CN101124319B - 神经干细胞 - Google Patents
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Abstract
利用EGF受体家族的受体下游的信号转导途径的激活物，任选与FGF受体下游的信号转导途径的激活物联用，由ES细胞或者胎儿或成年动物脑分离物获得贴壁神经干细胞的均一、对称的分裂群体。神经干细胞群体非常纯，并在超过100次传代后仍保持分化为神经元的能力。
Description
本发明涉及神经干细胞以及培养神经干细胞(NS细胞或NSC)以促进干细胞的对称分裂和自我更新的培养条件和方法。也提供了组合物、细胞群体、细胞系和单个神经干细胞。
虽然据说神经干细胞可在体外分离自多种来源，但迄今仍不可能在对称分裂、未分化状态的大规模培养中扩展细胞。从实验和治疗观点来看，都非常需要使在此状态中长期扩展细胞。获得的纯神经干细胞群体能够定向分化为三种细胞类型：神经元、星形细胞和少突胶质细胞。
培养神经干细胞(虽然作为不均一细胞群体的一小部分)的一种已知方法是神经球(neurosphere)系统。此系统包括连续传代不均一的细胞聚集体，其中仅有一小部分是真正的神经干细胞。神经球中的大多数细胞是定型祖细胞。
有许多关于神经球的不均一性和不稳定性，以及它们产生神经元的能力有限的报道(如Morshead等，2002)。Rappa等，Neuroscience 2003报道了以下方法：将神经球细胞平板接种在纤连蛋白上1-7天以转染神经球细胞，然后重建神经球但不提供神经球内干细胞(如果有)的显著表征。
Suslov等，2002提供了明确数据证明，神经球系统太不均一，以致于不能有意义地表征其中的任何干细胞。主要结论是，神经球内不仅不均一-″显示克隆内神经细胞谱系多样性，即除NSC以外，它们含有不同分化状态的神经元祖细胞和神经胶质祖细胞″-而且不同克隆神经球品系之间的基因表达型存在很大差异。正如论文中明确确认的那样，Suslov的基因表达型分析没有建立神经球内干细胞的定义：-“获得的分子表型表明我们系统中的产克隆NSC是不均一的，其中的亚组反映出不同的神经发育定型”。
本领域的许多文献描述了胶质细胞的特性。Skogh等，MCN 2001描述了表达GFAP以及对RC2和干蛋白染色易变的胶质细胞培养物-应注意，在体内，放射状胶质中不表达小鼠GFAP(Rakic，2003)。他们报道，他们的细胞不表达神经原性放射状胶质的标记Pax6(Malatesta等，2001，2003)，他们没有检测到其它放射状胶质标记。他们有不均一的培养物，没有进行克隆分析。
关于体外放射状胶质的其它报道认为它们是分化中间体或最终产物。因此，Bibel等(Nat Neurosci，2004)报道了从ES细胞通过瞬时放射状胶质样细胞产生神经元，Gregg和Weiss(JNeurosci，23：11587-601，2003；美国专利公开2003/0032181)描述了神经球细胞″分化″为放射状胶质。Hartfuss等(Dev Biol，2001)证明，放射状胶质存在于神经球。
Gregg和Weiss发现，放射状胶质是神经球的分化产物，可以断定“这些结果表明神经干细胞可产生RGC[放射状胶质细胞]和成年动物CNS中可重演(recapitulate)RGC指导的迁移”。流行的观点是：放射状胶质是神经球产生的分化细胞类型之一。
Liour和Yu(Glia，2003)证明，放射状胶质细胞分化可获自ES细胞，但本领域的其它报道没有提到神经原性放射状胶质的扩展。
Gobbel等，Brain Res 2003报道了多能大鼠细胞能增殖为“松散地粘附于基材上生长的细胞的球状簇″，即不形成均一的单层。而且，此论文的摘要断定：“这些细胞在3次分裂中大约两次产生有丝分裂后细胞，因此使扩展困难”。
他们的培养物中广泛出现产胶质细胞的分化，但作者发现“相对少”(＜3％)神经元。他们没有提供细胞的分子表型。
WO 01/30981描述了可分化为神经元的细胞的培养物。但这些细胞是GFAP和干蛋白阳性，被描述为星形胶质细胞，是相对不纯的混合群体。
干细胞需要特定细胞微环境或小生境的观点是干细胞生物学中的正统观点。虽然不总是承认，但已知神经球干细胞仅构成祖细胞、母细胞和未成熟的分化后代等全部细胞中的一小部分。此种混合细胞类型的聚集可构成其中可能有干细胞的小部分细胞的小生境。
文献中没有报道过由ES细胞产生神经干细胞的均一群体，仅产生可能在变为胶质细胞限制性之前瞬时扩展的神经上皮前体细胞(如Brustle等，Science 1999)。
因此，本领域中存在许多问题。
所有报道都承认他们的培养物是不均一的。不可能用神经球系统维持对称分裂和不分化状态的神经干细胞的大规模培养。培养大量神经干细胞的其它尝试没有成功地超过5-20代，细胞高度倾向于分化也阻碍了这些尝试。例外是有关成年大鼠海马干细胞的工作，但这些是染色体组型异常，并且低效率地形成神经元。
当瞬时神经发育前体已知时，没有分离和纯化到永生或接近永生的自我更新干细胞。
需要由ES细胞产生神经干细胞，然后在纯培养物中维持这些神经干细胞，但迄今这还不可能。也需要由ES细胞产生神经干细胞用于移植，但已知ES产生的细胞群体中持续存在ES和其它非神经细胞会在受试动物中产生肿瘤。还需要由胚胎和出生后的CNS获得纯神经干细胞群体。
完全理解控制神经干细胞行为的分子和细胞事件是必要的，它不仅是理解胚胎发生的途径，而且是可分离、扩展和控制神经干细胞用于将来的治疗应用的框架。本领域已知的神经干细胞的培养方法(由于上述原因)不适合用于这些研究和治疗应用。因此，需要开发培养能将细胞维持在对称分裂自我更新状态中的大量神经干细胞的方法和条件。尤其需要有确定成分培养基，它应满足上述要求，因为临床上非常需要采用确定成分培养基。
本发明解决了一个或多个上述问题。
更具体说，本发明提供了促进神经干(NS)细胞对称分裂的方法，该方法包括用含有以下成分的培养基培养所述细胞：
(a)EGF家族受体下游的信号转导途径的激活物；和
(b)FGF受体下游的信号转导途径的激活物。
在优选实施方式中，在无血清的条件下，如用无血清和无血清抽提物的培养基培养细胞。还优选培养细胞使其附着于基材，或称为贴壁培养。培养基也优选含有胰岛素或细胞上胰岛素受体的另一种激动剂。
在本发明内容中，应理解术语“促进”包括将神经干细胞维持在对称分裂状态中。
根据本发明的另一方面，提供了支持和优选促进神经干细胞以未分化状态自我更新和对称分裂许多代的培养基。该培养基基本上防止神经干细胞的不对称分裂和分化。
本发明还提供了获得神经干细胞的方法，特别是如本文所述的方法，还提供了由这种方法获得的细胞。
本发明也提供了神经细胞群体、组合物、细胞系、产克隆细胞系和单个神经干细胞，其包括自我更新、对称分裂的神经干细胞。
本发明其它方面提供了促进ES细胞分化为神经干细胞的方法，以及将获得的神经干细胞维持在自我更新、对称分裂、基本上不分化的状态中。
定义部分
“神经干细胞”
本说明书中所用“神经干细胞”指在维持产生神经元和胶质细胞的能力时能够进行20-30次以上细胞分裂的细胞。所述细胞优选能够进行40次以上、更优选50次以上、最优选进行无限次细胞分裂。
神经干细胞能够对称或不对称分裂。在对称分裂时，神经干细胞分裂形成两个子神经干细胞或两个定型祖细胞，尽管本文中除非另有规定的对称分裂指对称的自我更新；当不对称分裂时，神经干细胞分裂形成一个子神经干细胞和一个定型祖细胞(如神经元或神经胶质祖细胞)。
本发明神经干细胞可描述为放射状胶质，已证明它能表达放射状胶质标记RC2、3CB2、GLAST、BLBP和Pax6中的至少一种(优选全部)。本发明神经干细胞优选表达RC2、3CB2和GLAST。该细胞更优选表达RC2、3CB2、GLAST和BLBP或Pax-6中的至少一种。本发明神经干细胞的特征也可以是神经前体细胞标记干蛋白或波形蛋白、LewisX抗原、Musashi-1或凸素(prominin)中至少一种(优选全部)的表达呈阳性，Oct-4或Nanog中至少一种(优选两者)的表达呈阴性(也参见实施例1-3)。
本发明神经干细胞的定义是多能的，即，它们能够分化成许多神经细胞类型(如神经元/胶质细胞)。以下实施例证实了根据本发明培养的神经干细胞保留了它们的效能，且能够分化成所有预计的细胞类型。
“神经干细胞来源”
可能由各种来源产生本发明神经干细胞。例如，神经干细胞可直接衍生自胚胎、成年动物组织、胎组织或胚胎干(ES)细胞(野生型或遗传修饰的ES细胞)。本发明神经干细胞优选衍生自小鼠ES细胞，或者衍生自小鼠胚胎细胞。
本发明神经干细胞可衍生自人、灵长动物、啮齿动物和鸟类等。神经干细胞优选衍生自哺乳动物，尤其是小鼠、大鼠和人。
“EGF受体家族”
本说明书所用术语“EGF受体家族”指可被EGF信号转导因子家族活化的受体家族(通常是同源二聚体或异源二聚体受体)。受体由四个高度同源的跨膜糖蛋白：ErbB-1(也称为EGF-R)、ErbB-2、ErbB-3和ErbB-4组成。
“EGF受体”包括EGF受体家族的任何单体或二聚体受体复合物。
各受体具有胞外配体结合域，此结构域是一个单疏水跨膜结构域和负责通过1型受体酪氨酸激酶活性进行信号转导的胞质酪氨酸激酶结构域。配体与任何受体的结合导致受体二聚化和自身磷酸化，然后许多细胞底物的磷酸化导致一系列生物效应。受体二聚化可由各种刺激引发，包括受体配体和有毒环境刺激如UV辐射。各二聚体受体能通过征集不同含有SH2的效应物蛋白启动不同信号转导途径。例如，EGF-R二聚体可与衔接蛋白Grb复合，偶联于鸟嘌呤核苷酸释放因子SOS。Grb-SOS复合物可直接结合于受体中的酪氨酸磷酸化位点，或者间接通过Shc结合。这些蛋白相互作用使SOS与Ras紧密相邻，允许Ras活化。这随后能活化ERK和JNK信号转导途径，进而活化调节基因表达的转录因子，如c-fos、AP-1和Elk-1。EGF受体也可活化PLC γ信号转导途径。
“FGF受体”
本说明书中所用术语“FGF受体”描述跨膜FGF受体酪氨酸激酶家族的任何成员。这些受体有四种主要的同种型FGFR1、2、3和4，已知其作用与肝素及硫酸乙酰肝素(HS)系统紧密相关。FGF受体包括FGF受体家族的任何单体或二聚体(同源或异源二聚体)复合物。
