CN101135688A - 血清中果糖胺nbt测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种血清中果糖胺NBT测定方法，该方法的标准液采用去除脂蛋白的健康人血清为基质；果糖胺测定试剂盒采用双试剂R1、R2组合，所述R1包含NBT反应成分，pH为中性，所述R2为碱性碳酸钾缓冲液，所述R1、R2与待测标本的比例为40～56∶8～12∶3。该测定方法能有效减少各种非特异性还原物质的干扰，消除标准液的脂溶、浑浊现象，解决NBT在储存中的析出问题，测定准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种血清中果糖胺NBT测定方法。
背景技术
糖化血清蛋白(Glucosylated Serum Protein，GSP)是人血清中各种蛋白质与葡萄糖发生缓慢的非酶促糖化反应的产物。其中主要的是白蛋白的糖化，故GSP也可称为糖化白蛋白。由于白蛋白在人体内的半衰期为17天，因而测定GSP能反映测定前2～3周内的平均血糖水平，是糖尿病患者控制血糖的良好指标。因此，GSP的测定对糖尿病的诊断、预防、治疗均有重要意义，尤其是对糖尿病的各种并发症的预防和治疗更为重要。
测定GSP的方法很多，分化学法和层析法两大类；化学法通过测定血清中糖化蛋白上的酮胺(产物)来评价糖化的水平。层析法则是先分离糖化蛋白后再定量，方法繁琐，难以常规应用。近年来，在糖化血清蛋白方面出现了酶法测定技术，效果很好，不过价位太高，还难以普遍应用。化学法常用的有硫代巴比妥酸法和硝基四氮唑蓝(NBT)还原法。前者性能欠佳，已很少应用，目前流行的主要是NBT还原法。
NBT法测定的原理是：蛋白质糖化产物是酮胺，具有还原性，它在碱性溶液中可将NBT还原呈色，在波长550nm处测得的吸光度变化与量成正比，可比色定量。一种人工合成的物质1-脱氧-1吗啉果糖(DMF)，又称果糖胺，其结构近似酮胺，被广泛用作为比色标准。NBT法比较简单，易于操作，加之它比功能类似的糖化血红蛋白(GHb)观察期短(GHb反映100天左右的血糖水平)，发现病情变化的速度快，还有检查的费用低等优点，使这种方法接受快，流行广，问世已有近20年的历史。但近年来陆续发现NBT法还有许多问题和缺点，归纳文献报道大体可分为三大类：
1.标准液中果糖胺的水溶液不够稳定，使用中存在基质效应，造成体系的混浊。
2.血清中其它非特异性还原物质的干扰，例如β-脂蛋白，免疫球蛋白A轻键尿酸，维生素C以及一些能产生还原性代谢物的治疗药物等。
3.NBT在单试剂碱性环境中的析出问题等。
近年来，糖尿病防治领域出现许多新的情况，但NBT法的改进方面，进展不快，为此人们期待NBT法有重大革新，进一步突出优点，改进缺点，使之造福于广大糖尿病患者，本发明就是在这种背景下诞生的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服上述不足之处，而提供一种血清中果糖胺的NBT测定方法，该测定方法能有效减少各种非特异性还原物质的干扰，消除标准液的基质效应和脂浊、浑浊现象，解决NBT在储存中的析出问题，测值准确。
本发明的技术解决方案是，血清中果糖胺NBT测定方法，步骤为：
a.提供标准液、果糖胺测定试剂盒R1、R2试剂以及待测标本；
b.取15μl待测标本和R1试剂200～280μl混匀，置30-45℃孵育3～5分钟；
c.取R2试剂40～70μl与上述混合液混匀，孵育180～240秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测取吸光度的主波长为500～600nm，副波长650～750nm；
d.根据公式：血清果糖胺浓度(mmol/L)＝ΔA测定*标准浓度/ΔA标准得到血清果糖胺浓度；
所述标准液采用去除脂蛋白的健康人血清为基质；所述果糖胺测定试剂盒采用双试剂R1、R2组合，所述R1包含NBT反应成分，pH为中性，所述R2为碱性碳酸钾缓冲液。
