probiotics：a role in the treatment of intestinalinfection and inflammation？Gut 50：54-59)。在单胃动物中，共生微生物丛通过竞争营养物和病原体结合位点，和/或调节免疫反应导致对抗病原体的肠保护作用。对感染的宿主抗性也可通过共生细菌的活动诸如产生抗微生物物质或产生限制性生理条件来改善，所述限制性生理条件包括乳酸和其他发酵导致的酸化(Teitelbaum et al.2002.Annual Reviews Nutrition 22：107-138)。
农场动物发育中关键的阶段是向固体喂养的过渡，也称为断奶，此时可出现病原体的快速增殖。
小肠微生物群落(community)的组成和活性在断奶后的改变可为使得动物易受病原体感染的因素之一。乳杆菌数量明显减少和大肠菌(coliform)的增加一致地见于断奶后第一周的小猪的胃肠(GI)道中。在断奶后紧接的一段时期中，出现所谓的健康共生微生物丛或建立细菌性肠疾病之间的平衡容易倾向于疾病表达((Zimmermann etal.2001.Journal of Animal and Feed Sciences.10(1)：47-56))。与断奶后腹泻疾病相关的细菌包括产外毒素型(enterotoxigenic)大肠杆菌(Escherichia coli)K88(ETEC)和其他大肠杆菌菌株(断奶后大肠杆菌病(colibacillosis))，和沙门氏菌属(Salmonella spp.)(Hopwood et al.2003. In J.R.Pluske，J.L.Dividich，and M.W.A.Verstegen(ed.)，Weaning the pig.p.199-219.Wageningen Academic Publishers，Wageningen，The Netherlands.
目前为止，没有有效的疫苗来控制断奶后大肠杆菌病，并且许多致病性大肠杆菌菌株显示对多种抗生素的抗性(Amezcua et al.2002.Canadian Journal of Veterinary Research 66：73-78.)。因此，据报道外源性补充乳杆菌可能替代抗生素减少断奶期动物中的断奶后腹泻(Zimmermann et al.2001.Journal of Animal and Feed Sciences.10(1)：47-56)。
Konstantinov et al.2004，Applied and Environmental Microbiology.70(7)：3821-3830，描述了一种含有四种可发酵碳水化合物的饮食，将其给予断奶期小猪增加结肠中的内源性乳杆菌多样性。
本发明的一个目的是提供具有益生菌性质的新的分离的细菌以及包含它们的组合物。
发明详述
本发明一方面涉及分离的革兰氏阳性细菌，其包含16S核糖体RNA(rRNA)，所述16S核糖体RNA在严格条件下与以下核苷酸序列杂交
5’-CGC TTT CCC AAC GTC ATT-3’(SEQ ID NO.1).
并且所述细菌的基因组DNA显示与保藏号为CBS 117345的革兰氏阳性细菌的基因组DNA具有超过50％、更优选至少75％或更高同源性(可通过DNA-DNA杂交确定)。
本发明的细菌具有空前的与在广泛范围的工业饲料上生长的能力相关的性质，所述工业饲料包括廉价的且丰富可用的寡糖碳水化合物。其将在这些底物上在体内例如在动物肠道中或在体外生长。
本发明的细菌
本发明的革兰氏阳性细菌包含在严格条件下与SEQ ID NO.1杂交的16S rRNA。在此背景中，“严格条件”指这样的杂交条件，其允许与SEQ ID NO.1百分之百(100％)匹配的序列的杂交，而与SEQID NO.1具有一或多个错配的序列不发生杂交。这可通过例如在恒定温度50℃、在含有0％(vol/vol)甲酰胺的杂交缓冲液(0.9M NaCl，20mM Tris-HCl[pH 7.5]，0.1％[wt/vol]十二烷基磺酸钠)中杂交16h来进行，如(Konstantinov et al.2004.Applied and EnvironmentalMicrobiology.70(7)：3821-3830)所述。所述16S rRNA包含与SEQ IDNO.1百分之百(100％)匹配的序列。这是16S rRNA包含与SEQ IDNO.1的序列反向互补的序列的情况。
新菌种的成员在几乎完整的16S rRNA基因测序中显示高序列相似性，即它们显示超过90％相似性，优选地，超过92％，93％，94％，95％，96％，97％或98％。更优选地，它们显示超过99.0％，99.2％，99.4％，99.6％或99.8％相似性。在rRNA水平的相似性可通过已知的序列比较程序确定，所述程序诸如ARB，check Probe和BLASTPrograms。基于16S rRNA序列相同性，Lactobacillus kitasatonis(99％)，卷曲乳杆菌(L.crispatus)(98％)，和食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)(97％)与新的分离株的亲缘关系最近，但其基因组DNA相关性被发现低于49％。
本发明细菌的基因组DNA显示与保藏号为CBS 117345的分离的革兰氏阳性细菌具有至少60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％或94％同源性(本文称为DNA-DNA重结合(re-association)或DNA-DNA杂交)。一个实施方案中，本发明细菌的基因组DNA显示与保藏号为CBS 117345的分离的革兰氏阳性细菌具有至少95％，96％，97％，98％或99％同源性。本文叙述保藏号为CBS 117345的细菌时，应理解其衍生物包含在内，即通过细胞分裂(例如在体内或体外生长)衍生自保藏的细菌并且保持菌株CBS 117345的性质的细菌。
