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CN101124318B - 赋予宿主抗病性的新菌株及细菌细胞组合物 - Google Patents

赋予宿主抗病性的新菌株及细菌细胞组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了包含具有产生丁酸能力的溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)细胞、其培养物或其提取物的新细菌细胞组合物、以及使用其抑制癌发生的方法、免疫刺激的方法、预防或治疗病原体的方法、预防或治疗炎性肠病的方法和预防或治疗变应性疾病的方法。

Description

赋予宿主抗病性的新菌株及细菌细胞组合物
技术领域
本发明涉及包含具有高丁酸产生能力的溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)(下文中也称为B.fibrisolvens)细胞并且在抑制癌发生、提高免疫、预防和治疗致病性感染、预防和治疗炎性肠病以及预防和治疗变应性疾病中有用的新型细菌细胞组合物。
发明背景
近年来，报道了使用乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等具有高乳酸产生能力的益生菌制剂(专利文献1)，并且它们中的许多已经上市。制剂的基本功能是调节肠的功能。当宿主摄取制剂时，由于制剂中包括的产乳酸菌株产生乳酸，所以降低了肠道中的pH。因此，认为降低了在该低pH环境下不能生长的不利细菌数量，并作为其结果显示为调节肠功能。益生菌剂通过此微生物功能赋予宿主例如健康改善和疾病抵抗效果的yi,gif般观念得到社会上的广泛接受，并且效果也得到认可。根据本发明的益生菌剂是指对动物和人健康显示出有用活性的有活力微生物。
最近，不仅报道了由乳酸细菌(lactic acid bacteria)产生的乳酸，而且报道了下列事实，即乳酸细菌通过肽聚糖等蛋白质对宿主具有免疫刺激活性，其中所述的肽聚糖等蛋白质包含在所提供的微生物细胞自身，并且也报道了对某些特定细菌显示窄范围抗菌活性的细菌素(非专利文献1)。
此外，通过人和动物中的肠发酵产生的短链脂肪酸引起了注意。对于短链脂肪酸，它们表现出降低肠道中的pH的功能、促进肠运动(非专利文献2)以及促进Na吸收等的效果。在短链脂肪酸中，丁酸尤其引起了注意。作为其功能，其显示为是结肠上皮细胞重要的能量源(非专利文献3)，并且其赋予宿主非常有用的效果例如其抗癌活性(非专利文献4)，以及其促进肠粘膜细胞分化的效果。
然而，当丁酸直接经口施用时，其在特征性气味和安全性上存在问题。因此，为了使如此重要的生理学活性物质更加有效地作用于宿主，使其在宿主肠中小量地产生并持续吸收而非进行直接的经口腔施用是有效的。
作为使用微生物的肠内丁酸浓度的促进剂，已经公开了那些使用嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和/或长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)细胞作为有效成分的促进剂(专利文献2)。然而，文献中没有对其关于实际疾病效果的描述，并且施用细胞对疾病的抵抗程度也不清楚。
同样地，也公开了使用丁酸梭菌(Clostridium butyricum)(下文也称为C.butyricum)作为具有产生丁酸能力的微生物的方法(非专利文献5)。根据此已知文献，已经作为产丁酸细菌投放市场的丁酸梭菌能够调节肠功能。然而，其在抑制癌前病变细胞的效果方面存在如下问题，即单用微生物效果低，因此其需要与特定基质一起施用来获得足够效果(非专利文献6)。同样地，作为对以相同方式进行的对炎性肠病的预防效果的研究结果，也存在单用微生物效果低的问题。
此外，这些文献没有清楚地描述使用溶纤维丁酸弧菌作为益生菌的示例性方法，并且其中也没有表明其效果。
基于上述，大量注意力已指向具有对宿主更高的改善健康、抗癌和免疫刺激功能、因而具有高疾病抵抗活性并且也具有产生丁酸能力的细菌菌株。
专利文献1：JP-A-2002-306125
专利文献2：JP-A-10-84909
非专利文献1：Kawai等人，Curro Protein.Pept.Sci.，2004，5(5)，393-8，″The circular bacteriocins gas sericin A and circulacin A″
非专利文献2：Cherbut，C.等人，American Journal of Physiology，1998，275，G1415-G1422，″Short-chain fatty acids modify colonic motilitythrough nerves and polypeptide YY release in the rat″
非专利文献3：Cummings，J.H.，Gut，1981，22，763-779，″Short-chainfatty acids in the human colon″
非专利文献4Hague，A.等人，Gastroenterology，1997，112，1036-1040，″Butyrate acts as a survival factor for colonic epithelial cells：further fuelfor the in vivo versus in vitro debate″
非专利文献5：Kanauchi O.等人，Curro Pharm.Des.，2003，9(4)，333-346，″Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatorybowel disease″
