CN101120255A - 用于实体肿瘤预后的药物基因组学标志 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于实体肿瘤的预后或评估实体肿瘤治疗的方法、系统和仪器。实体肿瘤的预后的基因标志可根据本发明鉴别。抗癌治疗开始后，实体肿瘤患者的PBMC中，各基因标志均具有改变的表达模式，且所述改变的量值与所述患者的临床结果相关。在一个实施例中，使用Cox成比例危险模型(Cox proportional hazards model)判定CCI－779治疗期间RCC患者的临床结果与所述患者的PBMC中基因表达变化之间的相关性。Cox模型所鉴别的基因的非限定性实例描绘于表4A、4B、5A及5B中。所述基因可用作RCC预后的替代标志。其也可用作CCI－779或其他抗癌药物的功效的药物基因组学指标。

Description

用于实体肿瘤预后的药物基因组学标志

本申请案主张2005年2月8日申请的美国第60/654,082号的权利。

技术领域

本发明涉及基因标志和使用这些标志用于实体肿瘤的预后的方法。

背景技术

初生组织中的表达分布研究已证明正常与恶性组织之间存在转录差异。参见，例如Su，等人，Cancer Res.，61：7388-7393(2001)；和Ramaswamy，等人，Proc.NATL.ACAD.Sci.U.S.A.，98：15149-15151(2001)。新近临床分析也已鉴别似乎与临床结果的某些量度高度相关的肿瘤表达分布。某研究已证明原发性肿瘤活检的表达分布产生比得上或甚至可能胜过目前采纳的癌症患者中风险的标准量度的预后性“信号”。参见van de Vijver，等人，N Engl J Med，347：1999-2009(2002)。

虽然原发性肿瘤组织中的转录或其他生物化学变化可代表鉴别预后证据的最佳机会，但在许多肿瘤学情况中，原发性肿瘤已在化学疗法开始之前切除。在这些境况中，因此，希望确定某些其他“替代”组织中的反应是否能提供患者结果的指示。

发明内容

本发明的特征在于可提供实体肿瘤患者的最终临床结果线索的外周血单核细胞(PBMC)中的基因标志。抗癌治疗开始后，实体肿瘤患者的PBMC中，各基因标志均具有改变的表达模式，且这一改变的量值在统计上与实体肿瘤患者的临床结果显著相关。在许多实施例中，PBMC中的基因表达变化与患者结果之间的相关性通过Cox成比例危险模型、Spearman相关分析(Spearman correlation)或基于等级的相关性量度(class-based correlation metric)判定。本发明的基因标志可用作实体肿瘤预后的替代标志。其也可用作抗癌药物功效的药物基因组学指标。

一方面，本发明提供用于所关注的患者的实体肿瘤的预后或评估所关注的患者的实体肿瘤的治疗效力的方法。所述方法包含检测抗癌治疗期间所关注的患者的外周血细胞中至少一个基因的表达水平的变化，和比较所检测的变化与参考变化。罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的患者的PBMC中基因的表达水平变化与这些患者的临床结果相关。因此，所关注的患者的表达水平变化的量值指示患者治疗的预后或效力。在许多实施例中，参考变化具有经验上或实验上确定的值。如果所关注的患者的表达水平变化大于或小于参考变化，那么视为所关注的患者具有良好或不良预后。在许多其他实施例中，参考变化为罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的参考患者的外周血细胞中基因的表达水平变化。也可使用其他量度或标准计算参考变化。

可使用多种类型的血样确定所关注的患者的基因表达变化。这些血样的实例包括(但不限于)全血样品或包含高浓度或纯化PBMC的样品。也可使用其他类型的血样。在适当的相关模型下，这些样品中的基因表达水平变化在统计上与患者结果显著相关。

符合本发明的实体肿瘤包括(但不限于)肾细胞癌(RCC)、前列腺癌或头/颈癌。可根据本发明加以评定的抗癌治疗包括(但不限于)药物疗法、化学疗法、激素治疗、放射疗法、免疫疗法、手术、基因疗法、抗血管生成疗法、姑息疗法或其他常规或实验疗法或其组合。可使用任何与时间相关的临床指标评估所关注的患者的治疗的预后或效力。这些临床指标的非限定性实例包括疾病进展时间(TTP)或死亡时间(TTD)。

可使用多种相关法或统计法评定抗癌治疗期间外周血基因表达变化与患者结果之间的相关性。这些方法包括(但不限于)Cox成比例危险模型、最近邻体分析(nearest-neighbor analysis)、微阵列显著性分析(significance analysis of microarrays)(SAM)法、支持向量机(support vector machines)、人工神经网络(artificial neuralnetwork)或其他秩检验(rank test)、生存分析(survival analysis)或相关性量度(correlationmetric)。

在一个实施例中，使用单变量Cox成比例危险模型确定CCI-779治疗开始后RCC患者的PBMC中基因表达水平变化与这些患者的临床结果的时间量度(例如，TTP或TTD)之间的相关性。Cox成比例危险模型所鉴别的预后性基因的非限定性实例描述于表4A、4B、5A及5B中。这些预后性基因可用于预测临床结果或评估所关注的RCC患者的抗癌治疗的效力。

在一个实施例中，本发明中所使用的预后性基因的估计危险比率小于1。因此，所关注的患者的外周血细胞中较高值的基因表达水平的变化暗示患者的较佳预后。相反地，所关注的患者的较低值的变化指示较差预后。

在另一实施例中，本发明中所使用的预后性基因的危险比率大于1。结果，所关注的患者的外周血细胞中较高值的基因表达水平的变化指示患者的较差预后，且所关注的患者的较低值的变化暗示较佳预后。

所关注的患者的表达水平变化可从任何参考点起度量。在适当的相关模型下，所度量的表达水平变化在统计上与患者结果显著相关。在许多情况下，预后性基因的表达水平变化通过度量抗癌治疗开始后特定时间基因的外周血表达水平与基因的基线外周血表达水平之间的改变来确定。在一非限定性实例中，特定时间为治疗开始后约16周。也可使用小于或大于16周(例如，治疗开始后4、8、12、20、24或28周)的特定时间。

本发明的特征也在于两个或两个以上基因标志或多变量Cox模型用于实体肿瘤的预后的用途。另外，本发明的特征在于适用于RCC或其他实体肿瘤的预后的试剂盒。各试剂盒包括至少一个用于本发明的预后性基因的探针或大体上由其组成。

另一方面，本发明的特征在于使用罗吉斯回归(logistic regression)、ANOVA(方差分析(analysis of variance))、ANCOVA(协方差分析(analysis of covariance))、MANOVA(方差多重分析(multiple analysis of variance))或其他用于所关注的患者的实体肿瘤的预后或评估其治疗效力的相关法或统计法。这些方法包含检测抗癌治疗开始后特定时间所关注的患者的外周血细胞中至少一个实体肿瘤预后性基因的表达水平和将表达水平输入相关模型或统计模型中以确定所关注的患者的治疗的预后或效力。相关模型或统计模型描述罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的患者的PBMC中实体肿瘤预后性基因的表达水平与这些患者的临床结果之间的统计上显著的相关性。在许多实例中，相关模型或统计模型能够产生所关注的患者的临床结果的定性预测(例如，良好或不良预后)。适于此目的的统计模型或分析包括(但不限于)罗吉斯回归或基于等级的相关性量度。在许多其他实例中，相关模型或统计模型能够产生所关注的患者的临床结果的定量预测(例如，估计TTD或TTP)。适于此目的的统计模型或分析包括(但不限于)多种回归、ANOVA或ANCOVA模型。

