CN101182325A - 静脉给药银杏内酯b及提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种静脉给药银杏内酯B及提取方法，其特征是银杏内酯B含量≥97％，银杏酸≤2ppm，白果内酯未检出，可以直接作为静脉注射或静脉滴注原料药；提取采用叶干重8～25倍量、浓度为5％－30％乙醇水溶液回流提取若干次，过滤分离；将滤液浓缩至原体积的0.05～0.2倍量，加入吸附剂在搅拌状态下充分吸附，过滤，滤饼用3～10倍量乙醇回流提取若干次，合并提取液，浓缩至原体积的0.01～0.2倍量，静置析晶，过滤得银杏内酯；银杏内酯用10～50倍量的甲醇进行重结晶若干次，析晶温度－10℃～－25℃，过滤结晶、干燥，得银杏内酯B。较现有提取分离方法具有，工艺简单，可靠，经济性好，特别适用于工业生产，对设备要求低，银杏内酯B得率高，达0.04％左右，纯度高，且无污染，安全性好。

Description

静脉给药银杏内酯B及提取方法

技术领域

本发明是对药物原料——银杏内酯B及提取方法的改进，尤其涉及一种纯度高，银杏内酯B含量≥97％，银杏酸含量≤2pmm，白果内酯未检出(蒸发光散射检测)，可直接用于静脉给药的银杏内酯B及提取方法。

背景技术

银杏内酯的药用功能及价值，已被医学界所认可，随着对银杏内酯的深入研究，人们发现各内酯药效各不相同，其中银杏内酯B较其他内酯成份，药理活性最强，故倍受关注。

银杏内酯B的来源可分为人工栽培提取、化学合成和植物细胞培养。化学合成存在空间结构复杂、手性多变，合成非常烦锁，工艺复杂、成本高等不足，目前仍局限于学术价值，尚无生产意义；植物细胞培养，由于技术难度大，生产成本高等原因，目前也无实际生产意义。目前药用银杏内酯B，主要来自人工栽培银杏叶提取。但由于银杏内酯B在银杏叶中含量较低约为0.2％，在银杏提取物(Ginkgo biloba Extract，GBE)中也只有1％～2％。并银杏内酯A、B、C、J等及银杏酸、白果内酯共同存在，且各单体结构又极为相似，极性差异很小，单体分离纯化较为困难。现有技术较多采用传统色普或树脂柱层析分离，不仅对设备要求较高，造成投资成本高，且银杏内酯B有效提取率不够高，而且由于提取方法原因，含有一定量的有毒性的银杏酸和白果内酯，并分离纯度不够高，难以直接应用于静脉给药。所以通常提取银杏内酯B难以直接用于对纯度要求较高的静脉给药，只能作为口服用药原料。而口服给药其药效功能发挥远不如静脉给药高，不能充分发挥银杏内酯B的药效。因此，寻找有效的银杏内酯B提取及纯化方法，使之可直接用于静脉给药，成为银杏开发的重要任务。

中国专利01119824.9介绍了银杏叶提取物系统分离方法，通过加入1-2％抗氧剂水煮提，过聚酰吸附柱，过大孔吸附树脂，用乙酸乙酯萃取三次，得总内酯；上硅胶柱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，得白果内酯和银杏内酯AB；白果内酯重结晶得无色白果内酯，银杏内酯AB经反复重结晶得银杏内酯B。此法报导可分别得到的银杏总黄酮含量＞50％，银杏内酯B含量＞98％，白果内酯含量＞98.5％。但此法，不仅提取分离方法复杂，银杏内酯B收率也不高，只有0.015％，并且含有较高约5ppm左右银杏酸。

中国专利00117758.3公开的从银杏叶或银杏叶浸膏提取银杏内酯A、B的方法，首先采用乙醇、或甲醇、或丙酮、或丁酮、或乙酸乙酯有机溶剂及氯化物盐析剂浸取，对得到银杏内酯A和B的浓缩物，采用制备液相色谱对含有银杏内酯A和B的浓缩物进行分离，得到银杏内酯A和银杏内酯B。用甲醇与水进行重结晶，可得到单酯纯度96左右。此法采用液相色谱分离，生产条件复杂，生产技术要求较高，导致生产成本高，并且未对银杏酸及白果内酯作出定量指标，没有报导可直接用于静脉给药；其次，此法银杏内酯B收率较低，只有0.001％左右。

中国专利200310104958.7介绍的模拟移动床色谱分离提纯银杏内酯B方法，首先采用水煮法获得总黄酮24％、总内酯6％的银杏浸膏；再按每克浸膏粉加入0.8-1.2L乙酸乙酯，在30-35℃下进行液萃取，过滤，滤液减压蒸干得银杏内酯粗提物；再经模拟移动床纯化得混合物；最后，先用乙醇重结晶，冰箱冷冻放置，得银杏总内酯；再用甲醇重结晶，逐渐降温至零下10-18℃，结晶两次，得银杏内酯B。报导可得到纯度为90-95％银杏内酯B，但未报导白果内酯、银杏酸含量，不仅纯度仍然较低，而且制备复杂，未报导可以用于静脉给药。

中国专利200410061284.1公开的从银杏叶中提取银杏内酯B和白果内酯的方法，包括：A、在65-75℃用50-60％乙醇分别提取2-3次，合并提取液，减压浓缩，回收乙醇，加浓缩液1-2倍的水，沉淀、离心，取上清液上吸附柱，先用水冲洗，用75-80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩；B、将浓缩液加入1-2倍水和浓缩液30-40％的乙酸乙酯萃取2-3次，水相液浓缩、65-75℃真空干燥，为银杏黄酮甙产品，萃取分离出的有机相浓缩、干燥、粉碎到90-100目，为银杏内酯；C、加85-95％乙醇，上酸性氧化铝柱，收集流出液，浓缩至固形物25-30％时，停止加热，结晶析出，过滤，再用95％乙醇溶解结晶，重结晶，分离出结晶银杏内酯A，溶液再结晶，为银杏内酯B，用结晶的20-40％的95％乙醇冲洗，抽滤，再用95％乙醇溶解，重结晶，银杏内酯B经三次重结晶；D、将母液加入1-2倍水，在75-80℃蒸去乙醇，冷却，析出结晶，结晶为银杏内酯C，分离出结晶，母液减压蒸干，粉碎90-100目为黄色粉末白果内酯，用结晶的20-40％无水乙醇冲洗白果内酯，抽滤，用95％乙醇溶解，重结晶为白色的白果内酯，再用95％乙醇溶液溶解，再重结晶，白果内酯经三次重结晶。此法虽然报导可以得到纯度95％以上银杏内酯B和白果内酯，但仍未未公开银杏酸白果内酯含量，也没有报导可直接用于静脉给药，并且提取方法复杂，分离采用逐一分离方法，工艺步骤多而复杂。