非专利文献6：Nakanishi S.等人，Microbiol.Immunol.，2003，47(12)，951-958，″Effects of high amylose maize starch and Clostridiumbutyricum on metabolism in colonic microbiota and formation ofazoxymethane-induced aberrant crypt foci in the rat colon″。
本发明的公开
本发明解决的问题
本发明的目的是提供新分离的具有抑制癌发生效果、免疫刺激效果、病原体感染的预防和治疗效果、预防和治疗炎性肠病效果以及变应性疾病的预防和治疗效果的溶纤维丁酸弧菌的细菌细胞。另外，由于细菌菌株具有高丁酸产生能力，并且能够用作益生菌剂，所以其进一步的目的是提供抑制癌发生的方法、用于免疫刺激的方法、预防和治疗病原体的方法、预防和治疗炎性肠病的方法以及预防和治疗变应性疾病的方法。
解决问题的方法
本发明的发明者进行了大量研究来探寻具有进一步改善人和动物健康、抗癌和免疫刺激功能、并且也具有安全且可以费用不高地提供的在肠中产生丁酸的益生菌制剂。他们发现溶纤维丁酸弧菌具有此类功能，从而完成了本发明。
即，本发明显示如下。
(1)以保藏号FERM BP-10463保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的溶纤维丁酸弧菌MDT-1株及其突变株。
溶纤维丁酸弧菌MDT-1株及其突变株优选作为益生菌剂，并且具有高的产丁酸能力。
(2)细菌细胞组合物，其包含至少一种属于丁酸弧菌属(Butyrivibrio)微生物的细菌细胞、其培养物或其提取物。
(3)根据(2)的细菌细胞组合物，其中所述属于丁酸弧菌属的微生物是溶纤维丁酸弧菌。
(4)根据(3)的细菌细胞组合物，其中所述的溶纤维丁酸弧菌为属于I型溶纤维丁酸弧菌(具有高丁酸产生能力的类型)的菌株。
(5)根据(3)的细菌细胞组合物，其中所述的溶纤维丁酸弧菌为以保藏号FERM BP-10463保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的溶纤维丁酸弧菌MDT-1株及其突变株。
(6)药物制品，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(7)饲料添加剂，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(8)抑制癌发生的治疗剂，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(9)抑制癌发生的方法，其包括向人或脊椎动物施用有效量的(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物。
(10)免疫刺激剂，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(11)用于免疫刺激的方法，其包括向人或脊椎动物施用有效量的(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物。
(12)病原体感染的预防剂和/或治疗剂，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(13)预防和/或治疗病原体感染的方法，其包括向人或脊椎动物施用有效量的(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物。
(14)炎性肠病的预防剂和/或治疗剂，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(15)预防和/或治疗炎性肠病的方法，其包括向人或脊椎动物施用有效量的(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物。
(16)变应性疾病的预防剂和/或治疗剂，其包含(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
(17)预防和/或治疗变应性疾病的方法，其包括向人或脊椎动物施用有效量的(2)-(5)中任意一项所述的细菌细胞组合物。
本发明的效果
本发明的细菌细胞组合物具有抗癌活性、免疫刺激效果、预防和治疗炎性肠病的效果、预防和治疗病原体感染的效果以及预防和治疗变应性疾病的效果等。
附图简述
图1为显示细菌细胞组合物和二甲基肼的施用方案的图。
图2为显示施用DSS和溶纤维丁酸弧菌的小鼠中DAI的图。
图3为显示施用细菌细胞组合物对3-MC诱导的纤维肉瘤形成的效果的图。
图4为显示施用3-MC和细菌细胞组合物对体重增加的影响的图。
实施本发明的最佳模式
下文详细地描述本发明。
根据说明书的“I型”溶纤维丁酸弧菌为细菌基于发酵能力差异的分类(Shane BS等人，J.Gen.Microbiol.，1969，55，445-457，″Cellulolyticbacteria occurring in the rumen of sheep contained to low-protein teffhay″)。由于I型的发酵途径倾向于产生丁酸，并且通过细菌发酵形成的乳酸比率比IIb型少，所以其形成大量丁酸。
如表所示，在产生大量丁酸的I型菌株中，本发明的MDT-1株对降低细胞外pH具有最高的耐性。因此，预计其在甚至酸性的肠道中也可有利地生长。
表1溶纤维丁酸弧菌的最小生长pH
 
菌株 类型 最小生长pH
TH-1 IIb 5.2
MDT-1 I 5.3
51255 IIb 5.5
A38 I 5.8
OB156 IIb 6.0