用于预测所关注的患者的表达水平可为从基线或抗癌治疗开始后另一参考时间点起度量的相对表达水平。也可使用绝对表达水平预测所关注的患者。在后一种情况中，可使用基线或另一特定参考时间的表达水平作为预测模型中的协变量。

本发明的其他特征、目标及优点易见于下文具体实施方式中。然而，应理解当实施方式说明本发明的实施例时，其仅以说明的方式而非限定性方式给出。由具体实施方式，本发明的范畴内的多种变化和修改对所属领域的技术人员来说将变得显而易见。

附图说明

无

具体实施方式

本发明提供用于RCC或其他实体肿瘤的预后的方法和系统。实体肿瘤预后性基因可通过本发明加以鉴别。抗癌治疗开始后，实体肿瘤患者的PBMC中各预后性基因均具改变的表达分布，且这些改变的量值与此等患者的临床结果相关。在许多实施例中，表达分布改变从基线起度量，且表达分布改变与患者结果之间的相关性通过Cox成比例危险模型加以评定。

可使用本发明的预后性基因作为替代标记，以用于所关注的实体肿瘤患者的预后或监测所关注的实体肿瘤患者的治疗效力。归因于疾病的分子机理的个别异质性，不同患者对治疗可能会具有不同临床反应。与患者反应相关的基因表达模式的鉴别使得临床医师得以基于预测的患者反应选择治疗且从而避免不利反应。此提供改进的临床试验安全性和增加的药物及其他抗癌治疗的效益/风险比。外周血为通常以最低侵袭性的方式从患者获得的组织。通过确定患者结果与外周血中基因表达变化之间的相关性，本发明代表临床药物基因组学和实体肿瘤治疗的重大发展。

本发明的多个方面更详细地描述于以下分部中。使用分部并不旨在限制本发明。各分部可适用于本发明的任何方面。在本申请案中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”包括复数涵义，且除非另有说明，否则使用“或”意谓“和/或”。

I.鉴别实体肿瘤预后性基因的一般方法

本发明鉴别外周血基因表达分布的改变与实体肿瘤患者的临床结果之间的统计上显著的相关性。可鉴别具有所述相关性的基因。这些基因为实体肿瘤预后性基因且可用作替代标记，以用于实体肿的预后或评估实体肿瘤的治疗效力。

适于本发明的相关性分析包括(但不限于)Cox成比例危险模型(Cox，Journal of theRoyal Statistical Society，Series B 34：187(1972))、Spearman秩相关性(Snedecor和Cochran，Statistical Methods(第8版，Iowa State University Press，Ames，Iowa，第503页，1989))、最近邻体分析(Golub，等人，Science，286：531-537(1999)；和Slonim，等人，Procs.of theFourth Annual International Conference on Computational Molecular Biology，Tokyo，Japan，4月8-11日，第263-272页(2000))、微阵列显著性分析(SAM)法(Tusher，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，98：5116-5121(2001))、支持向量机及人工神经网络。也可使用其他秩检验、生存分析、相关性量度或统计法。

Cox成比例危险模型为最常使用的检查生存资料的回归模型。参见，例如Tibshirani，Clinical&Investigative Medicine，5：63-68(1982)；Allison，Survival Analysis Using the SASSystem：A Practical Guide(Gary NC：SAS Institute，1995)；及Therneau和Grambsch，Modeling Survival Data：Extending the Cox Model(New York：Springer，2000)。Cox模型检查生存与一个或一个以上协变量或预测因子之间的关系。如本文所使用，术语“生存”不限于真正的死亡或生存。实情为术语应广泛解释为涵盖任何时间相关的事件。通常视Cox成比例危险模型比许多其他回归模型更一般，因为Cox模型并不基于任何关于基本生存分布的性质或形态的假设。Cox模型假设基本危险率随独立协变量或预测因子而变化，且不对危险函数的性质或形态进行假设。

Cox成比例危险模型的非限定性实例通过以下等式描述：

$H_i\left(t\right)=H_0\left(t\right)\exp \left(\underset{j=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_j{x}_{\mathrm{ij}}\right)---\left(1\right)$

其中i是个体的下标，且H_i(t)为时间t时的危险且代表时间t时的终点(例如，死亡、疾病进展或另一时间相关的事件)的概率，假定个体生存直到时间t。X_j表示预测因子或协变量，其可为连续(continuous)、二分(dichotomous)或其他有序分类(orderedcategorical)变量。Cox成比例回归模型假设预测因子的效应随时间为恒定的。在许多实施例中，X_j代表抗癌治疗开始后实体肿瘤患者的外周血细胞(例如，PBMC)中基因j表达水平的变化。其中X_j具有高度偏斜分布，可执行对数转换来降低极值效应。H₀(t)为时间t时的基线危险，且表明当所有独立协变量都等于0时，各个体的危险。在Cox模型中，未指定基线危险函数。即使缺乏特定的基线危险函数，但仍可(例如)通过部分似然法(method of parial likeihood)估计Cox模型。

等式(1)所描绘的Cox模型为半参数的，因为当基线危险可采用任何形式时，均可估计协变量的系数。考虑x值随相应线性预测因子而不同的两个观察结果i和i′：

$\mathrm{PI}=\left(\underset{j=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_j{x}_{\mathrm{ij}}\right)---\left(2\right)$

和

${\mathrm{PI}}^{\text{'}}=\left(\underset{j=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\β}}_j{x}_{i^{\text{'}}j}\right)---\left(3\right)$

H_i(t)与H_i′(t)的比率：

H_i(t)/H_i′(t)＝[H₀(t)exp(PI)]/[H₀(t)exp(PI′)]＝exp(PI)/exp(PI′)(4)

与时间t无关。因此，等式(1)中的Cox模型为成比例危险模型。

等式(5)描述单变量Cox模型，其中仅单个预测因子通过Cox回归加以评定：

H_i(t)＝H₀(t)exp(βx_i)    (5)

危险比率(RR)定义为exp(β)，其代表预测因子一个单位变化的事件(例如，死亡或疾病进展)的相对风险。在许多应用中，PBMC表达值表现为以2为底的对数，且一个单位变化对应于双重表达。危险比率的自然对数产生系数β。当使用S-Plus或R程序包时，危险比率RR可使用程序包中的“coxph()”函数产生。

在单变量Cox分析中，小于1的危险比率指示系数β为负。结果，预测因子的值的增加产生降低的事件(例如，死亡或疾病进展)瞬时风险。相反地，预测因子的值的减小产生较高的事件瞬时风险。同样地，大于1的危险比率暗示系数β为正。因此，预测因子的值的增加(或减小)产生较高(或较低)的事件瞬时风险。

作为非限定性实例，当系数β为负时，与预测因子χ_i′相比预测因子x_i的增加产生较低的PI，因此，产生与H_i′(t)相比较低的H_i(t)。参见等式(2)、(3)及(4)，其中k＝1。相反地，x_i的减小产生与H_i′(t)相比较高的H_i(t)。当系数β为正时，x_i的增加(或减小)产生与H_i′(t)相比较高(或较低)的H_i(t)。因此，可使用Cox成比例危险模型评估不同个体之间的时间相关事件的相对风险。

