CN101123990A - 包含抗原和佐剂的纳米颗粒，和免疫原性结构 - Google Patents
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Abstract
公开了包含佐剂和抗原的纳米颗粒，抗原如肿瘤和病原体抗原，以及它们在一系列应用中的用途，如癌症和传染病的治疗。基于纳米颗粒或抗体的带有糖类配体的免疫原性结构，以及它们用于治疗和预防目的的用途，和用于分离和检测对抗该糖类结构的抗体的用途。
Description
发明领域
本发明涉及纳米颗粒，更特别地涉及包含佐剂和抗原的纳米颗粒，抗原如肿瘤和病原体抗原，以及它们在一系列应用中的用途。本发明进一步涉及带有糖类配体的免疫原性结构，以及它们用于治疗和预防目的的用途，和用于分离和检测对抗该糖类结构的抗体的用途。
发明背景
糖类和肽抗原直接注射给患者时缺乏免疫原性大大妨碍了它们在疫苗中的应用。这种抗原单独注射时常常被抗原呈递细胞(APCs)忽略，被迅速清除并且不诱导免疫反应。
在大多数情况下，将该抗原与佐剂结合给予仍是必需的。佐剂可以是单纯的递送系统如脂质体，其缓慢清除抗原并使其更可能到达并被APCs接受。然而，这实质上不是很有效并且通常需要与刺激免疫系统的试剂结合，如刺激细胞因子形成的细菌产物。细胞因子本身也可以共同给予。这些产品中的许多毒性太大或太具实验性而不能应用于人类，而且最有效的佐剂还未被批准用于人类。可以用于人类的大多数佐剂的有效性是有限的。寻找适于人类使用的有效佐剂是一项持久挑战。
糖类抗原免疫原性特别弱，因为它们仅可以刺激B细胞反应，不能刺激T细胞反应。这通常通过将糖类与蛋白载体结合来达到。然而，为了增强免疫反应，使用佐剂仍是必需的。
糖类抗原是用于抗癌免疫疗法的潜在目标，因为它们暴露于肿瘤细胞表面但是隐藏在正常细胞上。许多细菌及其他病原体也因糖类抗原而区别，如果糖类免疫原性不是如此弱的话，其是用于疫苗的好目标。因此改善糖类抗原的免疫原性将应用于多种治疗领域。
癌细胞通常以异常方式被糖基化，是将它们与正常细胞区分开来的特征。(Glycoconjugate J.(1997)，14：569；Adv.Cancer Res.(1989)，52：257；Cancer Res.(1996)，56：5309)。在大多数情况下，异常糖基化以糖蛋白和糖脂形式存在于细胞表面。因此这些改变的糖类结构可以被称作肿瘤相关抗原(TAA)，其常常不存在于正常细胞上。在很多情况下，细胞不显示出同种糖基化，即，细胞表面上存在复合聚糖链的不同糖形式(Annu.Rev.Biochem.(1988)，57：785)。在大多数改变的肿瘤相关抗原的发现和随后表征的过程中，研究表明它们对于癌细胞具有重要作用。例如，肿瘤相关抗原能够使退化细胞显示出恶性表型的特征性性质，如粘附能力增加，所述粘附在建立转移中起重要作用。然而，这种抗原在某些阶段也可以在正常细胞中表达，在那里它们负责这些细胞的正常功能。因此，肿瘤相关抗原是主要由肿瘤细胞呈递的结构，通常在细胞膜上或膜中，这允许它们与非恶性组织区分开。肿瘤相关抗原可以是例如多肽，特别是糖基化蛋白，或糖基化形式的多肽。可以代表肿瘤相关抗原的其他结构包括糖脂，例如神经节苷脂如GM2。这种肿瘤相关抗原可以表现为细胞膜脂类成分的改变，其可能是癌细胞的特征。
肿瘤相关抗原包括下列实例。
N-CAM(神经细胞粘附分子)，其常常在神经起源的肿瘤上表达并且引起同嗜性粘着(J.Cell Biol.118(1992)，937)。
Lewis Y糖类抗原，其存在于大多数上皮起源的肿瘤上，但是其在上皮组织的胎儿发育中也起重要作用。已经表明这个抗原在肺癌中的表达与预后不良有紧密关联，因为Lewis Y阳性癌细胞显然具有较高的转移潜力(N.Engl.J.Med.327(1992)，14)。
CEA(癌胚抗原)，其常常存在于胃肠道的上皮肿瘤中，并且已被鉴定为自粘分子(Cell 57(1989)，327)。
Ep-CAM(上皮细胞粘附分子)，其在几乎所有上皮起源的肿瘤上表达，但是其还存在于许多正常上皮上。它已被表征为自粘分子(self-adhesion molecule)并且因此可以被分类为全上皮(pan-epithelial)粘附抗原(J.Cell Biol.125(1994)，437)。
肿瘤相关抗原的更多实例是Sialyl Tn糖类，Lewis抗原(Lewis-x、Lewis-b、Lewis y-结构)、Globo H糖类、神经节苷脂如GD2/GD3/GM2、前列腺特异性抗原(PSA)、CA 125、CA 19-9、CA 15-3、TAG-72、EGF受体、Her2/Neu受体、p97、CD20和CD21。对抗所有这些抗原的单克隆抗体是可以获得的。肿瘤相关抗原的实例在DeVita etal.(Eds.，″Biological Therapy of Cancer″，2.Edition，Chapter3：Biology of Tumor Antigens，Lippincott Company，ISBN0-397-51416-6(1995)，(Elektrophoresis(1999)，20：362；Curr.Pharmaceutical Design(2000)，6：485，Neoplasma(1996)，43：285))中描述。
癌症的治疗方法有多种，然而目前治疗方案的成功率仍待提高。除手术和化疗之外，还已知免疫疗法。
在被动免疫疗法中，单克隆抗体(MAbs)以适当的量全身给予患者，直接与靶结合。治疗的目的是形成免疫复合物，通过一系列免疫反应，具有该靶的细胞或生物被消灭。治疗作用依赖于循环中MAbs的浓度和它们的生物半衰期，其生物半衰期通常相当短。因此在适当的一段时间内重复给药是必需的。如果使用异种MAbs，如鼠科动物抗体，可能发生不良反应，可能导致过敏性休克。由于这个缺点，这种免疫疗法仅被采用了有限的一段时间。
主动免疫方式以不同方法激活患者的免疫系统。给予类似于具体靶的抗原后，患者的体液和T细胞特异性免疫反应诱导防御机制，与体内该靶作斗争。各种类型的和抗各种不同疾病的疫苗抗原是本领域熟知的。例如，使用含有乙型肝炎表面抗原的疫苗接种抗乙型肝炎是大家熟知的。已经表明用于接种的高剂量范围抗原以及小剂量接种可以提供充分的血清转化率(Parish D.C.et al.，1991，SouthernMedical Journal，84，426-430；Goudeau A.etal.，1984，TheLancet，10，1091-1092)。
也已知甘露聚糖-粘蛋白融合蛋白质并且可以用于产生细胞毒性T细胞。已经表明依靠给予小鼠的融合蛋白剂量，几乎可以仅诱导细胞免疫(低剂量)，仅诱导体液免疫(高剂量)(Pietersz G.A.et al.，1998，Cancer Immunol.Immunother.，45，321-326).