本文所用术语“抑制癌发生的方法”指的是例如预防形成异常隐窝病灶(aberrant crypt foci)的方法，其中所述的异常隐窝病灶为大肠粘膜癌变前损伤。即，在完全没有癌发生可能性的正常状态的情况下或在有癌发生可能性的情况下，可以通过事先向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品完全地预防癌发生或降低其风险。同样地，当已存在癌发生的可能性时，可以以相同方式通过立即向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品预防或降低癌的发展。
本文所用术语“免疫刺激的方法”指的是例如当病原体细菌、病毒等进入人或动物身体时通过增加快速地显示疾病抗性的NK细胞数、快速且有效地进行产生IgG等的体液免疫应答、快速且有效地进行肠道免疫系统反应等进一步增强免疫力的方法。即，在完全没有发生病原体细菌或病毒感染可能性的正常状态的情况下或在有病原体细菌或病毒感染可能性的情况下，可以通过事先向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品完全地预防或者降低上述病原体细菌或病毒感染进入身体。同样地，当存在病原体细菌或病毒已经进入身体的可能性时，可以以相同方式通过立即向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品预防或降低由于上述病原体细菌、病毒等感染引起的疾病的发生或危险。
同样地，本文所用术语“预防和/或治疗病原菌感染的方法”指的是例如预防病原菌感染或当病原菌进入人或动物消化道或呼吸道时引起的疾病发生和危险的方法，其中所述的病原菌以沙门氏菌(Salmonella)属或弯曲杆菌(Campylobacter)属为代表。即，在完全没有感染可能性的正常状态的情况或在有感染可能性的情况下，通过事先向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品可以完全地预防或降低上述的病原菌感染。同样地，当存在患者已经感染了病原菌的可能性时，可以以相同方式通过立即向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品完全地预防或降低由上述病原菌感染引起的疾病的起始和危险。
本文所用术语“预防和/或治疗炎性肠病的方法”指的是预防和/或治疗例如已知为溃疡性结肠炎或节段性回肠炎的难治疾病的症状或疾病。即，通过向已经患有上述疾病的人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品可以完全地治疗上述疾病或减轻其症状。同样地，在完全没有患上述疾病可能性的正常状态或有患上述疾病可能的情况下，可以以相同方式通过事先向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物预防或减轻上述疾病。
本文所用术语“预防和/或治疗变应性疾病的方法”指的是例如通过将作为免疫细胞的辅助性T细胞Thl/Th2的平衡朝向Th1细胞而改善和/或治疗变应性疾病症状的效果。具体而言，变应性疾病表现为遗传过敏性皮炎、花粉病、食物来源成分引起的腹泻等症状。即，在完全没有显示变应性症状可能性的正常状态的情况下或在有变应性症状危险的可能性的情况下，可以通过事先向人或动物施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品完全地预防变应性症状的危险或降低其风险。同样地，当已经显示变应性症状的可能性时，可以以相同方式通过向人或动物立即施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物或包含其的药物制品预防或减轻变应性症状的发展。
对本发明细菌细胞组合物中的细菌细胞的起源没有特别限制，只要其显示上文所述的多种特性即可。作为起源，其优选属于丁酸弧菌属的微生物，更加优选溶纤维丁酸弧菌，进一步优选分类入I型溶纤维丁酸弧菌的菌株，尤其优选溶纤维丁酸弧菌MDT-1(FERM BP-10463)。对MDT-1的突变株没有限制，只要可以从中获得本发明的效果即可。其实例包括MDT-1的传代培养株、人工突变株和自然突变株、重组菌株等。MDT-1株的细菌学性质如下。
MDT-1的细菌学性质
溶纤维丁酸弧菌菌株MDT-1是革兰氏阴性芽孢杆菌(Gram-negativebacillus)。细菌为严格厌氧性细菌，其生长需要高度的厌氧程度。该细菌对糖的利用如下表所示。
表2溶纤维丁酸弧菌MTD-1的糖利用1)
Figure S05848371620070817D000081
1)关于糖利用，测定培养24小时后的剩余量，并基于消耗量进行区分：“++”表示20mM或更多的消耗；“+”表示5mM或更多的消耗；并且“-”表示少于5mM的消耗。
2)Glu＝葡萄糖，Man＝甘露糖，Fru＝果糖，Gal＝半乳糖，Lac＝乳糖，Ara＝阿拉伯糖，Xyl＝木糖，Cel＝纤维二糖，Sta＝玉米淀粉，Avi＝微晶纤维素(microcrystalline cellulose)。
此外，细菌生长时形成的发酵产物如下。
表3溶纤维丁酸弧菌MTD-1生长时的发酵产物1)
1)使用葡萄糖和纤维二糖(各2g/l)作为底物培养24小时后的发酵产物。
2)在两种细菌中都未检测到琥珀酸和丙酸。
在本文中，溶纤维丁酸弧菌MDT-1于2004年11月9日以保藏号FERM P-20293保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6)(另外，该MDT-1株于2005年12月5日以保藏号FERM BP-10463转移为国际保藏)。
培养MDT-1株的方法如下所述。
在本发明中当培养溶纤维丁酸弧菌时，可以使用常规的营养培养基，只要其包含的成分显示中性pH附近的缓冲能力，并且天然培养基和合成培养基都可以使用，只要它们包含足够的碳源、氮源、金属、短链脂肪酸、维生素和氨基酸。
