CN101161674B - 一种环肽,其制备方法和其应用 - Google Patents
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Abstract
一种环肽，由3-15个氨基酸通过肽键连接而成，环肽中氨基酸种类为常见或不常见氨基酸、天然或合成氨基酸，其构型为L-型或D-型，连接顺序由氨基酸之间自由组合。优选结构式(I)由8个常见氨基酸通过肽键连接而成的环肽，此环肽的制备方法，及其在制备免疫抑制作用药物中的应用。
Description
技术领域：本发明涉及药物技术领域，具体地，涉及一种环肽化合物，其制备方法，及其在制备抗免疫抑制作用药物中的应用。
背景技术：免疫抑制剂(Immunosuppressant)是一类具有免疫抑制的药物，其主要功能是抑制机体异常的免疫反应，以用于多种器官移植(Organ transplantation)时的抗排斥反应和自身免疫性疾病(auto-immune diseases)的治疗。20世纪，伴随着外科手术和免疫抑制药物的进展，器官移植已经成为脏器功能衰竭的有效和常规治疗手段。据资料统计，2005年，中国完成肾移植手术约8000例，肝移植手术近4000例，同期美国完成器官移植手术达14492例。目前，我国能够移植的器官种类和每年实行移植手术的数量均处于亚洲首位，且我国器官移植的实施以每年5000余例次递增。器官移植时及手术成功后，患者面临的最大问题是如何保护移植的器官不被人体免疫系统排斥，使其能够长期存活，现代医学认为服用免疫抑制性药物是最好的办法。因此，器官移植领域的发展与免疫抑制药物的创新发现密切相关，器官移植患者数量的逐年上升以及移植后终身服用抗排斥药物的特点，同时决定了新型免疫抑制药物的重要性和巨大市场潜力。自身免疫性疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病、肾病综合征、重症肌无力等等，范围广，病理复杂，迁延难愈，但该类疾病发生的基本病理机制是免疫耐受的缺失，因此采用免疫抑制剂进行治疗，已成为医学界的共识。鉴于器官移植手术逐年上升，且患者须终身服用，以及众多自身免疫性疾病发病增加，治疗困难且周期较长，因此研制新型免疫抑制药物将会对其患者带来福音，并具有较好的市场发展前景。免疫移植药物的发展历经了几个里程碑式的发展。1960年以前，由于缺少有效的免疫抑制剂，当时虽已开始肾移植，但移植后器官尚不能长期存活；1960年后的20年间硫唑嘌呤((Azathioprine，AZ)的发现，以及其与氢化泼尼松的联合使用在某种程度上抑制了排斥反应，使得器官移植的范围及成功率大大增加；1980年后迄今环孢菌素(Cyclosporin A，CyA)的发现与临床应用，使20多年来器官移植取得最重大进展(环孢菌素是瑞士诺华公司于1984年成功上市的产品，于1995年对其进行了剂型改造，形成了现在临床中最为广泛使用的新山地明)。近年来，继环孢菌素后，一系列新型免疫抑制药物从自然界中被发现，包括他克莫司(FK506)、西罗莫司、15-脱氧精胍菌素，麦考酚酸酯、赛尼哌，咪唑立宾，以及单克隆抗体、细胞因子类等。这些药物虽然具有一定的治疗作用，但由于缺乏选择性和不容忽视的毒副作用如肾脏毒性、神经毒性、诱发癌症与感染等，因此目前可供使用的免疫抑制类药物仍然远远不能满足临床的需求，也因此寻找高效、低毒的新型免疫抑制药物仍是目前和今后国际制药界的热点之一。自然界在漫长的演化过程中，积累了众多具有不同药理作用特点的药物分子宝库，中草药就是中华民族自古智慧地认识和利用自然的典型。我们认为从具有特定治疗作用的中草药中有望借助现代定向生物活性筛选手段发现具有治疗意义的现代创新药物，并循着这一哲学和方法学，曾经高效、捷径地发现了一批具有前景的药用分子。风湿病的形成被认为是与免疫和抗炎药理有关，因此从抗风湿中草药中发现具有强生理活性、低副作用的免疫抑制活性物质是可能的，如从民间治疗类风湿关节炎的雷公藤中发现免疫抑制活性的雷公藤内酯醇，并已经进入临床就是例证。因此，抗风湿中草药可能是自然界中继真菌后免疫抑制活性物质的另一重要来源。短瓣花环肽F(brachystemin F)是从云南抗风湿中草药短瓣花(Brachystemma calycinum)中发现的一类具有抑制T-，B-淋巴细胞转化的环八肽天然产物(临床上使用的环孢菌素为真菌来源的环十一肽)，目前尚未见其结构式报道，因此其是一种新化学物质，其生物活性属于首次发现。
