CN101171343A - 含有假异胞嘧啶核碱基衍生物的3’修饰寡核苷酸及其作为引物或探针的应用 - Google Patents
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Abstract
文中披露了在其3’末端区域含有某些修饰核碱基的引物及其各种用法，所述引物能减少扩增反应期间形成的引物－二聚体。
Description
本发明涉及核酸扩增，例如应用于聚合酶链式反应(PCR)的化合物和方法。
检测是否存在靶核酸在各种领域中起着重要作用，包括：医学诊断、法医学和遗传分析。PCR是核酸扩增方法的例子之一，其提供的高度灵敏方法通过选择性扩增靶核酸序列来检测是否存在靶核酸。
核酸扩增，例如PCR的重要问题是会产生非特异性扩增产物。会在PCR反应中造成问题的非特异性扩增过程的例子之一是“引物-二聚体”扩增。例如，当引物的3’末端区域与其自身或另一引物有一定程度互补时，会导致引物-二聚体扩增。这些引物能彼此杂交形成引物-二聚体。然后，引物-二聚体的扩增会产生引物-二聚体扩增子，进而用作进一步扩增的模板。这种过程的后果之一是消耗了引物，从而导致灵敏度降低或者甚至不能扩增所需的靶核酸。
熟知在PCR反应期间加入过量的引物使得甚至3’末端区域的弱互补性亦会产生引物-二聚体扩增子，从而使该问题愈加复杂。因此，需要开发能抑制扩增反应，例如PCR中引物-二聚体形成的试剂和方法。
本文出乎意料地发现在引物的3’末端区域掺入某些修饰的核碱基(nucleobase)对扩增反应期间的引物-二聚体扩增子形成有有益影响。
在一些实施方式中，本发明提供的多核苷酸在离该多核苷酸3’末端不超过4个核苷酸处含有至少一个嘧啶核碱基，其中所述修饰的嘧啶核碱基具有以下结构：
其中R选自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基、C3-C10芳基醚、C3-C10取代的芳基醚、-CF3、胺、取代的胺、C3-C6环状烷基、C3-C6取代的环状烷基、苯基、取代的苯基和杂芳基。
在一些实施方式中，R可以是-H。在一些实施方式中，R可以是C1-C6烷基。在一些实施方式中，R可以是C1-C6取代的烷基。在一些实施方式中，R可以是C3-C10芳基。在一些实施方式中，R可以是C3-C10取代的芳基。在一些实施方式中，R可以是-CF3。在一些实施方式中，R可以是氨基。在一些实施方式中，R可以是取代的氨基。在一些实施方式中，R可以是C3-C6环状烷基。在一些实施方式中，R可以是C3-C6取代的环状烷基。在一些实施方式中，R可以是苯基。在一些实施方式中，R可以是取代的苯基。在一些实施方式中，R可以是杂芳基。在一些实施方式中，R可以是氰基。在一些实施方式中，R可以是硝基。
在一些实施方式中，所述至少一个修饰的嘧啶核碱基离多核苷酸3’末端不超过3个核苷酸。在一些实施方式中，所述至少一个修饰的嘧啶核碱基离多核苷酸3’末端不超过2个核苷酸。在一些实施方式中，所述至少一个修饰的嘧啶核碱基是多核苷酸的3’末端核苷酸。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸可以是引物。在一些实施方式中，本发明多核苷酸在3’-末端可延长。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸可包含可检测标记、猝灭剂或小沟结合剂中至少一个。在一些实施方式中，本发明多核苷酸可用作探针。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括将多核苷酸引物与变性DNA模板退火，从而使该多核苷酸引物与该变性DNA模板一条链上的互补多核苷酸序列退火以形成引物-模板复合物；和延伸该引物-模板复合物的引物部分以形成双链扩增子，其中所述多核苷酸引物是本发明引物。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，包括在延伸步骤后使双链扩增子变性。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少1次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少10次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少20次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少30次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少40次。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，其中所述延伸在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下发生从而形成DNA扩增子片段。在一些实施方式中，引物延伸方法包括检测DNA扩增子片段。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，包括：i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物与变性DNA模板的第一和第二链退火，使得该第一多核苷酸引物与该变性DNA模板第一链的互补寡核苷酸序列退火，该第二多核苷酸引物与该变性DNA模板第二链的互补寡核苷酸序列退火，从而形成第一和第二引物-模板复合物，和ii)延伸该第一和第二引物-模板复合物中至少一个的引物部分以形成双链DNA扩增子，其中该第一多核苷酸引物或该第二多核苷酸引物中至少一个可以是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括先形成包含第一多核苷酸引物、第二多核苷酸引物、DNA模板和其它引物延伸试剂的混合物，再进行退火步骤。在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括在形成(混合物)步骤之后但在退火步骤之前使DNA模板变性，从而形成变性DNA模板和第二变性DNA模板的第一链。在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括先进行延伸步骤，再使双链DNA扩增子变性。
在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤1-100次。可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤1-50次。应该知道，本发明包括重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤1-100次之间所有可能的范围。即，重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤可以重复1次，最多100次以及中间的任何次数。例如，1-10的范围应理解为包括使用1-10之间所有整数，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的所有可能范围。在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤超过1次。在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤超过10次。在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤超过20次。在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤超过30次。在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤超过40次。在一些实施方式中，可任选重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤超过50次。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括先使多核苷酸探针与变性DNA模板的第一或第二链退火，从而使该多核苷酸探针与该变性DNA模板第一链的互补多核苷酸序列退火和/或使该多核苷酸探针与该变性DNA模板第二链的互补寡核苷酸序列退火，再进行延伸引物部分的步骤。在一些实施方式中，该多核苷酸探针包含至少一个可检测标记。在一些实施方式中，该多核苷酸探针还包含猝灭剂、小沟结合剂中的至少一个或二者。在一些实施方式中，该多核苷酸探针可以是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供连接寡核苷酸的方法，包括：i)形成包含与DNA模板退火的第一和第二多核苷酸链的复合物，从而使该第一多核苷酸链与该变性DNA模板链的第一互补多核苷酸序列退火和使该第二多核苷酸链与该变性DNA模板链的第二互补多核苷酸序列退火，其中该变性DNA模板链的第二互补多核苷酸序列位于该变性DNA模板链的第一互补多核苷酸序列的5’端，和ii)在该第一和第二多核苷酸链之间形成稳定的共价键，其中该第一多核苷酸链或第二多核苷酸链中至少一个是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供检测靶多核苷酸序列的方法，包括：(a)使靶多核苷酸链与第一探针对反应，所述第一探针对包含(i)含有与该靶链中第一靶区域互补的序列的第一多核苷酸探针和(ii)含有与该靶链中第二靶区域互补的序列的第二多核苷酸探针，其中该第二区域位于该第一区域的5’端并与该第一区域至少有一个核苷酸碱基重叠，该反应在能使该第一和第二探针分别与该靶链中第一和第二区域杂交以形成第一杂交复合物的有效条件下进行，(b)切割该第一杂交复合物中的第二探针以形成含有该靶链、该第一探针和该第二探针的第一片段的第二杂交复合物，其中该第二探针的第一片段的5’末端核苷酸紧邻该第一探针的3’末端核苷酸，(c)连接该第一探针与该第二探针的杂交片段以形成与该靶链杂交的第一连接链，(d)使该第一连接链变性(脱离)该靶链，和(e)再进行一轮或多轮步骤(a)-(d)，只要在最后一轮中可任选省去步骤(d)，其中该第一探针、该第二探针中至少一个或二者是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，至少一个所述修饰的嘌呤核碱基离该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者的3’末端不超过2个核苷酸。在一些实施方式中，至少一个所述修饰的嘌呤核碱基离该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者的3’末端不超过1个核苷酸。在一些实施方式中，修饰的嘌呤核碱基是该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者的3’末端核苷酸。