关于培养基中的碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、淀粉等。另外，可以使用蛋白胨、酵母、肉膏等作为氮源。此外，可以使用磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁、醋酸钾等作为无机盐。
关于培养方法，溶纤维丁酸弧菌可以通过在10℃-70℃、优选25℃-60℃、更加优选30-45℃、在通过用二氧化碳气体、氮气等替代空气来保持更高厌氧程度下搅拌培养2-96小时、优选3-48小时、更加优选5-24小时来进行培养。
本发明的细菌细胞组合物包含上述属于丁酸弧菌属的微生物的细菌细胞、其培养物或其提取物。培养物的实例包括通过以上述方式培养细菌获得的培养物上清等。提取物的实例包括通过从对细菌细胞进行裂解制备的裂解液中提取有效成分获得的提取物。优选地，本发明的细菌细胞组合物包含上述属于丁酸弧菌属的微生物的细胞，因为其可以更加有效地显示本发明的效果。
下面以包含上述属于丁酸弧菌属的微生物的细胞的本发明细菌细胞组合物为例，对本发明的细菌细胞组合物进行说明。
通过离心分离机处理所得培养液获得包含细菌细胞的沉淀。此外，也可以通过在等渗溶液等中悬浮细菌细胞来获得细菌细胞组合物。可以用氯化钠溶液等作为等渗溶液等。
为了获得本发明包含具有产生丁酸能力的微生物的细菌细胞组合物，可以通过在适合上述微生物的条件下进行培养、然后回收包含本发明微生物的细胞、并根据需要加入任选组分(溶液、非所述细胞的细胞、载体、稀释剂等)来制备本发明的细菌细胞组合物。
对细菌细胞组合物中的细菌细胞含量没有特别限制，只要根据使用目的能够发挥上文描述的足够功能即可。例如，以细菌细胞组合物的总重量为基础，含量可以是0.01-99质量％、优选0.1-80质量％。
除了本发明的细菌细胞，本发明的细菌细胞组合物可以进一步包含非本发明细菌细胞的细菌细胞，例如含有至少一种属于乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和梭菌(Clostridium)属的细菌细胞。当组合使用非本发明细菌细胞的细菌细胞作为益生菌剂时，可以期望比仅包含本发明细菌细胞的细菌细胞组合物进一步改善的效果。
本发明的细菌细胞组合物可以仅包含本发明的细菌细胞作为活性成分，或者包含适当载体和/或稀释剂以及作为活性成分的本发明的细菌细胞。对于所述载体或稀释剂，只要其对作为活性成分的本发明细菌细胞的抑制癌发生效果、免疫刺激效果、病原体感染的预防和治疗效果、预防和治疗炎性肠病的效果以及变应性疾病的预防和治疗效果没有抑制作用即可，可以使用通常使用的载体或稀释剂例如赋形剂(例如乳糖、氯化钠、山梨糖醇等)、表面活性剂或防腐剂作为细菌细胞组合物的载体或稀释剂。
通过单独或者以上述制剂形式使用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物，可以在人或宿主动物中发挥抑制癌发生、改善免疫、预防病原体感染、预防炎性肠病以及预防变应性疾病的效果。备选地，甚至当人或宿主动物已经患癌时，免疫力低下时；已有病原体感染的可能性时、已有炎性肠病感染的可能性时或已有变应性疾病感染可能性时，每种症状都可以通过施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物得到治疗或减轻。
对本发明的目标生物没有特别限制，只要其为本发明在其中能有效表达效果的生物即可。其实例包括人或动物。动物的实例包括脊椎动物例如宠物、且驯养的动物可作例证，并且尤其是鱼、两栖动物、爬行动物、禽类、哺乳动物等。它们的示例性实例包括饲养或珍爱的鱼、两栖动物和爬行动物、珍爱的禽类、宠物例如狗、猫和啮齿类、驯养的动物例如牛和猪以及家禽。
关于施用本发明的细菌细胞或细菌细胞组合物，期望能使细菌细胞或细菌细胞组合物到达消化道的实施方案，并且进一步期望能使其到达肠的实施方案。实施方案的实例包括以片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂、粉剂、口服用的口服溶液等经口施用、以及使用栓剂的肠胃外施用。
对于在本发明的药物、饲料添加剂、癌发生抑制剂、免疫刺激剂、病原体感染的预防剂和治疗剂、炎性肠病的预防剂和治疗剂以及变应性疾病的预防剂和治疗剂中作为活性成分的上述细菌细胞组合物的含量没有特别限制，只要能获得本发明的效果即可，当其以细菌细胞量表示时，优选为103-1014cfu/g、更加优选105-1013cfu/g、并且尤其优选106-1012cfu/g。
对于在本发明的药物、饲料添加剂、癌发生抑制剂、免疫刺激剂、病原体感染的预防剂和治疗剂、炎性肠病的预防剂和治疗剂、变应性疾病的预防剂和治疗剂、以及本发明的方法中作为活性成分的上述细菌细胞组合物的施用方法(剂量、施用频率、施用期间)没有特别限制，只要上述细菌细胞能到达肠并且能在肠中生长、并且能够获得本发明的效果即可。因此，其可以根据目标动物、目的以及细菌细胞的生长状态进行适当设置。
只要能获得本发明的效果，对剂量没有特别限制，但当其以每次施用的细菌细胞数量表示时，其优选每1千克目标动物103-1015cfu、更加优选106-1014cfu、并且尤其优选108-1012cfu。
上述剂量范围可以例如施用一次或者一段时间里连续施用。在连续施用的情况下，施用期间例如优选2天至6个月或更长、更加优选3天至6个月或更长、尤其优选7天至6个月或更长。根据本发明，本发明的效果可以进一步通过连续施用进一步延长的一段时间来表达。
在连续施用的情况下，施用频率例如优选1个月内施用一次或多次、更加优选2周内施用1次或多次、尤其优选1周1次至每天施用。
