CN101148649B

CN101148649B - 一种坚强芽孢杆菌及其菌剂和应用

Info

Publication number: CN101148649B
Application number: CN2007101212746A
Authority: CN
Inventors: 马平; 李社增; 鹿秀云; 郭庆港
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2007-09-03
Filing date: 2007-09-03
Publication date: 2010-06-09
Anticipated expiration: 2027-09-03
Also published as: CN101148649A

Abstract

本发明公开了一种坚强芽孢杆菌SAB-1(Bacilliusfirmus SAB-1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2100；本发明还公开了利用坚强芽孢杆菌SAB-1制备的微生物菌剂，本发明SAB-1菌株可用于草莓白粉病的防治，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染等特点。

Description

一种坚强芽孢杆菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于农用微生物领域，具体地说涉及一种坚强芽孢杆菌，以及利用该坚强芽孢杆菌生产的微生物菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

草莓白粉病是草莓生产中的主要病害。近年来，草莓白粉病的发生逐渐加重，特别是保护地草莓白粉病，发生严重时，病叶率在45％以上，病果率在50％以上，严重影响了草莓的产量、品质和经济效益(杨联伟.烟台果树，2005(3)：15～16)。因此，农民称草莓白粉病为“草莓的癌症”。草莓白粉病由草莓白粉菌引起，草莓白粉菌为羽衣草单囊壳(Sphaerotheca aphanis)，属子囊菌亚门白粉菌目白粉菌科单囊壳属，草莓白粉菌属于专性寄生菌(Peries O S.Mycologia，1962，52：380～386)。目前，防治草莓白粉病的主要方法是利用抗病品种和化学药剂。但是，通常情况下抗病品种的品质较差；化学药剂防治又存在容易使病菌产生抗药性，以及产生果实污染和环境污染问题，此外，对草莓白粉病防治效果较好的所有唑类药剂都抑制草莓的生长。而生物农药由于选择性强、效率高、成本低、不污染环境、对人畜无害等优点越来越受到人们的关注(刘博等.河南农业科学，2007(2)：20-23)，通过筛选和利用抗草莓白粉病的有益生物及其代谢产物，使生物防治成为控制草莓白粉病的有效途径。

目前，防治草莓白粉病的比较有效的微生物或微生物产物主要有：不吸水链霉菌杭州变种(Streptomyces ahygroscopuus v ar.hangzhouensis)(叶琪明等.中国生物防治，2001，17(2)：封3)，天然化合物蛇床子素(迮福惠等.莱阳农学院学报，2005，22(3)：189～190和严清平等.农药，2005，44(3)：136～137)，蜡状芽孢杆菌TS-02(陈冲等.安徽农业科学，2007，35(11)：3298～3300)。

人们对芽孢杆菌生防潜能的研究至少已有40年的历史，田间应用研究已经证实芽孢杆菌生防菌剂在产品中的稳定性，与化学农药的相容性和不同植物不同年份防效的一致性方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌(Monica L E等.Pest Manag Sci，2001，57(8)：695～706.)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是生物防治中报道较多的一种拮抗细菌，在植物病害的生物防治中发挥着尤为重要的作用(何礼远.生物防治通报.1985，1(3)：28～31。孔建等.微生物学报，1992，32(6)：445-449。鲁素云.北京农业大学出版社，1993)，它能够产生广谱的抗菌代谢物质，是土壤和植物微生态的优势微生物种群，具有很强的抗逆能力和抗菌防病作用，许多优良的天然分离株已成功地应用于植物病害生物防治(Cavaglieri L等，Researchin Microbiology，2005.156(5/6)：748～754)，但有关坚强芽孢杆菌在生物防治中的作用尚少见报道，朱天辉等(林业科学，2007，43(2)：120～123).谯天敏等，林业科技，2007，31(1)：28～31))等从松苗圃土壤中分离纯化出的一株具有拮抗活性的坚强芽孢杆菌(B.firmus)。因此，筛选对病原菌具有抑制作用的芽孢杆菌是防治有关植物病害的最有效方法之一。经过检索，还没有发现能用于防治草莓白粉病的坚强芽孢杆菌。