在一些实施方式中，该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者含有可检测标记、猝灭剂或小沟结合剂中至少一种或它们的任何组合。在一些实施方式中，该第一区域与该第二区域有一个核苷酸碱基重叠。在一些实施方式中，该第一探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第一探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。在一些实施方式中，该第二探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第二探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。在一些实施方式中，该第二探针的3’端以除核苷酸3’羟基以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第二探针的3’端以核苷酸3’磷酸基团结尾。
在一些实施方式中，本发明提供检测靶多核苷酸序列的方法，包括：(a)使靶互补链与第二探针对反应，所述第二探针对包含(i)含有与该靶互补链中第一区域互补的序列的第三多核苷酸探针和(ii)含有与该靶互补链中第二区域互补的序列的第四多核苷酸探针，其中该第二区域位于该第一区域的5’端并与该第一区域至少有一个核苷酸碱基重叠，该反应在能使该第三和第四探针分别与该靶互补链中第一和第二区域杂交以形成第三杂交复合物的有效条件下进行，(b)切割该第二杂交复合物中的第四探针以形成含有该靶互补链、该第三探针和该第四探针的第一片段的第四杂交复合物，其中该第四探针的第一片段的5’末端核苷酸紧邻该第三探针的3’末端核苷酸，(c)连接该第三探针与该第四探针的杂交片段以形成与该靶互补链杂交的第二连接链，(d)使该第二连接链变性(脱离)该靶互补链，和(e)再进行一轮或多轮步骤(a)-(d)，只要在最后一轮中可任选省去步骤(d)。在一些实施方式中，该第三探针或该第四探针中至少一个或二者是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，至少一个所述修饰的嘌呤核碱基离该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者的3’末端不超过2个核苷酸。在一些实施方式中，至少一个所述修饰的嘌呤核碱基离该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者的3’末端不超过1个核苷酸。在一些实施方式中，所述修饰的嘌呤核碱基是该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者的3’末端核苷酸。在一些实施方式中，该第一多核苷酸探针、该第二多核苷酸探针或二者可含有可检测标记、猝灭剂或小沟结合剂中至少一种或它们的任何组合。在一些实施方式中，该第三探针的5’端任选以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第三探针的5’端任选以核苷酸5’羟基结尾。在一些实施方式中，该第四探针的5’端任选以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第四探针的5’端任选以核苷酸5’羟基结尾。在一些实施方式中，该第一、第二、第三和第四探针的5’端任选以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第四探针的3’端任选以除核苷酸3’羟基以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第四探针的3’端任选以核苷酸3’磷酸基团结尾。在一些实施方式中，这些探针中至少一个含有可检测标记。在一些实施方式中，该标记可以是荧光标记。在一些实施方式中，该标记可以是放射性标记。在一些实施方式中，该标记可以是化学发光标记。在一些实施方式中，该标记可以是酶。在一些实施方式中，该第一探针和该第三探针中至少一个含有可检测标记。在一些实施方式中，该第一探针和该第三探针各含有可检测标记。在一些实施方式中，该第一探针和该第三探针上的可检测标记相同。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针中至少一个含有可检测标记。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针各含有可检测标记。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针含有相同的可检测标记。在一些实施方式中，所述切割产生了未与该第二杂交复合物相结合的该第二探针的第二片段，该方法还包括检测该第二探针的所述第二片段。在一些实施方式中，所述切割产生了未与该第四杂交复合物相结合的该第四探针的第二片段，该方法还包括检测该第四探针的所述第二片段。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针中至少一个同时含有(i)荧光染料和(ii)在荧光染料与荧光激发能量接触时能猝灭荧光发射的猝灭剂染料，所述切割切开该第二探针和/或第四探针中荧光染料和猝灭剂染料之间的共价键，从而增强该荧光染料的可观察荧光信号。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针各含有(i)荧光染料和(ii)猝灭剂染料。
在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括检测两种第二片段。在一些实施方式中，该第二片段含有基本上不与该靶链互补的一个或多个毗连核苷酸。在一些实施方式中，该一个或多个毗连核苷酸包含1-20个核苷酸。
在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括将该第二片段固定到固体支持物上。在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括将对该第二片段进行电泳。在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括通过质谱法检测该第二片段。在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括在最后一轮后检测该第二片段。在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括在多轮期间或之后检测该第二片段。在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括在所有轮次期间检测该第二片段。
在一些实施方式中，本发明检测靶多核苷酸序列的方法还包括在至少一轮后检测该第一杂交复合物、第二杂交复合物或二者。在一些实施方式中，该方法还包括在至少一轮后检测该第三杂交复合物、第四杂交复合物或二者。在一些实施方式中，该方法还包括在至少一轮后检测该第一连接链、第二连接链或二者。在一些实施方式中，该检测包括电泳分离步骤。
在一些实施方式中，本发明提供分析片段的方法，包括：i)使寡核苷酸引物与变性的DNA模板退火，从而使得该寡核苷酸引物同该变性DNA模板一条链的互补寡核苷酸序列退火以形成引物-模板复合物，ii)在有脱氧核糖核酸和不可延伸的核糖核酸存在下延伸该引物-模板复合物的引物部分以形成DNA扩增子片段，和iii)检测DNA扩增子片段，其中所述寡核苷酸引物是本发明多核苷酸。
以下方案1说明了含多个(x)核苷酸“N”的示范性多核苷酸，其定义了所需的核苷酸序列，其中下标1、2、3...x指核苷酸在引物中相当于3’端的位置，“...”表明Nx和N7之间可能有一个或多个核苷酸。
5′-Nx…N7N6N5N4N3N2N1-3′
方案1
因此，N1位于该示范性多核苷酸的3′末端，其可以称为该示范性多核苷酸的3′末端核苷酸。类似地，N2位于第二核苷酸位，其可以称为离3′末端1个核苷酸。类似地，N3位于第三核苷酸位，其可以称为离3′末端2个核苷酸。类似地，N4位于第四核苷酸位，其可以称为离3′末端3个核苷酸。据信，在引物中掺入本发明核碱基导致的引物-二聚体形成减少作用会使得在N4位附近更接近3’-末端的任何位置不含本发明核苷酸的引物减少。