所述标准液，其制备方法为：①用健康人混合血清，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.15～0.30um滤膜的过滤器过滤后，用做标准液的基质；先测其白蛋白含量，然后加入牛血清白蛋白，使达到约4.0wt％的浓度，最后加0.05～0.1wt％生物防腐剂，混匀，待用；
②向上述精制血清加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)2g/L，乳糖30g/L，摇匀，待用；
③测上述血清的果糖胺浓度，而后加入果糖胺干粉，使其浓度达到4mmol/L，充分混匀后置2～8℃冰箱过夜；
④24h后分装，后送冻干；
⑤复溶，直接当标准品使用，或把它的果糖胺值转移到经过反复过滤的健康人混合血清中。
本发明血清中果糖胺NBT测定方法所述的R1组分为：
pH6～8的磷酸钾缓冲液 50～100mmol/L
氯化钾 50～100mmol/L
NBT 0.5～1.5mmol/L
聚乙烯醇单烷醚 50～100mmol/L
胆酸钠 5～15mmol/L
尿酸酶 500～1000μ mol/L
Vitc氧化酶 200～500μ mol/L；
R2组分为
碳酸钾 0.1～1.0mmol/L
碳酸氢钾 0.1～0.3mmol/L；
所述R1、R2与待测标本的比例为40～56∶8～12∶3。
测定试剂盒设计成双试剂，R1内含GSP进行反应的全部成分，采用磷酸钾缓冲液，PH 6-8，中性PH有利于NBT及其它反应物的稳定和保存。R2为碱性较强的碳酸钾缓冲液，PH 10.4(25℃)，为果糖胺进行反应的环境条件。
本发明的血清中果糖胺的NBT测定方法，该测定方法能有效减少各种非特异性还原物质的干扰，消除标准液的基质效应和脂浊、浑浊现象，解决NBT在储存中的析出问题，具有广泛的市场前景。
具体实施方式
实施例1
血清中果糖胺NBT测定方法，其具体步骤为：
1.提供标准液、R1、R2试剂以及待测标本；
所述标准液的制备方法如下：①用健康人混合血清，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液(下层弃去)。经0.15～0.30μm滤膜的过滤器过滤后，用做标准液的基质。先测其白蛋白含量，然后加入牛血清白蛋白，使达到约4.0％的重量百分比浓度，最后加0.05％的重量百分比生物防腐剂(如甲基-异噻唑啉PC-300等)，混匀，待用；
②向上述精制血清加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)2g/L，乳糖30g/L，摇匀，待用；
③测上述血清的果糖胺浓度，而后加入Sigma公司购入的果糖胺干粉，使其浓度达到4mmol/L，充分混匀后置2～8℃冰箱过夜；
④次日按每小瓶0.5ml血清分装，后送冻干；
⑤将冻干品每瓶用1.0ml去离子水复溶，冻干品可直接当标准品使用，更多的是把它的果糖胺值转移到经过反复过滤的健康人混合血清中。转移是方法是：以上述精制血清为基质的标准品定标，经过反复过滤的健康人混合血清为基质的待测标准品当样品，按定值要求对待测标准品进行定值，此值就是转移值。
所述的R1组分为：
PH7.5的磷酸钾缓冲液 100mmol/L
氯化钾 100mmol/L
NBT 1.5mmol/L
聚乙烯醇单烷醚 100mmol/L
胆酸钠 15mmol/L
尿酸酶 1000μ mol/L
Vitc氧化酶 500μ mol/L；
所述的R2组分为：
碳酸钾 1.0mmol/L
碳酸氢钾 0.3mmol/L。
所述R1和R2均以水为溶剂。
2.取15μl待测标本和R1试剂240μl混匀，置37℃孵育3分钟；
3.取R2试剂60μl与上述混合液混匀，孵育210秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2。其中，测取吸光度的主波长为546nm，副波长700nm，ΔA＝A2-A1；
4.根据公式：得到血清果糖胺浓度。
实施例2
血清中果糖胺NBT测定方法，其具体步骤为：
1.提供标准液、R1、R2试剂以及待测标本；