关于施用方法，通过将每日剂量设置为上述范围，整个剂量可以一天一次施用或者可以将其分成1天2-3次施用。备选地，可以将其以此每日剂量属于上述范围的方式与饲料等混合施用。
实施例
虽然在下文中基于实施例示例性地描述了本发明，但它们不限制本发明的范围，并且本文包括它们所有未在本文显示的改变或修改的含义。
实施例1制备细菌细胞组合物
为了获得本发明的细菌细胞组合物，将由0.9g磷酸氢二钾(Wako PureChemical Industries生产)、0.9g磷酸二氢钾(Wako Pure ChemicalIndustries生产)、1.8g氯化钠(Wako Pure Chemical Industries)、1.8g硫酸铵(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.24g无水氯化钙(Wako PureChemical Industries生产)、0.375g七水硫酸镁(Wako Pure ChemicalIndustries生产)、1g醋酸钾(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.5g丙酸钠(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.3g正丁酸钠(Wako PureChemical Industries生产)、0.1g戊酸(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.1g异丁酸(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.1g异戊酸(WakoPure Chemical Industries生产)、0.1g2-甲基丁酸(Wako Pure ChemicalIndustries生产)、10mg柠檬酸铁铵(Wako Pure Chemical Industries生产)、6mg氯化锰(Wako Pure Chemical Industries生产)、2mg硫酸钴(WakoPure Chemical Industries生产)、0.4mg氯化镍(Wako Pure ChemicalIndustries生产)、0.4mg钼酸铵(Wako Pure Chemical Industries生产)、1mg15％硫酸铜(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.3mg硫酸铝钾(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.3mg硼酸(Wako Pure ChemicalIndustries生产)、2mg硫酸锌(Wako Pure Chemical Industries生产)、2mg磷酸吡哆醛(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.5mg对氨基苯甲酸(Wako Pure Chemical Industries生产)、0.2mg生物素(Wako PureChemical Industries生产)、2mg丙酸苯酯(Kanto Chemical Co.，Ltd.生产)、2mg L-精氨酸(Wako Pure Chemical Industries生产)、100mgPanvitan(Takeda Chemical Industries生产)、0.03μl维生素K1(SIGMA生产)、3g葡萄糖(Wako Pure Chemical Industries生产)、3g酵母提取物(Difco生产)、1.5g胰蛋白胨(Becton Dickinson and Company生产)、1.5gTypticase(Becton Dickinson and Company生产)和1g半胱氨酸盐酸盐(Wako Pure Chemical Industries生产)(pH7.0)组成的培养基(在下文中称为培养基A)进行CO2置换，密封于容器中，并加热灭菌。然后将溶纤维丁酸弧菌MDT-1(FERM BP-10463)接种于培养基A(40ml)中，并在37℃搅拌下培养5小时。通过用离心机(3000G，30分钟)离心如此获得的培养基，得到包含细菌细胞的沉淀。接下来，通过在0.8％的NaCl溶液中悬浮细菌细胞获得细胞密度为1010cfu/ml的细菌细胞组合物。
实施例2对ACF形成的抑制效果
使用本发明的细菌细胞组合物，对其抑制小鼠由DMH(二甲基肼，Aldrich生产)诱导的异常隐窝病灶(ACF)形成的能力进行了评估。此外，对已经作为丁酸细菌上市的丁酸梭菌(clostridium butyricum)实施了相同的测试，并比较了它们的抑制效果。
使用4周龄的雄性Jcl：ICR小鼠(CLEA Japan，Inc.)作为测试动物。测试通过设置下表所示的测试组实施，其中每个组10只动物。
通过使用胃管将通过实施例1中所述方法获得的细菌细胞组合物强制经口施用于小鼠。向对照组施用0.1ml0.8％NaCl溶液，向施用组施用0.1ml(109cfu)的0.8％NaCl溶液的细菌细胞组合物。图1显示施用细菌细胞组合物和二甲基肼(DMH；Aldrich生产)的方案。
在测试开始之后的第31天测定大肠道粘膜的癌变前损伤异常隐窝病灶(ACF)。对每只小鼠进行安乐死，分离部分小鼠从盲肠下至肛门的肠道，并在切开中央部分后用10％福尔马林(Junsei Chemical生产)固定，并用光学显微镜计数ACF。
表4测试组
 
组别 动物数量 施用DMH 施用细菌细胞
不施用DMH和细菌细胞 10 0.8％NaCl 0.8％NaCI
施用DMH但不施用细菌细胞 10 DMH50mg/kg体重 0.8％NaCl
施用DMH和溶纤维丁酸弧菌 10 DMH50mg/kg体重 109cfu，每周3次
施用DMH和丁酸梭菌 10 DMH50mg/kg体重 109cfu，每周3次