本文所用的术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”可互换使用来表示DNA、RNA或二者的单链或双链多聚物，包括含有修饰的或非天然存在的核苷酸的多聚物。此外，术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”和“核酸”表示含有骨架和多个核碱基的任何其它类型多聚物，其能通过核碱基特异性碱基配对与互补的多核苷酸链形成双螺旋，包括但不限于：例如Nielsen等，Science 254：1497-1500(1991)公开的肽核酸(PNA)、双环DNA寡聚物(Bolli等，Nucleic Acids Res.24：4660-4667(1996))和相关的结构。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸可包含天然存在的糖或糖苷部分，例如β-D-呋喃核糖的骨架。此外，在一些实施方式中，本发明修饰的核苷酸可包含含有一个或多个“糖类似物”的骨架。本文所用的术语“糖类似物”指糖核糖的类似物。示范性核糖糖类似物包括但不限于：具有5个以上或以下环原子的取代或未取代的呋喃糖，例如赤癣糖和己糖和取代或未取代的3-6碳无环糖。典型的取代的呋喃糖和无环糖是其中一个或多个碳原子被一个或多个相同或不同的-R、-OR、-NRR或卤素基团取代的那些糖，其中各R独立为-H、(C1-C6)烷基或(C3-C14)芳基。具有5个环原子的未取代和取代的呋喃糖的例子包括但不限于：2′-脱氧核糖、2′-(C1-C6)-烷基核糖、2′-(C1-C6)-烷氧基核糖、2′-(C5-C14)-芳氧基核糖、2′，3′-二脱氧核糖、2′，3′-二脱氧核糖、2′-脱氧-3′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟代核糖、2′-脱氧-3′-氯代核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)-烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)-烷氧基核糖、2′-脱氧-3′-(C5-C14)-芳氧基核糖、3′-(C1-C6)-烷基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-(C1-C6)-烷基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-(C1-C6)-烷氧基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-(C5-C14)-芳氧基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-卤代核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-氨基核糖-5′-三磷酸、2′，3′-二脱氧核糖-5′-三磷酸或2′，3′-二脱氢核糖-5′-三磷酸。其它糖类似物包括但不限于：例如“锁核酸”(LNA)，即在C-4’和C-2’位氧原子之间含有如亚甲基桥的那些糖，例如纳入本文作为参考的Wengel等，WO 99/14226和Wengel J.，Ace.Chem.Res.，32：301-310(1998)所述的
在一些实施方式中，本发明多核苷酸包括其中的磷酸骨架含有一个或多个“磷酸类似物”的那些多核苷酸。术语“磷酸类似物”指其中磷原子处于+5氧化状态并且一个或多个氧原子被非氧部分取代的磷酸类似物。示范性类似物包括但不限于：硫代磷酸根(phosphorothioate)、二硫代磷酸根(phosphorodithioate)、硒代磷酸根(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸根(phosphorodiselenoate)、硫代苯胺膦酸根(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸根(phosphoranilidate)、亚磷酰胺、硼磷酸根(boronophosphates)和相关的抗衡离子，包括但不限于H+、NH4 +、Na+、Mg++，如果存在这些抗衡离子的话。含磷酸类似物的本发明多核苷酸可包含，例如硫代磷酸键、甲基膦酸键和/亚磷酰胺(参见Chen等，Nucl Acids Res.，23：2662-2668 (1995))。多核苷酸键(polynucleotide linkage)的组合也属于本发明范围。
在一些实施方式中，本文所述多核苷酸可掺入PNA和DNA/PNA嵌合体中。包括肽核酸(PNA，也称为聚酰胺核酸)，参见，例如Nielsen等，Science254：1497-1500(1991)。PNA含有通过聚酰胺骨架而不是DNA和RNA特征性的糖-磷酸骨架相连的杂环核碱基单元。PNA能与互补DNA和RNA靶序列杂交。PNA寡聚物的合成与用于合成PNA寡聚物的反应性单体描述于，例如美国专利号5,539,082；5,714,331；5,773,571；5,736,336和5,766,855。PNA和DNA/PNA嵌合体合成的其它方法以及PNA合成的单体已描述于，例如Uhlmann等，Angew.Chem.Int.Ed.37：2796-2823(1998)。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸的大小可以自是长度为少数核苷酸单体(例如5-80个)到数百或数千个核苷酸单体。例如，本发明多核苷酸可含有5-50个核苷酸、5-30个核苷酸或5-20个核苷酸。在一些实施方式中，当本发明多核苷酸含有，例如5-30个核苷酸时，这种范围包括5-30之间所有可能的整数范围，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30个核苷酸。除非另有指明，当用一串字母，例如“ATGCCTG”表示多核苷酸时，应该知道这些核苷酸自左向右是5’到3’顺序，并且“A”表示脱氧腺苷、“C”表示脱氧胞苷、“G”表示脱氧鸟苷和“T”表示胸苷。此外，当用包含“X”的一串字母表示本发明多核苷酸时，应该知道“X”表示不同的核苷酸单体，其中“X”是除“A”、“C”、“G”或“T”以外的核苷酸单体。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸可用作扩增反应的引物。本文所用的“引物”指本文所定义的多核苷酸，可通过加入一个或多个核苷酸单体或与连接探针相连延伸其3’末端。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸可包含各自独立含有修饰的核碱基的一个或多个核苷酸。
本文所用的术语“修饰的核碱基”包括可通过加入和/或删除一个或多个功能基团、在杂环结构中有差异(即，用碳取代杂原子，或反之)和/或与一个或多个取代基相连而不同于天然存在碱基(例如，A、G、C、T和U)的核碱基。
在一些实施方式中，本发明所用修饰的核碱基包含具有以下结构的修饰嘧啶核碱基：
其中R选自-H、-F、-Cl、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基、C3-C10芳基醚、C3-C10取代的芳基醚、-CF3、-NR1R1、C3-C6环状烷基、C3-C6取代的环状烷基、苯基、取代的苯基和杂芳基，其中R1选自-H、-F、-Cl、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基。
本文所用的“烷基”指从母体烷烃、烯烃或炔烃的一个碳原子上除去一个氢原子而衍生的取代或未取代、支链、直链或环状单价烃基团。典型的烷基包括但不限于：甲基(甲烷基(methanyl))；乙基，例如乙烷基(ethanyl)、乙烯基、乙炔基；丙基，例如丙烷-1-基、丙烷-2-基(异丙基)、环丙烷-1-基、丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、环丙-1-烯-1-基、环丙-2-烯-1-基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁基，例如丁烷-1-基、丁烷-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙烷-l-基(异丁基)、2-甲基-丙烷-2-基(叔丁基)、环丁烷-1-基、丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2．基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-l，3-二烯-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。
本文所用的“芳基”指从芳族环系统的一个碳原子上除去一个氢原子而衍生的单价芳族烃基团。典型的芳基包括但不限于衍生自以下的基团：醋葸烯、苊、苯并荧蒽(acephenanthrylene)、蒽、薁、苯、
、晕苯、荧蒽、芴、并六苯、己芬、环己烯(hexalene)、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、并八苯(octacene)、辛芬(octaphene)、氯甲桥萘(octalene)、卵苯、戊-2，4-二烯、并五苯、并环戊二烯(pentalene)、戊芬、苝、非那烯(phenalene)、菲、茜、七曜烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉红省、苯并菲、三萘(trinaphthalene)等。在一些实施方式中，芳基是(C5-C20)芳基或(C5-C10)芳基。其它芳基是苯基(C6芳基)和萘基(C10芳基)。
本文在“取代的烷基”、“取代的芳基醚”、“取代的芳基”、“取代的胺基”、“取代的环状烷基”或“取代的苯基”中所用的“取代的”表示烷基、芳基、胺、环状烷基或苯基部分被一个或多个非氢取代基取代。这种取代基包括但不限于：-F、-Cl、-Br、-CF3、胺基、-OH、-CCl3、-CN、-CHO、-CO2R、-SO3R、-PO3RR、-C(O)NRR和-NO2，其中R可以是-H、C1-C6烷基或C3-C10芳基中任一个。本文所用的“杂芳基”表示具有选自N、O或S的至少一个杂原子的任何芳环系统。杂芳基部分的实例包括但不限于：呋喃、噻吩、吡啶、吡咯、吡嗪、喹啉和哌嗪(piperizine)。
在一些实施方式中，本发明所用修饰的核碱基包括但不限于假异胞嘧啶(pseudoisocytisine)
Pankiewicz，K.等，J Org.Chem.，v.47，458.8(1982)和Chu，C.K.等，J.Het Chem.，v.14，1119-21(1977)公开了其2′-脱氧衍生物。
本领域已知本发明所用具有各种R取代基的修饰核碱基的其它实例和制备方法，包括但不限于：Ashkinazi，R.等，WO 01019801 A1；Hlavka，J.等，美国专利号4,577,018；Hlavka，J.等，J.Het.Chem.，22(5)，1317-22(1985)；Skulnick，H.等，J.Med.Chem.，28(12)，1864-9(1985)；Lazarus，R.等，Biochemistry，20(24)，6834-41(1981)；Hunter，J.等，DE 2522090；Wierenga，W.等，J.Med.Chem.，23(3)，237-9(1980)及它们引用的参考文献所述的。
本发明所用核碱基和核苷/核苷酸的其它例子及制备方法可见本领域已知的各种数据库，包括ScifinderScholar、Chemical Abstracts等。应该知道，本领域技术人员通过本领域熟知的化学合成方法联用或不用本文和以上参考文献的指导不难获得本发明所用的其它核苷和核苷酸。
本发明寡核苷酸包括天然存在的碱基、修饰的碱基和碱基类似物的所有互变异构体形式。
