CN101168735B - 一种耐热角质酶及其编码基因和表达 - Google Patents
一种耐热角质酶及其编码基因和表达 Download PDFInfo
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Abstract
一种耐热角质酶及其编码基因和表达，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种有别于真菌角质酶的细菌角质酶，及其编码基因和表达系统，包括提取Thermobifida fusca WSH03-11总DNA，设计引物，PCR扩增得到编码耐热角质酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，全长906个核苷酸，编码301个氨基酸，以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，可实现耐热角质酶基因的高效表达。此角质酶热稳定性好，对角质、甘油三酯及各种可溶性合成酯都有很好的水解作用，可广泛用于纺织、洗涤剂等行业。
Description
技术领域
本发明涉及yi,gif种耐热角质酶及其编码基因和表达，属于生物工程技术领域。
背景技术
角质酶是能够水解角质大分子的水解酶。作为yi,gif种多功能酶，在纺织工业、食品工业以及化工工业等诸多领域都有着广泛的应用。
(1)在生物催化方面的应用
在工业产品及工艺中，角质酶具有独特的应用优势。从可溶性合成酯类到不溶性长链甘油三酯的多种酯，角质酶对其均具有水解活力，角质酶可在较低水分活度下进行脂肪和油的转酯化或醇类的(立体)选择性酯化；可进行丁酸和2-丁醇、甲基-、乙基-、丙基丙酸酯等物质之间的酯化、转酯化反应，也可参与合成聚合物表面活性剂及含有yi,gif个或多个手性中心的药物。
(2)在农业化学品工业中的应用
大量性质不同的化合物，例如除草剂、杀虫剂和植物生长物质等沉积或吸附在植物表面，它们对植物的作用很大程度上取决于其通过角质层的能力。根据这一特点，人们研究了含有角质酶的制剂，开发用于农用化学品的增效剂及辅剂、植物防御反应的诱导物、除草剂及植物生长的抑制剂等。
(3)在护理用品行业的应用
由于角质酶具有脂肪酶的性能，已被用作洗衣店的解脂肪酶或洗碟的清洁剂，用于去除脂肪。角质酶及其采用酶工程获得的变体已开发用于生产清洁剂或去污剂，Unilever等公司拥有相关专利。
(4)在食品工业和农产品深加工中的应用
角质酶在乳制品工业中牛奶脂肪的水解，以及油化学工业中具有应用潜力；可用于低附加值的农副产品加工废物转化成有价值的脂肪酸等物质。
(5)在纺织工业中的应用
退浆后未经加工的织物，其吸水性及白度均不尽人意。传统精练经浓碱煮练后，需消耗大量清水进行漂洗，产生大量污水，对环境极为不利。如采用生物酶对织物进行精练，以除去非纤维素杂质，可大大降低对环境的影响。角质酶可分解纤维表面的角质，并将附着的脂质等杂质一同从棉纤维表面除去，同时对棉籽壳也有yi,gif定的降解作用。将其和果胶酶复合使用，效果更好。
国外对角质酶进行了大量的、深入的研究，发现最早、研究最为广泛的角质酶产生菌为茄病镰刀菌Fusarium solani等植物病原真菌，后来研究者筛选到了产角质酶的细菌Pseudomonas putid和放线菌Thermobifida fusca、Thermoactinomyces vulgaris、Streptomyces acidiscabies等。但是国外对角质酶的研究主要还是集中在真菌角质酶上，而对细菌角质酶的报道很少，其主要原因是：国外仍旧侧重于开发生化性质研究已很深入的真菌角质酶，对细菌角质酶的研究没有足够重视；细菌角质酶编码基因还没有被阐明，无法采用基因重组技术获得大量产品作为研究材料。对基因和蛋白质数据库的全面搜索表明目前所有的细菌基因组中不存在真菌角质酶的同源序列，因此单凭生物信息学分析不能找到细菌角质酶的编码基因，该细菌角质酶的编码基因破译是一个学术上完全独立的寻找未知基因的原创性研究。和真菌角质酶相比，细菌角质酶具有比真菌角质酶催化效率高、对环境适应能力强、以及基因工程表达技术等方面优势，因此，研究细菌角质酶具有极其重要的价值。
国内对角质酶研究较少，野生菌产酶较低，且没有工业化生产角质酶的案例。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种耐热的细菌角质酶，本发明的另一个目的是提供一种编码该耐热角质酶的DNA分子。
本发明的再一个目的是提供所述的角质酶基因的表达：包含本发明基因的表达载体，及包含本发明表达载体的宿主细胞。
本发明的技术方案：一种角质酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。所述角质酶的编码基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
所述的角质酶基因的表达：包括提取Thermobifida fusca WSH03-11总DNA，设计引物，PCR扩增得到编码耐热角质酶的基因，它具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，全长906个核苷酸，编码301个氨基酸，以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，可实现耐热角质酶基因的高效表达。
(1)角质酶编码基因的分离克隆：
角质酶编码基因的分离：
嗜热子囊菌Thermobifida fusca WSH03-11菌株(该菌株巳在【化工进展】2006年第25卷第5期公开)，在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μLTris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μLRNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％十二烷基硫酸钠和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入5M的NaCl100μL和十六烷基三甲基溴化铵80μL，65℃下保温20min，用700μL的酚：氯仿：异戊醇体积比为25：24：1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿：异戊醇体积比为24：1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％浓度的乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为Thermobifida fusca总DNA；
角质酶编码基因的克隆：
根据蛋白Tfu_0883的基因设计引物P1、P2：
P1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
P2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
利用上述引物，以Thermobifida fusca总DNA为模版，PCR扩增角质酶基因，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑六个菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，结果表明此角质酶基因全长906个核苷酸，编码301个氨基酸；
(2)角质酶基因的改造：
以连接了角质酶基因的pMD18-T simple载体为模板进行定点突变PCR，设计引物P3、P4：
P3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
P4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布于含100mg/L氨苄青霉素-LB平板，挑选单菌落接入含100mg/L氨苄青霉素-LB液体培养基，经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果验证已突变去除Nco I位点；