与FGF受体相关的细胞信号转导途径包括MAP激酶途径和PLCγ途径。
“培养基”
本发明所用培养基优选包含任选补充附加组分的基本培养基。
基本培养基是为神经干细胞提供必需的碳和/或维生素和/或矿物质来源的培养基。基本培养基通常不含蛋白质，本身不能支持神经干细胞的自我更新/对称分裂。
优选地，本发明所用培养基不包含任何不明确的组分(如血清和/或饲细胞)，即成分未知或可能包含不明确或未指明的变化因子的组分。使用不含血清和血清提取物的完全确定成分培养基的优点是可以产生培养和后续操作神经干细胞的有效且一致的方案。
“培养表面”
本发明所有方面中培养神经干细胞的典型表面是本领域所认识可用于细胞培养的培养表面，包括塑料、金属、复合材料表面，尽管通常采用可购得的表面如塑料组织培养板。这种培养板的直径通常为数厘米。若扩大生产，可用更大直径的此类培养板并使用许多重复培养板单元。
培养表面还可包含细胞粘附蛋白质，通常包被于表面。呈现于干细胞上的受体或其它分子结合于蛋白质或其它细胞培养基材，促进与表面的粘附并促进生长。尤其优选明胶包被板。
本发明基于以下观察结果：用包含EGF受体激动剂或EGF和EGF-2受体激动剂的培养基培养附着于基材的神经干细胞，可促进干细胞的无限对称分裂，显著地阻止其分化为神经元/神经胶质细胞。
现在详细讨论本发明的各个方面。
本发明第一方面提供了一种促进神经干(NS)细胞对称分裂的方法，在包含下述成分的培养基中培养所述细胞：
(a)EGF家族受体下游的信号转导途径的激活物；和
(b)FGF受体下游的信号转导途径的激活物。
本发明获取神经干细胞的另一方法包括：
(1)获取包含神经干细胞的混合细胞群体；
(2)将细胞重新接种在包含下述成分的培养基中：(a)EGF家族受体下游的信号转导途径的激活物；和(b)FGF受体下游的信号转导途径的激活物。
(3)培养细胞；
(4)收获细胞聚集体；
(5)将细胞重新接种在包含下述成分的培养基中：(a)EGF家族受体下游的信号转导途径的激活物；和(b)FGF受体下游的信号转导途径的激活物。
(6)培养细胞；
(7)将细胞以单细胞形式重新接种在包含下述成分的培养基中：
(a)EGF家族受体下游的信号转导途径的激活物；和(b)FGF受体下游的信号转导途径的激活物。
可通过选择表达神经干细胞特异标记的细胞补充本方法，例如将此类表达标记连接于与其在分化后代中的表达相比，优选在神经干细胞中有活性的启动子。该方法优选包括于65％或低于65％汇合，更优选于55％或低于55％汇合，特别是低于50％汇合时传代细胞。
本发明方法的其它优选特征列于本发明实施例9的方案中。
本发明的培养物优选贴壁培养物，即细胞附着于基材。
基材一般为培养容器或其它物理支持物(如培养皿、培养瓶、珠或其它载体)的表面。优选地，包被基材以改善细胞粘附，合适的包被物包括层粘连蛋白、聚赖氨酸、聚鸟氨酸和明胶。也优选以单层培养物培养细胞，而不以悬液、球或簇培养细胞。在密度较高时，细胞可能开始相互堆积，但培养物基本上是单层或以单层开始，并附着于基材。
可优选利用EGF家族受体激动剂激活EGF家族受体下游的一条或多条信号传导途径。EGF家族受体激动剂适合作为EGF家族信号因子的成员，并优选结合于EGF受体的胞外结构域。术语“激动剂”也包括EGF家族信号转导因子的模拟物、融合蛋白、抗体或嵌合物及能激活EGF家族受体的片段、变体和衍生物。
组成EGF家族信号转导因子的分子的特点为包含至少一个EGF样结构域。此结构域由6个半胱氨酸残基通过形成二硫键产生的三个肽环确定。
可通过EGF受体家族的受体作用从而激活这些受体下游途径的特定激动剂包括EGF、TGF-α、双调蛋白、肝素结合-EGF、表皮调节素(epiregulin)、β-动物纤维素、神经调节蛋白1-4和畸胎癌生长因子-1(Cripto-1)。优选的激动剂是EGF本身。
可优选利用FGF的受体激动剂激活EGF受体家族下游的一条或多条信号转导途径。FGF的受体激动剂适合作为EGF家族信号因子的成员。术语“激动剂”也包括FGF家族信号转导因子的模拟物、融合蛋白、抗体或嵌合物及能激活FGF受体的片段、变体和衍生物。
优选地，FGF受体激动剂是FGF-2或层粘连蛋白-FGF。
应理解EGF受体家族或FGF受体下游的信号转导途径也能被组成性活化受体或各自信号转导途径的下游效应子(如MEK或Bcl2)激活。在本发明尤其优选的实施方式中，信号转导途径被细胞通透性小分子所激活，从而绕过各自受体且直接激活信号转导途径。因此，本发明术语“激活物”包括能激活EGF家族受体或FGF受体下游的信号转导途径的所有分子。
有效维持本发明中神经干细胞培养物的激活物如下列实施例1-1和1-2所述。这里，大量和神经干细胞的克隆群体维持于包含EGF和FGF-2的培养基中，并可传代数次。此外，可忽略/没有神经干细胞的分化，因为神经干细胞标记在受试细胞群体中普遍存在(见实施例1-3)，并且保持效力并能够分化为所有期望的细胞类型(见实施例1-4)。
因此，本发提供一种将大量神经干细胞群体有效地维持于自我更新、对称分裂和未分化状态的方法。本发明的组合物包括含有神经干细胞的组合物，其中神经干细胞为贴壁培养物且组合物中至少50％、70％或80％细胞为神经干细胞。神经干细胞的比例进一步优选为至少90％，更优选为至少95％，非常优选为至少97％。而且，本发明的神经干细胞可大批传代。优选神经干细胞至少已传代30次，更优选至少60次，非常优选至少90次。而且，在本发明的一个神经细胞群体中，至少80％，优选至少90％，更优选至少95％的所述细胞为对称分裂的神经干细胞。该组合物中细胞的特征还有单独或组合的本发明任意或全部特点。
也提供了包含以下组分的组合物：
神经干细胞；
EGF家族受体下游的信号转导途径的激活物；和
FGF受体下游的信号转导途径的激活物。
组合物优选包含基本培养基。也优选在组合物中至少80％，优选90％，更优选95％的神经干细胞为对称分裂的神经干细胞。
在上述神经细胞群体和组合物中，神经干细胞优选不含编码癌基因的外源性遗传物质，即细胞未被永生化。在特定实施方式中，群体/组合物中的神经干细胞的特征是它们表达至少一种以下蛋白：
神经前体细胞标记干蛋白或波形蛋白；
Sox-2；
放射状胶质细胞特异性标记RC2、3CB2、GLAST、BLBP或Pax-6；
LewisX抗原；
Musashi-1；和
凸素；
并且不表达至少一种以下蛋白：
Oct4，和
Nanog。
细胞优选表达RC2、3CB2和GLAST。在其它实施方式中，(任选除前述标记特征以外)细胞表达BLBP、Pax-6、神经前体细胞标记干蛋白或波形蛋白、LewisX抗原、Musashi-1或凸素中的至少一种。在尤其优选的实施方式中(任选除前述标记特征以外)细胞不表达Oct4或Nanog中的至少一种。
在其它实施方式中(任选除上述标记特征以外)细胞表达Sox-2，且不表达Sox-1。在包含小鼠衍生的NS细胞的某些组合物/群体中，不超过1％的细胞表达GFAP或βIII微管蛋白，因此确认有可忽略的细胞分化为星形胶质细胞或神经元。在其它组合物/群体中，不超过1％的细胞表达成熟星形胶质细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物。
本发明也可利用大鼠细胞进行。因此，我们取出大鼠CNS细胞并利用本发明方法获取具有下列特点的大鼠神经干细胞培养物：(i)高纯度，一般是超过80％或90％的大鼠神经干细胞，和(ii)多次倍增，超过50、100，甚至超过200次倍增后仍然能够形成神经元和神经胶质细胞的细胞占很大比例(至少50％)。本领域中，来自大鼠的细胞明显具有高度均一性，并且仅来自成年动物的海马。我们的细胞并非获自此来源，而是获自大鼠CNS。该方面值得注意是本发明的方法在三个物种(大鼠、小鼠和人)中有效。通常可见如果依照本发明方法一个单细胞形成一个神经干细胞集落后，可从该集落的细胞中获取神经元。例如，可通过分别染色(i)核(即对所有细胞染色)和(ii)神经元(即仅神经元)测定。可通过比较着色细胞的相对数量计算形成神经元的细胞比例。
本发明另一方面提供了制备神经干细胞的方法，其包括(i)按照上述方法培养神经干细胞，从而获得神经干细胞培养物，和(ii)分离所述培养物中的神经干细胞。优选地，分离的神经干细胞为条件控制以对称方式分裂的细胞。
许多细胞来源可用于产生神经干细胞。在一种方法中，获得动物神经组织中的细胞并根据本发明培养，以获取对称分裂的神经干细胞培养物。神经组织可来自成年或胎组织。神经组织可来自CNS，对称分裂的神经干细胞群体可获自小鼠的成年或胎儿CNS的提取物，或可获自人成年CNS的提取物。优选包含鉴定为具有放射状胶质表型细胞的神经组织，例如来自小脑核视网膜提取物的细胞鉴定具有此表型，两者均代表另外合适的细胞来源。神经干细胞可获自病变神经组织，用于模拟疾病，如为此目的从脑肿瘤中获取细胞。
或者，利用本发明由患病个体产生神经干细胞，然后(i)利用这些细胞进行实验或(ii)进行遗传修饰后将细胞移植回该个体。因此细胞可获自患有神经变性疾病，包括例如，阿尔茨海默病和帕金森病或脑肿瘤的个体。
获取神经干细胞的其它方法包括：
(i)获取能分化为神经干细胞的多能或全能干细胞，
(ii)用全能干细胞非允许的培养基以及在(a)EGF家族受体下游的信号转导途径的激动剂和(b)FGF家族受体下游的信号转导途径的激动剂的存在下培养(i)的细胞。
使用中，利用此方法移除潜在污染的ES细胞，或者至少大大减少其数量，产生较纯培养物和降低移植产生畸胎瘤的可能性的培养物。
干细胞适合为全能干细胞，尤其是ES或EG细胞。本方法优选包括在EGF受体激动剂和FGF受体激动剂的存在下培养细胞。
利用本发明的NS细胞，我们通过去除EGF和FGF并加入血清或BMP4获得了星型细胞，通过去除EGF间隔约一周后去除FGF并将细胞接种于层粘连蛋白获得神经元，通过去除EGF和FGF获得少突胶质细胞。通常，用于产生神经干细胞的本发明所有方法任选包括进一步使神经干细胞分化为神经元、星形细胞或少突胶质细胞的方法，还任选地在(如)实验中使用神经元、星形细胞或少突胶质细胞进行移植或其它操作。
一旦分离出神经干细胞培养物，可用于建立神经干细胞系。建立此细胞系优选包括下列步骤：