发明内容

本发明目的之一是针对防治草莓白粉病中存在的问题，提供一种可用于草莓白粉病生物防治的具有高效、广谱杀菌活性的坚强芽孢杆菌菌株。

本发明第二个目的是提供一种利用坚强芽孢杆菌菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。

本发明第三个目的是提供了本发明坚强芽孢杆菌菌株在防治草莓白粉病上的用途。

本发明通过以下技术方案实现：

一种坚强芽孢杆菌SAB-1(Bacillius firmus SAB-1)，已于2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2100。

利用上述坚强芽孢杆菌SAB-1生产的微生物菌剂，其活性成分为坚强芽孢杆菌SAB-1菌体和它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液态制剂。

上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的SAB-1菌株接种LB平板培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时；然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～32℃下培养20～24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；

(2)种子液的制备：按照0.05～0.5％比例(体积百分比)向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28～34℃下震荡培养12～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照1～10％比例(体积百分比)接入玉米粉豆饼粉培养基中，再在28～34℃、摇床转速为170～210rpm的条件下培养22～25小时，得菌株SAB-1的液体制剂；

其中所述的玉米粉豆饼粉培养基的组分及其重量百分比为：玉米粉2.5％～3.5％，豆饼粉2.5％～3.5％，NaCl0.4％～0.6％，CaCO₃ 0.1％～0.2％，KH₂PO₄0.01％～0.03％和MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.04％，其余为水。

上述制备方法步骤(1)中所述的低温是指通常保存菌种所用温度，本领域技术人员根据常识可知。

上述制备方法步骤(1)或(2)中所述的LB平板培养基、LB斜面培养基或LB液体培养基的组成成份及其制备方法都是本领域技术人员熟知的，可按照通常的方法制备。

上述玉米粉豆饼粉培养基的制备方法，按照重量百分比称取玉米粉、豆饼粉、NaCl、CaCO₃、KH₂PO₄和MgSO₄，将它们混合后，再加水至所需体积即可。

上述制备方法步骤(3)中所述的温度优选为30～32℃，摇床转速优选为210rpm，培养时间优选为24小时。

上述微生物菌剂，其坚强芽孢杆菌SAB-1的活菌数大于5×10⁹cfu/g。

上述坚强芽孢杆菌SAB-1在防治植物病害上的应用。

上述坚强芽孢杆菌SAB-1在防治草莓白粉病上应用。

本发明菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释，然后将稀释后的液体菌剂于草莓白粉病发病高峰前进行叶面、花蕾和果实表面喷雾，也可同时喷洒于草莓地的地表，即可达到控制草莓白粉病的目的。

SAB-1菌株的筛选分离过程：

SAB-1菌株是河北省农林科学院植物保护研究所从新疆的棉花黄萎病田土壤中分离得到的。2003年河北省农林科学院植物保护研究所从新疆农场的棉花田间五点采集土样，混匀后称取10g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170r/min振荡30min，静置2h，取上清液1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-2倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，各浓度取200μL微生物悬液涂于PDA、改良PDA、LB和KB培养基平板上，每个浓度3次重复，在28℃恒温分别培养1d、3d和5d，分别进行微生物的分离和纯化。并以草莓白粉病(Sphaerotheca aphanis)为靶标防治靶标病害，在大棚草莓种植田中进行微生物防病效果测定的筛选。结果从中筛选出一个对靶标病害具有显著防效的细菌菌株，编号为SAB-1。

SAB-1菌株的特征：

(1)形态特征

菌株SAB-1的细胞革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，培养8h后产生芽孢，芽孢中生，椭圆形，孢囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴孢晶体。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡乳白色，边缘不整齐，表面较湿润，有细小褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。