发明内容：本发明的目的在于提供一种新的具有免疫抑制药物药用价值的化合物短瓣花环肽F(brachystemin F)；另一目的在于提供一种从中草药中提取、分离该发明化合物的方法；还在于提供该发明化合物在制备免疫抑制性药物以及药物组合物中的应用，以及其在器官移植和自身免疫系统疾病中的应用。
本发明是基于中草药中蕴藏的宝贵药用分子资源，结合现代定向活性筛选的策略而发现的；旨在解决目前免疫抑制性药物存在的缺陷，发展高效、低毒的新型治疗药物，用于器官移植和自身免疫性疾病的治疗；其有益效果是从天然产物出发，产生新型免疫抑制剂，提高器官移植的成功率和患者的生存期，克服自身免疫性疾病的治疗瓶颈，同时带来巨大的市场经济效益。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种环肽，由3-15个氨基酸通过肽键连接而成。
所述环肽中氨基酸种类为常见或不常见氨基酸、天然或合成氨基酸，其构型为L-型或D-型，连接顺序由氨基酸之间自由组合。
优选的环肽，是具有结构式(I)的由8个常见氨基酸通过肽键连接而成的环肽，结构中含有2个脯氨酸，2个色氨酸，1个酪氨酸，1个苯丙氨酸，1个丙氨酸和1个异亮氨酸。
(I)：短瓣花环肽F(Brachystemin F)的化学结构式
本发明的制备权利要求1环肽的方法是，取短瓣花(Brachystemma calycinum)的根，晒干，粉碎，用90％乙醇回流提取，提取液合并，减压浓缩后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取物经硅胶和反相材料RP-18反复柱层析，以6当量盐酸封管，110℃加热水解1小时，喷以茚三酮试剂，通过比较水解前后斑点显色状况确定合并原则，制得结构式(I)所示短瓣花环肽F(Brachystemin F)，其结构为环(脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸)[cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)]。
更具体地，本发明从中草药中提取分离本发明化合物短瓣花环肽F(Brachystemin F)的方法和步骤为：
采集短瓣花(Brachystemma calycinum)的根(13kg)，晒干，粉碎。用90％乙醇回流提取4次，分别为2.0，1.5，1.0和1.0小时。提取液合并，减压浓缩后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物50g经硅胶柱层析(2.3kg，200-300目)，以氯仿-甲醇(100：0-70：30)梯度洗脱，收集流份经薄层展开后，用6当量盐酸封管，110℃加热水解1小时，喷以茚三酮试剂，通过比较水解前斑点不显色，而水解后斑点呈现阳性反应以确定合并原则。共得到12个含环肽的组份，其中组份VIII经干柱硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇(10：1)和氯仿-甲醇(8：1)洗脱后，以上述方法进行薄层检测，合并得环肽组份VIII-A(764mg)，本组份经反相材料RP-18(40-63μm)柱层析，以甲醇-水(50：50-55：45-63：37)梯度洗脱，收集含环肽的组得VIII-A-A(489mg)，本组份经进一步硅胶柱层析，氯仿-甲醇(12：1)洗脱，得本发明的纯化合物短瓣花环肽F(brachystemin F)(481mg)。即环(脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸)[cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)]。
本发明的另一种制备本发明环肽的方法，是采用组合化学或有机合成的方法制备。