(3)角质酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建：
用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素-LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；
(4)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：
将质粒CUT-pET20b(+)热击转化E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再于100mg/L氨苄青霉素-50mg/L氯霉素-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子：重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS，在TB培养基：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L和KH2PO42.31g/L，中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/L异丙基硫代βD半乳糖苷诱导，降温至24℃培养，44h时产酶达180u/mL，角质酶基因实现高效表达。
本发明的有益效果：
本发明提供了耐热角质酶基因的鉴定技术。以嗜热子囊菌Thermobifidafusca WSH03-11为出发菌株，发酵得到耐热角质酶，此角质酶在60℃仍具有很高活性。将此角质酶分离纯化，得到电泳纯纯品，进行蛋白质肽指纹图谱测序，发现和NCBI数据库中Thermobifida fusca编码的蛋白Tfu_0883极其类似，蛋白Tfu_0883通过序列预测为甘油三酯酶，没有指明其有角质酶活性。
本发明提供了耐热角质酶基因的高效表达方法。提取Thermobifida fuscaWSH03-11总DNA，设计引物PCR得到编码耐热角质酶的基因，它具有SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列，全长906个核苷酸，编码301个氨基酸。以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS为表达宿主，可实现耐热角质酶基因的高效表达。野生角质酶和重组角质酶都显示有角质酶活性，表明SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列所编码蛋白不仅仅是甘油三酯酶，而是可水解角质的角质酶。
附图说明
图1纯化后的角质酶的SDS-PAGE分析。
1、培养基上清液，2、疏水色谱，3、阴离子交换色谱，4、标准蛋白分子量。
图2重组角质酶摇瓶发酵培养基上清液SDS-PAGE图谱。
1、培养基上清液，M、标准蛋白分子量。
具体实施方式
实施例1 本实施例说明角质酶的纯化程序。
以Thermobifida fusca WSH03-11为出发菌株，在种子培养基中(可溶性淀粉20g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，K2HPO42g/L，NaCl5g/L，pH8.0)50℃，200rpm培养20h后以8％的接种量接入发酵培养基(乙酸钠7.5g/L，酵母膏7.5g/L，蛋白胨5g/L，K2HPO42g/L，NaCl5g/L，角质1g/L，pH8.0)，50℃，200rpm培养50h后，将角质酶发酵液于4℃，10000rpm离心20min除菌体。上清液通过活性炭柱收集。在通过活性炭柱的清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃，10000rpm离心20min，取沉淀物用适量缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH8)溶解，加入20％硫酸铵，0.22μm膜过滤后制成上样样品。Phenyl HP疏水柱用加入20％硫酸铵的缓冲液A平衡后，将上样样品吸入疏水柱，使之完全吸附后，分别用含20％硫酸铵的缓冲液A、20％～0％硫酸铵梯度的缓冲液A、缓冲液A和去离子水洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，洗脱液分部收集。酶活力部分用缓冲液A平衡的DEAE Sepharose阴离子交换柱进行进一步纯化，洗脱流速1mL/min，收集酶活力组分，用10000道尔顿膜离心浓缩，得纯化角质酶酶制品。纯化后角质酶达到电泳纯，表观分子量30KDa。纯化过程电泳图见图1。
实施例2 本实施例说明角质酶基因的鉴定过程。
将得到的角质酶纯品进行肽指纹图谱测序，测序结果显示和NCBI数据库中Thermobifida fusca编码的蛋白Tfu_0883极其类似，N端测序为ANPYERGP，和蛋白Tfu_0883相同，蛋白Tfu_0883通过序列预测为甘油三酯酶，没有指明其有角质酶活性。将野生菌角质酶纯品进行角质(经氯仿、甲醇萃取，果胶酶、纤维素酶处理的苹果皮)的酶水解。将300mg角质加入pH8.0，10mL50mM磷酸钾缓冲液，加入纯化角质酶30℃振荡反应18h，反应结束后加入冰醋酸终止反应，产物脂肪酸用氯仿萃取，并进行甲酯化硅烷化之后，用GC-MS测定，发现产生大量角质水解产物脂肪酸，种类和比例与其他角质酶的水解产物相同。同时此角质酶也可水解甘油三酯和可溶性酯，说明此酶确实为角质酶，不仅仅是数据库中蛋白Tfu_0883预测的甘油三酯酶。
实施例3 本实施例说明角质酶编码基因的分离克隆程序。
Thermobifida fusca菌株在LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA(三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％SDS(十二烷基硫酸钠)和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μL NaCl(5M)和80μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，65℃下保温20min，用700μL的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿：异戊醇(24：1)抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为Thermobifida fusca总DNA。
根据蛋白Tfu_0883的基因设计引物P1、P2：
P1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
P2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
利用上述引物，以Thermobifida fusca总DNA为模版，PCR扩增角质酶基因。PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收。回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板。经37℃培养过夜，平板上长了大约二十个左右的菌落，挑六个菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明此基因全长906个核苷酸，编码301个氨基酸，和蛋白Tfu_0883的基因有两个核苷酸的差异，编码氨基酸相同。此基因和真菌角质酶基因同源性低，是第一个报道的细菌角质酶基因。
实施例4 本实施例说明角质酶基因的改造程序。