中国专利200510023164.7公开采用高速逆流色普法(HSCCC)制备高纯度银杏内酯的制备方法，虽然能获得纯度高达99％的各种高纯度酯单体，但采用三个体系，二次分离过程的逐一分离方法，工艺十分复杂，并需借助色普仪，难以在实际生产中应用。

中国专利200510041266.1公开的银杏内酯提取和纯化工艺，按药材重量加数倍量的乙醇或甲醇提取，提取液回收醇后用脱脂溶剂除杂，萃取，再除杂，得粗制品；再用乙醇重结晶，过滤，干燥得银杏内酯精制品，但得到不是银杏内酯B，而是总量92％，银杏内酯B40％以上、银杏酚酸小于百万分之二的混合内酯。

上述众多方法，均存在一定不足，不是未单独分离银杏内酯B，就是不能得到纯度高、银杏酸含量低可直接用于静脉给药的银杏内酯B；能获得纯度较高的银杏内酯B，往往提取、分离工艺复杂，需采用多次分离方法，难以用于实际生产；以及银杏内酯B提取率不高；尤其是大部分工艺都未报导有毒银杏酸含量，因此都未见可直接用于静脉给药报导。

发明内容

本发明的目的在于克服上述已有技术的不足，提供一种纯度高，银杏内酯B含量≥97％，银杏酸≤2ppm，未检出有白果内酯的静脉给药银杏内酯B。

本发明的另一目的在于提供一种获得上述静脉给药银杏内酯B的提取方法。

本发明静脉给药银杏内酯B，其特征是银杏内酯B含量≥97％，银杏酸≤2ppm，白果内酯未检出。

本发明静脉给药银杏内酯B提取分离，包括对银杏叶浸提分离获得银杏内酯，后经甲醇重结晶提纯，其特征在于所说浸提为：用叶干重8～25倍量、浓度为5％-30％乙醇回流提取若干次，过滤分离；将滤液浓缩至原体积的0.02～0.2倍量，加入吸附剂在搅拌状态下充分吸附，过滤，滤饼用3～10倍量乙醇回流提取若干次，合并提取液，浓缩至原体积的0.01～0.2倍量，静置析晶，过滤得银杏内酯；银杏内酯用10～50倍量的甲醇进行重结晶若干次，析晶温度-10℃～-25℃，过滤结晶、干燥，得银杏内酯B。

本发明浸提，一种较好为乙醇水溶液为叶干重的10-20倍；所述乙醇浓度，更好为10％-25％。

本发明中：

选择采用浓度为5％-30％乙醇水溶液浸提，为实验所得，是本发明创新，此浸提液既能尽可能多的得到银杏内酯B(银杏内酯B≥45％)，同时提取液中其他银杏内酯相对低，提高银杏内酯B的得率，又极少带入银杏酸和白果内酯(银杏酸≤5ppm，白果内酯未能检出)，更有利于后续除去。经分别对用10％乙醇提取及50％乙醇提取一次重结晶得到的银杏内酯进行色谱检测，图谱1-4显示表明：采用本发明低浓度10％乙醇提取的银杏内酯，主要为A和B，银杏内酯C含量极少，且银杏内酯B含量(≥50％)高于银杏内酯A(43.3％)，不含白果内酯；而采用50％乙醇提取银杏内酯，不仅银杏内酯B含量有所降低，为30.1％，银杏内酯A较高(54.2％)，并且银杏内酯C含量有所升高，还含有白果内酯。表明：低浓度乙醇对银杏内酯B具有更好的选择性，采用低浓度乙醇提取银杏内酯B优于高浓度醇提取。图谱5-8显示表明：采用本发明低浓度10％乙醇提取的银杏内酯，银杏酸含量较低(4.3ppm)；而采用50％乙醇提取的银杏内酯，银杏酸相对较高(15.4ppm)，约高出4倍左右，即低浓度醇提银杏酸含量大大低于高浓度醇提。图谱表明，本发明获得银杏内酯B提取方法采用低浓度乙醇提取，具有优良的选择性，明显优于高浓度醇，而且更优于水提(内酯水溶解度更低)。

滤液浓缩，与通常中药如银杏叶浸提相似，作用主要是对浸提液中水及乙醇减量。

吸附剂，主要作用是促使提取物一银杏内酯富集，以提高内酯B含量及收得率；搅拌吸附，更有利于滤液中内酯与吸附剂的充分接触，提高吸附富集率；吸附剂可以采用符合中药提取的常用吸附剂，如活性碳、硅藻土、氧化铝等。

甲醇溶解低温(-10℃～-25℃)冷冻重结晶，为本发明方法又一创新，试验表明采用甲醇溶解低温冷冻重结晶，可以提高银杏内酯B的纯度，减少其他杂质含量，经此过程可以获得银杏内酯B含量≥97％、银杏酸≤2ppm、未检出白果内酯的高纯银杏内酯B。图谱9-13显示表明：甲醇-15℃冷冻结晶，所得银杏内酯B含量高达98.5％，银杏酸未检出；而甲醇0℃冷冻结晶，所得银杏内酯B含量仅94.6％。

回流提取及重结晶次数，从理论上讲次数多，提取率及纯度均会提高，试验表明，兼顾利率、纯度及经济性，本发明工艺中重复2-4次就能获得较理想结果，再增加次数提高效果并不明显，因此本发明兼顾经济性和提取率及纯度，认为2-4次较为经济实用。

本发明方法中所用乙醇、甲醇，如未指明浓度，均指市售工业级，例如浓度为95％及以上。

本发明从银杏叶中提取银杏内酯B方法，所得银杏内酯B纯度高，含量≥97％，白果内酯和银杏酸含量极低，银杏酸≤2ppm，白果内酯未检出(蒸发光散射检测)，因而可以直接作为静脉注射或静脉滴注原料药，是本发明银杏内酯B与其他方法所得银杏内酯B的一大区别。采用浓度为5％-30％乙醇水溶液浸提，不仅提取工艺简单，适用于工业生产，而且银杏内酯B含量高，银杏内酯B≥45％，还能降低提取银杏酯中其他不需要杂质的含量，例如银杏酸≤5ppm，白果内酯未能检出，其他银杏内酯较少，有利于获得纯度较高的银杏内酯B；甲醇-10℃～-25℃低温重结晶纯化，选择、分离纯化效果好，方法简单，实用性强，不仅可以获得较高纯度的银杏内酯B，而且此过程又能同时分离去除银杏酸及其他不需要的杂质，单一选择性强，大大提高了所得银杏内酯B的纯度、安全性及有效性。本发明方法简单、可靠，经济性好，银杏内酯B利率高，可达0.04％左右，成本低，特别适合于大规模工业生产，且无污染，对设备要求低，提取、分离成本低。