一旦拟合Cox模型时，就可使用至少三个假设检验评定协变量的统计显著性。这些检验为似然比检验(likelihood ratio test)、Wald检验和计分检验(score test)。在许多实施例中，通过一种或一种以上用于基因表达从基线的变化与患者结果之间的相关性的这些检验所确定的p值为至多0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。本发明的预后性基因的危险比率可小于1，诸如至多0.5、0.33、0.25、0.2、0.1或更低。基因的危险比率也可大于1，诸如至少2、3、4、5、10或更大。小于1的危险比率指示实体肿瘤患者的外周血细胞中基因表达水平的增加暗示患者的良好预后，而大于1的危险比率暗示患者的外周血细胞中基因表达水平的增加指示患者的不良预后。

本发明也涵盖使用多变量Cox模型使实体肿瘤患者的外周血基因表达变化与临床结果相关。各多变量Cox模型包括两个或两个以上协变量或预测因子，且各协变量代表抗癌治疗期间实体肿瘤患者的外周血细胞(例如，PBMC)中预测因子基因表达水平的变化。在许多实施例中，表达水平的变化从基线起度量。也可将不同协变量间的相互作用引入模型中。

可在多变量模型中检验对单变量分析为显著(例如，具有至多0.05、0.01、0.005、0.001或更低的p值)的预测因子。在一实例中，使用正向逐步选择法(forward stepwiseselection)选择用于多变量分析的预测因子。举例来说，可首先将对单变量分析为单一最显著的预测因子输入多变量模型中，接着输入次最显著的预测因子等等。在一些情况下，在不损害模型的预测性能的情况下，使用降维法(dimension reduction method)(诸如主成分分析(principal component analysis)或分片逆回归(sliced inverse regression))潜在减少多变量模型中的预测因子的数目。

可利用多种计算机程序进行Cox回归分析。这些程序的实例包括(但不限于)S-Plus、SAS或SPSS程序包。参见，例如Allison，Survival Analysis Using the SAS System：APractical Guide(Gary NC：SAS Institute，1995)；和Therneau，A Package for SurvivalAnalysis in S(Technical Report，www.mayo.edu/hsr/people/therneau/survival.ps，MayoFoundation，1999)。

也可使用修改的Cox模型。举例来说，可将分层因子引入Cox模型中以允许变量各级之间存在非成比例的危险。可使用残差发现预测因子的修正函数形式，鉴别通过模型不良预测的个体或评定成比例危险假设。另外，可通过修改的Cox模型分析随时间变化的协变量、时间依赖性系数、多个/相关观察结果或多个时标。也可使用处罚Cox模型(Penalized Cox model)或脆弱模型(frailty model)。

本发明的特征也在于使用其他相关法或统计法鉴别外周血基因表达变化与患者结果之间的相关性。这些方法包括(但不限于)加权投票(weighted voting)(Golub，等人，Science，286：531-537(1999))、支持向量机((Su，等人，CANCER Research，61：7388-93(2001))、K-最邻近法(K-nearest neighbor)(Ramaswamy，等人，Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA，98：15149-15154(2001))、相关系数(van′tVeer，等人，NATURE，415：530-536(2002))或其他合适模式识别程序。

可根据本发明加以评估的实体肿瘤治疗的实例包括(但不限于)药物疗法(例如，CCI-779疗法)、化学疗法、激素疗法、放射疗法、免疫疗法、手术、基因疗法、抗血管生成疗法、姑息疗法或其他常规或非常规疗法或其任何组合。符合本发明的实体肿瘤包括(不限于)RCC、前列腺癌、头/颈癌、卵巢癌、睾丸癌、脑肿瘤、乳癌、肺癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、皮肤癌、子宫颈癌、子宫癌、肝癌或其他不具有血液或淋巴细胞起源的肿瘤。可使用直接或间接观测进程评估实体肿瘤的状况或进展。合适观测法包括(但不限于)扫描(诸如X射线(X-ray)、计算机化轴向层面X射线摄影法(computerized axial tomography)(CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging)(MRI)、电子发射断层扫描(positron emission tomography)(PET)或超声波扫描术(ultrasonography)(U/S))、活检、触诊、内窥镜检查、腹腔镜检查或所属领域的技术人员了解的其他合适方法。

可通过大量标准评定实体肿瘤的临床结果。在许多实施例中，基于患者对治疗性治疗的反应度量临床结果。时间相关的临床结果量度的实例包括(但不限于)疾病进展时间(TTP)、死亡时间(TTD或生存)、完全反应时间、部分反应时间、微小反应时间、疾病稳定时间或其组合。

TTP是指治疗开始的日期到度量疾病进展的第一天之间的间隔。TTD是指治疗开始的日期到死亡时间之间的间隔。完全反应、部分反应、微小反应、疾病稳定或疾病进展可使用(不限于)WHO报导标准(WHO Reporting Criteria)，诸如WHO公开案第48号(World Health Organization，Geneva，Switzerland，1979)所述的标准加以评估。以此标准，在每次评定中度量一维或二维可度量的病变。当多个病变存在于任一器官中时，那么可选择多达6个(如果可用)代表性病变。

在许多情况下，“完全反应”(CR)定义为通过两次相隔不少于4周的观察判定所有可度量且可评估的疾病完全消失。不存在新的病变且不存在疾病相关症状。“部分反应”(PR)在提及二维可度量疾病时意谓通过2次相隔不少于4周的观察判定所有可度量的病变的最大垂直直径的乘积的和减少至少约50％。“部分反应”在提及一维可度量疾病时意谓通过2次相隔不少于4周的观察判定所有病变的最大直径的和减少至少约50％。就部分反应来说，不必所有病变均退回至合格状态，但任何病变均不应进展且不应出现任何新的病变。评定应为客观的。“微小反应”在提及二维可度量疾病时意谓所有可度量的病变的最大垂直直径的乘积的和减少约25％或更多但减少小于约50％。“微小反应”在提及一维可度量疾病时意谓所有病变的最大直径的和减少至少约25％但小于约50％。

“疾病稳定”(SD)在提及二维可度量疾病时意谓所有可度量的病变的最大垂直直径的乘积的和减少小于约25％或增加小于约25％。“疾病稳定”在提及一维可度量疾病时意谓所有病变的直径的和减少小于约25％或增加小于约25％。不应出现任何新的病变。“疾病进展”(PD)是指至少一个二维(最大垂直直径的乘积)或一维可度量病变的尺寸增加大于或等于约25％或出现新的病变。如果通过阳性细胞学证实出现胸膜积液或腹水，那么也视为疾病进展。病理性骨折或骨骼断裂不一定证明疾病进展。

在一非限定性实例中，根据表1判定一维和二维可度量疾病的总体个体肿瘤反应。

表1总体个体肿瘤反应

二维可度量疾病的反应	一维可度量疾病的反应	总体个体肿瘤反应
			PD	任一种	PD
任一种	PD	PD
			SD	SD或PR	SD
SD	CR	PR
			PR	SD或PR或CR	PR
CR	SD或PR	PR
			CR	CR	CR