因此，具有DNA、PNA或DNA/PNA的正常碱基、修饰的嘧啶核碱基、通用碱基、糖修饰或骨架修饰的组合的多核苷酸属于本发明范围。
在一些实施方式中，可将本发明多核苷酸与至少一种可检测标记、无荧光猝灭剂和/或至少一种稳定部分偶联。在一些实施方式中，与至少一种可检测标记、无荧光猝灭剂和/或至少一种稳定部分偶联的本发明多核苷酸可用作扩增反应的探针或引物。
术语“可检测标记”指当与本发明多核苷酸相连时可采用已知的检测方法检测这种多核苷酸的任何部分。示范性可检测标记包括但不限于：能用合适的检测器直接检测标记化合物的荧光团、生色团、放射性同位素、自旋标记、酶标记或化学发光标记，或者结合对，例如配体，如能以高亲和力特异性结合可检测抗配体(如标记的抗体或亲和素)的抗原或生物素。在一些实施方式中，标记可以是荧光标记，例如荧光素或罗丹明染料或荧光染料对，如FRET染料。
在一些实施方式中，本发明多核苷酸可包含一个或多个“无荧光猝灭剂”部分。本文所用的“无荧光猝灭剂”包括但不限于：例如特定的偶氮染料(如DABCYL或DABSYL染料和它们的结构类似物)，三芳基甲烷染料，如孔雀绿或酚红，4′，5′-二醚取代的荧光素(美国专利号4,318,846)，不对称花青染料猝灭剂(参见，Lee等，美国专利号6,080,868和Lee等，美国专利号6,348,596)，或在一个或多个氨基氮原子之处被芳族或杂芳族环系统取代的3-和/或6-氨基呫吨的无荧光衍生物(Haugland等，美国专利号6,399,392)。
本文所用的“无荧光”表明对于本文的任何方法，所述试验溶液中猝灭部分在发射-λmax的荧光效率小于或等于5％发射。在一些实施方式中，在发射-λmax的荧光效率小于或等于1％发射。在本发明的一些实施方式中，共价连接的猝灭部分在发射-λmax显示量子产率低于约0.1％发射。在一些实施方式中，在发射-λmax低于约0.01％发射。
在一些实施方式中，可将本发明多核苷酸与至少一个“稳定部分”偶联。本文所用的术语“稳定部分”所指的部分包括但不限于小沟结合剂(MGB)部分。参考文献描述了各种合适的小沟结合剂。参见，例如Kutyavin等，美国专利号5,801,155；Wemmer，D.E.和Dervan P.B.，Current Opinon in Structural Biology，7：355-361(1997)；Walker，W.L.，Kopka，J.L.和Goodsell，D.S.，Biopolymers，44：323-334(1997)；Zimmer，C和Wahnert，U.，Prog.Biophys.Molec.Bio.，47：31-112(1986)和Reddy，B.S.P.，Dondhi，S.M.和Lown，J.W.，Pharmacol.Therap.，84：1-111(1999)。
将MGB(以及报道基团，如上述荧光团和猝灭剂)通过接头与多核苷酸相连的合适方法见，例如美国专利号5,512,677；5,419,966；5,696,251；5,585,481；5,942,610和5,736,626。小沟结合剂包括，例如3-氨甲酰基-1，2-二氢-(3-H7)-吡咯[3，2-e]吲哚-7-羧酸酯的三聚物(CDPI3)和N-甲基吡咯-4-羧-2-酰胺的五聚物(MPC5)。其它MGB部分见美国专利号5,801,155。在某些实施方式中，可将MGB与增强水溶性的基团相连(例如，糖或氨基酸)。
本发明多核苷酸可用于，例如多核苷酸链延伸或连接反应的引物和/或探针。本文所用的“链延伸反应”指其中至少一种本发明多核苷酸(例如，作为引物或连接探针)可与至少一条DNA模板链退火的引物延伸反应。在多核苷酸链延伸反应中，退火步骤后可将引物延伸至少一个核苷酸从而形成扩增子或延伸产物。或者，在多核苷酸链延伸反应中，退火步骤后可将引物与第二连接探针相连从而形成连接产物。本发明包括所有可能的链延伸反应，包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、嵌套式PCR(nested PCR)、异步PCR(asynchronous PCR)、实时PCR、TaqMan试验、DNA测序、循环DNA测序(cycled DNA sequencing)、寡核苷酸连接试验(OLA)和片段分析，这些反应描述于，例如The PCR Technique：DNA Sequencing II(《PCR技术：DNA测序II》)，Eaton Publishing Co.(1997)；Genome Analysis，A LaboratoryManual Volume I：Analyzing DNA(《基因组分析：实验室手册》，第1卷：DNA分析)，Birren，B.，Green，E.，Klapholz，S.，Myers，R.M.和Roskams，J.编，冷泉港实验室出版社(1997)；Innis，M.等，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(《PCR方案：方法与应用指南》)，Academic Press(1989)；Chen，C.等，美国专利申请公布号2003/0207266 A1；Erlich等，美国专利号5,314,809；美国专利号6,221,606和Bi，W.等，美国专利号6,511,810。本发明寡核苷酸可各自合适地作为引物或探针用于以上任何引物延伸反应。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，包括将多核苷酸引物与变性DNA模板退火，从而使该多核苷酸与该变性DNA模板一条链上的互补多核苷酸序列退火以形成引物-模板复合物；和延伸该引物-模板复合物的引物部分以形成双链扩增子，其中所述多核苷酸引物是本发明引物。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，包括在延伸步骤后使双链扩增子变性。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少1次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少10次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少20次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少30次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少40次。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸方法，包括：i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物与变性DNA模板的第一和第二链退火，使得该第一多核苷酸引物与该变性DNA模板第一链的互补寡核苷酸序列退火，该第二多核苷酸引物与该变性DNA模板第二链的互补寡核苷酸序列退火，从而形成第一和第二引物-模板复合物，和ii)延伸该第一和第二引物-模板复合物中至少一个的引物部分以形成双链DNA扩增子，其中该第一多核苷酸引物或该第二多核苷酸引物中至少一个可以是本发明多核苷酸。在一些实施方式中，该方法可以包括先形成含第一多核苷酸引物、第二多核苷酸引物、DNA模板和其它引物延伸试剂(包括，例如缓冲液和聚合酶)的混合物，再进行退火步骤。在一些实施方式中，本发明所用聚合酶可包括至少一种热稳定聚合酶，包括但不限于Taq、Pfu、Vent、Deep Vent、Pwo、UITma和Tth聚合酶及它们的酶活性突变体和变体。可商品化购得熟知的这种聚合酶。聚合酶的其它描述见万维网URL：the-scientist.library.upenn.edu/yr 1998/jan/profil e1_980105.html。
在一些实施方式中，该方法在形成(混合物)步骤之后但在退火步骤之前使DNA模板变性，从而形成变性DNA模板和第二变性DNA模板的第一链。在一些实施方式中，先进行延伸步骤，再使双链DNA扩增子变性。在一些实施方式中，可重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤1-100次。在一些实施方式中，可重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤10-100次。在一些实施方式中，可重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤20-100次。在一些实施方式中，可重复双链DNA扩增子的退火、延伸和变性步骤30-100次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少1次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少10次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少20次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少30次。在一些实施方式中，可重复退火、延伸和变性步骤至少40次。
在一些实施方式中，本发明提供引物延伸的方法，包括先使多核苷酸探针与变性DNA模板的第一或第二链退火，从而使该多核苷酸探针与该变性DNA模板第一链的互补多核苷酸序列退火和/或使该多核苷酸探针与该变性DNA模板第二链的互补寡核苷酸序列退火，再进行延伸引物部分的步骤。在一些实施方式中，该多核苷酸探针包含至少一个可检测标记。在一些实施方式中，该多核苷酸探针还包含猝灭剂、小沟结合剂中的至少一个或二者。在一些实施方式中，该多核苷酸探针可以是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供“片段分析”或“遗传学分析”的方法，其中可通过模板指导的酶促合成使用标记的引物或核苷酸产生标记的多核苷酸片段；可通过尺寸依赖性分离方法，例如电泳或层析分离这些片段；和在分离后检测(例如通过激光诱导的荧光)分离的片段。在一些实施方式中，同时分离多类多核苷酸，通过光谱学可分辨的标记区分不同类别。
在一些实施方式中，本发明提供分析片段的方法，其中可根据末端核苷酸鉴定和确定片段类别，从而能在四种可能的末端碱基与一组光谱学可分辨染料的诸成员之间建立联系。使用可商品化购得的分光光度计通过检测发射和吸收带宽不难从本领域已知的荧光染料装配这些染料组。在一些实施方式中，通过DNA测序的链终止方法，即二脱氧DNA测序或桑格型测序检测片段类别。