(a)获取单个神经干细胞，
(b)依照前述任意方法培养神经干细胞，
从而获得神经干细胞的克隆群体。
在特定实施方式中，用于建立细胞系的神经干细胞为对称分裂的神经干细胞，或条件化使其以对称方式分裂的神经干细胞。优选根据上述制备神经干细胞的方法获得单个神经干细胞。
在优选实施方式中，根据上述方法获得的神经干细胞为神经干细胞的一个克隆群体，即其中所有的细胞为单个神经干细胞的后代。
单个神经干细胞和细胞系(可用上述方法任选获得)也形成本发明的一部分。在第一个实施方式中，提供在FGF受体家族受体下游的信号转导途径的激活物和FGF受体下游的信号转导途径的激活物存在的条件下维持的细胞。在其它实施方式中，单个神经干细胞和细胞系中细胞的特征为它们表达至少一种以下蛋白：
神经前体细胞标记干蛋白或波形蛋白；
Sox-2；
放射细胞特异性标记RC2、3CB2、GLAST、BLBP或Pax-6；
LewisX抗原；
Musashi-1；和
凸素；
并且不表达至少一种以下蛋白：
Oct4，和
Nanog。
细胞优选表达RC2、3CB2和GLAST。在其它实施方式中，(任选地除前述标记特征以外)细胞表达BLBP、Pax-6、神经前体细胞标记干蛋白或波形蛋白，LewisX抗原，Musashi-1或凸素中的至少一种。在尤其优选实施方式中(任选地除前述标记特征以外)，细胞不表达Oct4或Nanog中的至少一种。
在其它特定实施方式中(任选地除上述标记特征以外)，细胞表达Sox-2并不表达Sox-1。在某些小鼠衍生的细胞系中，不超过1％的细胞表达GFAP或βIII微管蛋白。在其它(如人)细胞系中，不超过1％的细胞表达成熟星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记。
单个神经干细胞和细胞系的细胞优选不含编码癌基因的外源性遗传物质，即它们没有被永生化。上述细胞系也优选为神经干细胞系。
第三方面，本发明提供获得并维持对称分裂神经干细胞的转染群体的方法，其包括：
(a)用编码可选择标记A的构建物转染ES细胞，其中所述可选择标记在神经前体细胞特异性启动子的控制下表达；
(b)促进ES细胞分化为神经前体细胞；
(c)选择表达可选择标记A的神经前体细胞；和
(d)根据以前所述的任何方法培养选择的细胞。
可选择标记A可编码抗生素抗性、细胞表面标记或另一种可选择标记，如EP-A-0695351所述。神经前体细胞特异性启动子可选自Sox-1、Sox-2、Sox-3、BLBP和干蛋白神经增强子。实施例1-1中提供了此选择方案的其它详细内容。
可遗传修饰本发明神经干细胞(即单个神经干细胞，以及本发明组合物、细胞系和群体中存在的神经干细胞)。因此，提供了转染本发明神经干细胞的方法，其包括：
(a)用编码可选择标记B和多肽的构建物转染神经干细胞；和
(b)选择表达可选择标记B的神经干细胞。
可选择标记B可编码抗生素抗性或细胞表面标记，可能与可选择标记A相同或不同。合适的转染方法是已知方法，包括电穿孔、脂质转染、核转染(necleofection)以及逆转录病毒和慢病毒转染。
遗传修饰的神经干细胞也形成本发明的一部分，因此，本发明提供了单个神经干细胞，或本发明组合物、群体或细胞系中存在的神经干细胞，它们还包含构建物。应理解，这些神经干细胞可能除了可选择标记B外已经包含可选择标记A。
如前所述，本发明方法适用于衍生自任何来源的神经干细胞。在一个具体实施方式中，本发明提供了由ES细胞来源获得神经干细胞的方法。根据该方法，将ES细胞转变为神经祖细胞，如单层培养或胚胎样小体分化，然后用NSA培养基培养神经祖细胞，从而促进ES细胞分化为神经干细胞。此外，考虑到NSA培养基可能包含补充成分，如补充的葡萄糖和HEPES。或者，补充有葡萄糖和HEPES的培养基(优选基本培养基)也可用于促进此分化。
在NSA和/或葡萄糖和HEPES的存在下，培养条件有助于神经干细胞增殖，额外优点是培养物中存在的任何非神经细胞优选死亡。这产生基本纯的神经干细胞培养物(如存在的所有细胞的至少80％，优选90％，更优选95％)。实施例1-5提供了此方法的其它细节。
在优选实施方式中，实施例1-5的方法可用于制备对称分裂的神经干细胞群体，然后用上述本发明培养方法维持该细胞群体。
实施例1-5的方法也可用于测定因子对ES细胞分化为神经干细胞的作用。在优选的测定实施方式中，用实施例1-5所述的方法在受试因子的存在下培养ES细胞。可通过(例如)测定得到的细胞的标记特征来评价该因子的作用，即显示出细胞是否与本发明细胞具有相似的标记特征，或者是否维持ES标记特征。受试因子可以是诱导因子或阻断因子。
神经干细胞在治疗神经病和神经变性疾病，尤其是治疗诸如帕金森病和阿尔茨海默病、多发性硬化和肌萎缩侧索硬化等疾病以及脑损伤中的使用引起了许多关注。本发明方法、组合物、细胞群体、细胞系和单个细胞都能够用于这种治疗，以及生产这种治疗所用制剂。
可用本发明治疗的具体神经病和神经变性疾病包括：帕金森病、运动神经元病、中风、多发性硬化和亨廷顿病。
因此，在第五个方面，本发明提供了上述细胞系、神经细胞群体、单个神经细胞和组合物用于细胞治疗以及生产治疗神经变性疾病和脑损伤所用的制剂中的应用。可用磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制这些制剂。
上述疾病的治疗方法可包括将本发明的单个细胞、细胞系、组合物或细胞群体植入患者。患者优选为哺乳动物，患者更优选是人。在胚胎和成年动物CNS中证明此种移植是成功的，实施例1-6中更详细地描述了此种移植。
本发明细胞，尤其是细胞系可用于测定诱导因子和阻断因子对神经干细胞分化的作用。这种测定可包括将本发明神经干细胞(即组合物、细胞系和群体中存在的细胞，或单个神经干细胞)与受试因子相接触。可通过测定得到的细胞的标记特征适当地评价该因子对神经干细胞分化的作用，即显示出该细胞是否与本发明细胞具有相似的标记特征，或者这些标记是否丢失。本发明细胞也适合于测定药物。
为了评价形成神经元或胶质细胞的细胞的比例，使细胞无性增殖；将细胞单独种板，并非形成克隆集落的所有细胞，而只有形成克隆集落通常超过50％的细胞能产生神经元(在合适的操作方案下)或胶质细胞(也在合适的操作方案下)。细胞不同于现有技术，因为当本领域技术人员宣称能够鉴定、甚至增殖具有神经干细胞特性的细胞时，细胞群体是高度不均一的。这是重要区别，因为不纯的群体包括将信号转导给其余神经干细胞以刺激分化并进一步减少神经干细胞的比例的细胞。虽然现有技术的方法可由单个细胞产生神经球，本发明能够由单个细胞产生基本纯的群体。
在本发明的具体实施方式(以下实施例中更详尽地描述)中，所有NS细胞集落产生15％或更多，优选至少20％，更优选约20-30％TuJ阳性神经元。在密度较高的培养物中，我们对TuJ阳性细胞计数。35％LC1 NS细胞在115代(连续培养一年以上)后获得神经元形态并表达βIII-微管蛋白。这些细胞在此阶段保持双倍体核型。LC 1是未克隆的群体。因此，该数据表明，就胶质-限制性前体或遗传转化而言，选择压力很小。
可以在不与异源细胞共同培养并且没有成分不确定的条件培养基、胞外基质组分或血清的情况下培养本发明细胞，这是以前除ES细胞以外的任何干细胞类型所不具有的特征。因此，在本发明下述内容中，优选以确定条件在均一的培养物中培养神经干细胞。即使微孔板中分离的单个NSC也可扩展，这表明对除EGF和FGF以外的胞外信号的依赖性很小，在体外NSC必需的外源性自我更新信号可以减少到EGF和FGF。
在实施例中更详细说明的其它实施方式中，通过接种单个细胞产生的基本上每个集落，即至少90％、优选至少95％、更优选至少97％的集落(i)显示在FGF加EGF存在的情况下神经前体细胞标记的表达相同并且没有分化标记，和(ii)在撤消生长因子时产生神经元。在具体实施例中，每个集落都具有这些特性。这是对称的自我更新的证据。而且，非克隆的NS细胞培养物的集落试验数据与克隆的NS5细胞系的数据相当。连续形成NS5的可扩展未分化集落表明产克隆细胞是干细胞，它们数量的扩大与NS群体成比例。形式上，可通过两种机制增加干细胞数量：从头产生或对称的自我更新分裂。前者需要前干细胞来源，即全能细胞或胎原基，它们都不存在于本文NS细胞培养物中，所以在NS细胞培养物中必须进行对称的自我更新。
以下实施例获得的特定NS细胞表达Sox2、Pax6、Emx2、Olig1、Olig2、干蛋白、BLBP、GLAST、波形蛋白，并且对RC2、3CB2、SSEA-1和凸素具有免疫反应性。它们优选不表达Sox1，并且对GFAP和神经元抗原是阴性。这些NS细胞缺少全能标记和其它胚层的标记。我们主张，在CNS发育期间神经干细胞特征被掩蔽(仅在离体时可证实)，用ES细胞通常就是这样。NS细胞中不能维持Sox1表达的发现是新的、不可预见的，表明用Sox1进行连续谱系选择或许没有生产力。
在本发明的其它实施方式中，在培养物中，NS细胞，例如ES细胞-衍生的未克隆(CGR8-NS)和克隆(NS5)NS细胞系以及胎皮层衍生的未克隆(Cor1)和克隆(Cor1-3)NS细胞系显示出放射状胶质标记3CB2、BLBP、GLAST、干蛋白、RC2和波形蛋白的表达。在这些培养物中优选少于10％，更优选少于5％，尤其是少于2％的细胞表达GFAP。在具体实施例中，在少于1％的细胞中表达GFAP。我们也证明，ES细胞衍生的NS细胞115代后一致地表达干蛋白和RC2而不表达GFAP和βIII-微管蛋白，这说明NS细胞表型是稳定的。优选的本发明细胞由ES细胞分化，并且(1)连续表达干蛋白和RC2，和(2)在30代后，优选60代后，更优选100代后连续不表达GFAP和βIII-微管蛋白。不表达GFAP和βIII-微管蛋白指在少于5％的细胞、优选少于2％的细胞中观察到表达。
我们已经通过RT-PCR进行了分析，RT-PCR证实，在特定的NS细胞中不存在全能、中胚层或内胚层特异性转录因子。我们也进行了Affymetrix(RTM)表达型分析，证实不存在谱系不适合的转录物，并证明在三种不同的NS细胞培养物(ES衍生的、胎皮层衍生的和克隆的胎皮层衍生的)中神经标记和放射状胶质标记的一致表达。