基因组DNA同源性通过利用滤膜杂交法来确定，所述方法由Klijn et al.(Klijn et al.1994.Systematic and Applied Microbiology.17：249-256)描述，但使用缺口平移(nick translation)[α-32P]dCTP，并且杂交温度为59℃。因此，分离的细菌是否显示与以保藏号CBS117345保藏在CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，3584 CT Utrecht，Netherlands)的细菌的基因组DNA发生上述百分比的基因组DNA-DNA杂交(或重结合)，可例如通过如下方法来确定：利用缺口平移和放射活性标记的核苷酸(例如dATP或dCTP)来标记总基因组DNA，并将标记的DNA杂交到包含与其比较同源性的细菌的总基因组DNA的滤纸。测定结合的DNA的放射活性并确定相对于同源杂交中所发现信号的结合百分比(例如CBS117345-CBS 117345杂交)。见实施例以及Klijn et al.(1994，supra，page 250，RH Column，最后一段-251页，LH栏，1-4行，包含在本文作为参考)。
本发明的革兰氏阳性细菌的基因组DNA G+C含量为35-36mol％。
分离并定性新菌种的6个成员(见实施例)。新菌种的成员显示为不可活动的非孢子形成型棒状。这些棒宽度可为至少大约0.6微米，并且长度至少2微米。它们可单独、成对或以长链的形式出现。一个实施方案中，它们的宽度不超过大约1微米，长度不超过大约20微米。其他实施方案中，菌落的直径至少1.4mm，白色，形状为圆形到略微不规则到粗糙(rough)。
所有上述大小、形状、排列、革兰氏染色和菌落外观的特征通过利用在MRS琼脂板上在37℃生长2天的细胞来测定。
本发明的革兰氏阳性细菌在15℃不生长，但在45℃生长。所述生物体是兼性厌氧的，并以同型发酵的方式产生D-和L-乳酸。不产生过氧化氢酶。从以下物质产生酸而不形成气体：D-葡萄糖，D-甘露糖，麦芽糖，半乳糖，D-果糖，乳糖，七叶苷(esculin)，蔗糖，amidon，甘露醇，纤维二糖(cellobiose)，水杨苷，海藻糖，苦杏苷，N-乙酰葡糖胺，熊果苷(arbutin)，核糖，糖原，5-酮葡糖酸(keto-gluconate)。
不从以下物质形成酸：甘油，赤藻糖醇，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，L-木糖，松三糖，鼠李糖，核糖醇(adonitol)，β甲基-木糖苷，山梨糖醇，L-山梨糖，己六醇(dulcitol)，肌醇，α甲基-D-甘露糖苷，α甲基-D-葡糖苷，熊果苷，菊糖，木糖醇，D-松二糖(turanose)，D-来苏糖(lyxose)，D-塔格糖(tagatose)，D-岩藻糖，L-岩藻糖，D-阿拉伯糖醇，L-阿拉伯糖醇，葡糖酸盐，2-酮葡糖酸。
它们能够降解寡糖碳水化合物诸如低聚果糖(fructooligosaccharides)(FOS)和甜菜粕(SBP)，其是便宜且易得的农业生产废液产品。它们降解FOS和SBP的能力可导致它们在动物的肠道中被FOS和SBP选择性富集。如实施例所述，所述菌种首次从断奶前幼猪的肠道分离。
本发明的组合物及其用途
另一方面，本发明提供用于食品、饲料或养殖工业的组合物。本发明的组合物包含至少一种本发明的分离的革兰氏阳性细菌，但也可包含两种或多种本发明的细菌(混合物)。优选，所述细菌是活细菌或有活力的(viable)细菌，但是一个实施方案中，也可使用死细菌/无活力(non-viable)的细菌。如果使用死细菌或无活力的细菌，剂量(菌落形成单位，cfu)可在杀死细菌前确定。所述组合物可为任何形式，其可适宜地配制为固体，液体或半液体组合物。例如，其可为冻干形式，例如在胶囊中。如果其为冻干的形式，优选将其加入水或另一种液体中来使用。
其可在使用前即刻加入食品或饲料中或在其到达最终的使用者之前已经包含在饲料或食品中。例如其可加入液体饲料或乳制品诸如牛奶，酸奶，甜点，涂抹食品(spread)，黄油和干酪中。
本发明的细菌培养物也可单独用作益生菌或与寡糖碳水化合物组合用作合益素(in symbiotic combination with oligosaccharidecarbohydrates)。因此，进一步包含寡糖碳水化合物的饲料或食品组合物也包含在本发明内。适宜的寡糖碳水化合物包括低聚果糖和甜菜粕，也包括本文所述的其他碳水化合物，诸如D-棉子糖，蔗糖，乳糖等。
一个实施方案中，所述组合物用于养殖工业(breedingindustry)，例如用于断奶期动物幼仔。在那些情况中，其可用于抵消或补偿断奶动物通常经历的应激效应，诸如伴随断奶的生长速率降低。因此，另一方面，本发明提供通过将本发明的组合物给予断奶前的动物幼崽来使得动物断奶的方法，具体是农场动物的幼崽例如小猪，或宠物诸如小狗或小猫。
具体感兴趣的是本发明的细菌作为益生菌的用途。本发明所述的细菌或其与寡糖碳水化合物的组合，可用于促进健康，生长性能和建群抗性，特别是在包括人在内的单胃动物中。优选地，其用于抑制或降低病原微生物诸如产肠毒素型大肠杆菌(E.coli)的生长，和/或其可用于减少或防止腹泻。所述方法包括将本发明的组合物给予动物。在本发明中，“单胃动物”指任何具有一个胃的动物，其用于大多数食肉动物或杂食动物，但除外反刍动物。
适宜量的一或多种细菌可单独或作为组合物(食品或饲料)的一部分每天(一次或多次每天)、每周或每月给予。适宜剂量的细菌或所用混合物中的每一种细菌，可由本领域技术人员确定。适宜剂量包括优选至少1×106cfu，优选约1×106-1×1012 cfu(菌落形成单位)每天每菌株，更优选约1×107-1×1011cfu/天，更优选约1×108-5×1010cfu/天，最优选1×109-2×1010cfu/天。
本发明的组合物可包括其他组分，诸如其他益生细菌，益生素，盐类，矿物质，调味品，脂肪，蛋白质，碳水化合物等。