对于主动免疫，抗原通常存在于免疫原性制剂中以提供疫苗。模拟该靶的抗原与该靶或其片段的一级或二级序列具有相似性。然而模拟表位(mimotope)或模拟表位抗原与该靶的三级结构具有相似性。
尽管已经开发了许多用于治疗癌症的产品，但是仍非常需要提供与已知物质相比特性改善的物质。特别是，在接种疫苗方面，需要高免疫原性、易于重复和卓有成效，但是不引起严重副作用的产品。
WO 02/32404(Consejo Superior de InvestigacionesScientificas)公开了由金属或半导体原子形成的纳米颗粒，其中包含糖类的配体与纳米颗粒核心共价连接。这些纳米颗粒用于调节糖类介导的相互作用并且是可溶和无毒的。要求GB-A-0313259.4(ConsejoSuperior de Investigaciones Scientificas and Midatech Limited)的优先权的PCT申请公开了磁性纳米颗粒，其具有包含惰性和磁性金属原子的核心，该核心与配体共价连接。GB申请0411537.4(ConsejoSuperior de Investigaciones Scientificas and Midatech Limited)公开了纳米颗粒，其包括与RNA配体结合的磁性纳米颗粒，特别是siRNA配体。
发明概述
本发明宽泛涉及包含佐剂和抗原的纳米颗粒，和带有糖类配体的免疫原性结构。
在一个方面，本发明提供了可以用于治疗各种疾病的改善的免疫原性结构，特别是在癌症预防和治疗中用于接种目的。
因此，本发明提供了免疫原性结构，其由与糖类配体共价连接的核心分子和至少一个T细胞辅助肽配体组成。
在另一方面，本发明提供了免疫原性结构，其由与多个糖类配体共价连接的核心分子组成，其中糖类配体包含至少一个新表位(neoepitope)结构。
核心分子可以是抗体或其衍生物或片段。可供选择地，核心分子也可以是由金属或半导体原子核心组成的纳米颗粒，如本文进一步描述。例如，金属核心可以包括Au、Ag、Cu、Pd或Al。WO 02/32404和Crespo et al，Physical Review Letters，93(8)：87204-14，2004中详细描述了纳米颗粒及其制备。根据本发明的免疫原性结构可以是任何糖类配体。例如，在优选实施方案中，它可以与基于糖类的肿瘤相关抗原显示出结构或功能相似性，如Lewis抗原，唾液酸或非唾液酸化，或Sialyl Tn或非唾液酸化的Tn或甚至上述背景部分论述的任何肿瘤相关抗原。
单个糖类配体可能也包含新表位结构。新表位可以由细胞表面蛋白的抗原的糖基化形成。糖类结构很少作为单个分子位于肿瘤细胞上，而是主要以由多个糖类结构组成的簇存在。这些簇可以形成新表位，其中单个配体不介导抗体结合和肿瘤细胞的破坏，但是糖类簇识别的结果是有效的免疫反应。
可以通过使用多个糖类配体以致呈现高密度的大量配体来设计和模拟肿瘤细胞上存在的糖类簇。这些配体可以与核心分子紧密连接并模仿簇，即肿瘤细胞上呈现的结构。
例如，抗体可以与肿瘤细胞上异常糖基化结构结合，但是不能与表面结构上呈现的单个糖类配体结合。因此来源于这些糖蛋白的糖类配体任选与异常糖基化的其它抗原的创造性组合成为可能并可以产生新表位结构。
通过以异常糖基化靶进行免疫治疗，以这个异常糖基化为特征的几乎全部肿瘤特异性受体可被阻断。它们当中是，例如EGF-受体家族的全部受体、CD55(791Tgp72/DAF-衰变加速因子)受体、转铁蛋白受体和P-糖蛋白。
也已经发现对抗异常糖基化的免疫原性结构以功能性方式与EGF受体家族的几个受体结合，因此诱导细胞生长的信号级联可以有效地被阻断。因此分别阻止或降低了生长因子与受体的结合。这种治疗与使用抗EGF受体细胞外蛋白部分的抗体的免疫疗法相比更特异，因为正常细胞EGF受体上未找到罕有的肿瘤相关糖类结构。另一方面，这种治疗更通用，因为具有相同异常糖基化的不同受体可被同时阻断。
通过使用对抗异常糖基化的免疫疗法，也可能阻止或降低EGF或调蛋白对癌细胞的促有丝分裂刺激。抗体与肿瘤相关糖基化的癌细胞的特异性结合阻断了生长因子受体与其生理配体的相互作用并抑制经由这些受体的信号转导和因此抑制细胞发育。同时，这种抗体可以通过其体液和细胞免疫系统内的作用特异性攻击肿瘤细胞。根据本发明，分别表达EGF受体或EGF受体家族的受体的肿瘤细胞被特异性结合并可以被裂解或生长被阻断。
已经将以新表位的靶进行的免疫疗法改善，其不影响正常组织的上皮细胞，而仅影响肿瘤细胞。
这种新表位的实例是由EpCAM蛋白或Her-2/neu受体与Lewis Y糖类或适当唾液酸化的糖蛋白糖基化形成的表位。当生产和制备对这些新表位特异性的抗体时，优选它们不与去糖基化的蛋白结合，也不与结构不同的蛋白上的糖基序结合。优选建议这些抗体作为被动免疫疗法的单克隆抗体，以便避免非特异性相互作用和副作用。新表位的鉴定也可以成为接种抗原的开发基础，即只呈递具有该表位的免疫原。这个表位或表位模拟物可以从适当的肽文库或通过抗独特型抗体技术容易地产生，或可以作为天然存在抗原的衍生物，例如片段。根据选择的新表位，可以获得恰具有这个新表位或其模拟物的抗原制剂，模拟物例如抗独特型抗体、模拟表位。这种抗原制剂是用于癌症患者主动免疫的有价值的活性物质，或它们也可以用作诊断制剂。
根据本发明的免疫原性结构可以是来源于类毒素例如破伤风类毒素、白喉类毒素或匙孔血蓝蛋白的T细胞辅助肽配体。该配体可以是不同长度，例如长度5至50个氨基酸，或者5至30个氨基酸或5至20个氨基酸。
使用与免疫原性结构连接的免疫原性肽，当注射给个体时，可以增长免疫原性。例如，氨基酸序列可以是FKLQTMVKLFNRIKNNVA(SEQ IDNo.1)。
本发明还包括包含一种或多种免疫原性结构的组合物，用于制备预防或治疗癌症的药物。该治疗可以是如下进一步讨论的主动或被动免疫疗法。此外，本发明公开的免疫原性结构用于分离适于检测和分离肿瘤细胞的抗体的应用也可以实施。
对于术语抗体、其衍生物或片段，应理解为所有类型的抗体，尤其是单特异性和多特异性单克隆抗体，或还有化学、生物化学或分子生物学上制备的抗体，或具有一定特异性的多克隆抗体，例如免疫血清或免疫血清的级分。
根据发明使用的抗体优选是天然的，即具有功能活性的抗体。优选这个抗体不具有连接的标记或其他检测试剂，以便不损害它的功能。天然抗体具有患者中自然存在的抗体的性质。天然抗体是异四聚体糖蛋白，其由两个相同轻链和两个相同重链组成。
然而也可以使用抗体衍生物，优选其选自抗体片段、缀合物、同源物或衍生物，或具有另外的效应器作用的复合物。无论如何，优选抗体衍生物含有Fab片段的至少一部分，优选连同F(ab′)2片段的至少一部分和/或绞链区的一部分和/或λ或κ抗体的Fc部分。
此外，根据本发明还可以使用单链抗体衍生物，如所谓的单链抗体。根据本发明使用的抗体优选是免疫球蛋白类型，如IgG、IgE、IgM、IgA或IgD。
术语金属或半导体原子的纳米颗粒簇包括适于作为固定配体或多个配体的基底，该配体包含糖类基团。合适的纳米颗粒在例如WO02/32404和Crespo R.et al.(Physical Review Letters，2004，93，8，pp 87204-1-4)中描述，并在下面进一步讨论。在使用金簇的情况下，通常可以使用50至500个金原子提供纳米范围内的核心直径。例如，核心直径可以在50至500nm、50至250nm、50至150nm之间。
配体与颗粒核心共价连接。实施这个步骤的方案是本领域熟知的，共价结合可以例如通过巯基进行。
糖类配体也可以与抗体连接在一起。为了得到具有多个结合的配体的抗体，可以使用含有高密度活性基团的分支接头。这些接头可以结合多个糖类配体，该配体然后可以作为簇结构定位于抗体上。
根据本发明的免疫原性结构可以用于制备预防和治疗疾病象癌症的药物。这个药物制剂可以用于免疫疗法。
在另一方面，本发明涉及纳米颗粒，其具有包括金属和/或半导体原子的核心，该核心与抗原配体连接。该配体典型地是糖类或肽抗原。该纳米颗粒可用于递送抗原并应用于各种应用，特别是作为疫苗用在治疗应用中。在优选实施方案中，纳米颗粒还可以与佐剂连接，例如刺激先天免疫系统的T辅助刺激肽或糖类。
这个递送系统有几个优于现有方法的优点。该纳米颗粒本身可以通过阻止抗原的破坏或清除以及通过提供颗粒形式的抗原来提高对抗原的免疫反应。
在使用另外佐剂的情况下，本发明允许使用单一递送载体以递送抗原和佐剂二者，或多种抗原或佐剂。
该纳米颗粒尺寸小，小至足以被细胞吸收并允许抗原被呈递到细胞表面上。在T辅助肽也与纳米颗粒缀合的情况下，T辅助肽也可能被呈递。
因此，在另一方面，本发明提供了纳米颗粒，其包含包括金属和/或半导体原子的核心，其中核心与多个配体共价连接，配体包括抗原配体。在优选实施方案中，配体还包括佐剂。