桑格型测序包括利用要测定序列的单链或双链DNA模板通过DNA聚合酶在体外合成DNA链。在按照寡核苷酸引物与模板退火之处确定的位点开始合成。通过掺入不支持DNA继续延伸的核苷酸来终止合成反应。示范性链终止核苷酸类似物包括缺乏3′-5′DNA链延伸所需的3′-OH的2′，3′-二脱氧核苷5′-三磷酸(ddNTP)。当使用适当比例的dNTP(2′-脱氧核苷5′-三磷酸)和4种ddNTP之一时，链群体的一部分中酶催化聚合将在掺入ddNTP的各位点终止。如果各反应使用标记的引物或标记的ddNTP，高分辨率电泳分离后可通过荧光检测序列信息。在链终止方法中，可将本发明染料与测序引物或二脱氧核苷酸相连。在该方法中，可将荧光染料分子与以下位置的互补官能团相连：例如引物5’末端，如Fung等，美国专利号4,757,141所述；引物的核碱基上；或二脱氧核苷酸的核碱基上，如通过纳入本文作为参考的Hobbs等，欧洲专利申请号87305844.0和Hobbs等，J Org.Chem.，54：3420(1989)所述的炔基氨基连接基团。
在一些实施方式中，优选通过电泳方法分离标记的多核苷酸，所述电泳方法公开于，例如Rickwood和Hames编，Gel Electrophoresis of Nucleic Acids：APractical Approach(《核酸凝胶电泳：实用方法》)，IRL Press Limited，伦敦，1981；Osterman，Methods of Protein and Nucleic Acid Research(蛋白质与核酸研究方法)，第1卷，Springer-Verlag，伯林，1984；或美国专利5,374,527；5,624,800和/或5,552,028。在一些实施方式中，电泳基质的类型可以是浓度(重量体积比)在约2-20重量百分比之间的交联或未交联聚丙烯酰胺。在一些实施方式中，聚丙烯酰胺浓度在约4-8百分比之间。在一些实施方式，例如DNA测序中，电泳基质可包含变性剂，例如脲、甲酰胺等。构建这种基质的详细方法见，例如Maniatis等，“Fractionation of Low Molecular Weight DNA and RNA inPolyacrylamide Gels Containing 98％Formamide or 7 M Urea”(用含98％甲酰胺或7 M脲的聚丙烯酰胺凝胶分级低分子量DNA和RNA)，刊于Methods inEnzymology，65：299-305(1980)；Maniatis等，“Chain Length Determination ofSmall Double-and Single-Stranded DNA Molecules by Polyacrylamide GelElectrophoresis”(通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定双链和单链小DNA分子的链长)，Biochemistry，14：3787-3794(1975)；Maniatis等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，冷泉港实验室，纽约，第179-185页，(1982)；和ABI PRISMTM 377 DNA Sequencer User′s Manual(DNA测序仪用户手册)，Rev.A，1995年1月，第2章(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚州)。应该知道，最佳电泳条件，例如具体分离采用的多聚物浓度、pH、温度和变性剂浓度取决于许多因素，包括待分离核酸的大小范围、它们的碱基组成、它们是单链还是双链、电泳所探寻信息的类别性质。
电泳分离后，可采用，例如检测标记多核苷酸的染料发射的荧光来检测标记的多核苷酸。为进行这种检测，可采用标准方法，例如高强度汞蒸气灯、激光等照射标记的多核苷酸。在一些实施方式中，照射方式是照射束的波长大于约600nm的激光。在一些实施方式中，用He-Ne气体激光或固态二级管激光产生的激光照射染料-多核苷酸。照射后，可利用光敏检测器，例如光电倍增管、电荷耦合器件检测标记多核苷酸的荧光强度。示范性电泳检测系统描述于，例如美国专利号5,543,026；5,274,240；4,879,012；5,091,652和4,811,218。
在一些实施方式中，本发明提供分析片段的方法，包括使多核苷酸引物与变性的DNA模板退火，从而使得该多核苷酸引物同该变性DNA模板一条链的互补多核苷酸序列退火以形成引物-模板复合物，在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下延伸该引物-模板复合物的引物部分以形成DNA扩增子片段，和检测该DNA扩增子片段。在一些实施方式中，该多核苷酸引物可以是本发明寡核苷酸。本发明片段分析方法的气体实施方式可见，例如纳入本文作为参考的美国专利号6,221,606。
本文所用的“连接反应”指其中等位基因特异性连接探针与至少一条DNA模板链退火，从而形成探针-模板复合物的反应。退火步骤后，通过连接试剂在探针和第二寡核苷酸片段之间形成共价键从而产生连接产物。本发明连接试剂可包含任何数量的酶或化学(即，非酶的)试剂。例如，连接酶是在合适条件下能在毗邻多核苷酸的3′-OH和5′-磷酸之间形成磷酸二酯键的一种酶连接试剂。温度敏感的连接酶包括但不限于：噬菌体T4连接酶、噬菌体T7连接酶和大肠杆菌连接酶。热稳定的连接酶包括但不限于Taq连接酶、Tth连接酶和Pfu连接酶。可从嗜热或嗜高温生物，包括但不限于原核生物、真核生物或古生物获得热稳定的连接酶。本发明方法也可用一些RNA连接酶。
化学连接试剂包括但不限于：活化、缩合和还原剂，例如碳二亚胺、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亚胺/胱胺、二硫苏糖醇(DTT)和紫外光。自连接，即在没有连接试剂存在下的自发连接也属于本发明范围。化学连接方法的详述方案和合适反应基团的描述可见Xu等，Nucleic Acid Res.，27：875-81(1999)；Gryaznov和Letsinger，Nucleic Acid Res.21：1403-08(1993)；Gryaznov等，Nucleic Acid Res.22：2366-69 (1994)；Kanaya和Yanagawa，Biochemistry 25：7423-30(1986)；Luebke和Dervan，Nucleic Acids Res.20：3005-09(1992)；Sievers和von Kiedrowski，Nature 369：221-24(1994)；Liu和Taylor，Nucleic Acids Res.26：3300-04(1999)；Wang和Kool，Nucleic AcidsRes.22：2326-33(1994)；Purmal等，Nucleic Acids Res.20：3713-19(1992)；Ashley和Kushlan，Biochemistry 30：2927-33(1991)；Chu和Orgel，Nucleic Acids Res.16：3671-91(1988)；Sokolova等，FEBS Letters 232：153-55(1988)；Naylor和Gilham，Biochemistry 5：2722-28(1966)；美国专利号5,476,930；和Royer，EP324616B1)等。在一些实施方式中，连接试剂是“活化”或还原剂。应该知道如果使用化学连接，第一探针的3’端和第二探针的5’端应包含有助于连接的合适反应基团。
在一些实施方式中，本发明提供连接寡核苷酸的方法，包括：i)形成包含与DNA模板退火的第一和第二多核苷酸链的复合物，从而使该第一多核苷酸链与该变性DNA模板链的第一互补多核苷酸序列退火和使该第二多核苷酸链与该变性DNA模板链的第二互补多核苷酸序列退火，其中该变性DNA模板链的第二互补多核苷酸序列位于该变性DNA模板链的第一互补多核苷酸序列的5’端，和ii)在该第一和第二多核苷酸链之间形成稳定的共价键，其中该第一多核苷酸链或第二多核苷酸链中至少一个是本发明多核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供连接寡核苷酸的方法，包括：第一寡核苷酸与变性DNA模板的一条链退火，使得该第一寡核苷酸与该变性DNA模板链的互补寡核苷酸序列退火，从而形成第一寡核苷酸-模板复合物；第二寡核苷酸与该第一寡核苷酸-模板复合物中与该第二寡核苷酸互补的寡核苷酸序列退火，从而形成第二寡核苷酸-模板复合物，其中该第二寡核苷酸与该第一寡核苷酸-模板复合物退火使得该第一寡核苷酸的3’末端和该第二寡核苷酸的5’末端与变性DNA模板的毗邻核苷酸相连；和在该第一寡核苷酸的3’末端和该第二寡核苷酸的5’末端之间形成稳定的共价键。在一些实施方式中，该第一寡核苷酸或该第二寡核苷酸中至少一个可以是本发明寡核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供检测靶多核苷酸序列的方法，包括：(a)使靶多核苷酸链和靶互补链与第一探针对和第二探针对反应，所述第一探针对包含(i)含有与该靶链中第一靶区域互补的序列的第一多核苷酸探针和(ii)含有与该靶链中第二靶区域互补的序列的第二多核苷酸探针，其中该第二区域位于该第一区域的5’端并与该第一区域至少有一个核苷酸碱基重叠，所述第二探针对包含(i)含有与该靶互补链中第一区域互补的序列的第三多核苷酸探针和(ii)含有与该靶互补链中第二靶区域互补的序列的第四多核苷酸探针，其中该第二区域位于该第一区域的5’端并与该第一区域至少有一个核苷酸碱基重叠，该反应在能使该第一和第二探针分别与该靶链中第一和第二区域杂交以形成第一杂交复合物，以及该第三和第四探针分别与该靶互补链中第一和第二区域杂交以形成第二杂交复合物的有效条件下进行；(b)切割该第一杂交复合物中的第二探针，以及该第二杂交复合物中的第四探针以形成(i)含有该靶链、该第一探针和该第二探针的第一片段的第三杂交复合物，其中该第二探针的第一片段的5’末端核苷酸紧邻该第一探针的3’末端核苷酸，和(ii)含有该靶互补链、该第三探针和该第四探针的第一片段的第四杂交复合物，其中该第四探针的第一片段的5’末端核苷酸紧邻该第三探针的3’末端核苷酸；(c)连接该第一探针与该第二探针的杂交片段以形成与该靶链杂交的第一连接链，连接该第三探针与该第四探针的杂交片段以形成与该靶互补链杂交的第二连接链；(d)使该第一连接链变性(脱离)该靶链，使该第二连接链变性(脱离)该靶互补链；和(e)再进行一轮或多轮步骤(a)-(d)，只要在最后一轮中可任选省去步骤(d)。