举例来说，在以下情形中可评定非可度量疾病的总体个体肿瘤反应：

a)总体完全反应：如果存在非可度量疾病，那么其应完全消失。否则，个体不能视为“总体完全反应者”。

b)总体进展：在非可度量疾病的尺寸显著增加或出现新的病变的情况下，总体反应将进展。

就相关性研究来说，实体肿瘤患者可基于其各自的临床结果分等级。其也可使用传统的临床风险评定法分等级。在许多情况下，这些风险评定法使用若干将实体肿瘤患者分为不同预后或风险群组的预后性因子。这些方法的一个实例为用于RCC的Motzer风险评定，描述于Motzer，等人，J Clin Oncol，17：2530-2540(1999)中。不同风险群组中的患者对疗法可具有不同反应。

可使用多种类型的外周血样鉴别外周血基因表达变化与患者结果之间的相关性。适于此目的的外周血样包括(但不限于)全血样或包含高浓度PBMC的样品。“高浓度”意谓样品中PBMC的百分率比全血中的高。在许多情况下，高浓度样品中的PBMC百分率比全血中的高至少1、2、3、4、5或更多倍。在许多其他情况下，高浓度样品中的PBMC百分率为至少90％、95％、98％、99％、99.5％或更高。含高浓度PBMC之血样可通过使用诸如菲科尔梯度离心(Ficoll gradients centrifugation)或CPT(细胞纯化管(cellpurification tube))的所属领域中已知的任何方法加以制备。

本发明中所使用的外周血样可在抗癌治疗之前、期间或之后的任何时候加以分离。举例来说，外周血样可在治疗性治疗之前分离。这些样品在本文中称为“基线”或“预处理”样品。这些样品中的基因表达分布在本文中称为“基线”或“预处理”分布。另一实例，外周血样可在抗癌治疗开始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16周从实体肿瘤患者中分离。也可使用其他时间间隔来制备血样。

在许多实施例中，基因表达变化通过度量抗癌治疗开始后特定时间的基因表达分布与基线表达分布之间的改变来确定。也可使用不为基线的参考时间点。

外周血基因表达变化可使用全基因表达分析加以评估。适于此目的的方法包括(但不限于)核酸阵列(诸如cDNA或寡核苷酸阵列)、蛋白质阵列、双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳/质谱及其他高通量核苷酸或多肽检测技术。

核酸阵列允许一次定量检测大量基因的表达水平。核酸阵列的实例包括(但不限于)来自Affymetrix(Santa Clara，CA)的Genechip^微阵列、来自Agilent Technologies(PaloAlto，CA)的cDNA微阵列及美国专利第6,288,220号和第6,391,562号中所述的微珠阵列。

待与核酸阵列杂交的聚核苷酸可用一或多个标记部分加以标记以允许检测杂交的聚核苷酸复合体。标记部分可包括通过光谱法、光化学法、生物化学法、生物电子法、免疫化学法、电法、光学法或化学法可检测的组合物。例示性标记部分包括放射性同位素、化学发光化合物、经标记的结合蛋白、重金属原子、诸如荧光标记以及染料的光谱标记、磁标记、联结酶、质谱标记、自旋标记、电子转移供体和受体等。也可使用未经标记的聚核苷酸。聚核苷酸可为DNA、RNA或其经修饰形式。

杂交反应可以完美杂交或差异杂交格式执行。在完美杂交格式中，使由一个诸如抗癌治疗期间的特定时间自实体肿瘤患者分离的外周血样的样品制备的聚核苷酸与核酸阵列杂交。形成杂交复合体后所检测到的信号指示样品中的聚核苷酸水平。在差异杂交格式中，用不同标记部分标记由两个生物样品(诸如一个来自所关注的患者和另一来自参考患者)制备的聚核苷酸。将这些经不同标记的聚核苷酸的混合物添加到核酸阵列中。然后，在来自不同标记的发射可个别检测的条件下检查核酸阵列。在一个实施例中，使用荧光团Cy3和Cy5(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway N.J.)作为差异杂交格式的标记部分。

可使用诸如由Affymetrix或Agilent Technologies提供的软件的市售软件分析从核酸阵列收集的信号。杂交实验中可包括诸如扫描灵敏性、探针标记及cDNA/cRNA定量的对照。在许多实施例中，在核酸阵列表达信号经受进一步的分析之前，使其按比例调整或归一化。举例来说，当在相似检验条件下使用一个以上阵列时，可使各基因的表达信号归一化以考虑杂交强度的改变。也可使用源自各阵列上所包含的内标归一化对照的强度使个别聚核苷酸复合体杂交的信号归一化。另外，可使用在所有样品中具有相对一致的表达水平的基因使其他基因的表达水平归一化。在一个实施例中，使基因的表达水平在所有样品中归一化以致平均值为0且标准偏差为1。在另一实施例中，使通过核酸阵列所检测到的表达资料经受排除展示所有样品中最小或可忽略改变的基因的改变过滤器。

II.鉴别RCC预后性基因

RCC包含所有肾癌病例中的大部分且在工业化国家中为十大最常见癌症之一。晚期RCC的5年生存率小于5％。RCC通常通过成像方法检测，30％明显非转移性患者经受手术后复发且最终死于疾病。新近表达分布研究已证明原发性恶性肿瘤的转录分布根本地由相应正常组织的转录分布改变而来(请参见Slonim，Pharmacogenomics，2：123-136(2001))。详细检查RCC肿瘤转录分布的特异性微阵列研究(Young，等人，Am.J.Pathol.，158：1639-1651(2001))已鉴别许多等级的在正常肾组织与原发性RCC肿瘤之间变化的基因。

已为诊断有RCC的患者开发出数个预后性因子和计分指数，典型例子为数个关键指标的多变量评定。一个实例为Motzer风险评定计分，其使用5个由Motzer，等人，J ClinOncol，17：2530-2540(1999)提出的预后性因子，即Karnofsky身体状况评分、血清乳酸脱氢酶、血红蛋白、血清钙及先前存在/不存在肾切除。可基于各自的Motzer风险评定计分将RCC患者分为良好、中等或不良预后等级。

本发明的特征在于用于RCC的预后的替代基因标志。RCC患者的外周血细胞中这些基因的表达水平在CCI-779疗法期间发生变化，且这些与基线表达水平的变化的量值与诸如TTP或TTD的临床结果的连续量度相关。

CCI-779为mTOR通路的小分子抑制剂，其当前在肿瘤学领域中的多种适应症中及诸如多发性硬化症之适应症中作为细胞生长抑制剂经受评估。CCI-779为免疫抑制雷帕霉素(rapamycin)的酯类似物且其本身为雷帕霉素的哺乳动物标靶的有效的选择性抑制剂。雷帕霉素的哺乳动物标靶(mTOR)会激活包括p70s6激酶的磷酸化的多个信号传输通路，此导致编码涉及翻译和进入细胞周期G1期的蛋白质的5′TOP mRNA的翻译的增加。归因于CCI-779对mTOR及细胞周期控制的抑制效应，其充当细胞生长抑制剂和免疫抑制剂。