本发明所得银杏内酯B：

长期毒性试验(见附录)，按公斤体重计算分别相当于人临床最大剂量50倍(犬)和75倍(大鼠)时仍未出现中毒症状，仍然是安全的。

急性毒性试验(见附录)，鼠静脉注射相当于临床用药剂量的1075倍，未出现任何明显的中毒症状，无自主活动和其他精神、神经系统异常，也无动物死亡。尸体解剖巨检未发现组织器官异常，给药组与对照组比较，体重增加无明显差异。

致突变试验(见附录)，三项致突变试验结果表明：在本试验条件和剂量(浓度)范围，注射用银杏内酯无潜在致突变力。

表明本发明银杏内酯B直接用于静脉给药，是安全的；并且药效学试验表明：对治疗心脑血管疾病具有独特疗效。

以下结合几个具体实施例的描述，结合药效学及毒性试验结果，进一步说明本发明，下述实施例仅用于说明本发明，而不应理解为对本发明的限制。

附图说明

图1为银杏内酯A、B混合对照溶液(进样5μl)标准图谱。

图2为银杏内酯A、B混合对照溶液(进样10μl)标准图谱。

图3为10％乙醇提取银杏内酯色谱图。

图4为50％乙醇提取银杏内酯色谱图。

图5为总银杏酸标准色谱图。

图6为总银杏酸标准色谱图(C13：0定位)。

图7为10％乙醇提取总银杏酸图谱。

图8为50％乙醇提取总银杏酸图谱。

图9为银杏内酯B对照溶液(进样5μl)标准图谱。

图10为银杏内酯B对照溶液(进样10μl)标准图谱。

图11为冷冻重结晶(-15℃)银杏内酯B图谱。

图12为重结晶(0℃)银杏内酯B图谱。

图13为冷冻重结晶(-15℃)总银杏酸图谱。

图14为银杏内酯B预处理对TTC染色后各组脑组织梗死染色脑片。

图15为银杏内酯B预处理对脑皮层和海马CA1区组织病理染色图。

具体实施方法

实施例1：取干银杏叶10kg，加入150kg的30％乙醇溶液回流提取二次，每次2小时，提取液砂芯过滤；合并滤液，滤液回收乙醇，浓缩至约25kg，浓缩液加入适量活性碳吸附24小时，并不断搅拌；过滤，滤饼用10kg95％乙醇分次回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇浓缩至约1Kg，静置析晶，滤过得粗品10.5g；再用100g95％甲醇重结晶3次，重结晶温度-12℃，过滤，干燥，得银杏内酯B3.6克。样品检测银杏酸小于2PPM，白果内酯未检出，银杏内酯B纯度97.8％。

实施例2：取干银杏叶10kg，加入150kg的10％乙醇溶液回流提取二次，每次2小时，提取液砂芯过滤；合并提滤液，滤液回收乙醇浓缩至约24kg，浓缩液加入适量活性碳吸附32小时，并不断搅拌；过滤，滤饼用20Kg95％乙醇分次回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇浓缩至约1.5kg，静置析晶，滤过得粗品13.4g；再用粗品300g95％甲醇重结晶3次，重结晶温度-15℃，过滤，干燥，得银杏内酯B4.2克。样品检测银杏酸小于2PPM，白果内酯未检出，银杏内酯B纯度98.5％。

实施例3：取干银杏叶10kg，加入150kg的5％乙醇溶液回流提取二次，每次2小时，提取液砂芯过滤；合并提取液，滤液回收乙醇浓缩至约30kg倍量，浓缩液加入适量活性炭吸附48小时，并不断搅拌；过滤，滤饼用30kg95％乙醇分次回流提取3次，合并乙醇提取液，回收乙醇浓缩至约2.0kg倍量，静置析晶，滤过得粗品11.3g；再用450g95％甲醇重结晶3次，重结晶温度-25℃，过滤，干燥，银杏内酯B3.8克。样品检测银杏酸小于2PPM，白果内酯未检出，银杏内酯B纯度98.4％。

色谱检测说明：

银杏内酯色谱测定，色谱仪：日本岛津公司LC-10ATVP泵，美国奥泰公司ELSD800检测器，色谱柱：Hypersil ODS 5μm大连依利特，流动相：水∶四氢呋南∶正丙醇(690∶300∶10)，流速：1.0ml/min，积分方法：面积外标法。

银杏总酸色谱测定，色谱仪：美国Lab Alliance公司，色谱柱：LichrospherC18 7C柱4.6*250mm 5μm汉邦科技公司，流动相：1％冰醋酸∶甲醇(10∶90)，波长：310mm，柱温：40℃，流速：1.0ml/min，积分方法：面积外标法。

附录：相关试验及结果

本发明静脉给药银杏内酯B药效学试验

一、受试药

1、名称：本发明提取银杏内酯B(银杏内酯B纯度97.4％，银杏酸小于2PPM，白果内酯未检出)

2、受试药制备方法：用氯化钠注射液配制各种浓度的银杏内酯B液，放置冷藏室避光保存。

二、试验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体重250～350g，10～12周龄。用标准颗粒全价饲料饲养，自由饮用清洁水。试验前在实验室内饲养3天，室温：18～22℃，相对湿度60～80％。

三、试剂

1、红四氮唑(2，3，5-Tripheny-2H-Tetrazolium chloride，TTC)，上海化学试剂公司，批号F990930，用1％磷酸盐PBS溶液配制成2％工作液。

2、丙二醛(MDA)测定试剂盒；超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒；蛋白定量试剂盒(TP)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

3、尼莫地平(nimodipine，NIM)，批号：20050218，江苏济川制药有限公司。

4、水合氯醛(choral hydrate)，分析纯，批号：20040420，中国医药集团上海化学试剂公司，用双蒸水配制成10％的溶液。

5、多聚甲醛(paraformaldehyde)，分析纯，批号：031119，上海凌峰化学试剂公司。

四、实验操作

1、动物分组

根据随机、双盲、对照和平行的原则，将大鼠分成如下组：

1、伪手术组；

2、缺血再灌注模型组(溶剂对照)；

3、尼莫地平为阳性药对照药，5mg.kg^-1；

4、银杏内酯B预处理组：银杏内酯B10mg.kg^-1，20mg.kg^-1，40mg.kg^-1。

2、实验程序

大鼠在水合氯醛(300mg/kg，ip)麻醉下，切开颈部皮肤，分离颈外浅静脉，伪手术组和溶剂对照组静脉给予生理盐水，实验组在缺血复灌前1小时股静脉给予银杏内酯B10～40mg/kg，给药体积1ml.kg^-1。