由ES细胞分化获得NS细胞优选包括：在连续的贴壁培养物中维持细胞，更优选省去形成神经球的步骤。然而，由来自胚胎或成年动物脑的原代细胞分离物分化获得NS细胞任选地包括：(i)首先形成悬浮聚集体或神经球，和(ii)然后在贴壁培养物中维持细胞。我们在实施例中发现，数天后该聚集体可附着在明胶包被的塑料板上，然后将长出NS细胞。
我们测定了在本发明细胞的早期和晚期传代阶段产生的神经元和星形细胞的比例，尤其是第8代和第115代的LC1NS细胞。后一培养物代表了12个月的扩展，倍增期为24小时。在晚期传代阶段获得的神经元数量稍有减少，但总数仍＞35％。独立地衍生自46C ES细胞的NS5克隆细胞系在第30代时神经元分化效率水平相似。在LC1NS细胞和NS5细胞的时间点，GFAP免疫反应性星形细胞的产生接近100％。而且，用多次传代培养、然后用GFP慢病毒转导、在植入前进一步扩展的LC1 NS细胞获得体内数据，证明神经元和星形细胞的广泛分化。与放射状胶质标记表达的一致性组合，关于未克隆的LC1NS细胞稳定分化潜力的数据表明，在FGF和EGF中贴壁培养有助于干细胞自我更新和抑制定型为胶质细胞或神经元的命运。
我们发现由ES细胞分化获得的NS细胞在植入后5周时间内不会形成肿瘤，从而区别于ES细胞，ES细胞在4周内会在小鼠脑中产生肉眼可见的畸胎瘤。
本发明也涉及核重编程方法和通过这些方法获得的细胞和动物。
核重编程是使体细胞，任选干细胞或终末分化的细胞的核重编程的技术，以便用作潜能相对较高的细胞核；最终，完全重编程的细胞核用作全能细胞核，重编程常常用来指全部重编程为全能。本领域已经建立了通过核转移重编程的方法，该方法在WO 96/07732所述发明公开后为公众所知，有时称为“多利羊”发明。因此，核转移可用于克隆非人动物。
核转移法有许多问题。主要是它们的效率仍低，因为获得的细胞是很少重编程的，以致于不是完全全能的。也需要能够对核作为重编程的一部分进行遗传操作。但是，由于获得供体细胞核的克隆群体困难，此操作目前不可能或不可靠。即使用克隆的细胞核，重编程方法是需要许多单独步骤的复杂过程。最后，一些种类的ES细胞仍然难以分离。采用重编程技术(如果可用且可靠)可提供产生这些种类的全能细胞的另选途径。
本发明其它方面的目的是为上述问题提供另选方法并提供解决的方案。
因此，本发明提供了核重编程的方法，其中供体细胞核获自本发明神经干细胞。
发现本发明神经干细胞可高效率地重编程，因此本发明提供了有效重编程的方法，也有助于产生许多种类的遗传修饰的重编程细胞，尤其是全能干细胞。通过本发明使单个神经干细胞无性繁殖的能力指遗传操作后可获得细胞的克隆群体，所有细胞都具有相同的遗传修饰，并用于重编程方法。
也可能根据存在特定的细胞表面标记和/或不存在其它标记来鉴定神经干细胞-这种方法具有以下优点：可省去根据本文所述发明的某些方面培养的步骤，因为可从混合的群体如脑匀浆物中直接收集神经干细胞。
因此，本文提供了核重编程方法，其中供体核来自根据本发明的任何实施方式或方面获得的神经干细胞。
核重编程的具体方法包括：
-获得供体细胞；
-获得受体细胞；
-将供体细胞核转移到受体细胞中，其中供体细胞是(i)神经干细胞，或(ii)按照本发明方法获得的细胞；和
-培养细胞，以便重编程供体细胞核，从而获得重编程的细胞。
通常在处理的一个阶段去除受体细胞核，因此得到的细胞是双倍体，任选在转移供体细胞核之前和之后进行此步骤。
本发明NS细胞提供的有趣的可能性之一是引入遗传损伤，如可诱导恶变的遗传损伤。因此，另一种选择是遗传操作供体细胞核。这可用于引入突变或感兴趣的基因，如产生用于测定或其它测试目的的细胞或动物，其中用同一操作获得许多细胞。
操作的范围很宽。一个例子是将引起疾病的遗传序列或推定的引起疾病的遗传序列引入供体细胞核，用于药物筛选。另一种选择是获得包含衍生自重编程细胞的组织的动物并用该组织进行试验。优选的是，将该细胞重编程回全能，如通过将细胞核转移到卵母细胞中。
在本发明的具体实施方式中，利用所需神经干细胞中细胞表面标记的本发明知识能够省去培养步骤，而在其它情况下需要从混合群体中分离神经干细胞。一种所述的重编程方法包括提供混合的细胞群体，根据细胞表面标记特征由混合群体中分离神经干细胞，将分离细胞的细胞核转移到受体细胞中。
用其它方法，可遗传操作分离细胞，然后将其细胞核转移到受体细胞中。同时，可培养分离细胞以获得克隆的细胞群体，然后将该群体中一个细胞的细胞核转移到受体细胞中。
更详细说，本发明细胞的一个应用是高通量药物筛选。本发明神经干细胞和由其获得的神经元、胶质细胞等可用于筛选，(如)以鉴定在任一细胞类型上有活性的因子。该细胞或后代可用于脑癌模型。用于筛选的细胞和后代可获自神经系统，尤其是CNS的肿瘤，以及由其衍生的神经细胞和其后代：相信所有人都明白筛选的本质，但主要包括：获得本发明细胞或其分化后代，在受试因子的存在下培养该细胞或后代，测定该因子对细胞或后代的作用。在具体筛选应用中，提供的细胞是本发明细胞或用本发明获得的细胞，该细胞经过修饰以表达EGF受体或另一种EGF受体。
可在用于筛选前修饰细胞。例如，细胞可遗传修饰，在基因中引入突变，或引入编码已知或怀疑与疾病(尤其是神经细胞疾病包括帕金森病和阿尔茨海默病)有关的基因产物的核酸。可引入帕金突变。可表达或突变编码与阿尔茨海默病有关的蛋白如APP的基因，或者改变其表达。
本发明细胞可用作细胞治疗的细胞来源。它们提供了可能用于核转移核来源的患者的干细胞来源。它们可用于递送基因治疗，包括神经保护性基因治疗。在示范性治疗中，本发明细胞表达胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)。可按照本发明并进行遗传操作来获得这些细胞。可植入该细胞以恢复受损的神经环路和/或恢复脑功能。
本发明的优点在于所获细胞的纯度。在移植或培养中纯群体更容易控制，因为在不均一培养物中，由于更多细胞已经定型为胶质细胞命运，获得的神经元百分数降低。一些治疗需要神经元和星形细胞。
其它治疗需要胶质细胞(如MS的少突胶质细胞，其它应用的星形细胞、游走细胞)。
本发明提供了克隆非人动物的方法。克隆非人动物的一种方法包括(i)由非人动物获得神经干细胞，(ii)获得与该非人动物相同物种的卵母细胞，(iii)将神经干细胞的细胞核转移到卵母细胞中，和(iv)将(iii)中获得的细胞植入相同种类的雌性动物体内。因此，本发明提供了基于神经干细胞分离的非人动物克隆的有效方法。相信该克隆方法可应用于基本上所有非人动物，尤其是家畜，包括牛、猪、羊、猫、犬、鸡和其它家畜；以及实验室动物，包括小鼠和大鼠。
本发明第一次使得能够以与ES细胞相同的方式培养双倍体、产克隆、可转染、组织干细胞的纯群体。这是干细胞生物学中的显著进步，它开辟了许多新的实验机会。例如，对不均一神经球培养物的依赖严重阻碍了以前对“神经干细胞”分布型分析的研究(如Suslov等)。而且，NS细胞的放射状胶质特征限定了它的体内对应物。能够培养和遗传操作放射状胶质的纯群体也开辟了分析可用作干细胞和专门化支架细胞的这些受人关注细胞的细胞生物学的新机会。最后，能够在没有异源细胞或细胞提取物的简单培养基中增殖NS细胞证实，可仅由生长因子驱动自我更新，而不需要迄今干细胞生物学家认为是不可缺少的复杂的微环境小生境。本发明开辟了用该细胞进行核重编程和任选的遗传操作的新途径。
本发明提供由NS细胞有效产生神经元。在本文方案中更详尽地描述的方法中，获得神经元的方法包括(a)在存在FGF受体激动剂且不存在EGF受体激动剂的情况下培养神经干细胞；和(b)然后，在没有FGF受体激动剂且没有EGF受体激动剂的情况下培养该细胞。发现(如)没有EGF的期间引发细胞在(如)随后撤消FGF时成为神经元。优选将神经干细胞接种在单层培养物中。一般地，将NS细胞转移到不含EGF但含有FGF-2的培养基中，去除培养基中的FGF-2(包括将该细胞转移到不含FGF-2的培养基中)之前培养一段时间，例如至少2天，或至少4天。在具体方法中，在含有FGF-2但不含EGF的培养基中培养该细胞一周，然后撤消FGF-2。撤消FGF导致培养物中一些细胞死亡，但有相当百分数的细胞存活并形成神经元。此方法可用作衍生NS细胞的本文所述任何方法的另选方法。
应理解，可根据本发明所有方面，在体内或体外实施方法和应用。
附图中说明了本发明方法和组合物，其中：
图1显示由ES细胞产生神经干(NS)细胞；
图2显示NS细胞可获自不同ES细胞系和胎儿前脑；
图3显示成年动物脑内NS细胞的掺入和分化；
图5显示分化培养基中培养的NS细胞在电压和电流钳条件下的电活性。
以下更详尽的说明附图，图1显示从ES细胞中产生神经干(NS)细胞：A.在EGF和FGF-2的存在下增殖贴壁NS细胞培养物(LC1)，(a)显示出未表达神经元(b)或星形细胞(c)抗原，并且均一表达了前体标记RC2(d)和干蛋白(未显示)。加入血清时LC1细胞分化为免疫阳性星形细胞(e)，去除生长因子时产生神经元(f-h)。115代后所获神经元占总细胞数的比例保持＞35％(i)。B，通过Sox1神经谱系选择产生克隆的NS-5细胞。a和c，第1代和第5代神经前体各自的相差图(Phase image)。b和d，对应的Sox1-GFP荧光。e，接种于Terasaki孔1小时后的单细胞。f，20代时克隆细胞系的相差图。C，ES细胞和神经干细胞/放射状胶质细胞标记的RT-PCR(46C，亲代ES细胞系；P5，神经分化后的5代；NS-5克隆的NS细胞系；LC1，NS群体(第17代)；脑，E12.5/E16.5小鼠脑)。D，NS-5对神经干细胞/放射状胶质细胞标记的免疫反应性。E，NS-5分化为星形细胞(a，b)和神经元(d，e)，它们丧失干蛋白免疫反应性(c，f)。F，NS-5细胞集落(a)在撤消生长因子时产生神经元，(b)在EGF/FGF存在下保持均一地表达没有GFAP免疫反应性的RC2和BLBP(c，d)。G，NS-5的中期扩散(Metaphase spread)(第31代)。
图2显示NS细胞可衍生自各种ES细胞系和胎儿前脑：NS细胞衍生自独立的ES细胞系(CGR8，E14Tg2a)或原代皮层组织(Cor-1)和纹状体组织(Str-1)。A，干细胞/放射状胶质标记的RT-PCR。B，转录调节蛋白的RT-PCR。C，通过形态(a，f)和神经干细胞/放射状胶质标记的免疫反应性(b，c，g，h)不能区分ES衍生的细胞系(CGR8-NS)和胎衍生的细胞系(Cor-1)与LC1，它们各自可分化为神经元(d，i)和星形细胞(e，j)。