体重的变化和器官的状态
虽然通过施用DMH减少了体重的增加，但其通过经口施用本发明的细菌细胞组合物得到改善(表5)。经口施用丁酸梭菌未发现此效果。在完成测试时未发现肝脏质量显著不同(表6)。每一体重的肝脏质量通过施用DMH得到减少，并且通过施用本发明的细菌细胞组合物改善到DMH非施用组的相似水平。脾脏质量通过施用DMH得到增加，并且通过施用本发明的细菌细胞组合物改善至某个程度。丁酸梭菌未发现此类效果。
表5体重的变化
Figure S05848371620070817D000151
a-c：显示不同符号之间有显著差异。(p<0.05)
表6器官重量
Figure S05848371620070817D000152
a-c：显示不同符号之间有显著差异。(p<0.05)
肠道的状况和ACF
从结肠到直肠的长度通过施用DMH得到缩短，并通过本发明的细菌细胞组合物改善至某种程度。另外，盲肠的质量以及结肠直肠的质量通过施用DMH得到降低，并通过本发明的细菌细胞组合物改善至某种程度。在盲肠内容物和结肠内容物的pH方面未发现差异。此外，通过经口施用本发明的细菌细胞组合物将ACF的形成数抑制至大约一半。丁酸梭菌也未发现此类效果。
表7结肠直肠长度、盲肠和结肠直肠重量以及盲肠和结肠直肠内容物的pH
Figure S05848371620070817D000161
a-c：显示不同符号之间有显著差异。(p<0.05)
表8ACF的形成数
 
组别 ACF的形成数
不施用DMH和细菌细胞施用DMH但不施用细菌细胞施用DMH和溶纤维丁酸弧菌施用DMH和丁酸梭菌       0±0.0a14.7±1.2b7.4±0.8c15.7±1.2b
a-c：显示不同符号之间有显著差异。(p<0.05)
实施例3免疫促进效果
通过测定首先攻击进入身体的外源物质例如病原体和病毒的NK细胞检测宿主中免疫促进的程度。
使用8周龄的雄性Jcl：ICR小鼠作为测试动物，并且每组测试3只动物。
通过使用胃管将通过实施例1中所述方法获得的细菌细胞组合物强制经口施用于小鼠。向对照组施用0.1ml0.8％NaCl溶液，向施用组施用0.1ml(109cfu)的0.8％NaCl溶液的细菌细胞组合物。连续实行施用3天，并在第一次施用1周后处死每只小鼠。
从通过颈椎错位处死的小鼠分离脾脏，并从中制备脾细胞。在裂解红细胞之后，洗涤细胞两次，并在PBBS(缓冲液，见表)中悬浮成107个细胞/毫升的密度。向100μl如此制备的脾淋巴细胞悬浮液中加入10μl下文所述的每种抗体，并将其于冰上放置30分钟。然后，将其用PBBS洗涤两次，并用于测试。使用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)测定细胞。在细胞标记中使用FITC标记的抗CD3抗体(Beckman Coulter，Inc.生产)、PE标记的抗CD19抗体(Beckman，Coulter，Inc.生产)以及PE标记的抗NK1.1抗体(Beckman Coulter，Inc.生产)。
通过经口施用细菌细胞组合物，降低了淋巴细胞中T细胞和B细胞的比率，并且增加了NK细胞和NKT(天然杀伤T)细胞的比率(表10)。当将其换算为细胞数目时，未发现经口施用细菌细胞组合物对T细胞和B细胞数量的影响(表11)。然而，NK细胞数量增加至3.5倍，且NKT细胞的数量增加至3.8倍。因此，向小鼠经口施用细菌细胞组合物促进了它们的免疫功能。
表9PBBS(磷酸盐缓冲的平衡盐溶液)(加入0.1％BSA)
除了BSA(Wako Pure Chemical Industries生产)，所有都由KantoChemical生产。
表10淋巴细胞的存在比率
 
组别 T细胞(％) B细胞(％) NK细胞(％) NKT细胞(％)    其它(％)
对照组 17.2 53.4 4.6 0.8 24.1
试验组 16.5 42.3 14.4 2.5 24.4
表11淋巴细胞的数量
 
组别 T细胞 B细胞 NK细胞 NKT细胞 其它
对照组 8.9×106 2.8×107 2.4×106 3.9×105 8.0×107
施用组 9.5×106 2.5×107 8.4×106 1.5×106 7.1×107
实施例4预防病原体感染的效果
弯曲杆菌(Campylobacter)是食物中毒的成因细菌，其从粪便或污染了的食物经口摄入，并驻留在肠道中。因此，检测溶纤维丁酸杆菌MDT-1株是否具有预防感染的效果。
使用5周龄的雄性Jcl：ICR小鼠(CLEA Japan，Inc.)作为测试动物，并且每组测试10只动物。
通过使用胃管将通过实施例1中所述方法获得的细菌细胞组合物强制经口施用于小鼠。向对照组施用0.2ml0.8％NaCl溶液，向施用组施用0.2ml(109CFU/ml)的0.8％NaCl溶液的细菌细胞组合物。从感染前4天开始连续进行施用3天。2天以后，将大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)菌株11580-3(家禽来源)经口接种0.2ml(107CFU/ml)。以与感染前相同的方式，在感染的次日开始连续施用细菌细胞组合物4天。将每只动物在感染后的第5天处死，并解剖收集盲肠粪便。将其用0.8％NaCl通过10倍连续稀释进行稀释，并涂布至弯曲杆菌10％羊血琼脂培养基(JapanBecton Dickinson and Company)上。在厌氧培养箱中于42℃培养48小时之后，计数存活的细胞(集落)数量来计算每1克盲肠粪便中弯曲杆菌细胞数量(log CFU/g)。
在对照组和细菌细胞组合物组中都未观察到致死情况。
如表12所示，对照组盲肠粪便中的弯曲杆菌数量平均为8.27logCFU/g(7.88-8.82log CFU/g)，并且细菌细胞组合物组中平均为6.96logCFU/g(4.79-8.69log CFU/g)。与对照组相比，细菌细胞组合物组表现为显著下降了1.31log CFU/g。