3、大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型

栓塞线制备：将直径2.6mm的尼龙线一端仔细打磨光滑，分别在距顶端18mm、20mm、22mm处做标志。

采用改良Koizumi法制作大脑中动脉阻断(MACO)模型，手术过程中监测肛温，使之保持在37±0.5℃。大鼠用水合氯醛麻醉(300mg/kg，ip)，颈部正中切口，暴露气管和右颈总动脉，在颈内动脉和颈外动脉分支点，从近心端结扎颈总动脉，从分支处分离结扎颈外动脉，距分支处2mm在颈总动脉上剪一小切口，由切口处向颈内动脉放置栓塞线约20mm或遇到阻力后停止。缝合颈部皮肤切口。将未进入血管的栓塞线留置在颈部切口外。缺血2h后将栓塞线向外拔出约10mm，使血流再通22h。伪手术组大鼠除颈内动脉不插栓线外，其它同缺血再灌注模型组。模型组剔除死亡或无神经功能缺失行为的大鼠。

4、神经功能行为学评分

大鼠缺血复灌后，除死亡鼠外，绝大多数鼠已处于清醒状态。按Longa的5分法对大鼠进行神经功能行为学评分，评分标准如下：0分：无神经缺损症状；1分：左前肢不能完全伸直；2分：向左旋转；3分：向左侧倾倒；4分：不能行走或昏迷。

5、梗死区范围测定

再灌注末神经功能行为学评分后，将大鼠断头处死，迅速取脑，将脑置于-20℃环境下(冰箱)保存10min后。将全脑从前向后连续切厚度约2mm的冠状脑片，每脑切5片。将脑片立即放入2％TTC溶液。由于TTC可使正常脑组织呈红色，受损伤脑组织呈白色。脑片在37℃密闭不透光环境下保持15min，后将脑片置于10％甲醛液避光保存，7天取出脑片拍照。根据显色将梗死区脑区和正常脑组织分离，分别称重，计算每鼠脑梗死百分比(梗死区脑组织占全脑重量的百分比)比较给药组(银杏内酯B和尼莫地平)与模型对照组值间统计学差异。

6、脑组织SOD和MDA测定

同前法制备大鼠脑局灶缺血复灌损伤模型，同前分组和给药，复灌结束后将大鼠断头处死，迅速取脑，制作10％脑组织匀浆。按试剂盒说明书用硫代巴比妥酸(TBA)法测定MDA含量，用黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量，双缩脲法测定匀浆中的蛋白浓度。

7、脑病理组织学检查

同前法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。同前分组，每组SD大鼠3只，再灌注末迅速打开大鼠胸腔暴露心脏，将灌流针插入大鼠心尖部，向上到达大鼠升主动脉。用剪刀在右心房处剪一小口。灌注开始后先灌冷生理盐水约200ml左右，相继灌4％的多聚甲醛150～200ml。灌注结束后将脑置于4％的多聚甲醛溶液4℃下保存。取各组大鼠视交叉至漏斗柄冠状切面的脑组织，常规石蜡包埋，做连续切片，切片厚度为5μm。取切片3和7片，常规HE染色，观察药物对缺血复灌引起皮层和海马(主要是CA1区)病理损伤的影响。

8、统计学处理

实验结果用表示，组间比较采用两样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

五、实验结果

1、银杏内酯B预处理对MACO大鼠行为的影响

结果表明：银杏内酯B10mg/kg，20mg/kg和40mg/kg，iv预处理剂量依赖地改善大鼠MACO后神经行为学功能，但仅银杏内酯B40mg/kg组值与溶剂对照组比较差别有统计学意义(P＜0.05，表1)，10和20mg/kg组虽有改善趋势，但与溶剂对照组值比较无统计学意义。尼莫地平5mg/kg，iv预处理也有减少MACO引起的脑功能损伤(p＜0.05)。

表1银杏内酯B对大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤神经功能缺失评分影响。

注：^*为与溶剂对照组比较P＜0.05，

2、银杏内酯B预处理对大鼠脑梗死体积的影响

银杏内酯B10～40mg/kg剂量依赖地减小大鼠局灶性脑缺血2h再灌注22h后的脑梗死体积，其中20mg/kg和40mg/kg组值与模型对照组值比较，差别有统计学意义(P＜0.05)，银杏内酯B10mg似有减小脑梗死体积的作用，但与溶剂对照组比较差别无统计学意义(图14和表2)。

图14 TTC染色脑片说明：梗死区为白色，非梗死区为红色：a伪手术组；b溶剂对照组；c银杏内酯B10mg/kg组；d银杏内酯B20mg/kg组；e银杏内酯B40mg/kg组；f尼莫地平组。

表2银杏内酯B预处理对大鼠脑中动脉缺血复灌损伤引起脑梗死区重量(g)影响

组别	全脑重量	非梗死区	梗死区	梗死区％
					溶剂对照	1.62±0.04	1.08±0.07	0.538±0.05	33±3
银杏内酯B10mg/kg	1.583±0.07	1.116±0.065	0.474±0.06	30.55±3
					银杏内酯B20mg/kg	1.60±0.06	1.11±0.07	0.368±0.05**	21.6±4**
银杏内酯B40mg/kg	1.59±0.07	1.366±0.06**	0.239±0.04**	13.6±3**
					尼莫地平5mg/kg	1.62±0.03	1.185±0.02**	0.428±0.03W	26.2±2**

Expressed as

；^**p＜0.01 compared with vehicle control

3、银杏内酯B预处理对脑MDA含量和SOD活力的影响

银杏内酯B20mg/kg组和40mg/kg组可以增加大鼠局灶性脑缺血2h再灌注22h后的脑组织的SOD活性(P＜0.05)，减少MDA含量(P＜0.05)，且有剂量依赖关系(表3)。