在一些实施方式中，该第一区域与该第二区域有一个核苷酸碱基重叠。在一些实施方式中，该第一和第三探针的5’端可以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第一和第三探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。在一些实施方式中，该第二和第四探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第二和第四探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。在一些实施方式中，该第一、第二、第三和第四探针的5’端各自独立以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第二和第四探针的3’端各自独立以除核苷酸3’羟基以外的基团结尾。在一些实施方式中，该第二和第四探针的3’端各自独立以核苷酸3’磷酸基团结尾。
在一些实施方式中，这些探针中至少一个含有可检测标记。在一些实施方式中，该标记可以是荧光标记。在一些实施方式中，该标记可以是放射性标记。在一些实施方式中，该标记可以是化学发光标记。在一些实施方式中，该标记可以是酶。在一些实施方式中，该第一探针和该第三探针中至少一个含有可检测标记。在一些实施方式中，该第一探针和该第三探针各含有可检测标记。在一些实施方式中，该第一探针和该第三探针上的可检测标记可以相同。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针中至少一个含有可检测标记。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针各含有可检测标记。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针可含有相同的可检测标记。
在一些实施方式中，切割步骤产生了未与该第三杂交复合物结合的该第二探针的第二片段，该方法还包括检测所述第二片段。
在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针中至少一个同时含有(i)荧光染料和(ii)在荧光染料与荧光激发能量接触时能猝灭荧光发射的猝灭剂染料，所述切割切开该第二探针和/或第四探针中荧光染料和猝灭剂染料之间的共价键，从而增强该荧光染料的可观察荧光信号。在一些实施方式中，该第二探针和该第四探针各含有(i)荧光染料和(ii)猝灭剂染料。
在一些实施方式中，切割步骤产生了未与该第四杂交复合物相连的该第四探针的第二片段，该方法还包括检测两种第二片段。在一些实施方式中，该第二片段含有基本上不与该靶链互补的一个或多个毗连核苷酸。在一些实施方式中，一个或多个毗连核苷酸包含1-20个核苷酸。
在一些实施方式中，该方法还包括将该第二片段固定在固体支持物上。在一些实施方式中，该方法还包括对该第二片段进行电泳。在一些实施方式中，该方法还包括通过质谱法检测该第二片段。在一些实施方式中，该方法还包括在最后一轮后检测该第二片段。在一些实施方式中，该方法还包括在多轮期间或之后检测该第二片段。在一些实施方式中，该方法还包括在所有轮次期间检测该第二片段。在一些实施方式中，该方法还包括在至少一轮后检测该第一杂交复合物、第二杂交复合物或二者。在一些实施方式中，该方法还包括在至少一轮后检测该第三杂交复合物、第四杂交复合物或二者。在一些实施方式中，该方法还包括在至少一轮后检测该第一连接链、第二连接链或二者。在一些实施方式中，该检测包括电泳分离步骤。
用于检测靶多核苷酸的连接方法的其它实施方式可见全文纳入本文作为参考的Bi，W.等，美国专利号6,511,810。
实施例
材料与方法
除非另有表述，所有合成反应均在氩气气氛中在烘箱或火焰干燥的玻璃器皿中进行。在氩气气氛中用氢化钙(CaH2)蒸馏二氯甲烷(CH2Cl2)。除非另有表述，所有其它溶剂从分配器接收使用。用购自Sigma-Aldrich(密尔沃基，威斯康星州)的1mm硅胶板进行薄层层析(TLC)，用紫外光(Spectroline；ENF-240C型)或用KMnO4或磷钼酸染色观察。用购自Sigma-Aldrich(密尔沃基，威斯康星州)的平均粒径为40μm的硅胶进行快速柱层析。未衍生的CPG支持物购自Applied Biosystems Inc(P/N 360139，Foster City，加利福尼亚州)。除非另有表述，所有其它试剂购自Sigma-Aldrich。除非另有表述，用ABI 394 DNA合成仪按照标准方法进行0.2mol规模的自动DNA合成。用Agilent 1100 HPLC系统通过反相HPLC纯化寡核苷酸。用Mariner质谱仪(Applied Biosystems，FosterCity)记录ESI-TOF质谱。用Agilent CE系统通过毛细管电泳(CE)检测合成寡核苷酸的纯度。
合成
2’-脱氧-假异胞苷CPG：
按照方案1合成2′-脱氧-假异胞苷(2′-Deoxy-pseudoisocvtidine)CPG。如Mayer，A.，Nucleosides，Nucleotides&Nucleic Acids，第22卷，1919-25(2003)所述合成N-苯甲酰基保护的2′-脱氧-假异胞苷(1)。
方案1
4′-(3-羧基丙酰基)-5′-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧-假异胞苷(2)：
向搅拌的30mg 1的0.7mL CH2Cl2溶液中加入8.5mg琥珀酸酐，2.9mgDMAP和14μL三乙胺(Et3N)。搅拌12小时后，用7mL CH2Cl2稀释混合物，用5％柠檬酸水溶液(1×7mL)和饱和的氯化钠，NaCl(1×7mL)洗涤。用Na2SO4干燥有机层，蒸发，采用硅胶层析纯化残留物得到18mg 4′-(3-羧基丙酰基)-5′-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧-假异胞苷。
2′-脱氧-假异胞苷CPG(3)：
向上文获得的17mg 5-三氟甲基-4′-(3-羧基丙酰基)-5′-二甲氧基三苯甲基-2′-脱氧尿苷的0.6mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入8.3mg 2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、5.7μL二异丙基乙胺(DIPEA)和594mg CPG(37μM/g)。混合物振荡2小时，然后用DMF(4×20mL)和THF(2×20mL)洗涤。高度真空下干燥5-三氟甲基-2′-脱氧尿苷CPG产物4小时。
2′-脱氧-假异胞苷的3′-末端核苷酸：
如上所述，用ABI 394 DNA合成仪按照标准方法进行0.2μmol规模的自动DNA合成。用Agilent 1100 HPLC系统通过反相HPLC纯化寡核苷酸。结果合成了表1所示多核苷酸。正向引物ATIRFcC和反向引物ATIRRcC血管紧张素II1型受体基因(ATIR，100bp)。正向引物LIGFcC和反向引物LIGRcC扩增部分人DNA连接酶I基因(LIG，250bp)。正向引物D10SFcC和反向以引物D10SRcC扩增部分人染色体10克隆RP11-143D9(D10S，102bp)。
表1
| 引物 | 引物序列 | |
| X＝C | X＝PC | |
| ATIRFcC | ATIRFcC-PC | GGATTCCCCACCAAATATTCAX |
| ATIRRcC | AT1RRcC-PC | GATAGGCATGGCCGTGTCX |
| LIGFcC | LIGFcC-PC | GCGAATACAAATATGACGGGX |
| LIGRcC | LIGRcC-PC | CGGGTACTTCCCAGTGTTGTX |
| D10SFcC | D1OSFcC-PC | ATGACGACTGAGGCTCCTAGX |
| D10SRcC | D10SRcC-PC | CCGTCCTTCCGTGAGTCATX |
扩增
每15μL反应(体系)用5000拷贝的gDNA进行所有gDNA扩增。
扩增反应条件：
使用未修饰和/或修饰的引物在含以下试剂的15μL反应(体系)中进行扩增：
-10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.3
-50mM KCl，3mM MgCl2，0.01％v/v明胶
-0.2mM dATP，0.2mM dCTP，0.2mM dGTP和0.4mM dUTP
-0.025单位/μL AmpliTaq GoldDNA聚合酶(Applied Biosystems，P/NN808-0107)
-200nM各种正向和反向引物
-无模板对照(NTC)实验用水或15ng基因组DNA(Applied Biosystems，P/N403062)。
如SYBRGreen PCR Master Mix and RT-PCR：Protocol(SYBR绿色PCR主混合物和RT-PCR：方案)(Applied Biosystems，2002)所述，通过SYBRGreenassay(SYBR绿色试验)使用ABI PRISM 7900HT序列检测系统(AppliedBiosystems；Foster City，加利福尼亚州)实时监测所有PCR反应的进展。
扩增反应分析：
如下所示通过凝胶电泳分析所有扩增产物。用5μL无核酸酶的水稀释PCR反应混合物(15μL)。将该溶液连同25bp DNA梯加载入4％琼脂糖凝胶孔中(Invitrogen，P/N G5018-04)。在12V DC，880mA进行电泳30分钟。采用紫外照射观察溴化乙锭染色的dsDNA条带，采用装配了柯达数码相机的AlphaDigDoc 1000软件(Alpha Innotech；San Leandro，加利福尼亚州)定量测定。
热循环：
采用以下热循环参数进行扩增温度循环。
表2
| AmpliTaq Gold活化 | 50轮 | |||
| 变性 | 退火/延伸 | |||
| 温度(℃) | 95 | 95 | 55 | 72 |
| 时间 | 2分钟 | 15秒 | 30秒 | 30秒 |
对于各引物对，使用未修饰和3’-修饰的引物进行含有对应于引物对的gDNA的扩增反应。此外，使用未修饰和3’-修饰引物进行不含任何模板的扩增反应作为无模板对照(NTC)反应。