该抗原可以是例如肽或糖类。在优选实施方案中，抗原是肿瘤特异性抗原。优选的糖类肿瘤抗原包括Sialyl Tn(STn)、SialylLewisa(Lea)、Sialyl Lewisx(Lex)或Sialyl Lewisy(Ley)及其非唾液酸化形式。在另一个优选实施方案中，该抗原是病原体特异性抗原，如细菌、病毒或寄生虫抗原。例如，可以使用HIV抗原Man alpha1-2Man或寄生虫抗原Gal alpha 1-3 Gal。
佐剂可以刺激先天免疫反应的细胞和/或适应性免疫反应的细胞，如T细胞，尤其是T辅助细胞。该佐剂可以是糖类部分或肽部分。优选的糖类部分包括葡萄糖、甘露糖、岩藻糖和/或N-乙酰葡糖胺。优选的肽部分包括活化T辅助细胞的肽，如来自细菌毒素的免疫原性肽。特别优选的肽部分包含氨基酸序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA(SEQ IDNo.1)。
优选，本发明的纳米颗粒是水溶性的。在优选实施方案中，本发明的纳米颗粒具有平均直径在0.5至10nm的核心，更优选1至2.5nm。优选，包括它们的配体的纳米颗粒具有10至30nm的平均直径。
除抗原和佐剂之外，纳米颗粒可以包括一种或更多类型的配体。例如，另外的配体或配体基团或结构域可以包括一个或多个肽、蛋白结构域、核酸分子、脂类基团、糖类基团、任何有机或阴离子或阳离子基团。糖类基团可以是多糖、寡糖或单糖基团。优选的配体包括糖缀合物，因此形成糖纳米颗粒。在存在核酸分子的情况下，核酸分子可以包括单或双链DNA或RNA。在特别优选的实施方案中，该纳米颗粒包括膜转位信号，辅助它们渗透通过细胞膜。
该颗粒可以具有固定于其上的一个以上种类的配体，例如2、3、4、5、10、20或100种不同的配体。可供选择地或另外地，多个不同类型的纳米颗粒可以一起使用。在优选实施方案中，与颗粒的单个金属核心相连的总配体的平均数量是至少一个配体，更优选50个配体，和最优选60个配体。
该纳米颗粒还可以包含标记，如荧光基团、放射性核素、磁性标记、染料、NMR活性原子或使用表面等离子体共振能够检测的原子。优选的磁性标记包括顺磁基团，包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或镧系元素+3。优选的NMR活性原子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或镧系元素+3。
纳米颗粒的核心可以是金属核心。优选，该金属核心包括Au、Ag或Cu，例如选自Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd的合金。
在一些实施方案中，纳米颗粒的核心是磁性的。优选的磁性纳米颗粒核心可以包括惰性(passive)金属原子和磁性金属原子，其在核心中的比率是大约5∶0.1至大约2∶5。该惰性金属可以是例如金、铂、银或铜，和磁性金属是铁或钴。
在另一个方面，本发明提供了包括如本文所述的一种或多种纳米颗粒的群体的组合物。在一些实施方案中，纳米颗粒的群体可以具有与核心连接的不同密度的相同或不同配体。有些情况下，可能需要包封纳米颗粒，使多个纳米颗粒能够递送至目标部位。合适的包封技术是本领域技术人员熟知的。纳米颗粒的包封群体可以是一个、两个、三个或许多不同类型。在优选实施方案中，该组合物包括纳米颗粒和药物可接受载体。
在更多方面，本发明提供了制备如本文所述的纳米颗粒的方法。方便地，该方法包括将配体与纳米颗粒核心缀合，通过将配体衍生接头和将衍生的配体包括在合成纳米颗粒核心的反应混合物中。在自我装配纳米颗粒过程中，纳米颗粒核心通过接头与配体连接。该接头可以包括巯基、烷基、二醇基或肽基团。示例的接头基团由通式HO-(CH2)n-S-S-(CH2)m-OH表示，其中n和m独立地是1至5。当合成了纳米颗粒时，分裂-S-S-接头以形成两个含硫的接头，其每一个允许通过-S-基与纳米颗粒核心共价连接。在优选实施方案中，接头基团包括C2、C 3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C15烷基和/或C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13或C15二醇基。该接头可以是混合接头，例如六甘醇-C11烷基。
不同的接头可以控制肽是被释放还是保持与纳米颗粒连接。例如，在本文描述的BMIX和BCll肽的情况下，该肽的前两个残基是FK，其是组织蛋白酶的切割位点。如果这距离纳米颗粒足够远(使用间隔物)，可以释放T辅助肽LQTMVKLFNRIKNNVA(SEQ ID NO：2)用于细胞内加工。
在一个实施方案中，可以使用WO 02/32404中首先描述的方案合成具有包括金原子的核心的纳米颗粒，其中使用二硫化物接头将配体衍生，所衍生配体与HAuCl4(四氯金酸)在还原剂存在下反应来制备纳米颗粒。在这个方法中，处于甲醇或水中的二硫化物保护的配体可以添加到四氯金酸水溶液中。优选的还原剂是硼氢化钠。该方法的这个及其他特征在WO 02/32404中描述。
在另一个方面，本发明还提供了本文描述的纳米颗粒用于预防或治标治疗。尤其是，该纳米颗粒可以用作疫苗。
在一个方面，本发明提供了上面限定的纳米颗粒用于制备治疗由给予该纳米颗粒所改善的病症的药物的用途。例如，本文描述的纳米颗粒或它们的衍生物可以配制为药物组合物，并以各种形式给予患者，尤其是治疗由给予抗原所改善的病症。
在一个实施方案中，本发明提供了本发明的纳米颗粒在制备治疗癌症的药物中的用途。癌症可以是例如结肠、胰腺、肠、肺、衬里、卵巢或膀胱癌。
还提供了本发明的纳米颗粒在制备治疗传染病的药物中的用途。引起该疾病的病原体可以是病毒、细菌或寄生虫。
以下描述了根据本发明可以治疗的具体用途的实例，以及纳米颗粒在体外和体内的其他应用。
现在将参考附图举例描述本发明的实施方案，该实施方案是非限制性的。
附图简述
图1显示了配体Glc(A)、Stn(B)和Ley(C)。
图2显示了T辅助肽配体BC11的结构。
图3显示了T辅助肽配体BMIX的结构。
图4A显示了对于BC11 I纳米颗粒的起始混合物(上面)和所产生纳米颗粒(下面)的NMR谱。
图4B显示了对于BC11 II纳米颗粒的起始混合物(上面)和所产生纳米颗粒(下面)的NMR谱。
图5A显示了对于BC11 I纳米颗粒的透射式电子显微镜照片(左)和粒径分布直方图(右)。
图5B显示了对于BC11 II纳米颗粒的透射式电子显微镜照片(左)和粒径分布直方图(右)。
图6显示了推定的BC11 I纳米颗粒的略图。
图7显示了来自接种BC11 I(圆形和正方形)或BC11 II(三角形)的小鼠的抗HSA-Ley的IgG的血清滴定度。来自未接种小鼠的对照血清显示为单个的实心正方形。箭头表示接种时间。
图8显示了来自接种BC11 III(三角形)或BC11 IV(正方形和圆形)的小鼠的抗HSA-Ley的IgG的血清滴定度。来自未接种小鼠的对照血清显示为空心正方形。箭头表示接种时间。
图9显示来自接种BC11 II伴破伤风毒素致敏的小鼠的抗HSA-Ley的IgG的血清滴定度。箭头表示接种时间。
发明详述
纳米颗粒
纳米颗粒是小颗粒，例如金属或半导体原子的簇，可以用作固定配体的基底。
本发明的纳米颗粒可溶于大多数有机溶剂，尤其是水。这可以用在它们的提纯中并且重要地意味着它们可以在溶液中使用以呈递固定于颗粒表面的配体。纳米颗粒可溶的事实具有呈递自然构象配体的优点。对于治疗应用，该纳米颗粒无毒、可溶和在生理条件下是稳定的。
优选，纳米颗粒具有平均直径0.5至50nm的核心，更优选0.5至10nm，更优选0.5至5nm，更优选0.5至3nm和还更优选0.5至2.5nm。除核心之外，当还考虑配体时，优选颗粒的总平均直径是5.0至100nm，更优选5至50nm和最优选10至30nm。可以使用本领域熟知技术测量平均直径，如透射电子显微术。
核心材料可以是金属或半导体和可以由一个以上类型的原子组成。优选，核心材料是选自Au、Fe或Cu的金属。纳米颗粒核心还可以由合金形成，包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd，并可以用于本发明。优选的核心材料是Au和Fe，最优选的材料是Au。纳米颗粒核心优选包括大约100至500个原子(例如金原子)以提供纳米范围的核心直径。其他特别有用的核心材料与具有NMR活性的一种或多种原子掺杂，这允许使用NMR在体外和体内检测纳米颗粒。NMR活性原子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或镧系元素+3或本申请其它地方描述的量子点。
包括半导体原子的纳米颗粒核心可以被检测，因为纳米尺度的半导体晶体能够担当量子点，也就是说它们可以吸收光，由此将材料中的电子激发到更高能量水平，随后以材料的特征频率释放光子。半导体核心材料的实例是硒化镉、硫化镉、碲化镉。还包括锌化合物如硫化锌。