所述标准液的制备方法如下：①用健康人混合血清，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液(下层弃去)。经0.15-0.30um滤膜的过滤器过滤后，用做标准液的基质。先测其白蛋白含量，然后加入牛血清白蛋白，使达到约4.0％的重量百分比浓度，最后加0.1％的重量百分比的生物防腐剂(如甲基-异噻唑啉PC-300等)，混匀，待用；
②向上述精制血清加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)2g/L，乳糖30g/L，摇匀，待用；
③测上述血清的果糖胺浓度，而后加入Sigma公司购入的果糖胺干粉，使其浓度达到4mmol/L，充分混匀后置2～8℃冰箱过夜；
④次日按每小瓶0.5ml血清分装，后送冻干；
⑤将冻干品每瓶用1.0ml去离子水复溶，冻干品可直接当标准品使用，更多的是把它的果糖胺值转移到经过反复过滤的健康人混合血清中。转移是方法是：以上述精制血清为基质的标准品定标，经过反复过滤的健康人混合血清为基质的待测标准品当样品，按定值要求对待测标准品进行定值，此值就是转移值。
所述的R1组分为：
pH7.5的磷酸钾缓冲液 62.5mmol/L
氯化钾 62.5mmol/L
NBT 0.75mmol/L
聚乙烯醇单烷醚 70mmol/L
胆酸钠 10mmol/L
尿酸酶 650μ mol/L
Vitc氧化酶 350μ mol/L。
所述的R2组分为：
碳酸钾 0.65mmol/L
碳酸氢钾PH 10.4(25℃) 0.22mmol/L。
所述R1和R2均以水为溶剂。
2.取15μl待测标本和R1试剂200μl混匀，置37℃孵育5分钟；
3.取R2试剂70μl与上述混合液混匀，孵育210秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2。其中，测取吸光度的主波长为546nm，副波长700nm，ΔA＝A2-A1；
4.根据公式：
，得到血清果糖胺浓度。
以下公布根据实施例得到的实验结果：
1.本发明血清中果糖胺NBT测定方法达到的几项技术指标：
a.测试参考值范围：1.58～2.14mmol/L(350例非糖尿病、健康人)。
b.线性范围：0～6mmol/L，判定依据r2≥0.995。
c.精密度：n＝21批内
CV＝0.9％；
批间
CV＝2.9％。
d.回收率：样品浓度为2.28时，回收率为<±10％。
e.准确度：相对偏差≤±15％。
2.R1试剂在贮存条件下的稳定性
将R1试剂分别置于24～26℃、2～8℃环境下，一年之后复测以下指标：
表1 R1试剂在不同贮存条件下的稳定性
| 新鲜 | 24～26℃一年 | 2～8℃一年 | |
| 空白吸光度 | 0.0009 | 0.007 | 0.024 |
| R1中尿酸酶活性 | 100％ | 77％ | 99％ |
尿酸酶是该试剂盒中最不稳定的物质，我们以最初酶活性100％为基准。从表1得出结论：试剂R1贮存一年相对稳定。
3.测定试剂盒最大线性范围、定标的K因数和高、中、低三个水平质控血清的稳定性(行业内这几个是评价试剂盒稳定性的指标)：
表2 试剂盒稳定性测试结果
| 新鲜 | 24～26℃一年 | 2～8℃一年 | ||
| 最大线性范围(mmol/L) | 6.00 | 6.11 | 6.13 | |
| 定标的K因数 | 0.0500 | 0.0518 | 0.0519 | |
| 质控血清(mmol/L) | 高 | 4.25 | 4.15 | 4.33 |
| 中 | 3.82 | 3.87 | 3.94 | |
| 低 | 2.13 | 2.12 | 2.24 | |
从表2可以看到：从以上三个方面观察试剂盒都是稳定的。
4.与罗氏经典测定法的相关性：本试剂与罗氏经典法比较，用二法同测样品110份，得相关系数γ＝0.989，线性拟合Y＝1.03X-13.2、二法相关良好。
5.关于干扰性：通过对该试剂盒进行抗干扰实验实测结果如下：
黄疸： 胆红素浓度<85.5umol/L.
脂血： 相当于甘油三脂<2000mg/dL.