图3显示成年动物脑内NS细胞的掺入和分化：a-h，用eGFP慢病毒转导的LC1NS细胞植入海马(a，b)或纹状体(c-h)4周后的共聚焦图像。b，d分别是a图和c图中插图的高倍放大图。e，f是植入eGFP的NS细胞(绿色)的例子，显示出与神经元标记TuJ(e，红色)或MAP-2(f，红色)的共表达(黄色)。g，星形胶质细胞标记GFAP(红色)。h，神经祖细胞标记干蛋白(红色)。i，植入成年小鼠纹状体4周后植入物产生的神经元(MAP2)、星形胶质细胞(GFAP)、祖细胞(干蛋白)的定量分析，以及细胞(Ki67)增殖。数据是5个独立动物的至少500个eGFP+细胞的平均值(±标准差)。标尺：a，c，100μm；b、d、e，40μm；f-h，20μm。
图5显示：A.三种不同的NS细胞在分化培养基中孵育6天(a)、20天(b)和30天(c)后，以不同膜电位(-70～+40mV，来自保持电位-90mV)获得的重叠的内向和外向电流追踪。B.通过获得(A)中所示电流记录后立即由电压钳转变为电流钳，对与(A)相同的三种细胞(a、b和c)注射去极化矩形电流脉冲后获得的重叠的电压反应。虚线代表-60mV的电压水平。C.在分化培养基逐渐增加培养时间(如标记所示)的细胞中-20mV引发的平均Na+电流。条线代表SE。D.在10mM Ba2+和TTX存在下-40mV和0mV引发的重叠的内向电流；保持电位为-90mV。E.与(D)中相同的细胞的电流/电压关系。
通过以下实施例证明了本发明的应用。
实施例
实施例1-1
分离和培养大量NS细胞群体
近年来建立了ES细胞分化操作方案，在贴壁单层培养中能够有效和一致地产生50-70％Sox1阳性神经前体细胞。为了分离、扩展和表征这些培养物中的神经前体细胞(衍生自小鼠)，采用以前产生的细胞系(46C细胞)，它含有靶向Sox1基因座的GFP-IRES-嘌呤霉素报道盒(Ying等，2003b)。7天后将嘌呤霉素加入分化培养物中，3天内，超过95％的其余细胞是GFP+神经前体细胞。此时，将细胞再接种在补充有EGF/FGF-2(无嘌呤霉素)的N2B27培养基中。这些细胞快速生长，在数代内就呈现均一的形态。
这些46C神经前体细胞(46C-NP)保持连续培养20代以上仍保持特征性双极形态。这些培养物中的细胞死亡非常少，接种效率高，倍增时间约为25小时。
实施例1-2
细胞系的培养
为了分离克隆的细胞系，将来自第5代46C-NP细胞的大量培养物的单个细胞接种于微孔板的单独孔中。在95个单个细胞中，15个生长成集落，这些细胞中，4个细胞系保持连续生长10代以上。一个细胞系(NP5)显示出特征性双极细胞，其均一形态与大量群体中观察到的相同。此NP5细胞系可以在培养物中无限地维持(NP541代；5个月以上)。
实施例1-3
NS细胞的表征
为了表征大量群体和克隆细胞系，用免疫细胞化学方法测定一系列标记。正如所料，发现各细胞系对神经前体细胞标记干蛋白或波形蛋白为阳性。重要的是，这些细胞也对放射状胶质细胞特异性标记RC2、3CB2和星形细胞-特异性谷氨酸转运蛋白(GLAST)为阳性。少于1％的细胞对GFAP或βIII微管蛋白为阳性，这预示在这些细胞传代期间星形细胞或神经元很少同时分化。不像灵长动物/人细胞，啮齿动物放射状胶质对GFAP为阴性。而且，这些细胞对识别LewisX抗原的抗体SSEA-1(以前用于富集成年动物神经干细胞)具有免疫反应性。
用一系列标记进行RT-PCR，以确认它们作为放射状胶质细胞的身份。所有四种克隆细胞系以及大量群体对Oct4或Nanog为阴性，这证实了它们不是ES细胞，而它们表达干蛋白、波形蛋白和GLAST，与免疫细胞化学检测一致。而且，各细胞系显示出放射状胶质细胞标记BLBP的表达。这些细胞也表达Musashi-1和凸素。
有趣的是，46C-NP的大量培养物逐渐丢失了Sox1的表达(如GFP报道物所评价)，以致于到第5代(～2周)，保持绿色的细胞非常少。同时，没有克隆细胞系显示出Sox1驱动的GFP表达，RT-PCR证实，这些细胞不表达Sox1，而表达相关的SoxB1类蛋白Sox2。总之，这些结果提示，可用嘌呤霉素选择方案分离一系列Sox1表达的神经前体细胞，可分离和无性扩展具有前脑放射状胶质细胞特性的Sox1-、Sox2+细胞。
实施例1-4。
NS细胞系分化为神经元和胶质细胞
NS细胞系表达的分子标记证实，它们是一类神经前体细胞。为了证实这些细胞是真正的多能干细胞(即能够作为神经元或胶质细胞分化)，测试了设计用于测试细胞潜能的一系列条件。
以前通过以下方案研究神经前体细胞诱导的分化，包括：去除促分裂原和/或加入血清或其它细胞因子。在此情况下，去除塑料板上培养的增殖的NP5和46C-NP细胞中的EGF、FGF或二者。同时去除EGF和FGF导致24小时内细胞快速且广泛地死亡。相反，仅用FGF培养在3天内导致细胞死亡。仅用EGF培养不导致细胞死亡或分化，但细胞增殖减少。因此，EGF显然起塑料板上培养的NS细胞必需的细胞存活信号(由FGF信号转导部分补偿)的作用。
也测定了去除细胞因子后血清对增殖细胞的作用。用此方式处理的细胞即使在没有EGF的情况下也能存活，并以同步方式快速分化，以致于100％细胞获得GFAP染色阳性和干蛋白染色阴性的大扁平星形细胞。因此，增殖群体内所有NS细胞都能够分化为星形细胞。可在没有血清时加入BMP4，然后去除塑料板上的EGF/FGF，从而模拟此作用。CNTF和TGF-b的作用与BMP4相似，虽然星形细胞形态不同，并且最初细胞死亡更多。BMP、CNTF和LIF各自显示诱导原代皮层祖细胞的星形细胞命运(Gross等，1996；Lillien和Raff，1990；Nakashima等，1999)。与这些研究一致，发现用BMP-4或血清处理能快速诱导Id基因(＞30倍)(数据未显示)。
在试图诱导神经元分化时，测试了去除层粘连蛋白处理的培养皿上的EGF。为了避免在塑料板上培养细胞时观察到的细胞死亡，在有FGF而没有EGF的情况下将细胞接种在层粘连蛋白基材上。在这些条件下，在塑料或明胶上没有观察到PCD，细胞存活。细胞的形态改变为更加延伸的双极形式，具有放射状胶质细胞的特征性终足(end-feet)。这些细胞显示出增殖显著降低(通过掺入BrdU)，但维持了放射状胶质细胞标记(RC2、波形蛋白、干蛋白)并且不分化，因为在高密度区域仅观察到一小部分神经元或星形细胞。为了诱导神经元分化，6天后将培养基由NSA/N2+FGF2改变为不含FGF2的NSA/B27。这能促进约40-60％神经元分化(如MAP2和βIII微管蛋白抗体染色测定)。如GABA免疫反应性测定，这些神经元是γ-氨基丁酸能的，而有少量星形细胞(GFAP)。这些结果与前述FGF在防止神经元分化中的作用一致。
也发现，可用与ES细胞相似的方法冻融各细胞系。
在进一步测试中，尝试由单个细胞开始分化。此克隆扩展和分化表明，所有细胞都能够形成神经元。
实施例1-5
不用遗传选择方案分离任何ES细胞系中的NS细胞
起初，优化用于分离NP5的N2B27培养基，使ES细胞转变为神经前体细胞，从而允许ES细胞和神经祖细胞良好存活。因此，在不用嘌呤霉素选择时，由于ES细胞和非神经细胞类型的遗留，不可能用EGF和FGF-2有效扩展46C-NP细胞(数据未显示)。为了克服此问题并由其它非靶向的ES细胞系产生放射状胶质细胞，测试了允许神经前体细胞而非其它细胞类型存活和扩展的其它基本培养基组合。
采用市售培养基NS-A培养基(Euroclone)，发现在第7天再接种46C ES细胞单层分化导致形成细胞块/球，以及非神经细胞死亡。随后这些细胞块发生附着，长出均一细胞群体。此可传代细胞群体(＞75代)的进一步表征揭示出与之前用嘌呤霉素选择方案观察到的表达标记相同的分布型。因此，该细胞对神经前体细胞标记(干蛋白、波形蛋白)、以及放射状胶质细胞标记(RC2、GLAST、BLBP和Pax6)为阳性。一旦建立了仅在形态上差异小和标记基因中无差异后，在N2B27或NSA培养基中46C-NP细胞的特性类似。
用此方案，分离了六种其它ES细胞系：CGR8、E14T、Oct4-GIP、S11、R1和V6.5。这些细胞系各自具有相似形态和表达分布型，并可不断传代。
实施例1-6
NS细胞的移植
为了测试NS细胞的体内潜力，将它们植入胚胎和成年动物CNS，以及肾囊移植物中。
在NP5上测试电穿孔。发现用方波电穿孔器能对它们进行有效的电穿孔。也可用lipofectamine plus试剂转染细胞。这是主要优点，因为目前可获得用于小鼠的所有遗传操作。
为了快速评价移植细胞，用携带eGFP标记基因的慢病毒颗粒转导46C-NP。感染非常有效，几乎95％的细胞成功地标记，随着传代eGFP信号强烈且稳定。采用慢病毒感染允许转基因稳定地整合，并在移植细胞的长期分析中保持信号稳定。
评价移植胚胎脑后(一种环境，其中所包含所有分子和因子能够维持并指导未成熟神经细胞的分化)细胞的行为。按照Magrassi和同事所述(Magrassi等，Development1999)方法，将100,000个细胞重悬于2微升终体积中，采用E14.5小鼠胚胎作为受体。移植后细胞存活良好(在移植物中对约20000个细胞进行近似评估)，容易检测到eGFP信号，它们显示移植后早期时间点已有的迁移活性。在移植后不同时间点(第四天、第七天、两周和一个月)，分析移植细胞的命运。在第四天及一周时，干蛋白免疫反应性表明大多数细胞仍不成熟，但有23％表达神经元标记Tuj-1，16.3％获得胶质细胞标记GFAP。这些数据表明像所期望的多能NS细胞一样，移植的NS能够在体内产生神经元和胶质细胞。
也将NS细胞移植入成年动物纹状体。在这些移植物中，细胞存活良好(存活总比胚胎移植物低)并向神经元和胶质细胞命运分化。移植后两周进行的定量分析表明43.3％细胞表达神经元特异性标记Tuj-1，26.6％显示对胶质细胞标记GFAP的免疫反应性。如干蛋白的表达表明，小部分细胞(11.1％)仍保持不成熟表型。
肾囊中植入NP5-GFP不增加畸胎瘤的发生率(n＝4，数据未显示)。