本发明的方法
一方面，本发明提供检测样品中本发明所述分离的革兰氏阳性细菌的方法。所述方法包括：
-提供探针，包括标记物和核苷酸序列SEQ ID No.1；
-将所述探针与样品在杂交条件下接触；
-去除未结合的探针；和
-检测指示结合的探针的标记物；
所述样品可获自任何排出物，其可反应肠的内容物。样品可适宜地获自粪便。更具有侵入性的方法是通过内镜取样。
利用本发明的方法，可获得建群是否存在的指征，尤其是在其与细菌定量组合的情况下。所述方法也可用于获得关于样品所来源的动物的健康指征。本发明的另一实施方案中，所述方法用于筛选来自猪肠道或其他来源的相关生物体。
本发明另一方面是通过将本发明的革兰氏阳性细菌或组合物给予动物来抑制或阻止肠道病原体的生长的方法。在猪或人中，本发明的方法用于抑制或阻止猪或人肠道病原体的生长，所述病原体例如梭菌(Clostridium)，沙门氏菌(Salmonella)，志贺氏菌(Shigella)，耶尔森氏菌(Yersinia)。或者，所述方法可用于抑制或阻止是哺乳动物胃肠道的正常寄居者但有时与猪或人的疾病相关的其他细菌的生长，所述细菌例如埃希氏菌(Escherichia)，肠杆菌(Enterobacter)，克雷伯氏菌(Klebsiella)。一个实施方案中，本发明的方法用于抑制或阻止产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)的生长。一个优选实施方案中，所述动物是宠物，诸如猫、仓鼠、或狗，或者是人。
附图简述
图1.菌株OTU171_001T在含有1％FOS，1％D-葡萄糖，1％D-果糖或1％SBP的MRS肉汤中的生长。
图2.菌株OTU171_001T(L.sobrius)和乳杆菌属德氏乳杆菌(L.delbrueckii)16S rRNA基因簇的选定成员的系统发生分析。该树利用邻接法(neighbour-joining method)采用部分16S rRNA基因序列(大肠杆菌位置107-1433)，使用ARB软件包(Ludwig et al.，2004 Nucl AcidsRes 32，1363-1371)来计算。条杆代表5％序列差异。
图3.饮食中补充L.sobrius菌株001T对ETEC攻击的猪的唾液、血清、空肠分泌中的总IgA的影响(最小二乘平均值±SEM)。
#饮食的影响：p＝0.10。
*饮食的影响：p＜0.05。
图4.饮食中补充L.sobrius菌株001T对ETEC攻击的猪的唾液、血清、空肠分泌中的抗L.sobrius菌株001T的sIgA的影响(最小二乘平均值±SEM)。
*饮食的影响：p＜0.05。
实施例
材料和方法
利用API 50CHL系统(bioMérieux)检测菌株的碳水化合物发酵能力。此外，低聚果糖(FOS)和甜菜粕(SBP)由L.sobrius_001T的降解利用MRS作为基本培养基(不含碳水化合物)来检测，如Barrangou et al.，2003(PNAS USA 100：8957-8962)所述。所述细菌培养物在37℃，有氧条件下在MRS基本培养基中增殖，所述培养基包含1％细菌用蛋白胨(wt/vol)，0.5％酵母提取物(wt/vol)，0.2％磷酸氢二钾(wt/vol)，0.5％乙酸钠(wt/vol)，0.2％柠檬酸铵(wt/vol)，0.02％硫酸镁(wt/vol)，0.005％硫酸锰(wt/vol)，0.1％Tween 80(vol/vol)，0.003％溴甲酚紫(vol/vol)。MRS基本培养基经高压灭菌，过滤除菌后加入D-葡萄糖(dextrose)，D-果糖，或FOS(Raftilose P95，Orafti)使得糖浓度为1％(wt/vol)。如果SBP发生降解，向基本培养基中提供1％SBP(wt/vol)，随后在水浴(100℃)中沸腾20min。
细胞形状，大小和排列，革兰氏染色和菌落外观通过利用在MRS琼脂板上在37℃生长2天的细胞测定。也检验了气体从葡萄糖的产生。过氧化氢酶形成以及在15和45℃的生长利用MRS肉汤作为基本培养基来进行。
基本完整的16S rRNA基因序列
确定6种代表性菌株的基本完整的16S rRNA基因序列(大约1.5Kb)。16S rRNA基因(对应大肠杆菌位置8-1492)通过PCR进行扩增，所述扩增利用引物S-D-Bact-0011-a-A-17(AGA GTT TGA T(C/T)(A/C)TGG CTC AG)，和S-D-Bact-1492-a-A-19(GGT TAC CTT GTT ACGACT T)(Leser et al.，2002 Appl Environ Microbiol 68，673-690)，并进一步如(Konstantinov et al.，2004 Appl.Environ.Microbiol.70(7)：3821-3830)所述克隆并测序所述产物。OTU_001T的序列以保藏号AY700063保藏在GenBank。系统发生分析利用ARB软件包进行(Ludwig et al.，2004 Nucl Acids Res 32，1363-1371)。为了估计分离株的大致的基因组大小并分析它们的基因组多样性，如前所述进行Apa I消化的染色体DNA的缓冲场凝胶电泳(PFGE)(McCartney et al.，1996 Appl Environ Microbiol 62，4608-4613)。分离株的基因组大小根据λPFG标准梯利用程序Quantity One(Bio-Rad)计算。G+C含量基于基因组DNA Tm的确定来计算(Marmur et al.，1962 J Mol Biol 4，109-118)。DNA-DNA相关性根据(Klijn et al.，1994 System ApplMicrobiol 17，249-256)通过滤膜杂交来分析，但使用缺口平移[α-32P]dCTP，杂交温度为59℃(比Tm低±25℃)。提取全细胞蛋白质并通过利用标准方法进行SDS-PAGE分离它们(Maniatis et al.，2003Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2nd ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，SDS-PAGE蛋白指纹利用Bionumerics软件包version 3.0.(Applied Maths)进行比较。