此外，本发明提供了其中含有治疗有效量的权利要求1或2或3的环肽化合物和/或药学上可接受的载体的药物组合物，以及其中含有治疗有效量的权利要求1或2或3的环肽化合物和/或药学上可接受的载体的免疫抑制剂。
本发明的环肽化合物可用在制备免疫抑制作用药物中，以及用在器官移植和免疫系统疾病中的治疗或辅助治疗。
本发明化合物可用于直接制备免疫抑制药物，可用于药物研究模板，通过组合化学方法合成一系列由不同种类、个数、构型常见或非常见氨基酸以不同连接顺序连接形成的环肽衍生物，用于系列免疫抑制药物的发现和制备。
本发明化合物可以直接应用，可以与其它药物包括植物提取物组成组合物的形式使用，可以使用不同的药用辅料，制成多种固体制剂和液体制剂，包括注射剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经注射(静注、肌注)和口服两种形式给药。使用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。对成人来说，给药量每天1～100mg比较合适。
具体实施方式：
下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
短瓣花环肽F[Brachystemin F：cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)]的制备及结构鉴定：
采集短瓣花(Brachystemma calycinum)的根(13kg)，晒干，粉碎。用90％乙醇回流提取4次，分别为2.0，1.5，1.0和1.0小时。提取液合并，减压浓缩后依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取物50g经硅胶柱层析(2.3kg，200-300目)，以氯仿-甲醇(100：0-70：30)梯度洗脱，收集流份经薄层展开后，用6当量盐酸封管，110℃加热水解1小时，喷以茚三酮试剂，通过比较水解前斑点不显色，而水解后斑点呈现阳性反应以确定合并原则。共得到12个含环肽的组份，其中组份VIII经干柱硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇(10：1)和氯仿-甲醇(8：1)洗脱后，以上述方法进行薄层检测，合并得环肽组份VIII-A(764mg)，本组份经反相材料RP-18(40-63μm)柱层析，以甲醇-水(50：50-55：45-63：37)梯度洗脱，收集含环肽的组得VIII-A-A(489mg)，本组份经进一步硅胶柱层析，氯仿-甲醇(12：1)洗脱，得本发明的纯化合物短瓣花环肽F(brachystemin F)(481mg)。即环(脯氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-色氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-色氨酸-酪氨酸)[cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)]。此化合物为新化合物，通过氨基酸分析和光谱资料(MS：ESI/Ion Trap，ESI/Q-TOF，MALDI/TOF和NMR)推定其结构式为：cyclo(Pro-Pro-Ile-Ser-Phe-Ala-Ser-Tyr)，命名为短瓣花环肽F(Brachystemin F)。
短瓣花环肽F(Brachystemin F)的结构鉴定数据：
氨基酸分析用日立835—50型氨基酸分析仪，分析条件为：样品经6当量盐酸110℃封管水解24小时；质谱(MS)用ESI/Ion Trap以确定碎片裂解途径，ESI/Q-TOF以确定精确分子量，MALDI/TOF配以CID以提供序列方向；核磁共振谱(1H NMR和13C NMR)用Bruker AM-400光谱仪测定，TMS为内标，pyridine—d5为测试溶剂；柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂产品；反相材料RP-18为日本Daiso有限公司产品。
短瓣花环肽F(Brachystemin F)的结构式如下所示：