在一些实施方案中，纳米颗粒的核心可以是磁性的并包括磁性金属原子，任选与惰性金属原子组合。例如惰性金属可以是金、铂、银或铜，和磁性金属可以是铁或钆。在优选实施方案中，惰性金属是金，磁性金属是铁。在这种情况下，方便地，核心中惰性金属原子与磁性金属原子的比例是大约5∶0.1至大约2∶5。更优选，该比例是大约5∶0.1至大约5∶1。如本文使用的，术语“惰性金属”是指不显示磁性并且化学性质上对氧化稳定的金属。惰性金属可以是抗磁性的或超顺磁性的。优选，这种纳米颗粒是超顺磁性的。
具有包括顺磁性金属的核心的纳米颗粒的实例为包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或镧系元素+3的那些。
其他磁性纳米颗粒可以是由材料如MnFe(尖晶石砖)或CoFe(钴铁氧体)组成，可以形成纳米颗粒(磁性流体，添加或不添加如上限定的另外的核心材料)。Biotechnol.Prog.，19：1095-100(2003)，J.Am.Chem.Soc.125：9828-33(2003)，J.Colloid Interface Sci.255：293-8(2002)中给出了用于制备这种纳米颗粒的自我装配连接化学的实例。
在一些实施方案中，本发明的纳米颗粒或其配体包括可检测标记。该标记可以是纳米颗粒核心的元素或配体。该标记可以是可检测的，因为纳米颗粒的那个元素的固有特性，或与可检测的其它部分连接、缀合或联合。标记的优选实例包括荧光基团、放射性核素、磁性标记或染料。荧光基团包括荧光素、罗丹明或四甲基罗丹明、Texas-Red、Cy3、Cy5等等，并可以通过荧光标记的激发和使用拉曼散射光谱的发射光检测来检测(Y.C.Cao，R.Jin，C.A.Mirkin，Science 2002，297：1536-1539)。
在一些实施方案中，该纳米颗粒包含用于检测纳米颗粒的放射性核素，其使用放射性核素放射的放射性，例如通过使用PET、SPECT，或用于治疗，即杀死靶细胞。本领域通常使用的可以轻易被改变而在本发明中使用的放射性核素的实例包括99mTc，其以各种氧化状态存在，尽管最稳定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；67Cu，其常常用作Cu2+盐；67Ga，其通常使用Ga3+盐，例如 枸橼酸镓；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；111In，其通常用作In3+盐；125I或131I，其通常用作碘化钠；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；通常用作Tl+盐如氯化铊的201Tl；39Y3+；71Lu3+和24Cr2+。放射性核素作为标记和示踪剂的普遍用途是本领域熟知的并可以由本领域技术人员轻易地改变而用于本发明的方面。可以极其容易地使用放射性核素，通过掺入纳米颗粒核心或将它们包括作为以固定在纳米颗粒上的配体部分存在的标记。
另外或可供选择地，本发明的纳米颗粒，或它们与其他种类相互作用的结果，可以用本领域熟知的很多技术使用如上指出的与纳米颗粒结合的标记或通过利用它们的性质而被检测到。这些检测纳米颗粒的方法可以从检测当纳米颗粒与另一个种类结合时产生的聚集体，例如通过简单肉眼观察或通过使用光散射(含有纳米颗粒的溶液的透射)，到使用复杂的技术如透射电子显微术(TEM)或原子力显微术(AFM)以显象纳米颗粒。检测金属颗粒的其它方法是使用等离子体共振，它是金属表面电子激发的，通常由光辐射所引起。表面等离子体共振(SPR)现象存在于金属(如Ag或Au)和介电材料如空气或水的分界面。当分析物与固定于纳米颗粒表面的配体结合改变了分界面的折射率，SPR就发生改变。SPR的更多优点是它可用于监测实时相互作用。如上所述，如果纳米颗粒包括或与具有NMR活性的原子掺杂，那么这个技术可用于在体外或体内检测该颗粒，使用本领域熟知的技术。使用基于使用纳米颗粒促进银还原(I)的定量信号放大的系统可以检测纳米颗粒。如果纳米颗粒包括配体作为荧光探针，可以使用荧光光谱。并且，糖类的同位素标记可用于促进它们的探测。
该配体可以包括允许随意控制最终的构建体中抗原和载体密度的惰性糖类成分(例如葡萄糖)。
抗原
抗原是一种分子，它被适应性免疫系统的细胞，即T细胞或B细胞或二者同时特异性识别。抗原包括蛋白、糖类、核酸乃至小分子如毒素。在本发明的优选实施方案中，抗原是肿瘤特异性抗原，尤其是肽或糖类肿瘤特异性抗原。在其他优选实施方案中，抗原是病原体上发现的抗原，如病毒、细菌或寄生虫。
糖类肿瘤特异性抗原的实例包括由肿瘤细胞表面上糖蛋白和糖脂的糖链携带的唾液酸化和非唾液酸化的Lewis结构。这些抗原常常在肿瘤中过表达并且好象参与肿瘤细胞与内皮的粘附。例如，SialylLewisa负责粘附人结肠、胰腺和胃癌细胞，而Sialyl Lewisx负责肺、肝和卵巢癌细胞的结合。Sialyl Lea在结肠直肠、肝和胃癌中过表达(对于综述，参见Ugorski and Laskowska(2002)，Acta BiochimicanPolonica，49，303-311)。
佐剂
佐剂是提高对抗原的免疫反应的试剂。佐剂可以通过刺激适应性免疫反应的细胞来提高抗体反应，和/或可以通过非特异性增加先天免疫系统活性而作用。通常，提高抗体反应的抗原通过在抗原更多暴露于淋巴细胞的适当部位浓缩抗原或通过刺激细胞因子的产生来做到这点。当用作疫苗递送平台时，纳米颗粒自己可以充当佐剂，通过提供颗粒形式的抗原，使得它们更容易被抗原呈递细胞摄取，如巨噬细胞。然而，使用与纳米颗粒缀合的提高免疫系统其他方面的其他试剂，这个作用可以大大增强。
增加先天免疫系统活性的佐剂包括糖类部分，如木糖、岩藻糖、甘露糖和N-乙酰基氨基葡萄糖。这些以几个方式起作用。它们可以结合在血液和淋巴中循环的分泌分子，其触发补体成分分裂导致补体固定。它们也可以结合吞噬细胞上的表面受体，象巨噬细胞，如CD2-6(MMR)，其刺激吞噬作用和细胞内吞。
这种佐剂也可以在刺激适应性免疫反应中起作用。
它们可以结合启动导致效应分子(细胞因子)释放的信号的细胞表面受体。例如，糖类与树突细胞表面上To11样受体的结合引起它们分泌细胞因子，包括白介素6(IL-6)，其妨碍调节性T细胞抑制效应T细胞对抗原的应答的能力。
B细胞也具有To11样受体。当结合受体时，它提高B细胞对抗原的反应。
其他佐剂直接刺激适应性免疫反应的细胞。例如，可以使用刺激辅助T细胞(HTL)反应的肽，以增强对抗原肽的CTL反应。这种肽可以是例如来自破伤风类毒素的高免疫原性抗原，其产生非特异性HTL反应。活化的HTL增强CTL的增殖、存活和效应功能。
这种肽在提高对糖类抗原的免疫反应中特别有用。尽管糖类抗原可以被糖类特异性B细胞结合和内化，但是它们不能活化仅由肽活化的HTL。然而本发明的纳米颗粒可以激起B细胞和HTL反应，因为它们与糖类抗原和HTL活化肽都结合。这提供了大大提高的免疫反应。
给药和治疗
本发明的纳米颗粒组合物可以通过很多不同的途径给予患者，包括肠或肠胃外途径。肠胃外给药包括通过下列途径给药：静脉内、皮肤或皮下、鼻、肌内、眼内、透上皮、腹膜内和局部(包括真皮、眼睛、直肠、鼻内、吸入和气雾)和直肠全身途径。
例如通过注射或使用递送枪弹道式实施给药，递送枪加速它们经由表皮外层的透皮途径。然后纳米颗粒可以被例如树突细胞吸收，树突细胞通过淋巴系统迁移而成熟，引起调节免疫反应和抗该抗原的接种。纳米颗粒还可以以气雾剂递送。小型纳米颗粒可能这样做。
本发明的特别小型纳米颗粒是递送至细胞和组织的巨大优点，因为它们可以被细胞吸收，即使当其与寻靶或治疗分子连接时。
本发明的纳米颗粒可以被配制为药物组合物，可以是固体或液体组合物形式。这种组合物通常将包含一些类型的载体，例如固体载体如明胶或佐剂或惰性稀释剂，或液体载体如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐溶液，或二元醇如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。这种组合物和制剂通常含有至少0.1wt％的该化合物。
对于静脉内、皮肤或皮下注射，或在病变部位注射，活性成分将是肠胃外可接受水溶液形式，该溶液是无热原的并且具有适当的pH、等渗性和稳定性。相关领域的技术人员肯定能够制备合适的溶液，使用例如该化合物或其衍生物的溶液，例如在生理盐水中、用甘油、液体聚乙二醇或油类制备的分散液。除一种或多种化合物之外，任选与其他活性成分组合，该组合物可以包含一种或多种药物可接受赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂、等渗剂、防腐剂或抗氧化剂或本领域技术人员熟知的其他物质。这种物质应该无毒并且不会妨碍活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质可以依赖于给药途径，例如口服或肠胃外。