喂养实验
动物实验包括3次重复。每次重复利用16只给予两种饮食治疗之一的断奶小猪(21日龄)来进行，所述饮食治疗为基本饮食(对照)以及含有L.sobrius菌株001T的基本饮食(LAB饮食)。平衡小猪的同窝幼仔和体重，登记性别。用标准饮食喂饲小猪，其中含有4％干甜菜粕。LAB饮食除了包含基本饮食还包含1ml/天的脱脂奶溶液，其中补充有1010CFU L.sobrius菌株001T，而仅仅将1ml奶添加到对照饮食中。实验期分成两个阶段：适应期，其中调节对象使其适应实验饮食(第0天到第7天)，和攻击期(第7天到第14天)。含有或不含L.sobrius菌株001T的脱脂奶在第0和第1天通过无菌注射器口服给予，并且直到实验最后一天，每天早晨在槽中小心地与饲料混合。猪在筛网状地板上圈养，在第0天和第1天，四只为一组圈养在一起，然后每只单独圈养。第7天，用1.5ml含有1010CFU/ml产肠毒素型大肠杆菌K88(ETEC)的悬液攻击小猪。
腹泻得分和ETEC定量
腹泻得分通过利用5分评分系统(1-5)目测评估每个对象来记录，排泄物是硬的(得分为1)，水样便(得分为5)。攻击后2和3天，收集每个对象的粪便样品，如Bosi，et al.2004.J.Anim.Sci.52所述定量ETEC和总大肠杆菌排出。
四个随机样品每组每个重复(每种饮食总共12个样品)用于进一步分离L.sobrius菌株，其分类学特征如Konstantinov，et aL，2004vide supra所述。
总分泌IgA(sIgA)，和抗-L.sobrius菌株001T和ETEC特异性sIgA效价
攻击之日，从所有对象收集唾液和血液样品。在处死前一天，再次收集唾液样品，在处死之前立即收集血液样品。所有sIgA测定通过ELISA进行。对于总sIgA检测，96-孔微量滴定板用山羊抗猪sIgA包被，亲和纯化(BETHYL Laboratories，Montgomery，TX)并在碳酸盐-重碳酸盐缓冲液，50mM，pH 9.4中稀释。随后，将补充有0.2％(v/v)Tween 20的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)加入孔以封闭剩余的结合位点。猪免疫球蛋白参比血清(BETHYL，Laboratories，Montgomery，TX)用作标准曲线的特异性抗体，山羊抗猪sIgA-HRP偶联物(BETHYL Laboratories，Montgomery，TX)作为第二抗体且ABTS(ROCHE Diagnostics)做为酶底物。在405nm通过微量读板器来读取吸光度(Sunrise Microplate Reader，TECAN ITALIA)。浓度值表示为μg/ml。L.sobrius菌株001T，ETEC-特异性sIgA效价分别根据Ibnou-Zekr et al.2003.Infect Immun.71(428-346)和Van den Broeck etal.1999.Infect.Immun.67：520-526确定。
处死时收集样品
第13或14天，所有小猪根据治疗平均分配，并在每次治疗中随机选择，用硫喷妥钠(sodium thiopenthal)(10mg/kg体重)麻醉。心内注射
Figure A20068001933600161
(0.5ml/kg体重；Intervet Italia，Peschiera Borromeo，Italy)进行安乐死。
在小肠总长的1/4和3/4处取样用于小肠绒毛和隐窝的形态测定分析，并如Bosi et al 2002，vide supra)所述测定。为了测定sIgA，获自末段空肠的50cm节段立即如Evans et al.1980.Scand.J.Immunol.11：419-429所述进行加工。胃肠道内容物样品也自胃，十二指肠，末段空肠，盲肠和结肠收集，用于测定pH。腔(Lumen)样品收集自末端回肠，并分成几个等分试样，用于利用Fast DNA Spin试剂盒(Qbiogene，Inc，Carlsbad，CA)进行基因组DNA提取，并分别进行固定用于进行原位荧光杂交(FISH)。靶向L.sobrius sp.nov.的16S rRNA的DNA寡核苷酸探针L-*-OTU171-0088-a-A-18(表2)用于对回肠腔样品如报道的那样进行FISH分析(Konstantinov et al.2004，vide supra)。
统计学分析
通过利用GLM法(SAS version 8.1，SAS Institute，Cary，NC)进行方差分析来分析数据，其中利用3-因素设计，包括饮食，批次，肠道绒毛对ETEC粘附的敏感性，以及1级反应。
乳杆菌特异性PCR扩增
如前所述进行PCR法(Konstantinov et al.2004，vide supra)，用于该研究的引物列于表2。PCR利用得自Life Technologies(Gaithersburg，MD)的Taq DNA聚合酶试剂盒来进行。PCR混合物(50μl)包含1.25Uμl的Taq聚合酶(1.25U)，20mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，3.0mM MgCl2，200μM的每种dNTP，100nM引物S-D-Bact-0011-a-A-17和S-G-Lab-0677-a-A-17以及1μl稀释成大约1ng/μl的DNA以及UV消毒的水(mili Q)。所述样品在热循环仪T1Whatman Biometra(Germany)中扩增，所述循环为：94℃预变性5min；35个以下循环：94℃、30sec，66℃、20sec，和68℃、40sec，最后在68℃延伸7min。PCR产物随后用作嵌套PCR反应中的模板，利用：S-G-Lab-0159-a-S-20和S-*-Univ-0515-a-A-GC，随后是以下循环程序：94℃、5min，以及35个以下循环：94℃、30sec，56℃、20sec，68℃、40sec，最后在68℃延伸7min。5μl等分试样通过在含有溴乙锭的1.2％琼脂糖凝胶(w/v)上进行电泳进行分析来检验产物大小和产量。