基于上述结果，当施用细菌细胞组合物时减轻了弯曲杆菌的感染。即，显示通过连续摄入细菌细胞组合物可以起预防或减轻感染的效果。
表12对弯曲杆菌的感染预防效果
Figure S05848371620070817D000191
＊存在显著差异：P<0.05
实施例5炎性肠病的预防效果
炎性肠病(IBD)例如溃疡性大肠炎和节段性回肠炎为难治疾病。因此，检测溶纤维丁酸弧菌MDT-1株是否具有同样效果。
使用4周龄的雄性Jcl：ICR小鼠(CLEA Japan，Inc.)作为测试动物，并且每组测试6只动物。
通过使用胃管将通过实施例1中所述方法获得的细菌细胞组合物强制经口施用于小鼠。向对照组施用0.1ml0.8％NaCl溶液，向施用组施用0.1ml(109cfu)的0.8％NaCl溶液的细菌细胞组合物。连续施用3天。
为了诱发IBD，将葡聚糖硫酸钠(DSS，MP Biomedical制造)在饮用水中溶成3％(w/v)浓度，并让小鼠自由摄取。在连续使用细菌细胞组合物3天后的次日开始施用DSS，并进行7天。在第8天，处死每只小鼠，并解剖测定肠道长度和质量。
以下列方式进行计算疾病活性指数(DAI)。即，通过从0到4的5阶段评估体重减少、粪便形状(腹泻程度)和潜血。在这种情况下，严重症状通过更高的值得到评估。将用这三项测试的总数除以3计算得到的值用作DAI。
以下列方式实行测试髓过氧化物酶(MPO)的方法。即，将大肠末端6cm长的部分悬浮于含有5ml/l(v/v)十六烷基三甲基溴化铵(HTAB，表面活性剂)(Wako Pure Chemical Industries生产)的20mmol/l磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)中，并进行超生破碎。离心(15,000转/分钟，15分钟)之后，将0.1ml上清与2.9ml含有20mM愈创木酚(SIGMA生产)和5ml/1的过氧化氢(Kanto Chemical Co.，Ltd.生产)的20mM磷酸盐缓冲液(pH＝6.0)混合，并测定在460nm波长处的吸收度变化，并用作MPO活性。
如表6所示，通过施用DSS降低了体重，但在经口施用细菌细胞组合物的小鼠中降低的程度得到减轻。
表13通过施用DSS和溶纤维丁酸弧菌所致小鼠体重的改变
Figure S05848371620070817D000201
a-c显示不同符号之间有显著差异(P<0.05，n＝6)。
虽然通过施用DSS观察到脾脏变大，肝脏变小以及大肠变短，但通过施用细菌细胞组合物这些改变的程度得到减轻(表14)。
表14施用DSS或溶纤维丁酸弧菌的小鼠的脾脏和肝脏重量以及肠管长度
Figure S05848371620070817D000211
a-c显示不同符号之间有显著差异(P<0.05，n＝6)。
同样地，从通过将体重减少、粪便形状和潜血转换成为数值获得的DAI值，认为通过施用细菌细胞组合物减轻了疾病病症(图2)。此外，在施用细菌细胞组合物的小鼠中肠道组织的MPO活性下降至仅施用DSS的小鼠的大约40％(表15)。基于这些结果，认为施用细菌细胞组合物的小鼠肠道组织中的嗜中性粒细胞更少所以炎性程度降低。
表15施用DSS或溶纤维丁酸弧菌的小鼠肠道中的MPO活性
 
施用DSS 施用溶纤维丁酸弧菌 MPO相对活性
- - 20c
+ － 100a
+ + 43b
a-c显示不同符号之间有显著差异(P<0.05，n＝6)。
基于上述结果，经口施用细菌细胞组合物减轻了症状。即，显示当连续摄取细菌细胞组合物时可以预防炎性肠病。
实施例6抗变态反应活性
通过向小鼠经口施用溶纤维丁酸弧菌可以使脾中的NK细胞(自然杀伤细胞)数量增加。NK细胞形成细胞因子IFN-γ。IFN-γ具有使辅助性T细胞的Thl/Th2平衡倾向于Th1的能力。Th1/Th2平衡是涉及影响变应性的指标。因此，也通过测定细胞因子检测溶纤维丁酸弧菌是否对变应性疾病有效。
在20ml合成培养基中培养溶纤维丁酸弧菌MDT-1株，直至其到达对数生长期的中期。将细菌细胞用PBS(缓冲液)洗涤一次，并通过离心沉淀回收，然后悬浮在含10％牛血清(JRH Bioscience)的RPMI-1640培养基(KOHJIN BIO生产)中，以此方式将细菌细胞数量变成4×107个细胞/毫升。
从小鼠分离脾脏，并从中制备脾细胞。在裂解红细胞之后，将细胞洗涤两次，并在含10％牛血清(JRH Bioscience)的RPMI-1640培养基(KOHJIN BIO生产)中悬浮成4×107个细胞/毫升的密度。向培养皿中加入0.5ml的脾细胞悬浮液，并进一步向其中加入0.5ml细菌液或培养基，然后在5％CO2的培养箱中孵育72小时。
以下列方式实行细胞因子的测定。即，对细胞培养液进行离心沉淀，并将所得上清用作样品。使用ELISA试剂盒(Amersham Biosciences)并根据其所附说明书进行IFN-γ和IL-4数量的测定。
作为结果，通过加入溶纤维丁酸弧菌MDT-1株增加了IFN-γ的产生。另一方面，降低了具有使Th1/Th2平衡倾向Th2能力的IL-4的产生(表16)。认为通过存在溶纤维丁酸弧菌MDT-1株使Th1/Th2平衡倾向于Th1。因此，经口施用溶纤维丁酸弧菌MDT-1株也对变应性疾病有效。
表16小鼠脾细胞细胞因子IFN-γ和IL-4的相对量
Figure S05848371620070817D000221
实施例7对肉瘤形成的影响
为了证实是否对在非大肠区域形成的癌有抑制效果，检测了对小鼠中通过皮下施用3-甲基胆蒽(3-MC)诱导形成纤维肉瘤的影响。