用25mg、75mg或250mg CCI-779静脉内(IV)输液每周一次地治疗111位晚期RCC患者(34位女性和77位男性)直到证明疾病进展。进一步分析一45位患者(18女性和27位男性)子组的基因表达结果。将这45位患者的RCC肿瘤在临床场所分类为常规(透明细胞)癌(24)、颗粒状(1)、乳头状(3)或混合亚型(7)。10个肿瘤分类为未知的。RCC患者主要是高加索人血统(Caucasian descent)(44位高加索人、1位美裔非洲人)且平均年龄为58岁(在40-78岁范围内)。纳入标准包括先前已接受晚期疾病的疗法或先前尚未接受晚期疾病的疗法但不是接受高剂量IL-2疗法的适当候选者的组织学上确认为晚期肾癌的患者。其他纳入标准包括具有以下特征的患者：(1)疾病的二维可度量的证据；(2)进入研究之前证明疾病进展；(3)年龄在18岁或更大；(4)ANC＞1500/μL，血小板＞100,000/μl且血红蛋白＞8.5g/dL；(5)由血清肌酸酐＜1.5×正常值上限证明肾功能足够；(6)由胆红素＜1.5×正常值上限和AST＜3×正常值上限(或如果存在肝转移，那么AST＜5×正常值上限)证明肝功能足够；(7)血清胆固醇＜350mg/dL，三酸甘油酯＜300mg/dL；(8)ECOG身体状况评分0-1；以及(9)至少12周的预期寿命。排除标准包括具有以下特征的患者：(1)存在已知CNS转移；(2)给药开始3周内进行手术或放射疗法；(3)给药开始4周内进行RCC化学疗法或生物疗法；(4)给药开始4周内用先前研究剂治疗；(5)免疫受损的状况，包括那些已知HIV为阳性或接受包括皮质类固醇的免疫抑制剂的同时使用的患者；(6)主动感染；(7)需要抗痉挛疗法治疗；(8)危急生命的心律失常治疗6个月内/或正在进行过程中存在不稳定的绞痛/心肌梗塞；(9)在过去3年里有先前恶性肿瘤病史；(10)对大环内脂类抗菌素过敏；以及(11)怀孕或任何其他大体上将增加与参与研究相关的风险的疾病。试验整段时间内以每周一次30分钟的静脉内输液所投与的三种剂量(25mg、75mg或250mg)中的一种的CCI-779治疗所选择的RCC患者。

治疗之前及CCI-779疗法开始后每8周记录残余、复发性或转移性疾病的临床病期及尺寸。肿瘤尺寸以厘米度量且报导为最长直径与其垂直直径的乘积。可度量疾病定义为通过CT扫描、X射线或触诊这两个直径均大于1.0cm的任何二维可度量病变。肿瘤反应通过所有可度量病变的乘积的和加以判定。指定临床反应的类别由临床方案定义给出(亦即，疾病进展、疾病稳定、微小反应、部分反应及完全反应)。也使用以Motzer风险评定指定的预后的类别(良好对中等对不良)。在45位RCC患者中，6位指定为良好风险评定，17位患者拥有中等风险计分且22位患者收到不良预后等级。除分类等级外，也监测总生存及疾病进展时间作为临床终点。

在CCI-779疗法之前及治疗开始后每8周从RCC患者的外周血分离PBMC。由所分离的PBMC制备核酸样品且根据制造商指南使其与HG-U95A基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交。参见GeneChipExpression Analysis-Technical Manual(第701021部分，第1修订本，Affymetrix，Inc.1999-2001)，其整体内容以引用的方式併入本文中。通过MAS 4算法由探针强度计算信号，且使用如实例中所述的尺度频率归一化法(scalefrequency normalization method)将信号强度转化为频率。

为鉴别与患者结果相关的PBMC中转录水平的特异性改变，使用考虑临床结果量度的检查效应的Cox成比例危险回归以将结果建立为Log₂转换的表达水平的函数(以ppm为单位)的模型。对已通过最初过滤标准的5,469个合格者中的每一个均执行两个临床结果量度TTP和TTD的Cox回归分析(整个资料集至少1个“存在”呼叫，及至少一个＞10ppm频率的转录物；参见实例3)。在Cox成比例危险分析中，与各转录物相关的危险比率指示良好或非良好结果的似然性，其中小于1的危险比率指示增加协变量的水平的风险较低且大于1的危险比率指示风险较高。

对各转录物和结果量度来说，计算危险比率且计算假设危险比率等于1(亦即，无风险)的Wald p值。就5个I型(亦即，假阳性)误差水平，计算对各结果量度所执行的5,469个检验中名义上显著的检验的数目。为调整5,469个检验不独立的事实，然后使用基于排列的方法评估所观察到的显著性检验的数目将在无风险的零假设下出现的频率。

Cox成比例危险回归模型适于评定通过HG-U95AAffymetrix微阵列度量的基因表达水平与临床结果之间的联系。使用来自在基线、8周及16周样品中通过最初过滤标准的5,469个合格者中的每一个的表达水平拟合模型(所有样品至少1个“存在”呼叫及至少一个＞10ppm频率的转录物)。就其与从基线成比例频率之变化的联系，检验两个临床量度TTD和TTP。基于Log₂转换的成比例频率值计算从基线的变化，且计算基线后8周和16周的变化。

临床结果与从基线表达水平的变化的比较结果，8周的变化概述于表2A和2B中，且16周的变化概述于表3A和3B中。临床结果与从基线基因表达的变化之间的联系的证据对16周的两个结果变量来说更有力。

表2A.8周从基线Log₂转换的频率变化的TTD临床结果的Cox成比例危险回归的排列结果(n＝30位患者)

死亡时间
			α-置信水平	所观察到的名义上显著的Cox回归的数目*	名义上显著的Cox回归的数目等于或超过所观察到数目的排列的百分率
0.1	584	44％(220/500)
			0.05	295	41％(206/500)
0.01	46	45％(226/500)
			0.005	25	38％(190/500)
0.001	5	19％(154/500)

^*就5,469个基因来说(通过“至少一个存在呼叫及至少一个频率＞10ppm”过滤)

表2B.8周从基线Log₂转换的频率变化的TTP临床结果的Cox成比例危险回归的排列结果(n＝30位患者)

进展时间
			α-置信水平	所观察到的名义上显著的Cox回归的数目*	名义上显著的Cox回归的数目等于或超过所观察到数目的排列的百分率
0.1	901	11％(53/500)
			0.05	503	10％(51/500)
0.01	95	16％(79/500)
			0.005	47	16％(78/500)
0.001	2	61％(308/500)

^*就5,469个基因来说(通过“至少一个存在呼叫及至少一个频率＞10ppm”过滤)

表3A.16周从基线Log₂转换的频率变化的TTD临床结果的Cox成比例危险回归的排列结果(n＝22位患者)

死亡时间
			α-置信水平	所观察到的名义上显著的Cox回归的数目*	名义上显著的Cox回归的数目等于或超过所观察到数目的排列的百分率
0.1	1106	3.8％(19/500)
			0.05	646	3.6％(18/500)
0.01	173	2.2％(11/500)
			0.005	80	4.2％(21/500)
0.001	14	4.0％(20/500)

^*就5,469个基因来说(通过“至少一个存在呼叫及至少一个频率＞10ppm”过滤)

表3B.16周从基线Log₂转换的频率变化的TTP临床结果的Cox成比例危险回归的排列结果(n＝22位患者)