(2)16SrDNA序列测定

用于扩增细菌16SrDNA的引物为：F27：(5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’)与R1492(5‘GGCTACCTTGTTACGACTT’3)。以SAB-1的基因组DNA为模板扩增16S rDNA，并进行测序，结果SAB-1的16SrDNA序列见序列表。将所得SAB-1的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，同时根据其16S rDNA序列用DNAMAN Version 4.0分析获得了其进化树(图1)。同源性比较结果表明菌株SAB-1与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的16S rDNA同源性均达到98％(图2和图3)，说明SAB-1菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)生理生化特征

将SAB-1菌株进行生理生化性状检测。结果(见表1)表明，SAB-1菌株的生理生化特征具有坚强芽孢杆菌生理生化特征，说明SAB-1菌株属于一种坚强芽孢杆菌。

细菌常规鉴定手册(《一般细菌常用鉴定方法》等)显示坚强芽孢杆菌可运动，好氧，革兰氏染色阳性，芽孢椭圆形或柱状，胞囊不膨大，在pH5-7的培养基上能够生长，在2％-10％NaCl培养基中均能生长；生长温度为10～45℃，最适生长温度28～31℃。甲基红反应阴性，V-P反应阴性。不能利用柠檬酸盐。接触酶反应阳性，卵磷脂酶阴性。将以上SAB-1菌株的部分生理生化性状检测结果与枯草芽孢杆菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物细菌研究细菌分类组编，科学出版社，1978年)，《芽孢杆菌属》)(蔡妙英，战立克等译，农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠，上海复旦大学出版社，1995)的检索表进行检索，确定菌株SAB-1生理生化性状与坚强芽孢杆菌相应性状吻合。同时结合16S rDNA序列同源性分析结果，最终鉴定SAB-1菌株为坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)。

表1菌株SAB-1生理生化测定结果

注：“+”表示阳性结果，“-”表示阴性结果，“ND”表示未测定，“d”表示11％-89％菌株为阳性。

本发明所具有的优点和有益效果：(1)本发明提供了一种能高效防治草莓白粉病等植物病害的坚强芽孢杆菌菌株，为防治草莓白粉病等植物病害提供了一种生物防治的新途径；(2)本发明生防效果显著，对草莓白粉病的防治效果达到90.31％～93.42％；(3)本发明制备方法简单、成本低、易于推广应用；(4)本发明无污染，无公害，低残留，对环境友好，对提高农产品质量和产量具有重要作用，同时能提高我国农产品的国际竟争力。

附图说明

图1为根据16SrDNA序列用DNAMAN 5.2.2分析获得的进化树结果。

图2为坚强芽孢杆菌SAB-1菌株与枯草芽孢杆菌168菌株(Bacilliussubtilis 168)的16S rDNA基因序列同源性比较结果。其中B.subtilis 168和B.licheniformis ATCC14580序列中“-”表示与SAB-1相应的碱基相同，“g、a、c、t”表示与SAB-1相应位点的碱基不同。

图3为坚强芽孢杆菌SAB-1菌株与地衣芽孢杆菌菌株(B.licheniformisATCC 14580)的16S rDNA基因序列同源性比较结果。其中B.subtilis 168和B.licheniformis ATCC14580序列中“-”表示与SAB-1相应的碱基相同，“g、a、c、t”表示与SAB-1相应位点的碱基不同。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1

SAB-1微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-40℃的菌株SAB-1在LB平板培养基上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁(30℃)培养，得接种液；其中LB平板培养基及LB斜面培养基组分及配比为：酵母浸膏0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂粉1％；蒸馏水97％，pH7.0-7.4；

(2)种子液的制备：在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)一接种环上述活化好的SAB-1菌株接种液，在摇床上进行振荡培养，转速190rpm，并在30℃下培养24小时，得种子液；其中LB液体培养基组分及配比为：酵母浸膏0.5％，胰蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水98％，pH7.0-7.4；

(3)玉米粉豆饼粉培养基的制备：按照3、0％玉米粉，3.0％豆饼粉，0.5％NaCl，0.1％CaCO₃，0.02％KH₂PO₄和0.03％MgSO₄·7H₂O配制培养基，然后加水补齐100％，搅拌混合得玉米粉豆饼粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；高压湿热灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉豆饼粉培养基中接种步骤(2)所得种子液2mL；在28℃恒温、转速190rpm条件下进行发酵培养；