对三组动物进行测试，分别为不施用3-MC/不施用细菌细胞组合物组(10只动物)、施用3-MC/不施用细菌细胞组合物组(13只动物)以及施用3-MC/施用细菌细胞组合物组(11只动物)实行测试。通过以每周3次的频率向4周龄的Jcl：ICR小鼠(CLEA Japan，Inc.)强制经口施用0.1ml(109CFU)按实施例1中所述方法获得的细菌细胞组合物。在第1次施用1周后，将20mg3-MC(SIGMA)溶解在2.0ml橄榄油中，并将其中的0.1ml(3-MC，1mg)皮下施用至肋的右侧。向对照组施用相同数量的橄榄油。在皮下施用1周后进行一次触诊，并将3mm或更大直径的硬块视为肿瘤。进行触诊15周。此外，在施用5周后每组处死3只动物，并测定淋巴细胞组分(NK细胞)。
分离每只处死小鼠的脾脏，并在添加了0.1％BSA的PBS(BSA/PBS)中悬浮脾细胞，并用离心沉淀洗涤。在用低渗溶液(14mmol/lNH4Cl，17mmol/l Tris，pH7.6)去除红细胞后，用BSA/PBS洗涤两次。通过加入荧光标记的T细胞抗体[FITC标记的抗CD3抗体、PE标记的抗CD19抗体、PE标记的抗NK1.1抗体、FITC标记的抗CD4抗体或PE标记的抗CD8抗体(Beckman Coulter，Hialeah，Florida)]对细胞悬浮液进行标记。用流式细胞术(FACSCalibur，Becton Dickinson)计数标记的淋巴细胞数量。
对3-MC诱导的纤维肉瘤形成的影响
如图3所示，在皮下施用橄榄油的小鼠中未发现肿瘤形成。在单用3-MC的测试组中，在施用3-MC后的第5周开始出现肿瘤。这个时间点肿瘤形成的比率为20％。此后形成比率持续增加，并且在施用3-MC后的第9周在所有小鼠中都形成了肿瘤。在另一方面，在施用细菌细胞组合物的组中第5周的肿瘤形成比率为0％，并且第9周为50％。此外，甚至在15周之后形成比率为75％。基于该结果，确定在小鼠中经口施用细菌细胞组合物具有延迟或抑制3-MC诱导的肿瘤形成的效果。另外，3-MC处理和施用细菌细胞组合物对小鼠的体重增加没有影响(图4)。
对脾淋巴细胞组分的影响
为了确定NK细胞是否与通过细菌细胞组合物对肿瘤形成的延迟或抑制效果有关，对脾中的淋巴细胞组分进行了测定。由于认为显示细菌细胞组合物的效果需要一段特定程度时间，所以仅在开始形成肿瘤之前即在施用3-MC的4周之后实行淋巴细胞的测定。4周后测试组之间体重和肝以及脾的重量以及饲料的摄入量方面都未发现显著差异(表17)。然而，通过施用细菌细胞组合物显著增加了NK细胞和NKT细胞的比率(表18)。
表17体重和肝以及脾的重量，以及饲料的摄入量
Figure S05848371620070817D000241
表18施与3-MC和细菌细胞组合物对脾淋巴细胞组分的影响
Figure S05848371620070817D000242
认为NK细胞在癌发生的开始阶段具有重要作用。此外，已有关于NK细胞细胞毒活性增加抑制癌发生的可能性的报道。此外，如实施例3所示，证实经口施用细菌细胞组合物使脾中的Th1/Th2平衡倾向于Th1。结果由于已知Th1细胞因子IFN-α促进NK细胞的增殖，所以认为NK细胞增加，延迟或抑制了癌的形成。
基于上述结果，证实通过经口施用细菌细胞组合物也可以抑制非大肠区域的癌。
虽然详细且引用特定实施方案对本发明进行了描述，但对本领域技术人员显而易见，其中可以进行多种变化和修改而不脱离本发明的宗旨和范围。
本申请基于2004年12月28日提交的日本专利申请(日本专利申请号2004-379693)，并在此处将其全部内容引入作为参考。
工业可应用性
本发明提供了具有抗癌作用、免疫刺激效果、预防和治疗炎性肠病的效果、预防病原体感染的效果、预防和治疗变应性疾病的效果等的细菌细胞组合物。

Claims (14)

1.以保藏号FERM BP-10463保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)MDT-1株。
2.细菌细胞组合物，包含以保藏号FERM BP-10463保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心的溶纤维丁酸弧菌MDT-1株的细菌细胞或其培养物。
3.药物制品，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
4.饲料添加剂，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
5.抑制癌发生的治疗剂，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
6.权利要求2所述的细菌细胞组合物的用途，用于制备在人或脊椎动物中抑制癌发生的治疗剂。
7.免疫刺激剂，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
8.权利要求2所述的细菌细胞组合物的用途，用于制备在人或脊椎动物中刺激免疫的免疫刺激剂。
9.病原体感染的预防剂和/或治疗剂，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
10.权利要求2所述的细菌细胞组合物的用途，用于制备在人或脊椎动物中预防和/或治疗病原体感染的预防剂和/或治疗剂。
11.炎性肠病的预防剂和/或治疗剂，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
12.权利要求2所述的细菌细胞组合物的用途，用于制备在人或脊椎动物中预防和/或治疗炎性肠病的预防剂和/或治疗剂。
13.变应性疾病的预防剂和/或治疗剂，其包含权利要求2所述的细菌细胞组合物作为活性成分。
14.权利要求2所述的细菌细胞组合物的用途，用于制备在人或脊椎动物中预防和/或治疗变应性疾病的预防剂和/或治疗剂。
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