实施例2
实施例2-1
方法
小鼠细胞的培养和分化
Ying和Smith，2003详细描述了ES细胞和神经分化。通常，在补充有N2和10ng/ml EGF及FGF-2的NS-A培养基(NS扩展培养基)(Euroclone)中，在未包被塑料板上培养的神经分化单层培养物于第七天重新种板，产生称为LC1的NS细胞和其它ES细胞衍生的NS细胞。细胞形成聚集体，然后贴壁长出NS细胞。于第七天在分化中的贴壁培养物中加入0.5μg/ml嘌呤霉素后产生46C-NS细胞。三天后将细胞重新接种于未包被的T75培养瓶，用添加10ng/ml EGF和FGF-2(Peprotech)但不含嘌呤霉素的N2B27培养基培养。通过有限稀释将单细胞接种于96孔板(Nunc)产生克隆细胞系NS-5(接种一小时后进行单细胞评分)。采用标准操作程序产生E16.5小鼠胚胎皮层/纹状体的原代培养物并使其附着在用0.1％明胶处理的培养瓶中。采用NS扩展培养基使Cor-1和Str-1细胞在明胶上扩展。为了分化为星形细胞，用补充有1％胎牛血清或10ng/ml BMP4(R&D System)的NS-A培养基将NS细胞以1×105细胞/孔重新接种于四孔板。为了分化为神经元，用仅补充FGF-2的NS-A培养基将5×104NS细胞接种于多聚鸟氨酸/层粘连蛋白处理的孔。七天后，将培养基更换为补充有B27(Gibco)但没有生长因子的NS-A。为了克隆分化，将1000个NS-5或Cor-1细胞接种于用层粘连蛋白预处理的10cm培养板中，在EGF/FGF-2中扩展12天并如上述原位分化。
NS细胞的表征
利用合适的TRITC或FITC第二偶联物进行免疫组化检测，利用DAPI染色进行核计数。以如下稀释度使用第一抗体：干蛋白(1∶10)，波形蛋白(1∶50)，Pax6(1∶5)，3CB2(1∶20)，RC2(1∶50)(DSHB)；TuJ(1∶200)(Covance)；GFAP(1∶300)(多克隆抗体和单克隆抗体，Sigma)，MAP2(1∶200)(Chemicon和Becton Dickinson)；NeuN(1∶200)，GABA(1∶200)，Gad65/67(1∶200)(Chemicon)；突触素(Synaptophysin)(1∶200)(Sigma)；Olig2(1∶5000)(H.Takebayashi)；Emx2(1∶2000)(A.Corte)；BLBP(1∶500)(N.Heintz)；凸素/mAb13A4(1∶200)(W.Huttner)。阴性对照为ES细胞、分化NS细胞或仅有第二抗体。利用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA，并利用Superscript II(Invitrogen)生成cDNA进行RT-PCR。除β-肌动蛋白(25个循环)外，对所有标记进行PCR，扩增30个循环。中期展开时，用5毫升0.56％KC1处理细胞20分钟，在甲醇∶乙酸(3∶1)中冰上固定15分钟，铺展于玻璃载片上并用TOPRO-3(Molecular probes)染色。
移植物
按照Magrassi等1998所述进行胎手术。在暴露于透照的情况下，利用玻璃毛细管将1μl HBSS中的5×104细胞注入E14.5Sprague Dawley大鼠胚胎的端脑囊泡中。将注射的胚胎放回腹腔发育到足月。分娩后第七天处死动物(出生后天(P)1，n＝16)和移植后五周(P30，n＝8)。对于成年动物移植，将129或CD1小鼠置于Kopf立体定向仪中，含2×105NS细胞的5μl HBSS细胞悬液注入纹状体(n＝22)或海马(n＝21)。两周后(n＝16)和四周后(n＝10)处死移植小鼠并经心脏灌注4％多聚甲醛。利用如下抗体对冷冻切片(16μm)进行染色：(小鼠)：NeuN(1∶100)和Ki67(1∶10)(Chemicon)，MAP2(1∶200；Becton Dickinson)，干蛋白(1∶5；Ron McKay)；(兔)：βIII微管蛋白(1∶500；Covance)；GFAP(1∶200；Dako)；第二抗体，得克萨斯红(载体)(Jackson ImmunoResearch)和AlexaFluor 488(Molecular Probes)。用防褪色溶液保存切片，用Nikon TE2000-SECLIPSE和Biorad Radiance 2100共聚焦显微镜分析。
实施例2-2
诱导ES细胞单层分化七天，然后将其再接种于补充有EGF和FGF-2的基本培养基(NS-A加N2)中。在这些极限条件下(不允许ES细胞存活)，存活细胞主要交联成为漂浮簇。3-5天后收获这些聚集体并重新接种于新鲜培养基中。它们在2-3日内贴壁并长出形态均一的双极细胞群体，称为LC1细胞。传代后LC1细胞继续以贴壁培养物形式生长，常形成网格。它们可随约24小时的倍增时间连续快速增殖。LC1细胞显示神经前体细胞标记干蛋白和RC2但星形细胞分化标记GFAP或神经元抗原的表达可忽略不计(图1A)。暴露于血清或BMP时，48小时内LC1细胞呈现典型星形细胞形态并随后一致地表达GFAP(图1A，e)。相反，再接种在无EGF的层粘连蛋白上5-7天后撤消FGF-2，出现具有神经元过程的细胞。这些细胞表达神经元标记III型β-微管蛋白、MAP2(图1A，f、g)和neuN(未显示)。大多数神经元呈GAD67(图1A，g)和GABA(未显示)染色和第七天一个亚群体显示表达成熟标记突触蛋白(图1A，h)。传代115次后，产生大量神经元(＞35％)(图1A，i)。
综合观察结果，晚期传代时LC1细胞保留双倍染色体内容物(未显示)，这证实了自我更新的神经干(NS)细胞的存在。
实施例2-3
为测定细胞聚集体对于NS细胞的产生是否必要，我们在整个衍生过程中保持细胞附着。利用46C ES细胞进行谱系选择(Li等，1998)，在这种细胞中，GFPirespac报告基因/选择盒整合入神经特化的特异性标记Sox1基因(Aubert等，2003)。分化诱导后瞬时嘌呤霉素选择产生纯化的神经前体细胞群体而没有ES细胞残留(Stavridis等，2003)(图1B，a、b)。然后，FGF-2和EGF加入到培养表达Sox1的神经前体细胞富集培养基中。细胞在此条件中保持粘附。3-4代后细胞异质性减少，表现为双极细胞数逐渐增加并开始形成广泛的网格。引起兴趣的是，细胞在此阶段不表达Sox1(图1B，c、d)但保持对Sox2和于蛋白阳性。为确立神经干(NS)细胞的存在，在Terasaki孔中分离单细胞并扩展为贴壁培养物(图1B，e、f)。最初五个克隆系衍生相似形态并以大量LC1群体为生长特征。这些细胞缺少全能因子Oct4和Nanog及早期神经标记Sox1的可检测的表达，但保留泛神经上皮标记Sox2和干蛋白(图1C)。因此，通过连续贴壁培养Sox1阳性早期神经外胚层前体细胞产生NS细胞。
实施例2-4
更详细地检测了克隆NS-5，发现其表达Pax6、Glast和BLBP mRNA，并且对RC2、波形蛋白、3CB2、SSEA1/Lex1和凸素呈免疫阳性(图1D)。认为这组标记可诊断神经原性放射状胶质细胞，它是神经系统发育期间神经元和星形细胞的前体(Campbell等，2002；Hartfuss等，2001)。与未克隆LC1细胞一样，NS-5细胞对星形细胞和神经元分化是合适的(图1E)。以克隆密度接种于EGF加FGF-2的NS-5细胞产生双极细胞集落。每个集落显示基本上所有细胞都表达RC2和BLBP，不表达GFAP(图1F，c、d)。可挑出这些亚克隆并继续扩展。为了测定NS培养物内能够神经元分化的细胞的频率，我们再一次以克隆密度接种NS-5细胞，在EGF/FGF-2中扩展12天，然后仅在FGF-2中扩展5天，然后再在没有生长因子的条件下扩展7天。每个集落(126/126)都产生TuJ阳性细胞(图1F，b)。这些数据表明，NS培养物中所有集落形成细胞都对神经元分化是合适的。最后，像LC1那样，NS-5细胞维持双倍体染色体组(图1G)并且代表不需要复合物细胞微环境就能自我更新的未转化的克隆神经干(NS)细胞系。
实施例2-5
为了评价无血清单层诱导方案是否是产生NS细胞的必要条件，通过在含血清培养基中形成胚胎样小体和暴露于视黄酸诱导ES细胞分化(Bain等，1995)。用G418对聚集体进行Sox2谱系选择(Li等，1998；Billon等，2002)48小时，然后再接种于存在FGF-2和EGF而没有血清的培养基中。贴壁后，增殖的Sox2阳性、干蛋白阳性细胞显示出NS细胞典型的双极形态和网格生长，加上在多代后有星形细胞和神经元分化的能力(数据未显示)。因此，NS细胞衍生自胚胎样小体。
实施例2-6
利用没有谱系选择的单层诱导产生NS细胞，如三种独立的ES细胞分离物E14TG2a、CGR8和R1的LC1中所述。所有受试NS细胞系中至少95％的细胞表达干蛋白和RC2。更详细地检测了CGR8和E14TG2a衍生的NS细胞，它们显示出全组放射状胶质细胞标记物(图2A)、神经前体细胞标记物Sox2和Sox3、以及bHLH转录因子Olig2和Mash1(图2B)。由于这些转录因子的假定决定性作用，下调Sox1但保持Sox2是这些NS细胞的显著特征(Pevny等，1998)。因此，当Sox1标记所有神经外胚层前体时，它不保留在Sox2可能起到关键作用的干细胞中。NS细胞也表达神经前体细胞扩展中涉及的Emx2(Hein等，2001；Galli等，2002)。经形态学和免疫染色评价，所有受试NS培养物都经历星形细胞和神经元分化(图2C)。
实施例2-7
根据它们与放射状胶质细胞的明显关系，我们检测了NS细胞是否从ES细胞的预适应到离体增殖产生，或是否可衍生自胎儿神经组织。来自E16.5胎脑的原代胎儿CNS细胞在加入生长因子的基本培养基中对塑料板的贴壁能力差，并且自发地形成聚集体。6-7天后，这些聚集体沉降到明胶包被的塑料板上。14天后，用胰酶消化长出物并接种于明胶包被的塑料板上。在三次独立实验中，使形态上可鉴定为NS细胞的细胞增殖，然后扩展为连续细胞系。这些胎脑衍生细胞与ES细胞衍生的NS细胞表达相同的放射状胶质细胞标记和神经原性标记(图2A，B)并显示出一致的mRNA分布型。它们对星形细胞和神经元分化同样是合适的(图2C)。将皮层衍生的Cor-1细胞以单细胞接种，然后集落须经依次撤消生长因子，如对NS-5所述。每个集落都产生TuJ阳性神经元。这说明Cor1培养物中所有产克隆细胞都是神经原性的。也不难对Cor-1细胞进行亚克隆，并由单个细胞连续扩展，表现出自我更新。因此，NS细胞衍生自胎脑并共享ES细胞衍生的NS细胞的关键特性。