短瓣花环肽F(Brachystemin F)：白色无定形粉末；Rf：0.25(乙酸乙酯/甲醇：4：1)；0.33(氯仿/甲醇：6：1)；0.45(75％甲醇，RP-18)；分子式：C43H58N8O11；分子量：862；MS：MALDI/CID给出“a”series：-Tyr-Pro-Pro-Ile/Leu-Ser-Phe-Ala-Ser-和“y”series：-(TyrPro)-Pro-Ile/Leu-Ser-Phe-Ala-Ser-；对750.5进行MS3给出Ser-Phe-Ala-Ser；HR-MS：885.4042[M+Na]+(calcd.for C43H58N8O11Na：885.4123)；1H NMR(py-d5，400MHz)，13C NMR(py-d5，100MHz)：见表1。
表1：短瓣花环肽F(Brachystemin F)的核磁共振波谱数据
实施例2：
按实施例1的方法制得短瓣花环肽F(Brachystemin F)，按常规法加注射用水，精滤，灌封灭菌可制成注射液。
实施例3：
按实施例1的方法制得短瓣花环肽F(Brachystemin F)，将其溶于无菌注射用水中，用无菌漏斗过滤，分装，低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。
实施例4：
按实施例1的方法制得短瓣花环肽F(Brachystemin F)，将其与适当药用辅料混合制成片心，包衣即得肠溶片。
实施例5：
按实施例1的方法制得短瓣花环肽F(Brachystemin F)，按常规法配以各种药用辅料可制成各种其它固体和液体制剂。
实施例6：
本发明化合物短瓣花环肽F(Brachystemin F)及其与药用辅料组成的药物组合物的免疫抑制药理作用。
(1)实验原理：利用纯系小鼠脾T/B淋巴细胞增殖反应，观察样品对细胞或体液免疫系统的影响。
(2)实验方法：常规无菌采取Balb/C小鼠的脾脏，轻轻研磨后，过200目钢网，RPMI 1640培养液洗一次，2000rpm×5min离心，细胞沉淀用双蒸水1min，双盐水1min破坏红细胞，离心弃上清，1640培养液调细胞浓度至2×106/ml，10μl/孔，种于96孔板，同时加ConA(终浓度5μg/ml)或LPS(终浓度15μg/ml)，90μl/孔。加不同浓度样品10μl/孔，同时设阳性药物环胞素A为阳性对照，加诱导剂、但未加药为阴性对照孔，未加诱导剂和未加药为空白对照孔。37℃、5％CO2孵育72h，培养结束前4h，加MTT 100μl(终浓度0.04％)，培养结束后，测定OD值(激发波长540nm)。淋巴细胞转化率＝(阴性对照孔OD值-样品孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白对照孔OD值)*100
(3)实验结果：见表2(实验报告由中国医学科学院协和医科大学药物研究所提供)。
表2 短瓣花环肽F(Brachystemin F)
对T-/B-淋巴细胞增殖的抑制活性数据
结果表明，短瓣花环肽F对T-/B-淋巴细胞的增殖均具有较强的免疫抑制活性，且对T-淋巴细胞的抑制活性优于对B-淋巴细胞的作用，其IC50分别达到0.14μg/ml和3.0μg/ml，即本发明化合物对细胞和体液免疫均具有抑制作用。这一结果表明本发明化合物可用于免疫抑制药物的制备，用于器官移植、自身免疫性疾病或过敏性疾病的治疗。
Claims (6)
1.结构式(I)所示的由2个脯氨酸，2个色氨酸，1个酪氨酸，1个苯丙氨酸，1个丙氨酸和1个异亮氨酸通过肽键连接而成的环肽，
结构式(I)。
2.制备权利要求1环肽的方法，采用组合化学或有机合成的方法制备。
3.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1的环肽化合物和/或药学上可接受的载体。
4.一种免疫抑制剂，其中含有治疗有效量的权利要求1的环肽化合物和/或药学上可接受的载体。
5.权利要求1环肽化合物在制备免疫抑制作用药物中的应用。
6.权利要求1环肽化合物在制备器官移植辅助药物中的应用。
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