如上所述进行凝胶电泳分析。依据所用的引物组，凝胶电泳显示含未修饰引物的NTC扩增中在约40-50bp处有显著量的非特异性扩增产物，表明有引物-二聚体扩增子形成。另一方面，在使用3’-修饰引物的NTC扩增的凝胶电泳图像中观察到引物-二聚体扩增子形成显著减少。使用未修饰引物的gDNA模板扩增反应的凝胶电泳明确显示了对应于所需模板扩增子的条带，也显示了对应于有引物-二聚体扩增子形成的条带。
使用未修饰引物的ATIR模板扩增明确显示在约100bp处有对应于所需模板扩增子的条带，也显示在约50bp处有对应于有引物-二聚体扩增子形成的条带。在另一方面，使用3’-修饰引物的ATIR模板扩增明确显示在约100bp处有对应于所需模板扩增子的条带，但未显示形成了可鉴定的引物-二聚体扩增子。
实时RCR监测显示使用未修饰和3’修饰引物的ATIR gDNA扩增效率非常相似。在另一方面，虽然使用未修饰引物的NTC扩增的Ct值约为30，但使用2’-脱氧-假异胞苷修饰引物的NTC扩增直到第37轮(扩增)后也未得到可检测的信号。
使用未修饰引物的LIG模板扩增明确显示在约250bp处有对应于所需模板扩增子的条带，也显示在约50bp处有对应于引物-二聚体扩增子形成的微弱条带。在另一方面，使用3’-修饰引物的LIG模板扩增明确显示在约250bp处有对应于所需模板扩增子的条带，但未显示形成了可鉴定的引物-二聚体扩增子。
实时PCR监测显示使用未修饰和3’修饰引物的LIG gDNA扩增效率相似，Ct值分别为26和33。在另一方面，虽然使用未修饰引物的NTC扩增的Ct值约为36，但使用2’-脱氧-假异胞苷修饰引物的NTC扩增显示通过50轮扩增未形成可检测的扩增子。
使用未修饰引物的D10S模板扩增明确显示在约100bp处有对应于所需模板扩增子的条带，也显示在约50bp处有对应于引物-二聚体扩增子形成的微弱条带。在另一方面，使用3’-修饰引物的D10S模板扩增明确显示在约100bp处有对应于所需模板扩增子的条带，但未观察到形成了引物-二聚体扩增子。
实时PCR监测显示使用未修饰和3’修饰引物的D10S gDNA扩增效率非常相似，Ct值分别为23和26。在另一方面，虽然使用未修饰引物的NTC扩增的Ct值约为29，但使用2’-脱氧-假异胞苷修饰引物的NTC扩增显示直到第40轮(扩增)后也未得到可检测的信号。
Claims (91)
1.一种在离其3’末端不超过4个核碱基处含有至少一个修饰的嘧啶核碱基的多核苷酸，其中所述修饰的嘧啶核碱基具有以下结构：
其中R选自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基、C3-C10芳基醚、C3-C10取代的芳基醚、-CF3、-NR1R1、C3-C6环状烷基、C3-C6取代的环状烷基、苯基、取代的苯基和C5-C10杂芳基，其中R1选自-H、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是-H。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C1-C6烷基。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C1-C6取代的烷基。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C3-C10芳基。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C3-C10取代的芳基。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是-CF3。
8.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是氨基。
9.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是取代的氨基。
10.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C3-C6环状烷基。
11.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C3-C6取代的环状烷基。
12.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是苯基。
13.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是取代的苯基。
14.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是杂芳基。
15.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，在离所述多核苷酸的3’末端不超过3个核苷酸处含有至少一个修饰的嘧啶核碱基。
16.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，在离所述多核苷酸的3’末端不超过2个核苷酸处含有至少一个修饰的嘧啶核碱基。
17.如权利要求1-14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的3’末端核苷酸是至少一个修饰的核苷酸。
18.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是引物。
19.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸在3’末端是可延伸的。
20.如权利要求1-17中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，含有可检测标记、猝灭剂、小沟结合剂中至少一种或它们的任何组分。
21.如权利要求20所述的多核苷酸，其特征在于，该寡核苷酸是在其3’末端不可延伸的探针。
22.一种延伸引物的方法：
i)将多核苷酸引物与变性DNA模板退火，从而使该多核苷酸引物与该变性DNA模板一条链上的互补多核苷酸序列退火以形成引物-模板复合物；和
ii)延伸该引物-模板复合物的引物部分以形成双链扩增子，其中所述多核苷酸引物是如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，包括在延伸步骤后使该双链扩增子变性。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和变性步骤至少一次。
25.如权利要求23所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和变性步骤至少十次。
26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和变性步骤至少二十次。
27.如权利要求23所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和变性步骤至少三十次。
28.如权利要求23所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和变性步骤至少四十次。
29.如权利要求22-28中任一项所述的方法，其特征在于，在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下进行延伸，从而形成DNA扩增子片段。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，检测该DNA扩增子片段。
31.一种延伸引物的方法，包括：
i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物与变性DNA模板的第一链和第二链退火，使得该第一多核苷酸引物与该变性DNA模板第一链的互补寡核苷酸序列退火，该第二多核苷酸引物与该变性DNA模板第二链的互补寡核苷酸序列退火，从而形成第一和第二引物-模板复合物，和
ii)延伸该第一和第二引物-模板复合物中至少一个的引物部分以形成双链DNA扩增子，
其中该第一多核苷酸引物或该第二多核苷酸引物中至少一个是如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，包括在形成步骤后但在退火步骤前使该DNA模板变性以形成变性DNA模板和第二变性DNA模板的第一链。
33.如权利要求31-32中任一项所述的方法，其特征在于，包括在延伸步骤后使该双链DNA扩增子变性。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和该双链DNA扩增子的变性步骤至少一次。
35.如权利要求33所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和该双链DNA扩增子的变性步骤至少十次。
36.如权利要求33所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和该双链DNA扩增子的变性步骤至少二十次。
37.如权利要求33所述的方法，其特征在于，重复退火、延伸和该双链DNA扩增子的变性步骤至少三十次。
38.如权利要求31-37中任一项所述的方法，包括先使多核苷酸探针与变性DNA模板的第一链或第二链退火，从而使该多核苷酸探针与该变性DNA模板第一链的互补多核苷酸序列退火或使该多核苷酸探针与该变性DNA模板第二链的互补寡核苷酸序列退火，再进行延伸引物部分的步骤。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸探针包含至少一个可检测标记。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸探针还包含猝灭剂、小沟结合剂的至少一种或二者。
41.如权利要求38-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸探针是如权利要求21所述的多核苷酸。
42.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其特征在于，在离所述探针的3’末端不超过2个核苷酸处含有至少一个所述修饰的嘌呤核碱基。