大多数NS细胞具有预计为放射状胶质细胞的延长的双极形态、薄层延伸、终足和卵形核(Rakic，2003)。也存在具有延伸短的扁平和致密细胞。中期标记物磷酸化的组蛋白H3的免疫染色表明，致密细胞是有丝分裂细胞。延时视像显微镜检查证实了细胞分裂前形态的动态变化。此外，延时揭示出，NS细胞经历着丝粒间(interkinetic)核迁移，这是体内神经上皮和放射状胶质细胞的良好鉴定的特征。
因此，NS细胞是神经原性放射状胶质细胞的体外可连续扩展的类似物。
实施例2-8
使冻/融传代40次的小鼠神经球在NS扩展培养基中贴附于明胶包被的塑料板上。长出与NS细胞难区分的双极细胞。这些细胞可连续增殖为均一的RC2阳性、GFAP阴性细胞群，然后诱导分化为星形细胞或神经元。
实施例2-9
我们研究了植入小鼠脑后NS细胞的行为。通过子宫内注射E14.5将慢病毒eGFP表达载体转导的ES细胞衍生的LC1细胞引入发育脑中(Magrassi等，1998)。出生后处死动物，检测脑切片中存在的eGFP阳性细胞。NS细胞后代迁移入不同脑区。免疫组化分析揭示出eGFP与前体表记干蛋白，神经元表记TuJ、NeuN和MAP2，以及GFAP(数量较少)的共表达。也将NS细胞注射入成年小鼠纹状体。在这种情况下，GFP阳性细胞保持定位在注射部位附近。移植4周后，44.4±5.7％GFP表达细胞具有神经元形态，并且对MAP2为免疫阳性，37.4±6.1％表达GFAP，4.2±1.9％保持干蛋白的表达(图3)。仅在1.0±0.6％GFP阳性细胞中检测到增殖标记Ki67，表明NS细胞在体内从细胞周期退出。与此一致的是，我们在移植1个月后在共计35个脑中未观察到不受调节的增殖或肿瘤形成的组织学证据。而且，植入小鼠肾囊的NS细胞不增殖或产生畸胎瘤。这些数据说明，NS细胞可在胎儿和成年动物脑环境中存活并分化，这有别于ES细胞(Brustle等，1997)，它们不产生畸胎瘤。而且，与传代神经球的移植物显著相反，神经元分化的频率显著相对高(Rossi等，2002)。
实施例3
采用膜片钳技术的全细胞变体研究了体外分化期间培养物中NS细胞的电生理特性，以了解从电生理观点看，特定处理后这些细胞是否可有效转化为成熟和有功能的神经元。
电生理记录的溶液
在浴液中建立电极和细胞之间的密封，浴液由以下组分组成(毫摩尔/升)：155NaCl、1.0CaCl2、1MgCl2、3.0KCl、10葡萄糖、10HEPES/NaOH(pH 7.4)。为电流钳记录和电压钳中的总电流记录建立全细胞配置后，尖头填充溶液含有(毫摩尔/升)：128KCl、10NaCl、11EGTA、4Mg-ATP、10HEPES/KOH(pH 7.4)。为了在电压钳条件下研究电压门控Na+通道，使膜片尖头充满(毫摩尔/升)：130CsCl、10NaCl、20TEA-Cl、10EGTA、2MgCl2、4Mg-ATP、10HEPES/CsOH(pH 7.4)，胞外溶液含有(毫摩尔/升)：130NaCl、2CaCl2、2MgCl2、10葡萄糖、5氯化四乙铵、CdCl20.2、10HEPES/NaOH(pH 7.4)。为了研究电压门控Ca2+通道，使膜片尖头充满(毫摩尔/升)：120CsCl，20TEA-Cl，10EGTA，2MgCl2，4Mg-ATP，10HEPES/CsOH(pH 7.4)，胞外溶液含有(毫摩尔/升)：130NaCl、10BaCl2、10葡萄糖、5氯化四乙铵、104-AP1、TTX 10-3、HEPES/NaOH(pH 7.4)。
膜片钳记录
用Axopatch 200B膜片钳放大器(Axon Instruments Inc.，Burlingame，CA)，在电压钳条件下以膜片钳全细胞设置(19)室温(20-24℃)记录离子电流，用与IBM兼容性PC连接的Digidata 1322A A/D转换器(Axon Instruments Inc.，Burlingame，CA)以采样间隔26-100微秒数字化记录的离子电流。用以下软件包：pClamp 9(AxonInstruments Inc.，Burlingame，CA)和ORIGIN 6(Microcal Software Inc.，Northampton，MA)进行刺激、获取和数据分析。在电压钳实验中，首先用模拟电路降低漏泄电流和电容性电流的线性组分，然后用P/N法几乎完全消除。膜片吸管由硼硅酸盐玻璃管制成，并经过煅烧抛光。内部充满溶液时吸管的最终阻抗为3-4MΩ。以5KHz过滤电流。
图5A显示出在不同体外分化阶段(用分化培养基分别培养6、20和30天)的三种NS细胞的全细胞电压钳步骤至测试电位去极化期间获得的电流记录，所用浴和吸管填充溶液适合于分离内向(Na+)和外向(K+)电压门控离子电流。通过简单地检查电流示踪证明，在体外分化早期已经存在相当大的外向电压门控电流(6天，示踪a)。此电流(可通过施加含有5mM氯化四乙铵的胞外盐水阻断)具有延迟-整流器K+电流的特征。在分化晚期其幅度仅稍有增加(20-30天，分别是示踪b和c)。相反，随着接触分化培养基的时间不断增加，6天后可以忽略内向电流幅度急剧增加。图5B显示胞内注射保持电位约-80mV产生的70～300pA矩形去极化电流刺激后引发的电压反应，图5A显示在相同细胞中从电压钳转变为电流钳模式。实际上，电压门控内向电流的幅度增加反映了分化细胞引发动作电位的能力。实际上，仅接触分化试剂6天和显示可以忽略的内向电流的细胞不能引发再生的电压反应(图5B中用(a)标记的示踪物)。相反，在分化培养基培养30天的细胞中可引发具有去极化速率相对较快的过调节作用电位(图5B中用(c)标记的示踪物)，并显示大内向电流(图A中的示踪c)。在用分化试剂处理20天的细胞中发现具有一时性作用电位的中间位置(图5B中用(b)标记的示踪物)，且显示中度内向电流(图A中的示踪b)。由此初步分析可以看出，这些细胞的兴奋性特性与内向电压门控电导率的大小严格相关。定量分析此电导率随与分化培养基的接触时间而变化，用不同分化阶段的细胞和应用对研究电压门控Na+通道的活性特异性的胞内和胞外盐水引发内向电流(参见方法)。在细胞分化的任何时间，快速失活性内向电流被选择性Na通道阻断剂河豚毒素(1□M)完全阻断，在测试电位为-20～-10mV时达到峰值，这显示神经元中电压门控Na+电流的典型特征(数据未显示)。在图5C中显示了-20mV时Na+电流幅度的进展随接触分化培养基的时间而变化。有趣的是，Na+电导率增加与接触分化培养基的细胞增多完全相关。实际上，在处理30天内，Na+电流幅度平均增加约十倍(从头5天期间的-55±14pA(n＝17)到25天以上的-434±135pA(n＝13))。以相同方式，在体外分化的头15天期间，Na+电流在0～+20mV的电流钳条件下引发再生电位(在阈值和峰值之间测定的□V)(n＝6)，然而，处理25天以上后，它达到+30～+70mV的值(n＝6)。总之，在用分化培养基处理25天以上的NS细胞中发现兴奋性特性和潜在的电压门控Na+电导率是神经元向其成年表型发育的典型特征。支持前述结论的另一特征是接触分化培养基至少7天或更长时间后，大多数受试细胞中存在电压门控Ca2+通道电导率。图5D显示了从泡在10mM Ba2+中的相同细胞使膜去极化至所示测试电位获得的样品示踪。-40mV引发电流组分的快速活化和相对快速的失活(□h＝21ms)是神经元LVA Ca2+通道电流的回忆(Carbone和Lux，1987)。相反，0mV引发的Ba2+电流(显示出慢(□h＝73ms)且不完全的失活)具有神经元HVA Ca2+通道电流的典型特征。图5E的电流-电压关系验证了此细胞中存在两种不同Ca2+通道(LVA和HVA)电导率。LVA电流平均在-40mV时达到峰值，而HVA电流的I/V关系在0mV时达到峰值。在27个细胞中，可检测到19个细胞的HVA Ba2+电流，在60％已表现出HVA Ca2+电流的细胞(n＝13)中检测到LVA电流组分。
这些数据表明，本发明神经干细胞产生的神经元可起以下作用：它们可以激发动作电位，活性神经元的标记。
因此，根据本发明，我们获得并均一地增殖了确定的NS细胞，作为ES细胞和胎儿脑提取物的分化后代。NS细胞以简单的贴壁单层培养物无性增殖并保持双倍体。长时间扩展后，它们在体外和植入成年动物脑中时有效分化为神经元和星形细胞。NS细胞也在体外形成少突胶质细胞。NS细胞均一地表达放射状胶质细胞、神经元和星形细胞的胎儿前体的形态特征和分子特征。我们能够建立小鼠和人胎儿脑的贴壁NS细胞系。
实施例6
用以下方法获得小鼠ES细胞和胎儿皮层的NS细胞。获得的NS细胞均一地表达放射状胶质细胞标记物。用免疫化学方法分析特异性衍生自CGR8ES细胞或E16胎儿皮层的NS细胞中所示标记物的表达(内标：Cor-1和克隆衍生物Cor-1.3)。大容量检测证明，几乎所有细胞都表达放射状胶质细胞标记物，而这些细胞对GFAP为阴性。
实施例7
用以下方法由扩展的小鼠胎儿前脑神经球产生NS细胞。衍生自胎儿神经球长期培养物(40代)的NS细胞系与ES衍生的NS细胞系的形态相同，表达神经前体细胞/放射状胶质细胞标记物免疫反应性，并可分化为神经元和星形细胞。这表明，获自新鲜胎儿神经球的NS细胞与冻存、然后长时间培养为神经球的那些神经球相同。
实施例8
将LC1小鼠NS细胞植入大鼠胎儿脑。植入E14.5大鼠脑室1周后，拍摄经慢病毒转染eGFP的NS细胞的共聚焦图像。供体细胞由脑室迁移入成簇实质中，作为单个细胞。植入的细胞显示出与eGFP和神经元标记物MAP2、星形胶质细胞标记物GFAP或祖细胞标记物干蛋白的共定位。因此，NS细胞在植入大鼠胎儿脑后迁移和分化。
实施例9
衍生和操作NS细胞系的方法
我们设计了以下衍生和操作NS细胞系的方法。
由ES细胞衍生小鼠NS细胞系