液体药物组合物典型地配制为具有大约3.0至9.0的pH，更优选大约4.5至8.5，和还更优选大约5.0至8.0。组合物的pH可以使用缓冲液来维持，如醋酸盐、枸橼酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、Tris或组氨酸，缓冲液典型地以大约1mM至50mM的范围使用。或者组合物的pH可以通过使用生理可接受酸或碱来调节。
药物组合物中通常包括防腐剂以妨碍微生物生长，延长组合物的储藏期限和允许多用途包装。防腐剂的实例包括石炭酸、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸和它的酯、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯、苯扎氯铵和苄索氯铵。典型地防腐剂以大约0.1至1.0％(w/v)的范围使用。
优选，药物组合物以预防有效量或治疗有效量(视情况而定，尽管预防可能被认为是治疗)给予个体，这足以显示有利于个体。典型地，这将产生提供有益于个体的治疗有效的活性。给予化合物的实际量，和给药速度和时间过程，将依赖于所治疗病症的性质和严重性。治疗的要求，如确定剂量等是普通医生和其他医生职责范围内的事情，典型地考虑待治疗的紊乱、患者的情况、递送部位、给药方法和专业人员已知的其他因素。Handbook of Pharmaceutical Additives，2ndEdition(eds.M.Ash and I.Ash)，2001(Synapse InformationResources，Inc.，Endicott，New York，USA)；Remington′sPharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins；and Handbook of Pharmaceutical Excipients，2nd edition，1994中可以找到上述技术和方案的实例。例如，优选组合物以每公斤体重大约0.01至100mg活性化合物，和更优选大约0.5至10mg/kg体重的剂量给予患者。
很清楚涉及肿瘤治疗的情况下，治疗包括由医师实施来减轻肿瘤对患者作用的任何手段。因此，尽管肿瘤的完全缓解是期望目标，但是有效的治疗还包括能够达到肿瘤部分缓解以及减慢肿瘤生长速度包括转移的任何手段。这种手段可以有效延长和/或提高生活质量和减轻疾病症状。
免疫疗法
本发明的组合物，如免疫原性结构，可以用于预防和治疗疾病，象癌症，和更特别地用于免疫疗法。
在本发明中，术语“接种”意思是主动免疫，就是由于给予少量抗原诱导特异性免疫应答，例如经由皮下、真皮内、肌内、口服或鼻内途径，该抗原被接种的个体识别为外来的并因此在合适的制剂中具有免疫原性。因此为了建立抗该抗原的特异性免疫应答，该抗原被用作免疫系统的“触发子”。
根据本发明，接种可以是治疗或预防性的，如同所有抗微生物疫苗一样。例如，通过给没有罹患癌症的个体接种，也许可能达到抗癌症爆发的预防性保护。可能施加这种预防接种的个体的实例是发展为癌症的风险增加的个体，尽管这个应用不限于这种个体。处于癌症风险的患者可能已经具有发展的肿瘤(原发肿瘤或转移)，或显示出癌症易感性。
对于根据本发明的癌症患者的主动免疫，免疫原性结构典型地被配制为疫苗。优选，这种药物制剂含有药物可接受载体，所述载体例如可以进一步包括辅助物质、缓冲剂、盐和/或防腐剂。药物制剂可以例如用于预防和治疗癌症患者中的癌症相关病症，如转移形成。这样做时，抗原呈递细胞在体内或离体特异性调节以使产生抗TAA的免疫反应。
对于用特异性抗原或抗原组合的主动免疫，通常使用疫苗制剂，其含有免疫原-它是天然TAA或它的表位，模拟物或新表位模拟物，或免疫原性抗体-主要以低浓度，例如从0.01μg至10mg范围的免疫原性量，然而剂量范围可以增至100至500mg的范围。根据接种抗原的免疫原性，该免疫原性例如通过外来种类的序列或通过衍生作用确定，或还分别根据使用的辅助物质或佐剂，可以选择例如0.01μg至1mg范围内，优选100μg至500μg的合适免疫原性剂量。然而，将在延长期限递送给生物的储库疫苗还可以含有高得多的量的接种抗原，例如至少1mg至100mg以上。
浓度将取决于给予的液体或悬浮疫苗的量。疫苗通常以即用型注射器或安瓿形式提供，具有0.01至1ml范围的体积，优选0.1至0.75ml。本发明试剂盒成分的接种抗原优选存在于适于皮下、肌内以及真皮内或透皮给药的药物可接受载体中。也可由粘液途径给药，例如通过鼻内或经口接种。如果使用固态物质作为疫苗制剂的助剂，例如将分别给予含助剂的疫苗抗原的吸附物或悬浮混合物。在特殊实施方案中，疫苗以溶液或水溶剂中的液体疫苗存在。
优选，肿瘤疫苗的接种单位已经在即用型注射器或安瓿中提供。疫苗的稳定制剂可以以即用型形式有利地出售。尽管不必要求防腐剂，如硫柳汞或可容忍性改善的其他防腐剂的含量，但是它可以以使制剂在制冷温度至室温的储存温度下稳定性更久的形式提供。然而根据本发明的疫苗还可以以冰冻或冻干形式提供和可以在需要时分别融解或重构。
已经证明通过使用佐剂适于增加根据本发明使用的抗体的免疫原性。为了这个目的，使用固体物质或液体疫苗佐剂，例如氢氧化铝(Alu-Gel)或磷酸铝、生长因子、淋巴因子、细胞因子如IL-2、IL-12、GM-CSF、γ干扰素、或补体因子如C3d、其它的脂质体制剂、或具有另外抗原的制剂，免疫系统已经对该抗原产生了强烈的免疫反应，如破伤风类毒素、细菌毒素，如假单胞菌外毒素和脂质A和脂多糖的衍生物。
在类毒素肽与核心结构共价连接的情况下，佐剂的需要可以降低或取消。
实施例
实施例1
负载糖类抗原、T辅助载体和连接于金表面的葡萄糖的纳米颗粒的制备和表征描述如下。
使用配体Glc、STn和Ley(图1)。选择C2脂肪族间隔物将葡萄糖残基与金表面连接，而C5脂肪族接头用于两个抗原的连接。
通过氨基末端基团将来自破伤风类毒素的混杂T细胞肽表位(FKLQTMVKLFNRIKNNVA)与C11脂肪族间隔物连接而制备T辅助肽配体BC11(图2)。通过氨基末端基团将相同破伤风类毒素T细胞肽表位与由六甘醇和C11脂肪族间隔物组成的混合接头连接而制备T辅助肽配体BMIX(图3)。
对于糖纳米颗粒的制备，Glc、STn、Ley和BC11或BMIX以期望比例溶于氘化甲醇中并在500MHz记录这些溶液的1H NMR谱。这些混合物的谱允许清楚地鉴定属于单独成分的信号和证实这些信号的强度相当于根据原始溶液中不同配体的比例所预期的强度(图4)。用甲醇稀释后，如下所述处理该混合物以得到相应的糖纳米颗粒，通过离心过滤重复纯化该颗粒。这些构建体在氘化重水中的1H NMR谱(图4)表明在所用以前建立的实验条件下获得的GNPs中维持了原始配体比例。上清液的1H NMR谱也证实所述的配体比例。
按照上述程序，制备下列糖纳米颗粒：BC11 I(Glc∶STn∶BC1128∶1∶1)、BC11 II(Glc∶STn∶BC11 20∶9∶1)、BC11 III(Glc∶STn∶Ley∶BC11 18∶10∶1∶1)、BC11 IV(Glc∶STn∶Ley∶BC1118∶1∶10∶1)、BMIX I(Glc∶STn∶BMIX 28∶1∶1)、BMIX II(Glc∶STn∶BMIX20∶9∶1)、BMIX III(Glc∶STn∶Ley∶BMIX 18∶10∶1∶1)、BMIX IV(Glc∶STn∶Ley∶BMIX 18∶1∶10∶1)BMIX V(Glc∶Ley∶BMIX 28∶1∶1)和BMIXVI(Glc∶Ley∶BMIX 20∶9∶1)。
使用透射电子显微术(TEM)测定这些构建体的平均直径，对于BC11 I、BC11 II、BC11 III和BC11IV分别是2.25nm、1.45nm、2.05nm和1.81nm，和对于BMIX I、BMIX II、BMIX III、BMIX IV、BMIX V和BMIX VI分别是1.80nm、1.55nm、2.19nm、1.77nm、1.64nm和1.79nm。从这些平均直径，估计簇中金原子的数量，与金连接的链和GNPs的近似分子量。[3]以下给出了这些值。
已经制备和表征了几个另外的糖纳米颗粒(1-4)(数据未显示)。这些构建体的组分如下：1(STn，100％)、2(Ley100％)、3(Glc∶STn∶HS(CH2)10COOH接头20∶1∶1)、4(Glc∶STn∶HS(CH2)11O(CH2CH2O)6CH2COOH接头28∶1∶1)。
实验部分
HAuCl4和NaBH4购自Aldrich Chemical Company。对于所有实验和溶液，使用纳米纯净水(Nanopure water)(18.1mΩ)。
肽BC11-Au-抗原糖类纳米颗粒的制备
a)BC11 I(Glc∶STn∶BC11 28∶1∶1).
