CN101126834B - 一种用于点扫描激光共焦显微镜的面内扫描方法和系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于点扫描激光共焦显微镜的扫描方法和系统，该方法首先将样品台、计算机和扫描共焦显微镜测量物镜构成激光共焦扫描显微镜的三维扫描系统，实现自动控制扫描；然后在样品台上对被测样品定位；三维扫描系统使样品台依次进行旋转、一维横向移动，直至被测样品扫描完一层，接着复位进行轴向扫描被测样品下一层，直至被测样品测量完毕。该方法在于不改变光路的情况下，通过样品台的旋转移动完成扫描，克服了以往扫描台存在的机构复杂，扫描速度慢的缺点。主要应用于点扫描的激光共焦显微镜中，但也可用于类似的光点扫描测量系统中。

Description

一种用于点扫描激光共焦显微镜的面内扫描方法和系统

技术领域

本发明属于生物、医疗、微纳制造等科学仪器用的光电探测技术领域，涉及激光共焦扫描显微镜的扫描方法，特别是一种用于点扫描激光共焦显微镜的面内扫描方法和系统。

背景技术

激光共焦扫描显微镜与普通显微镜相比，具有更高的分辨率和层析成像能力，广泛应用于生物、生命、医疗和微纳米制造以及材料等的科学仪器中。现有激光共焦扫描显微镜中的面内(X、Y)扫描方法多采用光束扫描方式，通常采用振镜等器件来实现X、Y扫描。而采用物体移动的扫描方式均为两维直线扫描。前者的好处是可以大大提高测量速度，但系统结构复杂，对光学系统质量要求苛刻；后者光路稳定，系统结构简单，同时由于只需考虑消除轴上点像差即可，因此光学系统成本降低，但扫描速度慢，难以实用化。

发明内容

针对上述现有技术创造的缺陷或不足，本发明的目的在于提供一种可用于点扫描激光共焦显微镜的面内扫描方法和系统，该方法同时具有机构简单，光路稳定，同时具有高的扫描速度。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种用于点扫描激光共焦显微镜的面内扫描方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

步骤一，首先将样品台、计算机和扫描共焦显微镜测量物镜构成激光共焦扫描显微镜的三维扫描系统，实现自动控制扫描；

步骤二，然后在样品台上对被测样品定位；

步骤三，三维扫描系统使样品台依次进行旋转、一维横向移动，直至被测样品扫描完一层，接着复位进行轴向扫描被测样品下一层；

步骤四，重复步骤三的过程，直至被测样品测量完毕。

扫描顺序可以是旋转扫描与横向扫描交替进行，也可以是同步协调进行。横向扫描指垂直于扫描共焦显微镜测量物镜光轴的任意一个方向(设为X方向)，轴向扫描指与前述光轴方向平行的方向(设为Z方向)。横向移动可以由直线运动机构如步进电机、伺服电机等实现，旋转可以由各种旋转机构如旋转电机等实现。轴向扫描可以是样品台移动，也可以是扫描共焦显微镜测量物镜移动，还可以是其它的轴向扫描方法。所述的扫描机构与计算机相连，实现自动控制扫描。本方法可适用于任何一种形式如反射式、透射式等的共焦扫描显微镜。

实现上述方法的系统，该系统包括光源系统和测量系统，其特征在于：

所述的光源系统包括有光源，在光源的光路上有第一滤光片、会聚透镜、第一针孔、准直透镜、中性滤光片、分光镜和观察系统；

所述的测量系统包括有显微物镜，显微物镜设有第二滤光片、集光透镜、第二针孔、光电探测器、放大电路；

测量系统的显微物镜和被测样品对准；

样品台用于放置被测样品，该样品台主要包括转动机构和X位移平台；若轴向扫描采用样品台移动，该扫描台还包括z向扫描机构(如附图1所示)，若轴向扫描采用测量物镜移动，该扫描台不包括Z向扫描机构；样品台与一计算机相连，计算机与测量系统的放大电路相连。

本发明在不改变光路的情况下，通过样品台的旋转、移动即可完成扫描，同时克服了以往扫描台存在的机构复杂，扫描速度慢的缺点。本发明主要应用于点扫描的激光共焦显微镜中，但也可用于类似的光点扫描测量系统中。

附图说明

图1为激光共焦扫描显微镜系统示意图。

图2为样品工作台横向扫描运动轨迹(面内扫描方法)示意图。

其中的标号分别表示：1、光源，2、第一滤光片，3、会聚透镜，4、第一针孔，5、准直透镜，6、中性滤光片，7、显微物镜，8、被测样品，9、分光镜，10、观察系统，11、第二滤光片，12、集光透镜，13、第二针孔，14、光电探测器，15、放大电路，16、计算机，17、z向扫描机构，18、转动机构，19、X位移平台。

下面结合附图对本发明作进一步说明。

具体实施方式

参见图1，本发明涉及的扫描共焦显微镜测量物镜构成的激光共焦扫描显微镜系统，包括光源系统和测量系统；所述的光源系统包括有光源1，在光源1的光路上有第一滤光片2、会聚透镜3、第一针孔4、准直透镜5、中性滤光片6、分光镜9和观察系统10；