变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析
获自腔提取的DNA的扩增子通过DGGE(Dcode TM system；Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)利用以前所述的方案(Konstantinov et al.2004，vide supra)来分离。简而言之，在37.5∶1丙烯酰胺-双丙烯酰胺的8％聚丙烯酰胺凝胶(梯度30-60％)(大小200×200×1mm)中进行电泳用于分离利用引物S-G-Lab-0159-a-S-20and S-*-Univ-0515-a-A-GC获得的PCR产物。在200V跑胶5min，所述凝胶在85V在0.5×TAE缓冲液中恒定温度60℃下进行电泳16h，随后用AgNO3染色。
用于实时PCR分析的参照菌株
L.sobrius菌株001T在37℃增殖，在deMan，Rogosa，Sharpe(MRS)肉汤(Difco，Le Point de Claix，France)中在无氧条件下生长，而ETEC在含有1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％NaCl，pH 7.0的Luria-Bertani肉汤中生长。两种培养物(2ml)在24h后通过在5,000xg离心10min来收获，并用0.2μm孔径的滤膜过滤的PBS(每升：8gNaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4；pH 7.2)洗涤。细菌沉淀物最终重悬于1ml PBS。10μl的每种培养物用于总细胞计数确定，其基于4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(phenylindole)(DAPI)染色和显微分析，如Konstantinov et al.，vide supra)所述。利用Fast DNA Spin试剂盒(Qbiogene)从剩余的990μl细菌培养物分离基因组DNA。最终，L.sobrius和ETEC基因组DNA稀释到浓度108-10细胞/ml每实时PCR反应并用于产生实时PCR标准曲线。
实时PCR测定用于定量L.sobrius菌株001T和ETEC.
靶向L.sobrius菌株001T的菌株特异性和种特异性定量PCR检验分别通过使用引物OTU171_RDA_F和OTU171_RDA_R，以及L-*-OTU171-0077-a-S-2S-G-Lab-0159-a-A-2来实现(表2)。对于ETEC定量，使用引物K88AD_F和K88AD_R(表2)。此外，16S rRNA基因靶向的引物，968F和R1401(表2)用于总细菌定量。实时PCR在具有iCycler最佳系统界面软件(optical system interface software)version 2.3(Bio-Rad，Veenendaal，The Netherlands)的iCycler IQ实时检测系统与上进行。反应混合物(25μl)包括12.5μl IQ SYBR GreenSupermix(Bio-Rad)，0.2μM每种引物组，和5μl模板DNA。特定L.sobrius菌株001T定量的PCR条件为：起始DNA变性步骤95℃、3min，然后以下步骤的40个循环：在95℃变性15sec，在60.3℃进行引物退火并延伸45sec。使用相同的条件进行L.sobrius种特异性定量，但引物退火和延伸温度是62.5℃。对于总细菌定量，条件是94℃、5min，以及35个以下循环：94℃、30sec，56℃、20sec，68℃、40sec(Nübel et al.1996.Journal of Bacteriology 178：5636-5643)。为了检测ETEC，条件是：92℃、45sec，50℃、45sec，72℃、45sec，40个循环(Alexa et al.2001.Veterenary Medicine 46：46-49)。为了测定每种样品中L.sobrius菌株001T和ETEC的数量，从两份连续稀释液检测到的荧光信号与利用各种细菌在相同实验中产生的标准曲线相比较。连续稀释的L.sobrius菌株001T基因组DNA用作总细菌定量的实时PCR对照。
实施例1  分离本发明的细菌
靶向食淀粉乳杆菌样种系型OTU171的16S rRNA的DNA寡核苷酸探针L-*-OTU171-0088-a-A-18(5’-CGC TTT CCC AAC GTCATT-3’)(Konstantinov et al.2004 vide supra)用于筛选来自圈养在不同位置的小猪(21日龄)的一系列乳杆菌分离株。生长于乳杆菌选择性琼脂(Difco，Le Point de Claix，France)的总共192个分离株通过利用CY3-标记的种系型特异性探针的原位荧光杂交(FISH)联合图像分析如所述(Konstantinov et al.2004 vide supra)来筛选。两种食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)-样菌株在圈养于Wageningen，theNetherlands附近的农场的小猪的粪便中鉴定，进一步在该研究中表示为OTU171_001T和OTU171_002。三种菌株(OTU171_003，OTU171_004，OTU171_005)从来自Bologna，Italy附近的农场的小猪的粪便中分离，一种分离株见于喂养于Bristol，UK(OTU171_006)附近农场的小猪的回肠腔样品中发现。选出6个分离株通过表型和分子分类方法进一步定性。嗜酸性乳杆菌(L.acidophilus)DSMZ20079T，食淀粉乳杆菌DSMZ 20531T，卷曲乳杆菌DSMZ 20584T，鸡乳杆菌(L.gallinarum)DSMZ 10532T，瑞士乳杆菌(L.helveticus)DSMZ 20075T，和L.kitasatonis JCM1039T用作参照菌株。所有乳杆菌分离株和参照菌株在MRS琼脂上或MRS肉汤中在无氧条件下在37℃进一步培养。