溶血： 相当于血红蛋白<500mg/dL
高糖血症：葡萄糖浓度<900mg/dL
Vitc浓度：<220umol/L
尿酸浓度：<40mg/DL
实验结果表明：只有当病人血清中的含量超过上述这些值时才会对测试值造成一定影响，普通常规的病人血清都无干扰。发明人还曾对20多种常用治疗药物，如维生素C，石旋糖酐，左旋dopa等，在体外进行过实验，只有左旋dopa在治疗剂量时，可致果糖胺升高。
由于测定糖化蛋白的异类基团与NBT的阳性反应没有完全特异化，为慎重起见，发明人坚持评价结果密切结合临床以及其他相关的实验(如HbAlc)等：
6.GSP与空腹血糖的相关性
GSP与HbAlc在10位初诊糖尿病人(到临床随意抽样)的测值的相关数据如下：
表3 GSP与空腹血糖的相关性
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 性别 | 男 | 男 | 男 | 男 | 女 | 男 | 女 | 女 | 男 | 女 |
| 年龄 | 54 | 50 | 62 | 52 | 48 | 35 | 61 | 49 | 48 | 59 |
| 空腹血糖(mmol/L) | 12.38 | 8.7 | 7.53 | 12.67 | 9.82 | 10.4 | 9.33 | 8.52 | 14.36 | 15.08 |
| 糖化血红蛋白(％) | 15.7 | 12.1 | 6.9 | 8.1 | 12.3 | 13.4 | 12.7 | 8.1 | 11.9 | 14.2 |
| 果糖胺(mmol/L) | 3.5 | 3.5 | 2.2 | 3.3 | 2.5 | 3.3 | 3.8 | 2.2 | 2.8 | 3.8 |
这三个项目的参考值上限根据临床检验第三版公布的标准：空腹血糖：6.1mmol/L，HbAlc：6.0％，GSP：2.15mmol/L，以上结果对照参考值上限，完全符合糖尿病的诊断，他们之间的相关十分良好。
综上试验结果，说明本发明血清中果糖胺NBT测定方法采用的标准液和试剂盒稳定，测试准确。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种血清中果糖胺NBT测定方法，步骤为：
a.提供标准液、果糖胺测定试剂盒R1、R2试剂以及待测标本；
b.取15μl待测标本和R1试剂200～280μl混匀，置30-45℃孵育3～5分钟；
c.取R2试剂40-70μl与上述混合液混匀，孵育180～240秒后，空白管调零，读取吸光度A1，90秒后读吸光度A2，其中，测取吸光度的主波长为500～600nm，副波长650～750nm；
d.根据公式：血清果糖胺浓度(mmol/L)＝ΔA测定*标准浓度/ΔA标准得到血清果糖胺浓度；
其特征在于：所述标准液采用去除脂蛋白的健康人血清为基质；所述果糖胺测定试剂盒采用双试剂R1、R2组合，所述R1包含NBT反应成分，pH为中性，所述R2为碱性碳酸钾缓冲液。
2.根据权利要求1所述的血清中果糖胺NBT测定方法，其特征在于：所述R1组分为
pH6～8的磷酸钾缓冲液 50～100mmol/L
氯化钾 50～100mmol/L
NBT 0.5～1.5mmol/L
聚乙烯醇单烷醚 50～100mmol/L
胆酸钠 5～15mmol/L
尿酸酶 500～1000μmol/L
Vitc氧化酶 200～500μmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的血清中果糖胺NBT测定方法，其特征在于：所述R2组分为
碳酸钾 0.1～1.0mmol/L
碳酸氢钾 0.1～0.3mmol/L。
4.根据权利要求1所述的血清中果糖胺NBT测定方法，其特征在于：所述R1、R2与待测标本的比例为40～56∶8～12∶3。
5.根据权利要求1所述的血清中果糖胺NBT测定方法，其特征在于：所述标准液的制备方法为：
①用健康人混合血清，反复冻融数次至上层澄清，取澄清的上层液经0.15～0.30um滤膜的过滤器过滤后，用做标准液的基质；先测其白蛋白含量，然后加入牛血清白蛋白，使达到约4.0wt％的浓度，最后加0.05～0.1wt％生物防腐剂，混匀，待用；
②向上述精制血清加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)2g/L，乳糖30g/L，摇匀，待用；
③测上述血清的果糖胺浓度，而后加入果糖胺干粉，使其浓度达到4mmol/L，充分混匀后置2～8℃冰箱；
④24h后分装，后送冻干；
⑤复溶，直接当标准品使用，或把它的果糖胺值转移到经过反复过滤的健康人混合血清中。
6.根据权利要求5所述的血清中果糖胺NBT测定方法，其特征在于：所述生物防腐剂为甲基-异噻唑啉。
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