表3银杏内酯B对大鼠脑局灶性缺血再灌注损伤后脑组织MDA和SOD的影响

注：^*为与溶剂对照组比较P＜0.05；#为与伪手术组比较P＜0.05，

4、银杏内酯B预处理大脑皮层和海马CA1区神经元病理学改变的影响

组织病理学结果表明：伪手术组大鼠皮层和海马CA1区神经元排列整齐，层次清楚，无细胞坏死，无炎性细胞浸润；模型对照组该脑区神经元数量明显减少，排列紊乱，大量坏死细胞，神经元胞体肿胀，核深染、固缩、碎裂或溶解消失，炎性细胞(主要为中性粒细胞)浸润明显，细胞间质稀疏；银杏内酯B10mg/kg组与溶剂对照组相似，有较多的坏死细胞，呈片状或灶状分布，细胞排列层次消失，组织水肿明显；银杏内酯B20mg/kg和银杏内酯B40mg/kg以及尼莫地平组组病变轻微，可见点状坏死，轻度水肿，神经元数量多于溶剂对照组但少于伪手术组(见图15)。由图15各组脑组织CA1区和皮层HE染色显示，银杏内酯B预处理可以减轻脑组织缺血再灌注后病理损伤。

图15说明：大鼠皮层和海马CA1区病理学观察，HE染色，200倍视野：a1伪手术组皮层；a2伪手术组海马；b1溶剂对照组皮层；b2溶剂对照组海马；c1银杏内酯B10mg组海马；c2银杏内酯B10mg组皮层；d1银杏内酯B20mg组海马；d2银杏内酯B20mg组皮层；e1银杏内酯B40mg组海马；e2银杏内酯B40mg组皮层；f1尼莫地平组海马；f2尼莫地平组皮层。

六、结论

本实验证实：静脉给药用银杏内酯B10-40mg/kg静注剂量，依赖降低大鼠脑膜中动脉缺血复灌引起的梗死体积，增加缺血区的SOD，降低MDA水平，减少缺血复灌引起的皮层和海马CA1区损伤。表明：静脉给药用银杏内酯B有抗大鼠局灶性脑缺血损伤作用，表明本品对治疗心脑血管疾病具有独特疗效。

本发明静脉给药银杏内酯B长期毒性试验

一、研究目的

通过比格犬和大鼠静脉注射银杏内酯B13周慢性毒性试验，观察过量药物可能引起的不良反应，包括不良反应的性质、程度等；推测银杏内酯B重复静脉给药的临床毒性靶器官或靶组织。

二、受试药

1.本发明制取的银杏内酯B；

2.溶剂：氯化钠注射液  规格：4.5g/500mL 批号：0512196，生产单位：扬州中宝制药有限公司；

3.受试药制备方法  用氯化钠注射液配制注射用银杏内酯B液，溶液放置在冷藏室避光保存。

三、试验动物

犬：6月龄Beagle犬12只，雌性体重5-6.5kg，雄性7-8.5kg，两组(高剂量组和溶剂对照组)，每组雌雄各3只，共12只。由南京安立默科技有限公司提供。

大鼠：6周龄SD大鼠：4组，每组雌雄各10只，每笼同性别5只。实验开始时雌鼠体重70-90g，雄鼠80-110g，由南京江宁青龙山动物繁殖场提供，动物质量合格证号SCXK(苏)2002-0018。

四、给药途径静脉注射(bolus)犬前臂静脉，大鼠胃静脉

五、给药体积与给药速度犬2.0mL/kg/min，大鼠：1.0mL/kg/min

六、给药期限13周

七、给药剂量选择

犬：银杏内酯B100mg/kg；大鼠：125mg/kg，50mg/kg，20mg/kg，用等体积生理盐水做溶剂对照，每日一次，每周6天。

八、观察指标

1.一般状况观察

在给药期间每日一次观察犬和大鼠外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便形状、摄食量、给药局部反应。体重每周一次。

2.血液学指标

红细胞计数、血红蛋白、红细胞容积、平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白、平均红细胞血红蛋白浓度、白细胞计数及其分类、血小板计数、网织红细胞计数、凝血酶原时间等。

3.血液生化学指标

天门冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、γ谷氨酰转移酶、尿素氮、肌酐、白蛋白、总蛋白、总胆红素、血糖、总胆固醇、甘油三酯、钠离子浓度、钾离子浓度、氯离子浓度、肌酸磷酸激酶。

4.尿检查(仅犬)

尿液外观、比重、pH、尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、酮体、潜血、白细胞。

5.系统尸解和组织病理学检查

5.1系统尸体解剖

试验期间及时观察症状，及时发现濒死动物，进行病理学检查。试验结束活杀所有存活犬，收集血标本后，认真仔细检查器官，发现病理改变及时记录，按指导原则要求测定脏器重量，并将应检查的标本送病理教研室做病理学检查。

5.2脏器系数

对心、脑、肝、肾、脾、肾上腺、胸腺、肺、睾丸、附睾、卵巢和子宫等脏器进行称重，并计算脏器系数。

5.3组织病理学检查

检查的脏器和组织包括：心、肝、脾、肺、肾、脑、食管、胃、小肠、大肠、垂体、脊髓、骨髓、淋巴结、膀胱、睾丸、附睾、子宫、卵巢、胸腺、肾上腺、视神经(犬)、甲状腺、甲状旁腺、唾液腺、胆囊(犬)、胰腺、气管、主动脉、前列腺、乳腺、坐骨神经、眼(犬)及给药局部组织等。

6.观察指标的时间和次数

临床症状每日一次，及时发现记录，体重每周一次，进食量(大鼠)每周一次。

试验开始前和结束后进行犬的血液学检查，血液生化和尿常规检查，大鼠在实验结束日活杀前采血进行血液学、血液生化检查。

试验结束后进行尸体解剖和病理学检查。

眼科检查：犬药前和活杀前，检查瞳孔大小，对光反射，眼睑和结膜有无充血，溃疡。

心电图：犬给药前和给药结束后各进行一次。

九、结果

(一)犬

1)临床症状

犬：银杏内酯B组犬给药后，与对照组比，一般情况良好，无行为异常，未见呼吸频率和幅度改变，体重增加与对照组无明显差异，粪便黄成形。给药局部无红肿、溃烂和硬结等局部血管刺激症状。

2)死亡  对照组与给药组犬和大鼠在试验13周内均未出现死亡

3)体重  犬：未见与给药有关改变，0～13周体重变化详见表4

4)食物消耗  犬由动物中心统一饲养，每日早晚各一次供食和水，而给药在早上给食前进行，每日检查未发现有剩余食物。

5)眼科检查  观察期间未见瞳孔、结膜和巩膜与给药有关的变化。

6)ECG；未见与给药有关的变化(心率和心电图指标)，给药前和给药后犬心电图，给药组与对照组比较，P波，PR间期，QRS波，T波，ST段均未发现异常，均未出现心律失常。