实施例2  菌株的表征
与OTU171探针杂交的食淀粉乳杆菌-样分离株是革兰氏阳性的，非孢子形成型和不可运动型的棒状，这些菌株的菌落是白色的，形状为环形到无规则形。所有菌株显示类似的发酵特征，如通过API50CHL所示。将该菌株与其他参照菌株相区分的表型特征总结于表1。与L.kitasatonis相反，所有新的分离株均可发酵D-棉子糖。也检测了菌株OTU171_001T发酵FOS和SBP的能力(图1)。菌株在MRS-FOS中生长到终细胞密度OD600＝1.81。该MRS-FOS生长与MRS-D-葡萄糖相比较慢，但类似于将菌株接种于MRS-D-果糖后的细胞密度(图1)。也在MRS-SBP肉汤中获得了与在MRS-D-葡萄糖上生长速率基本相同的阳性生长(OD600＝2.7)。如果不补充碳水化合物，在半合成培养基中生长的细菌不能维持在OD600nm＝0.25以上。
菌株产生DL-乳酸，不在15℃生长，但在45℃生长，是过氧化氢酶阴性的。从以下物质产生酸但没有气体形成：D-葡萄糖，D-甘露糖，麦芽糖，半乳糖，D-果糖，乳糖，七叶苷，蔗糖，amidon，甘露醇(6菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T)，纤维二糖(6个菌株中3个，包括菌株OTU171_001T)，水杨苷(6个菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T)，海藻糖(6个菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T)，苦杏苷(6个菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T，弱反应)，N-乙酰葡糖胺(6个菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T)，熊果苷(6个菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T)，核糖(6个菌株中的2个，包括菌株OTU171_001T，弱反应)，糖原(6个菌株中的3个，通过菌株OTU171_001T发酵)，5-酮葡糖酸(5keto-gluconate)(6个菌株中的2个，通过菌株OTU171_001T发酵，弱反应)。FOS和SBP也通过OTU171_001T发酵。不从以下物质形成酸：甘油，赤藻糖醇，D-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，L-木糖，松三糖，鼠李糖，核糖醇，β甲基-木糖苷，山梨糖醇，L-山梨糖，己六醇，肌醇，α甲基-D-甘露糖苷，α甲基-D-葡糖苷，熊果苷，菊糖，木糖醇，D-松二糖，D-来苏糖，D-塔格糖，D-岩藻糖，L-岩藻糖，D-阿拉伯糖醇，L-阿拉伯糖醇，葡糖酸盐，2酮葡糖酸。
6中菌株的DNA G+C含量为35-36mol％(表1)。
6种代表性分离株的几乎完整的16S rRNA基因序列显示高序列相似性(＞99％)。随后的系统进化分析法证实新分离的菌株与属于乳杆菌属的德氏乳杆菌群的菌种(Collins et al.1991；Mukai et al.2003)的相关性(图2)。发现与以下细菌具有高水平序列相关性：L.kitasatonis(99％)，卷曲乳杆菌(98％)，食淀粉乳杆菌(97％)和鸡乳杆菌(97％)。
通过SDS-PAGE的分离株全细胞蛋白分析显示与参照菌株的全细胞蛋白相比有明显差异。所有新分离株的SDS指纹中均检测到50kD蛋白质。SDS-PAGE蛋白图谱的聚类分析之后，新分离株的指纹形成相似性高于85％的相关聚类，而它们仅仅个别地与检验的典型菌株相关，相似性指数低于70％。
此外，所述新分离株与最接近的典型菌株通过DNA-DNA杂交来比较。OTU171_001T，OTU171_002和OTU171_003的标记的DNA与来自6个OTU171菌株的未标记的DNA发生高水平重结合(78-100％)，而对于所检验的密切相关的乳杆菌菌种仅仅观察到低水平重结合(2-49％)(表3)。所述结果表明，在研究过程中分析的所述分离株，属于与最接近的典型菌株不同的单独的种。
为了进一步评估6个分离株的基因组多样性，通过目测比较Apa I消化的染色体DNA的PFGE图谱。所有分离株均显示相互不同的PFGE。平均基因组大小为1.2Mb。
新的种进一步称为L.sobrius典型菌株OTU171_001T。
实施例3  动物观察
发现用LAB饮食喂养的小猪生长速度明显更快(+74％，P＜0.05)，而它们不显示与对照饮食喂养的小猪的不同的饲料摄入(表4)。在用LAB饮食喂养的小猪中观察到腹泻得分＞2的天数增加(+1.9天，P＜0.05)，而平均腹泻得分没有明显改变。总大肠杆菌和ETEC的粪便排出在攻击期的第2天没有受到影响。感染后第3天，虽然没有统计学显著性，但在用LAB喂养的小猪中观察到更高的ETEC粪便排出(表4)。
胃，十二指肠，空肠，盲肠和结肠中的pH在两个饮食组中没有明显差异(表5)。通过绒毛高度和隐窝深度测定的小肠形态学也不被饮食改变。
实施例4IgA和sIgA效价