(5)17h以后，每隔30分钟从步骤(4)的三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90％即可停止发酵培养；即得坚强芽孢杆菌SAB-1液体制剂。

实施例2

本试验在河北省保定市满城县农户路新站的草莓大棚内进行，每小区两行，四次重复，随机区组排列。实验时整个棚内草莓叶上白粉病中度发生。采用背负式手动喷雾器接种实施例1所制备的坚强芽孢杆菌SAB-1菌剂(用水进行稀释，含菌体10⁸cfu/mL)；另设对照药剂(10％世高水分散粒剂，市购，瑞士先正达生产，1500倍水稀释液喷雾处理)和空白对照(清水喷雾)；待空白对照充分发病后调查，草莓白粉病级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(二)第119部分：杀菌剂防治草莓白粉病(GB/T17980.119-2004)。并计算病情指数和防效。试验结果(见表2)表明，坚强芽孢杆菌SAB-1的菌剂处理后草莓白粉病的防治效果显著高于空白对照和药剂对照，其防效达到93.42％。枯草芽孢杆菌菌株SAB-1对草莓白粉病表现了较好的防治效果。

表2坚强芽孢杆菌SAB-1对草莓白粉病的作用效果

处理	处理前病情指数	处理后病情指数	防效(％)
处理	处理前病情指数	处理后病情指数	防效(％)	SAB-1	95.00	5.00	93.42a

处理	处理前病情指数	处理后病情指数	防效(％)
处理	处理前病情指数	处理后病情指数	防效(％)	药剂CK	95.00	45.00	40.79b
空白CK	50.00	40.00	0.00c	药剂CK	95.00	45.00	40.79b

实施例3

本试验在河北省高碑店市昊龙绿色科技示范园314棚进行，每小区两行，四次重复，随机区组排列。实验时整个棚内草莓叶上白粉病中度发生。采用背负式手动喷雾器接种实施例1所制备的坚强芽孢杆菌SAB-1菌剂(用水进行稀释，含菌体10⁸cfu/mL)；另设对照药剂(10％世高水分散粒剂，市购，瑞士先正达生产，1500倍水稀释液喷雾处理)和空白对照(清水喷雾)；待空白对照充分发病后调查，草莓白粉病级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准农药田间药效试验准则》(二)第119部分：杀菌剂防治草莓白粉病(GB/T17980.119-2004)。并计算发病率和防效。试验结果(见表3)表明，坚强芽孢杆菌SAB-1的菌剂处理后草莓白粉病的防治效果显著高于空白对照和药剂对照，其防效达到90.31％。枯草芽孢杆菌菌株SAB-1对草莓白粉病表现了较好的防治效果。

表3坚强芽孢杆菌SAB-1对草莓白粉病的作用效果

处理	处理前发病率(％)	处理后发病率(％)	防效(％)
处理	处理前发病率(％)	处理后发病率(％)	防效(％)	SAB-1	70.00	5.00	90.31a
药剂CK	75.00	35.00	36.67b	SAB-1	70.00	5.00	90.31a
药剂CK	75.00	35.00	36.67b	空白CK	95.00	70.00	0.00c

实施例4

本试验在河北省高碑店市昊龙绿色科技示范园308棚进行，每小区两行，四次重复，随机区组排列。实验时整个棚内草莓果上白粉病中度发生。处理分为菌体悬浮液和去菌体胞外代谢产物。将实施例1所得的坚强芽孢杆菌SAB-1菌剂稀释(含菌体10⁸cfu/mL)，然后将SAB-1菌剂稀释液分成两份，一份用于直接喷雾(处理为培养液，含菌体与代谢产物)；一份在5000转/分条件下离心20分钟，上清液是坚强芽孢杆菌SAB-1的胞外代谢产物；沉淀用离心前等量的0.9％的生理盐水悬浮，即为菌体悬浮液(含菌体10⁸cfu/mL)；用清水作为空白对照。结果(见表4)表明，坚强芽孢杆菌SAB-1的培养液(含菌体与代谢产物)、胞外代谢产物、菌体悬浮液处理的防治效果差异不显著，但是都显著高于空白对照和药剂对照，说明坚强芽孢杆菌SAB-1胞外代谢产物和活菌体对草莓白粉病都有防治作用。因此坚强芽孢杆菌SAB-1防治草莓白粉病的有效活性成分包括坚强芽孢杆菌SAB-1的菌体及其代谢产物。