由于在目标基因内部存在一个Nco I酶切位点，而基因两端分别为Nco I和EcoR I位点，所以设计引物将Nco I位点突变去除，以方便下步得克隆表达。以连接了角质酶基因的pMD18-T simple载体为模板进行定点突变PCR，设计引物P3、P4：
P3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
P4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min。将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞。转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果正确，验证了已经成功突变去除Nco I位点。
实施例5 本实施例说明角质酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建程序。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记。将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒。
实施例6 本实施例说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。
将质粒CUT-pET20b(+)热击转化E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再氨苄青霉素(100mg/L)-氯霉素(50mg/L)-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子(重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21Rosetta(DE3)PlysS)在TB培养基(甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO412.54g/L，KH2PO42.31g/L)中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/LIPTG(异丙基硫代βD半乳糖苷)诱导，降温至24℃培养，44h时产酶达180u/mL。发酵上清液电泳图见图2，表观分子量31kDa。将重组酶进行和实验二相同的酶水解试验，发现和野生菌角质酶具有相同的性质，重组酶可水解角质、甘油三酯和可溶性酯，结果表明角质酶基因实现高效表达。
序列表
<210>SEQ ID NO：1
<211>906
<212>DNA
<213>嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11
<400>1
<210>SEQ ID NO:2
<211>301
<212>PRT
<213>嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11
<400>2
Claims (2)
1.一种氨基酸序列为SEQ ID NO：2的多肽的应用，其特征是用作角质酶。
2.一种表达如权利要求1所述的用作角质酶的多肽的编码基因的方法，其特征是：
(1)角质酶编码基因的分离克隆：
角质酶编码基因的分离：
嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL 10％十二烷基硫酸钠和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入5M的NaCl100μL和十六烷基三甲基溴化铵80μL，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比为25∶24∶1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比为24∶1的混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL 70％浓度的乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为Thermobifida fusca总DNA；
角质酶编码基因的克隆：
根据蛋白Tfu_0883的基因设计引物P1、P2：
P1：5’-ggAATACCATATgTCCATggCCAACCCCTACgAgCgCgg-3’
P2：5’-CATCTCgAgAgAATTCgggAACgggCAggTggAgCg-3’
利用上述引物，以Thermobifida fusca总DNA为模版，PCR扩增角质酶基因，PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到780bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-Tsimple载体连接，连接产物转化大肠杆菌(E.coli)JM109，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，平板上挑六个菌落，接入LB液体培养基，10h后提取质粒，将此质粒进行序列测定，结果表明此角质酶基因全长906个核苷酸，编码301个氨基酸；
(2)角质酶基因的改造：
以连接了角质酶基因的pMD18-T simple载体为模板进行定点突变PCR，设计引物P3、P4：
P3：5’-CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC-3’
P4：5’-gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg-3’
PCR反应在50μL体系中进行，反应条件为在95℃变性5min后开始循环，然后95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸4min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布于含100mg/L氨苄青霉素-LB平板，挑选单菌落接入含100mg/L氨苄青霉素-LB液体培养基，经37℃过夜培养，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果验证已突变去除Nco I位点；
(3)角质酶基因在大肠杆菌表达载体上的构建：
用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和角质酶基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于含100mg/L氨苄青霉素-LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的CUT-pET20b(+)质粒；
(4)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：
将质粒CUT-pET20b(+)热击转化大肠杆菌(E.coli)BL21 Rosetta(DE3)PlysS宿主菌，再于100mg/L氨苄青霉素-50mg/L氯霉素-LB平板上经37℃培养过夜，挑选转化子：重组菌CUT-pET20b(+)/E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS，在TB培养基：甘油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，K2HPO4 12.54g/L和KH2PO4 2.31g/L，中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基37℃培养3h后用4mg/L异丙基硫代βD半乳糖苷诱导，降温至24℃培养，44h时产酶达180u/mL，角质酶基因实现高效表达。
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