表4犬静脉注射银杏内酯B100mg/kg/d，13周体重变化

7)血液学  溶剂对照组和银杏内酯B组犬主要血液学指标变化，见表5-1.表5-2

与对照组比较，各项血液学指标未出现与给药有关的异常，血液学指标中对照组雌雄各有2犬的白细胞计数低于4×10⁹/L，但无统计学意义的差异，其余血液学指标给药组与溶剂对照组比较均无明显差异。

表5-1犬静脉注射银杏内酯B100mg/kg.13周对血液学指标影响(药前基础值)

表5-2犬银杏内酯B100mg/kg.iv，13周后主要血液学指标

8)临床化学  给药前对照组与给药组各项血液生化指标，无明显差异。静脉注射银杏内酯B雌雄犬药后血清总蛋白、白蛋白、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和谷氨酰氨基转肽酶似有增加，但与溶剂对照组值比较差异无统计学意义，其他变化轻微和零星，不认为有意义。见表6-1，6-2。

9)尿检查  未见与给药有关的变化

10)器官重量

银杏内酯B组雌犬心、肝、肾、脾脏器重量和脏器系数稍高于对照组值(P＜0.05)。雄犬脏器重量与脏器系数与对照组比较，差异无统计学意义。详见表7

表6-1犬银杏内酯B100mg/kg，静脉注射13周对血液生化指标的影响---药前血液生化基础值

表6--2犬银杏内酯B100m/kg静脉注射13周后对血液生化指标的影响

^*与对照比较有统计学意义的差异

11)巨检  未见与给药有关的变化，但某些器官的脏器重量和系数银杏内酯B组与对照组比较差异有显著性意义。

12)镜检  未见与给药有关异常，详见病理报告。

13)体温  详见表8

14)注射部位  肉眼和显微镜下检查未见明显血管刺激症状。

表7-1雌性犬静脉注射银杏内酯B100mg/kg 13周对脏器重量及脏器系数的影响

^*P＜0.05与溶剂对照组比较

表7--2雄性犬静脉注射银杏内酯B100mg/kg对脏器重量及脏器系数的影响

(二)大鼠13周长期静脉注射银杏内酯毒理学研究结果

1.一般情况大鼠：静注银杏内酯B后，三个剂量组(20，50和125mg/kg)与对照组比较，未见精神和行为异常，进食量与体重变化与对照鼠比较，无明显差异。

2.死亡  本试验观察期间所有大鼠包括溶剂对照组和低、中和高剂量组雌雄大鼠均存活到观察期结束。

3.体重  雌雄大鼠连续静注银杏内酯B前、后每周体重变化和试验结束时体重，与对照组比较差异无统计学意义，提示银杏内酯B静注不影响大鼠体重增加。见表9

表8犬静脉注射银杏内酯B对犬体温的影响

表9-1雄性大鼠银杏内酯B三个月静脉注射体重变化

4.血液学检查

结果表明：雌雄大鼠银杏内酯B125mg/kg，iv连续13周对各项血液学指标，无明显影响，给药组与溶剂对照组间各对应值比较，差异无显著性意义，即未发现与给药有关的改变。见表10

表9-2雌性大鼠银杏内酯B三个月静脉注射体重变化

表10雌雄SD大鼠静注银杏内酯B125mg/kg，13周对血液学指标的影响

5.对凝血的影响

雌雄大鼠银杏内酯B125mg/kg，iv连续13周对凝血指标(出凝血时间和前凝血酶原时间)，无与给药有关的明显影响，

6.血液生化指标的影响

结果表明：雌雄大鼠银杏内酯B125mg/kg，iv连续13周对各项血液生化指标，无明显影响，给药组与溶剂对照组间各对应值比较，差异无显著性意义，即未发现与给药有关的改变。见表11。

表11雌雄SD大鼠静注银杏内酯B125mg/kg，3个月对血液生化指标的影响

7.器官重量

结果表明：雌雄大鼠银杏内酯B125mg/kg，iv连续13周给药对脏器重量无明显的与给药有关影响，给药组与溶剂对照组间各对应值比较，差异无显著性意义，即未发现与给药有关的改变。见表12

表12大鼠长期银杏内酯B125mg/kg静脉注射对脏器重量的影响

8.大鼠长期银杏内酯B125mg/kg静脉注射对脏器系数的影响

结果表明：雌雄大鼠银杏内酯B125mg/kg，iv连续3个月对脏器系数无明显影响，给药组与溶剂对照组间各对应值比较，差异无显著性意义，即未发现与给药有关的改变。见表13

9.病理学检查

银杏内酯B125mg/kg静注13周后雌雄大鼠病理学检查结果表明未发现与给药有关的病理学改变。

10.注射部位肉眼检查犬注射部位，未发现给药血管出现静脉炎样的改变。

表13大鼠长期银杏内酯B125mg/kg静脉注射对脏器系数的影响

十、结果评价

本试验结果表明：比格犬静脉注射银杏内酯B100mg/kg，大鼠银杏内酯B20mg/kg，50mg/kg和125mg/kg，连续13周静脉注射，给药期间犬和大鼠均未出现与给药有关的生长、行为、精神、体重、食物消耗、血液学和血凝、血液生化、尿常规检查等异常，病理学肉眼和显微镜观察也未发现内脏结构组织形态等方面的改变，不能确定毒性靶器官。脏器系数等与对照组比较各项指标差异无统计学意义(P＞0.05)，由于药物溶解性和给药体积的限制，本试验按公斤体重计算该剂量分别相当于人临床最大剂量50倍(犬)和75倍(大鼠)时仍未出现中毒症状，仍然是安全的。

本发明静脉给药银杏内酯B急性毒性试验

一、试验目的

按拟临床给药途径(灌胃)进行急性毒性反应的观察，以对银杏内酯B安全性进行临床前评价。

二、受试物

(1)名称：本发明制取的银杏内酯B，室温保存；

(2)溶媒和/或辅料：吐温-80(国药集团化学试剂有限公司)，无水乙醇(上海试剂一厂，批号：050701)。

三、实验动物

健康成年小鼠SPF级，体重18～22g；雌雄各半，每笼5只。南京军区总院提供，合格证号：SCXK：2003-0004

四、试验方法

4.1预试验

预试验分组和剂量设计：本预试验采取霍恩氏Horn法，剂量从10g/kg开始，4.64g/kg，2.15g/kg和1.0g/kg，每组雌雄各2只。观察24小时内动物死亡数。