肽BC11(3.1mg，1.31μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(8.8mg，36.7μmol)和STn(0.8mg，1.31μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn和BC11的信号之间比例为28∶1∶1。
用MeOH(2.8mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(286μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(157μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[4]。将黑色固体溶于水(700μL)并用离心过滤(AMICON MW10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供1.2mg BC11 I纳米颗粒。TEM：平均直径2.25nm、309个金原子、92条链、MW＝90586。
b)BC11 II(Glc∶STn∶BC11 20∶9∶1).
肽BC11(4.0mg，1.7μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(8.1mg，33.9μmol)和STn(9.3mg，15.2μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn和BC11的信号之间比例为20∶9∶1。
用MeOH(3.7mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(368μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(202μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[4]。将黑色固体溶于水(500μL)并用离心过滤(AMICON MW10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供1.8mg BC11 II纳米颗粒。TEM：平均直径1.45nm、116个金原子、53条链、MW＝45358。
c)BC11 III(Glc∶STn∶Ley∶BC11 18∶10∶1∶1).
肽BC11(2.8mg，1.2μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(5.1mg，21.3μmol)、Ley(0.9mg，1.2μmol)和STn(7.3mg，11.8μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn、Ley和BC11的信号之间比例为18∶10∶1∶1。
用MeOH(2.4mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(256μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(142μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[4]。将黑色固体溶于水(500μL)并用离心过滤(AMICON MW10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供0.5mg BC11 III纳米颗粒。TEM：平均直径2.05nm、225个金原子、71条链、MW＝76661。
d)BC11 IV(Glc∶STn∶Ley∶BC11 18∶1∶10∶1).
肽BC11(2.7mg，1.1μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(4.9mg，20.6μmol)、Ley(8.8mg，11.4μmol)和STn(0.7mg，1.1μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示G1c、STn、Ley和BC11的信号之间比例为18∶1∶10∶1。
用MeOH(2.3mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(248μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(137μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[4]。将黑色固体溶于水(500μL)并用离心过滤(AMICON MW10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供1.2mg BC11 IV纳米颗粒。TEM：平均直径1.81nm、201个金原子、71条链、MW＝75409。
肽BMIX-Au-抗原糖类纳米颗粒的制备
a)BMIX I(Glc∶STn∶BMIX 28∶1∶1).
肽BMIX(3.5mg，1.31μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(8.8mg，36.6μmol)和STn(0.8mg，1.31μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn和BMIX的信号之间比例为28∶1∶1。
用MeOH(2.7mL，总体积3.2mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(314μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(157μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[2]。将黑色固体溶于水(700μL)并用离心过滤(AMICON MW 10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供1.0mg BMIX I纳米颗粒。TEM：平均直径1.80nm、201个金原子、71条链、MW＝63300。
b)BMIX II(Glc∶STn∶BMIX 20∶9∶1).
肽BMIX(3.5mg，1.31μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(6.3mg，26.2μmol)和STn(7.2mg，11.7μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn和BMIX的信号之间比例为20∶9∶1。
用MeOH(2.7mL，总体积3.2mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(314μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(157μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h。在这里不可能通过倾析分离甲醇层。然后将体积减至1mL，添加水(700μL)并用离心滤器(AMICON MW 10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供2.5mg BMIX II纳米颗粒。
TEM：平均直径1.55nm、140个金原子、53条链、MW＝50567。
c)BMIX III(Glc∶STn∶Ley∶BMIX 18∶10∶1∶1).
肽BMIX(3.9mg，1.46μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(6.3mg，26.2μmol)、Ley(1.1mg，1.46μmol)和STn(9.0mg，14.6μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn、Ley和BMIX的信号之间比例为18∶10∶1∶1。
用MeOH(3.2mL，总体积3.7mL)稀释该溶液。添加HAuCl4的水溶液(350μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(193μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[2]。将黑色固体溶于水(500μL)并用离心滤器(AMICON MW 10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供2.8mg BMIXIII纳米颗粒。
TEM：平均直径2.19nm、309个金原子、92条链、MW＝103569。
d)BMIX IV(Glc∶STn∶Ley∶BMIX 18∶1∶10∶1).
肽BMIX(3.7mg，1.38μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(6.0mg，24.8μmol)、Ley(10.7mg，13.8μmol)和STn(0.85mg，1.38μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、STn、Ley和BMIX的信号之间比例为18∶1∶10∶1。
用MeOH(3.0mL，总体积3.5mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(330μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(182μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[2]。将黑色固体溶于水(500μL)并用离心滤器(AMICON MW 10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供1.8mg BMIX IV纳米颗粒。
TEM：平均直径1.77nm、201个金原子、71条链、MW＝75934。
e)BMIX V{Glc∶Ley∶BMIX 28∶1∶1).
肽BMIX(3.7mg，1.4μmol)溶于CF 3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(9.4mg，39.1μmol)和Ley(1.1mg，1.4μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、Ley和BMIX的信号之间比例为28∶1∶1。
用MeOH(3.0mL，总体积3.5mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(331μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(182μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h并通过倾析分离甲醇层[2]。将黑色固体溶于水(700μL)并用离心滤器(AMICON MW 10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMICON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供0.7mg BMIX V纳米颗粒。
TEM：平均直径1.64nm、140个金原子、53条链、MW＝45568。
f)BMIX VI(Glc∶Ley∶BMIX 20∶9∶1).