43.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个所述修饰的嘌呤核碱基离所述探针的3’末端不超过1个核苷酸。
44.如权利要求38-41中任一项所述的方法，其特征在于，所述修饰的嘌呤核碱基是所述探针的3’末端核苷酸。
45.一种连接寡核苷酸的方法，包括：
i)形成包含与DNA模板退火的第一和第二多核苷酸链的复合物，从而使该第一多核苷酸链与该变性DNA模板链的第一互补多核苷酸序列退火和使该第二多核苷酸链与该变性DNA模板链的第二互补多核苷酸序列退火，其中该变性DNA模板链的第二互补多核苷酸序列位于该变性DNA模板链的第一互补多核苷酸序列的5’端，和
ii)在该第一和第二多核苷酸链之间形成稳定的共价键，其中该第一多核苷酸链或第二多核苷酸链中至少一个是如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸。
46.一种检测靶多核苷酸序列的方法，包括：
(a)使靶多核苷酸链与第一探针对反应，所述第一探针对包含(i)含有与该靶链中第一靶区域互补的序列的第一多核苷酸探针和(ii)含有与该靶链中第二靶区域互补的序列的第二多核苷酸探针，其中该第二区域位于该第一区域的5’端并与该第一区域至少有一个核苷酸碱基重叠，该反应在能使该第一和第二探针分别与该靶链中第一和第二区域杂交以形成第一杂交复合物的有效条件下进行，
(b)切割该第一杂交复合物中的第二探针以形成含有该靶链、该第一探针和该第二探针的第一片段的第二杂交复合物，其中该第二探针的第一片段的5’末端核苷酸紧邻该第一探针的3’末端核苷酸，
(c)连接该第一探针与该第二探针的杂交片段以形成与该靶链杂交的第一连接链，
(d)使该第一连接链变性脱离该靶链，和
(e)再进行一轮或多轮步骤(a)-(d)，只要在最后一轮中可任选省去步骤(d)，
其中该第一探针、该第二探针中至少一个或二者是如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述第一区域与所述第二区域有一个核苷酸碱基重叠。
48.如权利要求46-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。
49.如权利要求46-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。
50.如权利要求46-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。
51.如权利要求46-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。
52.如权利要求46-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针的3’端以除核苷酸3’羟基以外的基团结尾。
53.如权利要求46-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针的所述3’端以核苷酸3’磷酸基团结尾。
54.如权利要求46-53所述的方法，包括：
(a)使靶互补链与第二探针对反应，所述第二探针对包含(i)含有与该靶互补链中第一区域互补的序列的第三多核苷酸探针和(ii)含有与该靶互补链中第二区域互补的序列的第四多核苷酸探针，其中该第二区域位于该第一区域的5’端并与该第一区域至少有一个核苷酸碱基重叠，该反应在能使该第三和第四探针分别与该靶互补链中第一和第二区域杂交以形成第三杂交复合物的有效条件下进行，
(b)切割该第二杂交复合物中的第四探针以形成含有该靶互补链、该第三探针和该第四探针的第一片段的第四杂交复合物，其中该第四探针的第一片段的5’末端核苷酸紧邻该第三探针的3’末端核苷酸，
(c)连接该第三探针与该第四探针的杂交片段以形成与该靶互补链杂交的第二连接链，
(d)使该第二连接链变性脱离该靶互补链，和
(e)再进行一轮或多轮步骤(a)-(d)，只要在最后一轮中可任选省去步骤(d)。
55.如权利要求54所述的方法，其特征在于，所述第三探针与所述第四探针中至少一个或二者是如权利要求1-20中任一项所述的多核苷酸。
56.如权利要求54-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。
57.如权利要求54-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。
58.如权利要求54-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四探针的5’端以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。
59.如权利要求54-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四探针的5’端以核苷酸5’羟基结尾。
60.如权利要求46-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四探针的5’端任选以除核苷酸5’磷酸基团以外的基团结尾。
61.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四探针的3’端以除核苷酸3’羟基以外的基团结尾。
62.如权利要求54-58中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四探针的所述3’端以核苷酸3’磷酸基团结尾。
63.如权利要求46-62中任一项所述的方法，其特征在于，至少一个所述探针含有可检测标记。
64.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述标记是荧光标记。
65.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述标记是放射性标记。
66.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述标记是化学发光标记。
67.如权利要求63所述的方法，其特征在于，所述标记是酶。
68.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一探针和第三探针中至少一个含有可检测标记。
69.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一探针和第三探针各含有可检测标记。
70.如权利要求69所述的方法，其特征在于，所述第一探针和第三探针上的可检测标记相同。
71.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针和第四探针中至少一个含有可检测标记。
72.如权利要求54-63中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针和第四探针各含有可检测标记。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述第二探针和第四探针含有相同的可检测标记。
74.如权利要求54-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割产生了未与所述第二杂交复合物相连的所述第二探针的第二片段，所述方法还包括检测所述第二探针的所述第二片段。
75.如权利要求54-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述切割产生了未与所述第四杂交复合物相连的所述第四探针的第二片段，所述方法还包括检测所述第四探针的所述第二片段。
76.如权利要求74-75中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二探针和所述第四探针中至少一个同时含有(i)荧光染料和(ii)在荧光染料与荧光激发能量接触时能猝灭荧光发射的猝灭剂染料，所述切割切开该第二探针和/或第四探针中荧光染料和猝灭剂染料之间的共价键，从而增强该荧光染料的可观察荧光信号。
77.如权利要求76所述的方法，其特征在于，所述第二探针和所述第四探针各含有(i)荧光染料和(ii)猝灭剂染料。
78.如权利要求74-75中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测两种所述第二片段。
79.如权利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二片段含有基本上不与该靶链互补的一个或多个毗连核苷酸。
80.如权利要求79所述的方法，其特征在于，所述一个或多个毗连核苷酸包含1-20个核苷酸。
81.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括将所述第二片段固定到固体支持物上。
82.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括将对所述第二片段进行电泳。
83.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括通过质谱法检测所述第二片段。
84.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括在最后一轮后检测所述第二片段。
85.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括在多轮期间或之后检测所述第二片段。
86.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括在所有轮次期间检测所述第二片段。
87.如权利要求74所述的方法，其特征在于，还包括在至少一轮后检测所述第一杂交复合物、第二杂交复合物或二者。
88.如权利要求1和15-21中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，R是氰基。
89.如权利要求1和15-21中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，R是硝基。
90.如权利要求22-87中任一项所述的方法，其特征在于，R是氰基。
91.如权利要求22-87中任一项所述的方法，其特征在于，R是硝基。
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