测量系统包括有显微物镜7，显微物镜7设有第二滤光片11、集光透镜12、第二针孔13、光电探测器14、放大电路15；

测量系统的显微物镜7和测样品10对准；

样品台用于放置被测样品10，该样品台主要包括z向扫描机构、转动机构和X位移平台；样品台与一计算机16相连，计算机16与测量系统的放大电路15相连。

其中，X位移平台垂直于扫描共焦显微镜测量物镜光轴，z向扫描机构平行于扫描共焦显微镜测量物镜光轴。

横向移动由步进电机或伺服电机实现，旋转由旋转电机实现。

所说的共焦扫描显微镜可以是反射式(如附图1所示)也可以使透射式的。

放大电路15采用本领域常规的放大电路。

参见图2，图2是本发明的样品工作台横向扫描运动轨迹(面内扫描方法)示意图。光源1发出的光通过第一滤光片2选择所需波段的光，该光通过会聚透镜3会聚到第一针孔4，被滤波后接着通过准直透镜5产生平行光，经过中性滤光片6和分光镜9进入显微物镜7，再照射到被测样件8上；由被测样品8散射的光返回到透镜7，再经分光镜一部分到观察系统10，一部分通过第二滤光片11、集光透镜12和针孔13到达光电探测器14。若第一针孔4、第二针孔13和被测样品8的对应的被测点处于共轭，则探测器探测到的光强值最大。对被测样品8对应的被测样点由计算机16控制Z向扫描机构进行轴向扫描，可找到其对应的共轭点位置。但为了对整个样件进行测量，就必须进行逐点扫描。本发明的特点就在于其扫描新方法。以往的扫描方法中横向扫描均是采用互相垂直的两维X、Y方向的扫描，本发明采用一维旋转和一维平移的方法实现横向扫描。如附图2，2(a)表示转动机构18使被测样品8每转一圈后，x方向位移平台19使被测样品8沿x方向移动一固定距离，直到整个被测样品8的面被扫描完毕。若被测样品8的初始定位点为其中心A，则x扫描方向可正可负，直到扫描到最大范围(B点所在的圆周)处；若初始定位点为最边缘处(如图中所示的B点)，则x扫描方向为向着被测样品8的中心处移动，直到样品中心A点为止。图2(b)表示转动机构18使被测样品8转动一周的同时在x方向移动一固定距离而得到的扫描点运动轨迹，与图2(a)同样的道理，起始点可以是A点，也可以是B点。当横向扫描完成后由Z向扫描机构17完成轴向的移动，进行下一层的横向扫描。依次交替进行轴向和横向扫描，直至完成整个样件测量范围的扫描。

下面结合实施例对本发明的可行性进行分析。

假定使用放大倍数为40X，数值孔径为0.65的显微物镜，其横向理论分辨率约0.43μm。我们设定横向采样间隔为0.5μm，即x方向每次移动的固定距离为0.5μm，在每个圆周上采样的相邻两点圆周距离也为0.5μm。系统中的光电探测器14采用光电倍增管，因为光电倍增光的响应时间在10^-9s量级，所以通过采样控制可保证每个采样点曝光时间的一致性。横向测量范围设定为250μm(相当于40X显微物镜的视场大小)。于是x方向移动250/2/0.5＝250(个间隔)，也意味着共转动250转。若转动机构18使得样品8的转速为1000转/秒，且采用图2(a)的扫描方式，则完成整个一次横向扫描的时间为250×1000^-1＝0.25(s)，这样即使轴向扫描100层，所需要的时间仅为25s。可见该方法不仅可保证扫描精度同时其扫描速度也大大提高，完全满足实际测量的需求。

Claims (1)

1.一种用于点扫描激光共焦显微镜的面内扫描方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

步骤一，以光源(1)、第一滤光片(2)、会聚透镜(3)、第一针孔(4)、准直透镜(5)、中性滤光片(6)、分光镜(9)和观察系统(10)组成光源系统，以显微物镜(7)、第二滤光片(11)、集光透镜(12)、第二针孔(13)、光电探测器(14)和放大电路(15)组成测量系统，将样品台与计算机相连，计算机与测量系统的放大电路(15)相连，实现自动控制扫描，其中样品台由z方向扫描机构、xy平面内转动机构和x方向位移平台组成；

步骤二，在样品台上对被测样品(8)定位，使光源(1)发出的光通过第一滤光片(2)选择所需波段的光，该光通过会聚透镜(3)会聚到第一针孔(4)，被滤波后接着通过准直透镜(5)产生平行光，依次经过中性滤光片(6)和分光镜(9)进入显微物镜(7)，再照射到被测样品(8上，由被测样品(8)散射的光返回到显微物镜(7)，再经分光镜一部分到观察系统(10)，一部分依次通过第二滤光片(11)、集光透镜(12)和第二针孔(13)到达光电探测器(14)，光电探测器(14)通过放大电路(15)和计算机(16)相连；

步骤三，由计算机控制z方向扫描机构、xy平面内转动机构和x方向位移平台使样品台依次进行xy平面内旋转、x方向移动，直至被测样品扫描完一层，接着复位进行z方向扫描被测样品下一层，对被测样品每层的扫描轨迹为同心圆线或者螺旋线，其中显微物镜的光轴方向平行于z方向；

步骤四，重复步骤三的过程，直至被测样品测量完毕。

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