在攻击时(第7天)，小猪唾液和血清中sIgA的总含量不受饮食中加入L.sobrius菌株001T的影响(图2)。一周后，唾液中的总sIgA含量在用LAB饮食喂养的小猪中得以保持，而在对照饮食组中所述值明显降低(p＜0.05)。对于血清，总sIgA在小猪中增加，但L.sobrius菌株001T添加组与对照相比倾向于具有更多sIgA(p＝0.10)。空肠分泌物中的总sIgA含量不受影响。
饮食补充L.sobrius菌株001T对ETEC攻击的猪的唾液、血清和空肠分泌物中抗该菌株的sIgA的影响显示于图3。抗L.sobrius菌株001T的sIgA抗体在几乎所有猪中检出而与饮食无关。其浓度(表示为总sIgA)仅仅在自补充1周之后收集的血清中明显高于LAB饮食喂养的小猪(p＜0.05)。通常，不考虑饮食，抗L.sobrius菌株001T的sIgA在2周之后仍然存在肠分泌物中，并且可见在血液中有少量的减少。但是，观察到与第一周的样品相比，第二周的样品中识别L.sobrius菌株001T的唾液sIgA明显减少。ETEC特异性sIgA在LAB和对照组之间没有统计学差异。
实施例5  培养基和回肠腔样品中L.sobrius的定量PCR检测
加入LAB饮食的L.sobrius菌株001T的数目通过实时PCR利用物种特异性引物定量。当样品与各种量(109-105细胞)的L.sobrius菌株001T混合，通过实时PCR实验，DAPI染色细胞的直接FISH计数或活细胞计数获得的结果之间没有明显差异。此外，当比较提取自生长在MRS中的培养物或回肠样品的DNA时，实时PCR效率不受影响。此外，进行实时PCR分析，来定量接受LAB饮食的4只小猪的回肠样品中的L.sobrius，结果与通过FISH所得结果相比较。对于3组样品，两种方法，即定量PCR和FISH，以相同水平检测到靶菌种(大约108/g)。但在第4份样品中，通过定量PCR而不是FISH评估L.sobrius，这是由于FISH技术的检测限所致(表6)。
实施例6  通过实时PCR检测小猪回肠腔样品中的L.sobrius菌株001T和ETEC的一致性
为了评估回肠腔中ETEC的数目是否以定量方式受到添加L.sobrius菌株001T的影响，进行种特异性(L.sobrius)和菌株特异性(L.sobrius菌株001T或ETEC)实时PCR测定。在回肠样品中测定计数并比较用LAB和对照饮食喂养的小猪的结果(表7)。在16只用LAB饮食喂养的小猪中的12只中，检测给予的L.sobrius菌株001T(＞103细胞/g)，其群体大小为0.66±1×108细胞/g回肠腔(平均计数±SD)。在LAB组中，在16份样品的13份中鉴定到了大量L.sobrius(＞103细胞/g)，每克回肠腔的L.sobrius群体为1.6±0.9×108细胞。所述菌种以低得多的水平在对照组中检出(2.3±3×104；p＜0.05)。ETEC在用对照饮食喂养的16只小猪中的12只中检出(＞103细胞/g)，并以相对较大的群体存在(1±1×106细胞/g)。反之，该病原体的群体在LAB组中明显更低(4.2±0.7×104；p＜0.05)。令人感兴趣的是，ETEC没有在具有较大群体的(＞108细胞/g)L.sobrius菌株001T的LAB组中的四只小猪的回肠样品中检出。细菌总数在两个饮食组之间没有明显差异(表7)。
实施例7  断奶期小猪的回肠中乳杆菌群体的DGGE分析
作为实时PCR检测的补充，对小猪的回肠腔样品进行乳杆菌特异性16S rRNA基因靶向的扩增与DGGE指纹分析的组合。虽然一些个别变异见于乳杆菌特异性扩增子的数目与位置，但是指纹显示高度相似性。但是，描述给药的L.sobrius菌株的特异性DGGE带的存在中的明显差异见于大多数来自LAB饮食喂养的小猪的回肠样品(8个中的7只)。所述扩增子以低频率和强度存在于来自对照饮食喂养的小猪的回肠样品中。这些数据与实时PCR结果一致，并表明与实验性ETEC攻击之后的对照组相比，LAB组中L.sobrius的出现增多。
表1.食淀粉乳杆菌样菌株和紧密相关乳杆菌的DNA G+C含量和表型特征。Taxa：1，食淀粉乳杆菌样(OTU171)菌株；2，L.kitasatonis；3，食淀粉乳杆菌；4，卷曲乳杆菌；5.L.gallinarum；6，L.gasseri；7，嗜酸性乳杆菌；8，L. johnsonii；9，瑞士乳杆菌。属于嗜酸性乳杆菌群的taxas 2-9的数据来自Mukai et al.，2003；+，阳性；D，菌株依赖性；D-，通常阴性；-，阴性；W，弱反应。所有菌株均从D-葡萄糖，半乳糖，D-果糖，D-甘露糖和麦芽糖产生酸并产生DL-乳酸。没有菌株从阿拉伯糖，木糖，鼠李糖，松三糖或山梨糖醇产生酸。
Figure A20068001933600261
表2.本研究所用DNA寡核苷酸的列表
Figure A20068001933600271
1.Alexa，P.，K.Stouracova，J.Hamrik，and I.Rychlik.2001.Veterinary Medicine 46(2)：46-49.
2.Heilig，H.，E.G.Zoetendal，E.E.Vaughan，P.Marteau，A.D.L.Akkermans，and W.M.deVos.2002.Applied and Environmental Microbiology 68(1)：114-123.
3.Leser，T.D.，J.Z.Amenuvor，T.K.Jensen，R.H.Lindecrona，M.Boye，and K.Moller.2002.Applied and Environmental Microbiology 68(2)：673-690.
4.Nübel，U.，B.Engelen，A.Felske，J.Snaidr，A.Wieshuber，R.I.Amann，W.Ludwig，and H.Backhaus.1996.Journal of Bacteriology 178：5636-5643.