预实验拟用无水乙醇溶解，吐温-80助溶银杏内酯B后，再用生理盐水稀释。小鼠静脉给药和小鼠灌胃体积分别为10ml/kg和20mL/kg。由于受试药溶解限制，本试验用11.75％银杏内酯B溶液。静脉和灌胃给药体积均为20mL，但给药分两次(上午8:00和下午4:00)，预试验给药剂量分别为2.15g/kg/d，1.00g/kg/d和0.64g/kg/d。结果表明小鼠银杏内酯B给药后7天内受试药组与赋形剂组均无一小鼠死亡。小鼠进食、精神和神经活动，粪便均未见异常。由于溶解性和给药体积限制，本试验拟用最大给药剂量作为急性毒性试验的评价指标。

4.2正式试验

4.2.1动物来源和饲养条件同上，18-22g昆明小鼠40只，雌雄各半。

4.2.2剂量2150mg/kg(iv)，4300mg/kg(ig)

4.2.3给药途径

本受试物为注射剂，故试验采取静脉注射(iv)和灌胃(ig)给药。给药时间上午8:00和下午4:00。经口给药时禁食16小时但不禁水。

4.2.4给药容量  尾静脉注射(bolus)：10ml/kg(0.1ml/10g/次，2次/日)；

灌胃：20mL/kg(0.2mL/10g/次，2次/日)

4.2.5观察期限  14天，如果毒性反应出现较慢，应适当延长观察时间。

4.2.6观察指标

包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌物、排泄物、死亡情况及中毒反应(中毒反应的症状、严重程度、起始时间、持续时间、是否可逆)等。对濒死及死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后进行大体解剖，当发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官进行组织病理学检查。

4.2.7结果

在观察期14天内，小鼠静脉注射银杏内酯B2150mg/kg和灌胃4300mg/kg均未出现明显毒性反应，给药后动物自发活动减少，但2小时后恢复正常，所有鼠存活到观察期结束。体重增加受试药组和溶剂对照组之间无明显差异。观察期结束后尸体解剖肉眼观察未发现重要脏器出现异常改变。见表14

表14银杏内酯B静脉2150mg/kg或灌胃4300mg/kg药前和药后体重变化  n＝20

五、结果分析

本试验结果表明：小鼠银杏内酯B一次静脉注射2.15g/kg(相当于临床用药剂量的1075倍)和4.3g/kg灌胃后14天内，未出现任何明显的中毒症状，无自主活动和其他精神、神经系统异常，也无动物死亡。观察期结束后尸体解剖巨检未发现组织器官异常，给药组与对照组比较，体重增加无明显差异。

本发明静脉给药银杏内酯B致突变试验

一、试验目的

评价“静脉给药银杏内酯B”的可能存在的遗传毒性和潜在致癌作用的可能性，为临床研究和安全用药提供信息。

二、受试药  本发明制取的银杏内酯B

三、试验内容

3.1体外鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验

3.2体内哺乳动物骨髓多染红细胞微核试验

3.3中国仓鼠肺细胞(CHL)染色体畸变试验

四、组胺酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验

4.1银杏内酯B组胺酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)，结果表明：在5个试验剂量组4个菌株(TA98，TA100，TA102，TA97)，无论是否S₉活化系统存在，银杏内酯B的Ames试验均为阴性结果。

4.2溶剂：DMSO  规格500mL/瓶  批号20021109(中国医药集团)氯化钠注射液  规格4.5g∶500mL  生产单位：扬州中宝制药有限公司

4.3受试药制备：用DMSO将银杏内酯B配制成0.5、1.5、5.0、15和50mg/ml共5个浓度，避光冷存。

4.4对照品

4.4.1阳性对照药：阿的平，对硝基喹啉，甲基甲烷磺酸酯，2-氨基芴，1，8-二羟基蒽醌。

4.4.2溶剂对照：DMSO(色谱纯)。

4.4.3空白对照：不加受试物和溶剂。

4.5菌株

4.5.1试验菌株名称：组胺酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)，四株菌株为TA₉₇、TA₉₈、TA₁₀₀、TA₁₀₂。

4.5.2来源及保存：美国加利福利亚大学生物化学系提供，液氮冻存。

4.5.3菌株鉴定：正式试验前，进行试验菌株基因型鉴定(组胺酸营养缺陷型鉴定、深度粗糙型鉴定、R因子鉴定及ΔuvrB鉴定)及自发回复数鉴定，试验用菌株生物学特性符合要求，测试用菌液浓度为1-2×10⁹/ml。

4.6代谢活化系统

哺乳动物肝微粒体酶(S₉)活化系统：上海市疾病预防控制中心提供，按Lowry方法测得蛋白质含量为35mg/ml。液氮保存。

4.7剂量及选择理由

剂量设置：银杏内酯B能溶于DMSO，经预试后，设剂量级5个，分别为0.05、0.15、0.5、1.5、5.0mg/皿。

4.8试验方法

操作步骤：将鉴定合格的菌株进行实验。采用标准平皿参入法，设0.05、0.15、0.5、1.5和5.0mg/皿等5个系列剂量组，每个剂量组4个菌株，试验分活化试验(+S₉)和非活化试验(-S₉)，同时设相应的阳性和阴性对照组。各剂量组和对照组均做3块平皿，48小时观察结果。并重复一次。

4.9结果判定

4.9.1受试物所诱发的回复突变菌落数增加，超过溶剂对照组的2倍，有剂量反应关系；

4.9.2某测试点超过对照2倍，需呈现重复性，并有统计学意义。

符合上述之一者，即可判为Ames试验阳性，否则为阴性。

4.10结果

银杏内酯B自0.05、0.15、0.5、1.5、5.0mg/皿，不论加入S₉或不加入S₉对TA₉₇、TA₉₈、TA₁₀₀及TA₁₀₂ 4个菌株的回复突变菌落数，均未超过自发回复突变数的2倍；各阳性对照化合物组，均呈超过2倍的阳性反应。重复试验结果一致。提示银杏内酯B对组胺酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)无诱发回变作用。见表15。

表15银杏内酯B Ames试验结果(6皿均值±标准差)

表中结果为两次重复实验结果的均值。

^*阳性物：不加用S₉：TA₉₇ 500μg/皿阿的平；TA₉₈ 200μg/皿对硝基喹啉；TA₁₀₀及TA₁₀₂1μl/皿甲基甲烷磺酸酯；加用S₉：TA₉₇、TA₉₈、TA₁₀₀ 10μg/皿2-氨基芴，TA₁₀₂ 500μg/皿1，8-二羟基蒽醌。