进展时间
			α-置信水平	所观察到的名义上显著的Cox回归的数目*	名义上显著的Cox回归的数目等于或超过所观察到数目的排列的百分率
0.1	1317	1.2％(6/500)
			0.05	872	0.4％(2/500)
0.01	283	0.4％(2/500)
			0.005	136	0.4％(2/500)
0.001	15	3.4％(17/500)

^*就5,469个基因来说(通过“至少一个存在呼叫及至少一个频率＞10ppm”过滤)

表4A和4B提供PBMC中的20个例示性基因，其具有就TTP来说各自与低风险(危险比率＜1.0)或高风险(危险比率＞1.0)相关的16周转录水平变化。表5A和5B列出PBMC中的20个例示性基因，其具有就TTD来说各自与低风险(危险比率＜1.0)或高风险(危险比率＞1.0)相关的16周转录水平变化。表6提供这些基因的注解。

表4A.展示与TTP显著相关的16周变化的经CCI-779治疗的患者的RCCPBMC中 的20个例示件基因

(16周时表达增加暗示进展的良好预后)

合格者	危险比率	P值	基因名称(GeneName)	单一基因ID(Unigene ID)
					36131_at	0.0805	0.0056	UNK_AJ012008	Hs.74276
935_at	0.1098	0.0013	CAP	Hs.104125
					40441_g_at	0.1186	0.0016	DKFZP564M2423	Hs.165998
37007_at	0.1250	0.0055	TDE1	Hs.272168
					410_s_at	0.1345	0.0054	CSNK2B	Hs.165843
33666_at	0.1501	0.0109	HNRPC	Hs.182447
					32234_at	0.1502	0.0119	DYT1	Hs.19261
41185_f_at	0.1523	0.0169	SMT3H2	Hs.180139
					32594_at	0.1561	0.0092	CCT4	Hs.79150
40063_at	0.1562	0.0006	NDP52	Hs.154230
					36585_at	0.1584	0.0047	ARF4	Hs.75290
34849_at	0.1747	0.0055	SARS	Hs.4888
					37023_at	0.1763	0.0223	LCP1	Hs.16488
39342_at	0.1763	0.0046	MARS	Hs.279946
					38943_at	0.1764	0.0050	HCCS	Hs.211571
590_at	0.1765	0.0024	ICAM2	Hs.347326
					35787_at	0.1833	0.0004	UNK_AI986201	Hs.355812
41551_at	0.1891	0.0015	RER1	Hs.40500
					37738_g_at	0.1973	0.0014	PCMT1	Hs.79137
36950_at	0.1978	0.0380	UNK_X90872	Hs.279929

表4B.展示与TTP显著相关的16周变化的经CCI-779治疗的患者的RCC PBMC中 的20个例示性基因

(16周时表达增加暗示进展的不良预后)

合格者	危险比率	P值	基因名称	单一基因ID
					41833_at	70.3014	0.0022	JTB	Hs.6396
38590r_at	34.3415	0.0013	PTMA	Hs.250655
					41231f_at	25.2728	0.0124	HMG17
34392_s_at	20.1103	0.0027	DKFZP564B163	Hs.3642
					35298_at	14.9081	0.0202	EIF3S7	Hs.55682
36637_at	13.3407	0.0152	ANXA11	Hs.75510
					36198_at	13.1169	0.0004	KIAA0016	Hs.75187

33619_at	12.3924	0.0225	RPS13	Hs.165590
					32205_at	12.0630	0.0016	PRKRA	Hs.18571
36587_at	11.8495	0.0223	EEF2	Hs.75309
					38738_at	11.0671	0.0028	SMT3H1	Hs.85119
36186_at	10.9675	0.0016	RNPS1	Hs.75104
					40874_at	10.7873	0.0085	EDF1	Hs.174050
40203_at	9.7115	0.0031	SUI1	Hs.150580
					41834_g_at	9.5538	0.0123	JTB	Hs.6396
39415_at	9.3960	0.0133	HNRPK	Hs.129548
					34647_at	8.1524	0.0164	DDX5	Hs.76053
36515_at	8.1450	0.0002	GNE	Hs.5920
					41235_at	8.0415	0.0011	ATF4	Hs.181243
37912_at	7.9835	0.0026	TRAF4	Hs.8375

表5A.展示与TTD显著相关的16周变化的经CCI-779治疗的患者的RCC PBMC中 的20个例示性基因

(16周时表达增加暗示生存的良好预后)

合格者	危险比率	P值	基因名称	单一基因ID
					35770_at	0.0568	0.0034	ATP6S1	Hs.6551
40771_at	0.0811	0.0313	MSN	Hs.170328
					1394_at	0.1206	0.0856	UNKJL25080	Hs.77273
33659_at	0.1228	0.0152	CFL1	Hs.180370
					39738_at	0.1243	0.0083	APOL
1878_g_at	0.1327	0.0115	ERCC1	Hs.59544
					1863_s_at	0.1379	0.0569	UNKJJ67092	Hs.194382
39092_at	0.1671	0.0162	PURB	Hs.301005
					AFFX-HSAC07/X00351_3_at	0.1832	0.0242	BACTIN3_Hs_AFFX	Hs.288061
32318s_at	0.1943	0.0673	ACTB	Hs.288061
					41332_at	0.1978	0.0002	POLR2E	Hs.24301
37023_at	0.2310	0.0320	LCP1	Hs.16488
					39354_at	0.2387	0.0034	KIAA0106	Hs.120
36666_at	0.2499	0.0082	P4HB	Hs.75655
					33424_at	0.2521	0.0005	RPN1	Hs.2280
36581_at	0.2542	0.0554	GARS	Hs.283108
					36668_at	0.2676	0.0458	DIA1	Hs.274464
691_g_at	0.2699	0.0382	P4HB	Hs.75655
					40768_s_at	0.2769	0.0473	NUP214	Hs.170285
41421_at	0.2885	0.0472	KIAA0909	Hs.107362

表5B.展示与TTD显著相关的16周变化的经CCI-779治疗的患者的RCC PBMC中 的20个例示性基因

(16周时表达增加暗示生存的不良预后)

合格者	危险比率	P值	基因名称	单一基因ID
					39739_at	29.9466	0.0023	MYH9	Hs.32916
33215_g_at	19.6111	0.0050	RPMS12	Hs.9964
					34401_at	18.4364	0.0088	UQCRFS1	Hs.3712
36765_at	17.0062	0.0001	DKFZP434I114	Hs.72620
					41190_at	15.5344	0.0082	TNFRSF12	Hs.180338
1817_at	14.8747	0.0066	PFDN5	Hs.288856
					34570_at	13.6770	0.0011	RPS27A	Hs.3297
31708_at	12.3739	0.0055	RPL30	Hs.334807
					34608_at	12.1813	0.0164	GNB2L1	Hs.5662
121_at	11.8726	0.0040	PAX8	Hs.73149
					34646_at	11.7518	0.0007	RPS7	Hs.301547
327_f_at	11.7018	0.0206	RPS20
					41553_at	11.5948	0.0015	C8ORP1	Hs.40539
36333_at	11.3559	0.0218	RPL7	Hs.153
					1683_at	11.2771	0.0001	WIT-1
32341_f_at	10.8460	0.0088	RPL23A	Hs.350046
					324_f_at	10.8113	0.0089	BTF3
162_at	10.7452	0.0058	USP11	Hs.171501
					32435_at	10.5153	0.0145	RPL19	Hs.252723
32432_f_at	9.6275	0.0239	RPL15	Hs.74267