表4坚强芽孢杆菌SAB-1菌体及胞外代谢物对草莓白粉病的防治效果

处理	处理前发病率(％)	处理后发病率(％)	防效(％)
处理	处理前发病率(％)	处理后发病率(％)	防效(％)	SAB-1培养液	26.79	5.00	78.37a
SAB-1胞外代谢产物	20.88	8.60	52.25a	SAB-1培养液	26.79	5.00	78.37a
SAB-1胞外代谢产物	20.88	8.60	52.25a	SAB-1菌体悬浮液	15.10	5.00	61.63a
药剂CK	25.90	18.33	17.98b	SAB-1菌体悬浮液	15.10	5.00	61.63a
药剂CK	25.90	18.33	17.98b	空白CK	20.50	17.69	0.00c

序列表

<110>河北省农林科学院植物保护研究所

<120>一种坚强芽孢杆菌及其菌剂和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1016

<212>DNA

<213>Bacillus firmus

<400>1

ccacttctgt caccttcggc ggctggctcc ataaaggtta cctcaccgac ttcgggtgtt 60

acaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120

atgctgatcc gcgattacta gcgattccag cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc 180

cgaactgaga acagatttgt gggattggct taacctcgcg gtctcgctgc cctttgttct 240

gtccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300

caccttcctc cggtttgtca ccggcagtca ccttagagtg cccaactgaa tgctggcaac 360

taagatcaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420

gacaaccatg caccacctgt cactctgccc ccgaagggga agccctatct ctaggggtgt 480

cagaggatgt caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc 540

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag tcttgcgacc gtactcccca 600

ggcggagtgc ttaatgcgtt agctgcagca ctaaggggcg gaaaccccct aacacttagc 660

actcatcgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 720

gctcctcagc gtcagttaca gaccagagag tcgccttcgc cactggtgtt cctccacatc 780

tctacgcatt tcaccgctac acgtggaatt ccactctcct cttctgcact caagttcccc 840

agtttccaat gaccctcccc ggttgagccg ggggctttca catcagactt aagaaccgcc 900

tgcgagccct ttacgcccaa taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc 960

tgctggcacg tagttagccg tgctttctgg ttaggtacgt caaggtgccg ccctat 1016

Claims

1.一种坚强芽孢杆菌SAB-1(Bacillius firmus SAB-1)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No、2100。

2.利用权利要求1所述的坚强芽孢杆菌SAB-1生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为坚强芽孢杆菌SAB-1菌体和它的胞外代谢产物。

3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于其所述菌剂为液态制剂。

4.权利要求2或3所述的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(2)种子液的制备：按照0.05～0.5％体积百分比比例向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28～34℃下震荡培养12～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照1～10％体积百分比比例接入玉米粉豆饼粉培养基中，然后在28～34℃、摇床转速为170～210rpm的条件下培养22～25小时，所得即为菌株SAB-1的液体制剂；

其中所述的玉米粉豆饼粉培养基的组分及其重量百分比为：玉米粉2.5％～3.5％，豆饼粉2.5％～3.5％，NaCl 0.4％～0.6％，CaCO₃ 0.1％～0.2％，KH₂PO₄0.01％～0.03％和MgSO₄·7H₂O 0.02％～0.04％，其余为水。

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)所述的温度为30～32℃。

6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)所述的摇床转速为210rpm。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)所述的培养时间为24小时。

8.权利要求1所述的坚强芽孢杆菌菌株SAB-1在防治植物病害上的应用。

9.权利要求1所述的坚强芽孢杆菌菌株SAB-1在防治草莓白粉病上应用。