肽BMIX(3.5mg，1.31μmol)溶于CF3COOD(100μL)，在氩流下浓缩该溶液直至观察到油的形成。然后添加Glc(6.3mg，26.2μmol)hLey(9.2mg，11.8μmol)，并将混合物溶于CD3OD(500μL)中。1H-NMR谱显示Glc、Ley和BMIX的信号之间比例为20∶9∶1。
用MeOH(2.7mL，总体积3.2mL)稀释该溶液并添加三氟乙酸将pH值调至1。添加HAuCl4的水溶液(314μL，0.025M)。然后，以几份添加1N NaBH4水溶液(157μL)，伴快速摇动。形成的黑色悬液摇动另外2h。在这里不可能通过倾析分离甲醇层。然后将体积减至1mL，添加水(700μL)并用离心滤器(AMICON MW 10000，30min，14000rpm)纯化。该过程重复两次，直至纳米颗粒不含盐和起始原料。将AMI CON过滤器中的残渣溶于500μL水中并冻干以提供1.8mg BMIX VI纳米颗粒。
TEM：平均直径1.79nm、201个金原子、71条链、MW＝73864。
缀合抗原的纳米颗粒诱导免疫反应的用途
用纳米颗粒BC11 I、II、III和IV接种小鼠并监测对缀合抗原的免疫反应。30μg纳米颗粒在200μl佐剂(Sigma M-6536-MPL+TDM)中注射。在第0、28、40和157天给予2×100μl的四次注射。前三次皮下给予和最后一次注射腹膜内给予。第39、48和67天采血并测定抗HSA-Ley的IgG滴度(图7和8)。BC11 I/II和BC11 III/IV中看到结果之间有大的差异。BC11 I/II中抗Ley的滴度升高是由于使用佐剂的非特异性效应。重复免疫时，滴度没有增加而是开始降低。相反，用BC11 III/IV，滴度随加强免疫而增加，证明真实的免疫作用。
BC11 II用于破伤风类毒素致敏的接种。在第0天，给动物皮下注射来自Aventis Pasteur MSD-Diftavax的2.35IU破伤风类毒素(用0.9％盐水将2小瓶配制成共3.4ml，并给药100μl)。在第14天，含50μg纳米颗粒的2×100μl于佐剂(Sigma M-6536)中皮下注射和在第34天，含50μg纳米颗粒的2×100μl于佐剂中腹膜内注射。在第33和44天采血。图9显示了5只小鼠的结果(不同的动物用不同的符号表示)。第一个箭头表示破伤风类毒素致敏的，第二个箭头表示用纳米颗粒皮下注射和第三个箭头表示用纳米颗粒腹膜内注射。
实施例2
金纳米颗粒作为免疫原性结构
根据WO 02/32404所述技术制备金纳米颗粒的制剂。用各种密度的肽序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA制备比例为alpha-Sialyl-Tn∶Lewis y＝30∶3和3∶30的金纳米颗粒的不同构建体。剩余空间可用Glc-C2封闭。可供选择地，接头也可以是序列FKFQILYNSIMG。
Sialyl-Tn或Lewisy或两个接头组合的比例也可以使用根据WO02/32404的技术增加。例如，高达数百个糖类基团可以容易地与核心分子连接。不同配体的比例可以容易地改变。可供选择地，也可以是与核心分子共价结合一个单个Sialyl Tn或Lewis y糖类。
抗体作为免疫原性结构
SialylTn糖类与HE2的偶联
SialylTn-O(CH2)3NH(CH2)4COO-pNp与HE2偶联。为了增加SialylTn糖类配体的数量，可以使用本领域熟知的分支接头将糖类配体偶联到抗体上。通过SEC、LDS-PAGE、蛋白质印迹和不同的ELISA试验分析终产物。
实验部分
材料和方法
HE2 Panorex，10mg/ml，Lotl70901
SialylTn-O(CH2)3NH(CH2)4COO-pNp，2×5mg，Fa.LectinityDMF(N，N-二甲基甲酰胺(无水的，Merck)
偶联缓冲液：0.1M Na2HPO4+0.15M NaCl(pH＝8)
配制缓冲液：NaCl 0.86％+1mM Na2HPO4(pH＝6.0)。
步骤
1.使用Slide-A-Lyzer透析盒，将100mg HE2(V＝I0ml；浓度：10mg/ml)对着2×700ml偶联缓冲液在4℃透析20小时，直至～10ml体积，根据SEC的浓度约10mg/ml。
2.用2×100μl DMF(100μl/瓶)溶解2×5mg SialylTn-O(CH2)3NH(CH2)4COO-pNp。
3.SialylTn(在DMF中)溶液添加至～10ml(～100mg)冷冰HE2(在偶联缓冲液中)。
4.用100μl DMF(从小瓶1转移至小瓶2)漂洗SialylTn-小瓶，其也添加至反应混合物。
5.反应混合物在+4℃转动过夜(28小时)。用SEC观察反应动力学(参见5.3.1和6.3.1)。
6.使用Slide-A-Lyzer透析盒，将HE2-SialylTn(10ml，～10mg/ml)的终溶液对着2×800ml配制缓冲液在4℃透析20小时。
分析
大小排阻层析
在ZORBAX GF-250柱上于Dionex系统中，通过大小排阻层折(SEC)定量HE2-SialylTn的浓度。用凝胶过滤标准(Fa.BioRAD)测试HPLC系统。HE2用作HE2-SialylTn定量的参考标准。保留时间(与分子量增加有关)缩短与SialylTn与HE2的偶联反应的效率有关。收到的数据表明偶联效率随在23-27小时反应时间达到饱和而增加。
LDS-PAGE(十二烷基硫酸锂PAGE)
使用Bis-Tris-Gel(4-12％)″SilverXpressTM-Stain的LDS-PAGE：参见“NuPAGE Bis-Tris-Gel”说明小册子，第13页。结果在图7中示出。
| 泳道 | 样品 | 浓度 | 体积[μl] | 制备 |
| 1 | Mark 12MW标准 | - | 10 | 无 |
| 2 | HE2在偶联缓冲液中透析 | 20μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 3 | HE2在偶联缓冲液中透析 | 10μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 4 | HE2在偶联缓冲液中透析 | 50μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 5 | HE2在偶联缓冲液中透析 | 2.5μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 6 | HE2SiaTn在制备缓冲液中透析 | 20μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 7 | HE2SiaTn在制备缓冲液中透析 | 10μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 8 | HE2SiaTn在制备缓冲液中透析 | 5μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 9 | HE2SiaTn在制备缓冲液中透析 | 2.5μg/ml | 10 | 参见SOP |
| 10 | Mark 12MW标准 | - | 10 | 无 |
蛋白质印迹
使用兔x小鼠IgG2a的蛋白质印迹
步骤：
1.含Bis-Tris-Gel(4-12％)的LDS-Gel
2.蛋白质转移：参见NuPAGE Bis-Tris-Gel说明小册子第14-20页(用Immobilon转移膜PVDF 0.45μm，Fa.Millipore)
3.膜显色
材料：
缀合：兔x小鼠IgG2a-HRP，#61-0220，Fa.Zymed
染色液1：含15mg HRP-Color Reagent(Fa.BioRAD)的5ml MetOH
染色液2：含15μl 30％H2O2的25ml PBS def.1x
步骤：
用含3％脱脂奶粉的PBS室温下封闭膜1小时。
用PBS洗涤膜。
与缀合物(1∶1000稀释于PBS中)在室温下孵育1小时。
用PBS洗涤膜。
用染色液1+2显色和用水终止。
用抗SialylTn CD175s(IgG型)/大鼠x小鼠IgG1-HRP的蛋白质印迹。
步骤：
1.含Bis-Tris-Gel(4-12％)的LDS-Gel
2.蛋白质转移：参见NuPAGE Bis-Tris-Gel说明小册子第14-20页(用Immobilon转移膜PVDF 0.45μm，Fa.Millipore)
3.膜显色
材料：
第二Ab：抗SialylTn CD175s(IgG型)，90μg/ml，Fa.DAKO，Code.No.M0899，Lot.089(601).
缀合：大鼠x小鼠IgG1-HRP，Fa.Becton Dickinson，Mat.No.559626，Batch：37205。
3％脱脂奶粉，于PBS deflx中。
染色液1：含15mg HRP-Color Reagent(Fa.BioRAD)的5mlMetOH。
染色液2：含15μl 30％H2O2的25ml PBS。
步骤：
用含3％脱脂奶粉的PBS室温(RT)下封闭膜1小时。
用PBS洗涤膜
与第二Ab(浓度10μg/ml)V＝5ml，室温下孵育1小时。
用PBS洗涤膜。
与缀合物(1∶1000稀释于PBS中)室温下孵育1小时。
用PBS洗涤膜。
用染色液1+2显色和用水终止。
与SialylTn偶联后，蛋白质印迹并用兔抗小鼠IgG2a-HRP染色证实HE2抗体重链分子量的增加。
为了显示(HE2的)抗独特型结合活性的多少保留在偶联产品中，
实施标准ELISA
固定的IGN111俘获抗独特型HE2，由抗小鼠IgG2a-HRP检测。表明HE2比HE2-SialylTn的反应性高2-3倍，这表明偶联后仅发生结合的中度损失。
实施其它标准ELISA，通过小鼠抗SialylTn-抗体检测SialylTn。其中起始原料HE2和偶联产品HE2-SialylTn被固定。对于检测，抗SialylTn(小鼠IgG)/大鼠抗小鼠IgG1-HRP用于SialylTn的检测。
结果表明HE2-SialylTn反应产物的确携带SialylTn，与偶联之前HE2相反。
结论
SialylTn已经成功与HE2抗体偶联在一起。偶联反应动力学时间延长，大约24小时后达到饱和。SialylTn已经主要与HE2抗体重链偶联在一起，而轻链仅部分与SialylTn偶联。HE2-SialylTn偶联产品保留了大多数HE2的独特型特异性，这个新糖蛋白的SialylTn部分由SialylTn特异性抗体所识别。内毒素水平低于检测极限。
参考文献
本文提及的参考文献全部以其整体明确地引入作为参考。
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[4]This methanolic layer was concentrated under reducedpressure.The 1H-NMR spectrum of the residue showed the sameinitial ratio，approximately，between Glc，STn，Ley and BC11signals.