表3.L.sobriu sp.nov.和系统发生学紧密相关的乳杆菌属的DNA相关性所有值均是两次分析的平均值，标准偏差低于5％。
Figure A20068001933600281
-
-，未检测。
表4.饮食补充L.sobrius菌株001T对被攻击的猪的生长，饲料摄入，腹泻得分(1＝粪便非常坚硬；5＝水样腹泻)，总大肠杆菌和ETEC排出的影响(最小二乘平均值±SEM).
Figure A20068001933600291
*饮食的影响：p＜0.05.
表5.饮食补充L.sobrius_001T菌株对ETEC攻击的猪的不同胃肠道节段的pH的影响(最小二乘平均值±SEM)
表6.用于测定和定量四个猪回肠样品(A，B，C，D)中的L.sobrius的定量实时PCR和FISH的比较。计数表示为平均细胞g-1。
Figure A20068001933600302
-，未检出，低于105细胞g-1。
表7.实时PCR测定的回肠样品中L.sobrius菌株001T，L.sobrius，ETEC，和总细菌(BAC)的数量。计数表示为平均值±SD细胞g-1。
*，与在p＜0.05比较的各个值具有显著差异
序列：
SEQ IDNO：1-用于靶向食淀粉乳杆菌样种系型OTU171的16S rRNA的序列
SEQ IDNO：2-5-用于乳杆菌特异性PCR扩增的引物
SEQ IDNO：6和7-用于总细菌定量的引物
SEQ ID NO：8和9-用于定量产肠毒素型大肠杆菌的引物
SEQ IDNO：10和11-用于物种特异性定量PCR的引物
SEQ IDNO：12和13-用于菌株特异性定量PCR的引物
序列表
<110>瓦赫宁根大学(Wageningen University)
<120>新的益生菌
<130>P6001554
<160>13
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>sequence used for targeting the 16S rRNA of L.amylovorus-like
     phylotype OTU171
<400>1
cgctttccca aacgtcatt                                                                  19
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for Lactobacillus specific PCR amplification
<400>2
agagtttgat ymtggctcag                                                                  20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for Lactobacillus specific PCR amplification
<400>3
ggaaacagrt gctaataccg                                                                  20
<210>4
<211>64
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for Lactobacillus specific PCR amplification
<400>4
cgccgggggc gcgccccggg cggggcgggg gcacgggggg atcgtattac cgcggctgct                      60
ggca                                                           64
<210>5
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for Lactobacillus specific PCR amplification
<400>5
caccgctaca catggag                                             17
<210>6
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for total bacterial quantification
<400>6
cggtgtgtac aagaccc                                             17
<210>7
<211>17
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for total bacterial quantification
<400>7
aacgcgaaga accttac                                             17
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for enterotoxogenic E.coli quantification
<400>8
ggcactaaag ttggttca                                            18
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for enterotoxogenix E.coli quantification
<400>9
cacccttgag ttcagaatt                                             19
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>primer for species specific quantitative PCR
<400>10
cggtattagc acctgtttcc                                            20
<210>11
<211>18
<212>DNA
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<220>
<223>primer for species specific quantitative PCR
<400>11
acttcggtaa tgacgttg                                              18
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<212>DNA
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<223>primer for strain specific quantitative PCR
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<212>DNA
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<220>
<223>primer for strain specific quantitative PCR
<400>13
ccttgtttat tcaagtgggt ga                                         22

Claims (13)

1.分离的革兰氏阳性细菌，其包含：
a)16S rRNA，其在严格条件下与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列杂交，和
b)基因组DNA，其显示与保藏号CBS 117345的革兰氏阳性细菌的基因组DNA的至少75％发生DNA-DNA重结合，其中所述DNA-DNA重结合可通过滤膜杂交来确定。
2.权利要求1所述分离的革兰氏阳性细菌，其中所述细菌能发酵D-棉子糖、蔗糖和乳糖。
3.保藏号CBS 117345的分离的革兰氏阳性细菌，或通过细胞分裂衍生自所述细菌的细菌。
4.用于食品、饲料或养殖工业的组合物，包含至少一种权利要求1-3的分离的革兰氏阳性细菌。
5.权利要求4的组合物，其还包括低聚果糖和/或甜菜粕。
6.权利要求1-3之一的分离的革兰氏阳性细菌作为益生菌在食品、饲料或养殖工业中的用途。
7.权利要求1-3之一的分离的革兰氏阳性细菌在制备用于抑制或降低人或动物的病原体感染和/或用于防止或减少腹泻的组合物中的用途。
8.检测样品中权利要求1-3之一的分离的革兰氏阳性细菌的方法，所述方法包括：
-提供探针，所述探针包含标记物和核苷酸序列SEQ ID No.1；
-使所述探针与样品在杂交条件下接触；
-去除未结合的探针，和
-检测指示结合的探针的标记物。
9.用于动物断奶的方法，包括将至少一种权利要求1-3的革兰氏阳性细菌或权利要求4或5的组合物给予动物。
10.抑制或防止动物或样品中潜在的肠道病原生物体的生长的方法，包括给药至少一种权利要求1-3的革兰氏阳性细菌或权利要求4或5的组合物。
11.权利要求9或10的方法，其中所述动物是单胃动物、宠物或人。
12.权利要求9-11之一的方法，其中将权利要求1-3之一的菌株以下述的量给予动物：至少1×107菌落形成单位(cfu)每天，优选至少1×108cfu/天，更优选至少5×1010cfu/天。
13.权利要求4或5的组合物，包括至少1×107菌落形成单位(cfu)的所述菌株。
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