在贴壁单层培养物中，ES细胞可有效转变为表达Sox1的神经祖细胞[P1]。本文别处描述了用于此ES细胞分化的详细方案和疑难解答[P2]。简要说，通常在明胶包被的组织培养塑料板上，在无饲细胞的条件下，用补充有10％胎牛血清和100U/ml重组白血病抑制因子(LIF)的培养基培养ES细胞[P3]。在T75培养瓶(Iwaki)中将未分化的ES细胞扩展至～80％汇合，胰酶消化，重悬于N2B27培养基[P2]。将细胞接种到用0.1％明胶溶液(Sigma)包被至少10分钟，然后干燥的9cm培养板(Iwaki)上。由于初始接种密度是有效神经诱导的重要参数，并且可因ES细胞系而不同，我们通常接种几种不同的每板细胞密度(0.8×106、1×106和1.2×106)。每天更换培养基，同时去除脱附或死亡的细胞。在这些条件下，4-5天内50-80％细胞将经历神经谱系特化，从第5天起可检测到明显的神经元分化。
可通过如下方法使不均一祖细胞培养物转变为均一的NS细胞系。在第7天用胰酶消化分化培养物，再将2-3×106细胞接种于未包被的T75培养瓶中的NS扩展培养基中，该培养基包含NS-A培养基(Euroclone)，补充有终浓度2mM的L-谷胺酰胺(Gibco)、修饰的N2补充物(在室内新鲜制备)[P2]以及小鼠EGF(Peprotech)和人FGF-2(Peprotech)各10ng/ml。扩展培养基可在4℃储存长达4周。2-3天内，培养瓶的悬浮培养物中将含有数千个漂浮的聚集体(绝对数量因初始ES细胞分化效率而不同)。通过温和离心或在30ml通用试管中重力沉降10分钟收获细胞聚集体。此步骤去除了细胞碎片和死细胞，从而富集NS细胞创建者(founder)并保证完全交换培养基。将细胞再接种于明胶包被的T75培养瓶(Iwaki)的10ml新鲜NS扩展培养基中。再过3-7天后，细胞聚集体将贴附于培养瓶，短时间后长出具有特征性双极NS细胞形态的细胞。广泛长出细胞后(再过3-4天)，用胰酶消化整个群体，并以单细胞再接种到含有扩展培养基的明胶包被的T75培养瓶中。细胞非常迅速地生长(倍增时间～25小时)并保持贴壁。在几代内消除了残留的分化细胞和母细胞(由GFAP和TuJ1免疫染色监测)，培养物对NS细胞标记物为均一的阳性。
对于46C ES细胞(Sox1-GFP-IRES-pac敲入)[P4]而言，可用嘌呤霉素(0.5□g/ml)瞬时选择通过连续贴壁培养消除非神经细胞并产生NS细胞。用N2B27培养基将46CES细胞(1×106)接种到明胶包被的9cm培养皿上，以诱导神经定型。六天后，加入嘌呤霉素处理48小时。然后，用含EGF(10ng/ml)和FGF-2(10ng/ml)的N2B27培养基将富集的Sox1表达细胞群(～3-5×106)再接种到明胶包被的9cm培养板上。起初形态不均一的Sox1表达群体逐渐获得Sox1阴性特征，3-4代后，获得均一的NS细胞形态和标记物表达。
由胎儿CNS和神经球衍生小鼠NS细胞系
NS细胞扩展培养基中胎儿E16.5皮层和原代培养物解离后，悬液中形成细胞簇。通过接种到含有扩展培养基的明胶包被的基材上不难使这些原代聚集体转变为贴壁NS细胞系。为了促进贴壁，先通过沉降有效去除细胞碎片/死细胞和完全交换培养基很重要。细胞聚集体在2-5天内将贴壁并长出。然后可用胰酶将长出的细胞消化为单细胞，在NS细胞扩展培养基中再接种和增殖。可通过将传代的胎儿神经球[P5]解离和直接接种到明胶包被的塑料板上的NS扩展培养基中方便地建立NS细胞。在初始的几代中，衍生的NS细胞系倾向于聚集、从培养瓶上脱附和再形成神经球，尤其是若细胞密度高时。因此，应该在50％或低于50％汇合时传代培养物。自发聚集的倾向是可变的，但通常在进一步传代后降低，或者通过建立克隆细胞系。
NS细胞的传代和扩展
一旦建立后，用NS扩展培养基增殖NS细胞。在明胶包被的培养板/培养瓶上培养NS细胞，通常以1∶2至1∶5分瓶。NS细胞的倍增时间约为25小时。用胰酶/EDTA或通过无钙镁PBS(Sigma)孵育传代细胞。为了建立克隆细胞系，可使单个细胞沉积在含有扩展培养基的明胶包被的微孔中。较不严格地说，可以非常低的密度每9cm培养皿1000个细胞接种细胞。在两周内出现集落，可挑出并扩展集落。
深低温保藏和回收NS细胞
冻/融后不难回收NS细胞。通常，我们用胰酶消化60-90％汇合的T75培养瓶，并将沉淀重悬于添加10％DMSO的1.5ml NS扩展培养基中。然后，将其分装到3个1ml冻存管(Nunc)中，储存于-80℃。可在这些条件下储存6个月以上后回收NS细胞。如果需要长期储存，将冻存小瓶转移到液氮中。通过将小瓶迅速置入37℃使NS细胞解冻，然后转移到10ml预热的NS扩展培养基中。离心细胞，然后重悬于新鲜扩展培养基中以去除DMSO。对于NS细胞而言，深低温保藏后的细胞回收率＞95％。
NS细胞的星形细胞和神经元分化
在明胶包被的培养瓶/板上NS细胞接触BMP4(10ng/ml)或1％FCS的NS-A溶液(含有N2，不含EGF/FGF)2天内，NS细胞快速分化为GFAP阳性星形细胞。对于星形细胞分化而言，细胞密度不是重要参数。
对神经元分化而言，用不含钙/镁的Accutase(Sigma)的PBS溶液使细胞脱附，从而收获NS细胞，再将0.5-1.0×104细胞接种于聚鸟氨酸/层粘连蛋白包被的4孔板(Nunc)的各孔中，各孔中含补充有FGF-2(5ng/ml)、修饰的N2和B27(Gibco)的NS-A培养基。我们发现，与其它基本培养基相比，用NS-A基本培养基更容易发生神经元分化。每2-3天更换一半体积的培养基，以保持培养基的调节。在这些条件中7天后，我们将培养基交换为以1∶1的比例混有神经基本培养基(Gibco)的NS-A，其中补充有0.25×N2加B27，不含EGF或FGF。此配方能促进进一步的神经元分化和成熟。为了长期培养神经元(超过14天)，我们将培养基交换为存在BDNF(10ng/ml)、补充有B27但不含N2的神经基本培养基。
人NS细胞的培养和神经元分化
在0.1％明胶(Sigma)包被的培养瓶/板上用扩展培养基扩展人NS细胞，对于小鼠NS细胞而言，再补充100U/ml重组人白血病抑制因子(LIF)。细胞的倍增时间约为1周。达到～30％汇合后，用胰酶一分为二地传代。应该避免过度生长，以维持单层培养物并防止聚集和脱附。
就神经元分化而言，用Accutase(Sigma)收获人NS细胞，再将大约1×104细胞接种于含有扩展培养基的聚鸟氨酸/层粘连蛋白(Sigma)包被的12孔板(Iwaki)的各孔中。扩展细胞，直到它们达到约80％汇合。去除扩展培养基中的EGF和LIF能诱导神经元分化。在没有EGF和LIF的情况下处理7天后，将培养基交换为以1∶1的比率混有神经基本培养基(Gibco)的NS-A，其中补充有0.5×N2、B27、FGF2(5ng/ml)和BDNF(10ng/ml)。在这些条件下再过7天后，将培养基转换为补充有B27和BDNF(10ng/ml)但不含N2或FGF-2的神经基本培养基。在整个此方法中，就小鼠NS细胞而言，每2或3天更换一半培养基。再过10天后，具有与TuJ1和MAP2的免疫反应性的神经元形态细胞多达总细胞数的40％。与用于测定神经元分化的小鼠NS细胞方案(其中出现的GFAP阳性细胞很少)相比，也产生了大量星形细胞。
因此，本发明提供了获得和维持对称分裂、不分化状态的许多物种神经干细胞的方法和培养基。用获自或提取自ES细胞、胎儿和成年动物来源的细胞实施本发明。在所有情况下，通过本文所述方法得到的细胞的外观和行为基本相同；它们都可以高纯度培养物维持，大量(如几百次)倍增后，仍有高比例的细胞保持形成神经元和胶质细胞的能力。特别地，NS细胞成功地获自小鼠(ES，胎儿CNS，成年动物CNS)和大鼠(胎儿CNS)。在纯群体的培养物中培养小鼠神经干细胞，移植后能在体内生长并分化，但不形成肿瘤。
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Claims (10)
1.一种神经细胞群体，其特征在于，所述细胞维持在EGF和FGF-2存在的条件下，所述细胞在一贴壁单层培养物中，所述细胞中至少80％是对称分裂的神经干细胞，不多于1％的细胞表达成熟的星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物，所述神经干细胞不是来自人胚胎干细胞。
2.如权利要求1所述的神经细胞群体，其特征在于，所述群体中的神经干细胞的特征是它们表达标记物RC2、3CB2和BLBP。
3.如权利要求2所述的神经细胞群体，其特征在于，所述群体中神经干细胞的特征还在于它们表达以下蛋白中的至少一种：GLAST、Pax-6、神经前体细胞标记物干蛋白或波形蛋白、LewisX抗原、Musashi-1或凸素。
4.如权利要求2或3所述的神经细胞群体，其特征在于，所述群体中神经干细胞的特征还在于它们不表达以下蛋白中的至少一种：Oct4或Nanog。
5.如权利要求1至4中任一项所述的神经细胞群体，其特征在于，所述群体中的神经干细胞表达Sox-2并且不表达Sox-1。
6.如权利要求1至5中任一项所述的神经细胞群体，其特征在于，所述群体中神经干细胞不含编码癌基因的外源性核酸，或者其中所述神经干细胞不是永生化干细胞。
7.一种神经干细胞系，所述细胞在EGF和FGF-2存在的条件下维持在一贴壁单层培养物中，其中，不多于1％的细胞表达成熟的星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物，所述神经干细胞不是来自人胚胎干细胞。
8.一种包含神经干细胞、EGF和FGF-2的组合物，其特征在于，所述神经干细胞是贴壁单层培养物，组合物中至少80％的细胞是对称分裂的神经干细胞且不多于1％的细胞表达成熟的星形细胞、神经元或少突胶质细胞的标记物，所述神经干细胞不是来自人胚胎干细胞。
9.如权利要求8所述的组合物，其中至少90％所述细胞是对称分裂的神经干细胞。
10.一种权利要求1-6所述群体、权利要求7所述细胞系或权利要求8或9所述组合物中存在的神经干细胞在生产治疗神经变性疾病和脑损伤的制剂中的应用。
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