Claims (69)
1.纳米颗粒，其包含包括金属和/或半导体原子的核心，其中该核心与多个配体共价连接，该配体包含至少一种抗原和至少一种佐剂。
2.权利要求1的纳米颗粒，其中至少一种佐剂刺激先天免疫反应。
3.权利要求1或权利要求2的纳米颗粒，其中至少一种佐剂刺激T细胞反应。
4.权利要求3的纳米颗粒，其中T细胞反应包括T辅助细胞反应。
5.权利要求1或权利要求2的纳米颗粒，包含是糖类部分的佐剂。
6.权利要求5的纳米颗粒，其中糖类部分包括葡萄糖、甘露糖、岩藻糖和/或N-乙酰葡糖胺。
7.上述任一项权利要求的纳米颗粒，包含是肽部分的佐剂。
8.权利要求3或权利要求4的纳米颗粒，其中该肽部分是活化T辅助细胞的肽。
9.权利要求7或权利要求8的纳米颗粒，其中该肽部分包含蛋白酶切割位点。
10.权利要求9的纳米颗粒，其中该肽包含氨基酸序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA。
11.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中抗原是肿瘤特异性抗原。
12.权利要求11的纳米颗粒，其中抗原是糖类抗原。
13.权利要求12的纳米颗粒，其中抗原是唾液酸化的。
14.权利要求12的纳米颗粒，其中抗原是唾液酸化的。
15.权利要求14的纳米颗粒，其中抗原是sialyl Tn、sialylLewisa、sialyl Lewisx或sialyl Lewisy。
16.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中抗原是病原体特异性抗原。
17.权利要求16的纳米颗粒，其中病原体是细菌、病毒或寄生虫。
18.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中至少一种配体通过接头基团与纳米颗粒连接。
19.权利要求18的纳米颗粒，其中接头基团包括巯基、烷基、二元醇基团或肽基团。
20.权利要求19的纳米颗粒，其中接头基团包括C2-C15烷基和/或C2-C15二元醇。
21.权利要求20的纳米颗粒，其中接头基团是C2-C15烷基或六甘醇-C11烷基。
22.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒包含标记。
23.权利要求22的纳米颗粒，其中标记是荧光基团、放射性核素、磁性标记、染料、NMR活性原子或使用表面等离子体共振能够检测的原子。
24.权利要求23的纳米颗粒，其中磁性标记是顺磁基团，包括Mn+2、Gd+2、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+2或镧系元素+3。
25.权利要求23的纳米颗粒，其中NMR活性原子是Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3或镧系元素+3。
26.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒是水溶性的。
27.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒的核心具有0.5至10nm的平均直径。
28.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中纳米颗粒的核心具有1至2.5nm的平均直径。
29.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中包含其配体的纳米颗粒具有10至30nm的平均直径。
30.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中核心是金属核心。
31.权利要求30的纳米颗粒，其中金属核心包含Au、Ag或Cu。
32.权利要求30或权利要求3 1的纳米颗粒，其中金属核心是选自Au/Ag、Au/Cu、Au/Ag/Cu、Au/Pt、Au/Pd、Au/Ag/Cu/Pd、Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd或Au/Fe/Cu/Gd的合金。
33.权利要求30至32任一项的纳米颗粒，其中纳米颗粒的核心是磁性的。
34.权利要求33的纳米颗粒，其中纳米颗粒在核心中包含惰性金属原子和磁性金属原子，其比率是大约5∶0.1至大约2∶5。
35.权利要求34的纳米颗粒，其中惰性金属是金、铂、银或铜，磁性金属是铁或钴。
36.权利要求1至29任一项的纳米颗粒，其中核心包含半导体原子。
37.权利要求36的纳米颗粒，其中半导体原子能够充当量子点。
38.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体还包含肽、蛋白结构域、核酸片段、糖脂或糖蛋白。
39.前述任一项权利要求的纳米颗粒，其中配体包含DNA或RNA。
40.组合物，包含一种或多种前述任一项权利要求的纳米颗粒的群体。
41.根据权利要求40的组合物，进一步包含药物可接受载体。
42.免疫原性结构，由与糖类配体和至少一种T细胞辅助肽配体共价连接的核心分子组成。
43.免疫原性结构，由与多个糖类配体共价连接的核心分子组成，其中糖类配体包含至少一种新表位结构。
44.根据权利要求42或权利要求43的免疫原性结构，其中核心分子选自由金属或半导体原子核心和抗体或其衍生物或片段组成的纳米颗粒。
45.根据权利要求42至44任一项的载体分子，其中金属核心包括Au、Ag、Cu，Pd或Al。
46.根据权利要求42的免疫原性结构，包含新表位结构。
47.根据权利要求42至46任一项的免疫原性结构，其中糖类配体是Lewis抗原或Sialyl Tn。
48.根据权利要求47的免疫原性结构，其中Lewis抗原是唾液酸化的。
49.根据权利要求47的免疫原性结构，其中Lewis抗原是唾液酸化的。
50.根据权利要求42至49任一项的免疫原性结构，其中T细胞辅助肽配体来源于选自破伤风类毒素、白喉类毒素或匙孔血蓝蛋白的类毒素。
51.根据权利要求42至50任一项的免疫原性结构，其中T细胞辅助肽配体具有氨基酸序列FKLQTMVKLFNRIKNNVA。
52.药物组合物，包含一种或多种根据权利要求42至51任一项的免疫原性结构。
53.根据权利要求52的药物组合物，含有至少一种疫苗佐剂。
54.根据权利要求52或权利要求53的组合物用于制备免疫治疗用药物的用途。
55.权利要求54的用途，其中药物用于预防或治疗癌症。
56.根据权利要求42至51任一项的免疫原性结构用于分离适于检测和分离肿瘤细胞的抗体的用途。
57.一种通过将至少一种抗原和至少一种佐剂与纳米颗粒的核心缀合而制备权利要求1至39任一项的纳米颗粒的方法，该方法包括：用接头衍生抗原；用接头衍生佐剂；并将接头衍生的抗原和佐剂与制备纳米颗粒的核心的反应物反应，使得在纳米颗粒自装配过程中，纳米颗粒核心与抗原和佐剂通过接头连接。
58.权利要求57的方法，其中接头基团包括巯基、烷基、二元醇基团或肽基团。
59.权利要求57的方法，其中接头基团包括C2-C15烷基和/或C2-C15二元醇。
60.权利要求57的方法，其中接头基团是C2-C15烷基或六甘醇-C11烷基。
61.权利要求57至60任一项的方法，其中反应混合物包含衍生抗原、衍生佐剂、金属和/或半导体原子的盐和还原剂以制备纳米颗粒。
62.用权利要求57至61任一项的方法可获得的纳米颗粒。
63.权利要求1至39任一项的纳米颗粒，或权利要求40或权利要求41的组合物，用于预防性或治标性治疗。
64.权利要求1至39任一项的纳米颗粒，或权利要求40或权利要求41的组合物，用作疫苗。
65.权利要求11至15任一项的纳米颗粒用于制备治疗癌症用药物的用途。
66.权利要求65的用途，其中癌症是结肠、胰腺、肠、肺、肝、卵巢或膀胱癌。
67.权利要求16或权利要求17的纳米颗粒用于制备治疗传染病用药物的用途。
68.权利要求67的用途，其中疾病是疟疾或结核。
69.权利要求65至68任一项的用途，其中纳米颗粒包含膜易位信号，以便它们能够渗透细胞膜。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20080213 |