表6.RCC预后性基因的注解

合格者	入藏登记号(Entrez)	基因标题
			36131_at	AJ012008	编码RNCC蛋白、DDAH蛋白、Ly6-C蛋白、Ly6-D蛋白及免疫球蛋白受体的智人基因
935_at	L12168	腺苷酰环化酶相关蛋白
			40441_g_at	AL080119	DKFZP564M2423蛋白
37007_at	U49188	肿瘤差异表达1
			410_s_at	X57152	酪蛋白激酶2，β多肽

33666_at	M16342	核内不均一核糖核蛋白C(C1/C2)
			合格者	入藏登记号(Entrez)	基因标题
32234_at	AF007871	肌张力障碍1，扭转(常染色体支配；torsinA)
			41185_f_at	AI971724	SMT3(miftwo 3的抑制因子，酵母)同系物2
32594_at	AF026291	含TCP1的伴侣素，亚单元4(δ)
			40063_at	U22897	核域10蛋白

36585_at	M36341	ADP核糖基化因子4
			34849_at	X91257	丝氨酰tRNA合成酶
37023_at	J02923	淋巴细胞细胞内蛋白1(L-plastin)
			39342_at	X94754	甲硫氨酸tRNA合成酶
38943_at	U36787	成熟的细胞色素c合成酶(细胞色素c血红素裂解酶)
			590_at	M32334	细胞间粘附分子2
35787_at	AI986201	EST，与细胞浆动力蛋白中间体链1适当类似[智人]
			41551_at	AW044624	与酿酒酵母(S.cerevisiae)RER1类似
37738_g_at	D25547	蛋白质-L-异天冬氨酸酯(D-天冬氨酸酯)O-甲基转移酶
			36950_at	X90872	gp25L2蛋白质的智人mRNA
41833_at	AB016492	跳跃易位断点
			38590_r_at	M14630	胸腺素α原(基因序列28)
41231_f_at	X13546	高迁移率族(非组蛋白染色体)蛋白17
			34392_s_at	AL050268	DKFZP564B163蛋白
35298_at	U54558	真核翻译起始因子3，亚单元7(ζ，66/67kD)
			36637_at	LI9605	annexin A11
36198_at	D13641	外部线粒体膜的移位酶20(酵母)同系物
			33619_at	L01124	核糖体蛋白S13
32205_at	AF072860	蛋白激酶，干扰素诱导性双链RNA依赖性活化剂
			36587_at	Z11692	真核翻译延伸因子2
38738_at	X99584	SMT3(miftwo 3的抑制因子，酵母)同系物1
			36186_at	L37368	RNA结合蛋白S1，富含丝氨酸域
40874_at	AJ005259	内皮分化相关因子1
			40203_at	AJ012375	假定翻译起始因子
41834_g_at	AB016492	跳跃易位断点

合格者	入藏登记号(Entrez)	基因标题
			39415_at	X72727	核内不均一核糖核蛋白K
34647_at	X52104	DEAD/H(Asp-Glu-Ala-Asp/His)盒多肽5(RNA解螺旋酶，68kD)
			36515_at	AJ238764	UDP-N-乙酰葡糖胺-2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶
41235_at	AL022312	激活转录因子4(tax反应性增强子元件B67)
			37912_at	X80200	TNF受体相关因子4
35770_at	D16469	H+转运溶菌ATP酶(空泡型质子泵)，亚单元1
			4077_1at	Z98946	moesin

1394_at	L25080	智人GTP结合蛋白(rhoA)mRNA，完全编码序列(complete cds)。
			33659_at	X95404	cofilin 1(非肌)
39738_at	Z82215	脱脂蛋白L
			1878_g_at	M13194	切割修复交叉互补啮齿动物修复不足，互补群1(包括重叠反义序列)
1863_s_at	U67092	簇Incl U67092：人类共济失调毛细血管扩张基因座蛋白(ATM)基因，外显子1a、1b、2、3及4，部分编码序列(partial cds)。
			39092_at	AW007731	富含嘌呤的元件结合蛋白B
AFFX-HSAC07/X003513_at	X00351	BACTIN3受控序列(智人)[AFFX]
			32318_s_at	X63432	肌动蛋白，β
41332_at	D38251	聚合酶(RNA)II(DNA指导)多肽E(25kD)
			37023_at	J02923	淋巴细胞细胞内蛋白1(L-plastin)
39354_at	D14662	抗氧化剂蛋白2(非硒谷胱甘肽过氧化物酶，酸性非钙依赖性磷脂酶A2)
			36666_at	M22806	前胶原-脯氨酸，2-酮戊二酸4-加双氧酶(脯氨酸4-羟化酶)，β多肽(蛋白质二硫键异构酶；甲状腺激素结合蛋白p55)
33424_at	Y00281	核糖体结合蛋白I
			36581_at	U09510	甘氨酰tRNA合成酶
36668_at	M28713	心肌黄酶(NADH)(细胞色素b-5还原酶)
			691_g_at	J02783	前胶原脯氨酸，2-酮戊二酸4-加双氧酶(脯氨酸4-羟化酶)，β多肽(蛋白质二硫键异构酶；

合格者	入藏登记号(Entrez)	基因标题
					甲状腺激素结合蛋白p55)
40768_s_at	X64228	核孔蛋白214kD(CAIN)
			41421_at	AB020716	KIAA0909蛋白
39739_at	AF054187	肌球蛋白，重链多肽9，非肌
			33215_g_at	Y11681	核糖体蛋白，线粒体，S12
34401_at	L32977	泛醇细胞色素c还原酶，Rieske铁-硫多肽1
			36765_at	AL080154	DKFZP434I114蛋白
41190_at	U83598	肿瘤坏死因子受体超家族，成员12(移位链相关膜蛋白)
			1817_at	D89667	前折叠素(prefoldin)5
34570_at	S79522	核糖体蛋白S27a
			31708_at	L05095	核糖体蛋白L30
34608_at	M24194	鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)，β多肽2样1
			121_at	X69699	配对盒基因8
34646_at	Z25749	核糖体蛋白S7

327_f_at	L06498	核糖体蛋白S20
			41553_at	AI738702	染色体8开放阅读框架(open reading frame)1
36333_at	X57958	核糖体蛋白L7
			1683_at	X69950	肾母细胞瘤(Wilms tumor)相关蛋白
32341_f_at	U37230	核糖体蛋白L23a
			324_f_at	X53281	基本转录因子3
162_at	U44839	泛素特异性蛋白酶11
			32435_at	X63527	核糖体蛋白L19
32432_f_at	L25899	核糖体蛋白L15

表4A、4B、5A和5B中的各合格者代表HG-U95A基因芯片上的寡核苷酸探针组合。通过合格者鉴别的基因的RNA转录物可在核酸阵列杂交条件下与合格者的至少一个寡核苷酸探针(PM或完美匹配探针)杂交。较佳地，基因的RNA转录物在核酸阵列杂交条件下不与PM探针的错配探针(MM)杂交。除错配探针中心处或附近的单一同数取代外，MM探针与相应PM探针相同。对25-基体的PM探针来说，MM探针在第13个位置处具有同数碱基变化。