各实验组4个菌株加与不加S₉活化系统回变菌落均数均为超过阴性对照回变菌落数的2倍，故可认为银杏内酯B的Ames实验为阴性结果。

五、小鼠骨髓细胞微核试验和中国仓鼠肺细胞染色体畸变试验

5.1.受试药配制：因银杏内酯B难溶于水，易溶于DMSO。

精确称量银杏内酯B以DMSO溶解供细胞染色体畸变试验用。

用0.5％羧甲基纤维素(CM纤维素钠盐300-800)化学纯，批号F20040419，国药集团化学试剂有限公司)制成所需浓度的混悬液供小鼠骨髓细胞微核试验用。

5.2.对照品

5.2.1.阳性对照品：

5.2.1.1微核试验：环磷酰胺。

5.2.1.2中国仓鼠肺细胞(CHL)染色体畸变试验：丝裂霉素C，环磷酰胺。

5.2.1.3空白对照品：DMSO。

5.3小鼠骨髓细胞微核试验

5.3.1动物

性成熟昆明种小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司(中国科学院上海实验动物中心)提供。生产许可证号：SCXK(沪)2003-0003；动物使用许可证号：SYXK(苏)2002-0130。

5.3.2剂量及选择理由

剂量设置：剂量级3个：分别为1.08、0.54、0.27g/Kg.bw

5.3.3给药途径  经口灌胃。

5.3.4方法

5.3.4.1操作步骤：

经预试后确定采样时间为给药后30小时。选择体重18-24克的昆明种小鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。试验组分别以1/2、1/4和1/8LD₅₀三个剂量经口灌胃给药，阴性对照用等体积的0.5％羧甲基纤维素，阳性对照用40mg/Kg.bw的环磷酰胺腹腔注射，全部动物给药两次，于第二次给药后6h后处死动物。取胸骨常规制片，Giemsa染色，光学显微镜下每只动物观察1000个嗜多染红细胞，计算微核细胞的千分率。

5.3.4.2.结果判别标准：

a.受试物所诱发的微核率的增加，有剂量反应关系；

b.某测试点微核增加呈现重复性，并有统计学意义。

符合上述之一者，即可判为微核试验阳性，否则为阴性。

5.4结果

试验结果：小鼠骨髓细胞微核试验结果。见表16

表16银杏内酯B小鼠经口给药骨髓细胞微核试验结果

^*与阴性对照组比P＜0.001

由表16可见：银内B高、中、低三个剂量组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核发生率与阴性对照组相比较均无显著性差异(P＞0.05)，阳性对照组与阴性对照组比，则有明显差异(P＜0.001)。

5.5结论

银杏内酯B在本实验条件下不能引起小鼠骨髓细胞微核率升高。提示银杏内酯B不引起小鼠体细胞发生突变。

六、CHL细胞染色体畸变试验

6.1细胞  中国仓鼠肺细胞(CHL细胞)。

6.3剂量及选择理由

剂量设置：经预试验在药物的最大溶解度(10.00mg/ml)下，细胞存活率大于90％，所以设3个剂量级：分别为10.0、5.0、2.5mg/ml。另设阳性对照和阴性对照组。直接阳性为丝裂霉素C 0.2μg/mL培养液，间接阳性为环磷酰胺20μg/mL培养液，直接阴性为DMSO 0.1ml/L培养液，间接阴性为50ml肝微粒体酶/L培养液。

6.4方法

6.4.1.操作步骤：

细胞置37℃培养液中培养3d，分别加入不同剂量的银内B作用48h，在最大溶解度(10.00mg/ml)下细胞存活率大于90％，故以10.00mg/ml为染色体畸变试验的最高剂量。

正式试验时，在不加肝脏微粒体酶(S₉)时，处理24h后收获细胞。在加S₉₉混合物时，药物处理6h后，洗去S₉混合物和药物，再培养18h收获细胞，在收获细胞前2h加入秋水仙素，剂量为0.2μg/ml，按常规方法制备染色体，然后染色，镜检。重复上述试验，观察结果是否一致。

每一剂量观察100个中期分裂相细胞的染色体畸变数，记录间隙(g)，断裂(b)，交换(t)，环状(r)，多倍体(p)5种类型畸变(其中g不计入总的畸变率)，以百分率表示。

6.5结果判别标准：

畸变率  ＜5％   阴性    (-)

畸变率  ＞5％   可疑    (±)

畸变率  ＞10％  阳性    (+)

畸变率  ＞20％  强阳性  (++)

某一测试点呈现可重复的并有统计学意义的增加；符合上述一条即可判为阳性。

6.6结果

CHL细胞染色体畸变试验结果。见表17

表17银杏内酯B对CHL细胞染色体结构的影响

^**和阴性对照组比较P＜0.01

从表17可知：银杏内酯B高、中、低三个剂量组，无论加与不加活化系统，CHL细胞染色体畸变率均＜5％。而阳性对照组加与不加活化系统，CHL细胞染色体畸变率则分别高达28％和29％、30％。显示银杏内酯B不引起CHL细胞染色体结构异常。

6.7结论

银杏内酯B鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验结果表明，无论是否存在S9代谢激活物都无致突变作用。注射用银银杏内酯B，小鼠骨髓细胞微核试验和中国仓鼠肺细胞(CHL)染色体畸变试验结果表明：在本试验条件下，注射用银杏内酯B不诱发小鼠骨髓细胞微核增加；也不诱发CHL细胞染色体出现畸变。三项致突变试验的结果表明：在本试验条件和剂量(浓度)范围，注射用银杏内酯无潜在致突变力。

Claims (4)

1.静脉给药银杏内酯B，其特征是银杏内酯B含量≥97％，银杏酸≤2ppm，白果内酯未检出。

2.根据权利要求1所述静脉给药银杏内酯B提取方法，包括对银杏叶浸提分离获得银杏内酯，后经甲醇重结晶提纯，其特征在于所说浸提为：用叶干重8～25倍量、浓度为5％-30％乙醇回流提取若干次，过滤分离；将滤液浓缩至原体积的0.02～0.2倍量，加入吸附剂在搅拌状态下充分吸附，过滤，滤饼用3～10倍量乙醇回流提取若干次，合并提取液，浓缩至原体积的0.01～0.2倍量，静置析晶，过滤得银杏内酯；银杏内酯用10～50倍量的甲醇进行重结晶若干次，析晶温度-10℃～-25℃，过滤结晶、干燥，得银杏内酯B。

3.根据权利要求2所述静脉给药银杏内酯B提取方法，其特征在于所说乙醇水溶液为叶干重的10-20倍。

4.根据权利要求2所述静脉给药银杏内酯B提取方法，其特征在于所说所述乙醇浓度为10％-25％。

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