在许多情况下，通过合格者鉴别的基因的RNA转录物可在核酸阵列杂交条件下与这一合格者的PM探针的至少50％、60％、70％、80％、90％或100％杂交，但不与其相应MM探针杂交。在许多其他情况下，如由相应探针对的杂交强度差(亦即，PM-MM)与总杂交强度(亦即，PM+MM)的比率所度量，这些PM探针的每一个的差别计分(R)为至少0.015、0.02、0.05、、0.2、0.3、0.4、0.5或更高。又在许多其他情况下，通过合格者鉴别的基因的RNA转录物可在例如临界值Tau为0.015且显著性水平α₁为0.4的基因芯片的默认设置值下产生“存在”呼叫。参见GeneChip^Expression Analysis-DataAnalysis Fundamentals(第701190部分，第2修订本，Affymetrix，Inc.2002)，其整体内容以引用的方式併入本文中。

HG-U95A基因芯片上各PM探针的序列和从其得到PM探针的相应靶序列可获自Affymetrix序列资料库。参见，例如www.affymetrix.com/support/technical/byproduct.affx？product＝hgu133。所有这些PM探针序列和其相应靶序列均以引用的方式併入本文中。

表4A、4B、5A及5B中所列的各基因和相应单一基因ID以及Entrez入藏登记号根据HG-U95A基因芯片注解确定。单一基因包含非冗余集合的定向基因簇。认为各单一基因簇包括代表单一基因的序列。表4A、4B、5A及5B中所列的基因的其他信息可基于相应单一基因ID或Entrez入藏登记号获自美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)(Bethesda，MD)的Entrez资料库。

由HG-U95A合格者鉴别的基因也可通过对人类基因组序列资料库BLAST检索合格者的靶序列来判定。适于此目的的人类基因组序列资料库包括(但不限于)NCBI人类基因组资料库。NCBI提供诸如“blastn”的BLAST程序用于检索其序列资料库。在一个实施例中，通过使用合格者的靶序列的明确片段(例如，最长明确片段)进行NCBI人类基因组资料库的BLAST检索。将由合格者代表的基因鉴别为那些与明确片段具有显著序列一致性的基因。在许多情况下，所鉴别的基因与明确片段的序列一致性至少为95％、96％、97％、98％、99％或更高。

如本文所使用，表4A、4B、5A及5B中由合格者代表的基因不仅包括那些其中明确描述的基因，而且包括那些表格中未列出但能够与表格中的合格者的PM探针杂交的基因。所有这些基因均可用作用于RCC或其他实体肿瘤的预后的生物标志。

上述分析使用Cox成比例危险回归鉴别与临床结果TTP和TTD的连续量度相关的RCC患者的PBMC中(从基线水平)8或16周的转录水平的变化。排列分析指示16周变化与临床结果TTP和TTD之间存在显著联系，但8周PBMC转录变化与这些临床结果之间存在不太显著的联系。

PBMC中的转录变化似乎“滞后”CCI-779暴露的发现受到极大关注，因为其支持以下理论：CCI-779疗法后PBMC中的转录改变反映外周血的循环细胞对肿瘤变化的反应而非通过血液中的CCI-779指导转录改变。这一理论解释16周PBMC转录水平的变化与临床结果更显著地相关的观察结果，因为实现血液中CCI-779的稳态水平与PBMC对肿瘤变化的反应之间会存在滞后。因此，可使用根据本发明鉴别的转录物作为药物功效的早期药物基因组学指标。应注意，在大部分转录物中，其与16周的临床结果的显著联系的方向与8周的一致，但显著性低，此暗示8周PBMC中的转录模式与16周的显示类似趋势，但与所关注的临床结果的显著联系与16周不同。

在显示与疾病进展显著负面相关的增加的转录物中(亦即，当16周表达的增加值升高时，PBMC转录物与RCC患者中的越发更短的TTP相关)，存在数个所关注的观察结果。与跳跃易位断点编码的转录物同源的两个独立序列在具有更短TTP的患者的PBMC中增加。另外，20个与疾病进展负面相关的例示性转录物(表4B)中的三个编码涉及真核翻译开始和延伸的因子。这些真核翻译相关因子的鉴别受到关注，因为归因于CCI-779抑制mTOR通路，其最终抑制哺乳动物翻译。

跳跃易位断点蛋白JTB在具有快速进展时间的患者的PBMC分布中16周时急剧增加。正常蛋白编码高度保守的膜转运体蛋白，跳跃易位现象后，此产生缺乏跨膜域的截断蛋白(Hatakeyama，等人，Oncogene，18：2085-2090(1999))。在20个16周时增加与快速疾病进展显著相关的转录物中，鉴别对应于这一转录的两个独立合格者(表4B中的41833_at和41834_g_at)。这一发现暗示这些患者中的总染色体组不稳定性可出现于PBMC的替代组织中，因为RCC患者的PBMC中所度量的表达水平未必反映源自在血液中循环的转移性肾癌细胞的任何转录(Twine，等人，CANCER Res.，63：6069-6075(2003))。

就生存来说，在具有更短死亡时间的患者中，大量编码核糖体蛋白的转录物增加。展示编码核糖体蛋白的转录物的表达水平与数个研究中的淋巴细胞含量强烈相关(数据未展示)。因为淋巴细胞在具有较短TTP与较长TTP的患者之间无差异分布(数据未展示)，所以隐含疗法约4个月后，循环淋巴细胞中的转录激活可能不良预示RCC患者的总生存。因此，可使用循环淋巴细胞反应指示RCC患者中的不良预后。

预示其他时间相关临床事件的基因也可使用与Cox成比例危险模型组合的探针阵列加以鉴别。抗癌治疗期间实体肿瘤患者的外周血细胞中的这些基因的表达水平的变化统计上与患者结果显著相关。

III.RCC或其他实体肿瘤的预后

本发明的特征在于PBMC中的表达分布变化与实体肿瘤患者的临床结果相关的预后性基因。这些预后性基因可用作RCC或其他实体肿瘤的预后的替代标志。其也可用作CCI-779或其他抗癌药物的功效的药物基因组学指标。

可通过本发明评定的临床终点的实例包括(但不限于)死亡、疾病进展或其他时间相关事件。这些临床终点的合适量度包括TTP、TTD或其他时间依赖性临床量度。任何实体肿瘤或抗癌治疗均可根据本发明加以评估。

一方面，所关注的患者的预后涉及以下步骤：

检测抗癌治疗开始后所关注的患者的外周血细胞(例如，PBMC)中的一个或一个以上预后性基因的表达水平的变化；和

比较所检测的变化与参考变化。

抗癌治疗开始后，预后性基因各具有改变的表达水平，且罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的患者的PBMC中的这一改变的量值与这些患者的临床结果相关。因此，在所关注的患者中检测到的变化预示患者的临床结果。

所关注的患者的基因表达变化可从任何参考点起度量，且在适当相关模型(例如，Cox模型或诸如最近邻体分析的基于等级的相关性量度)下，罹患相同实体肿瘤的患者中从某点起度量的表达水平的变化与这些患者的临床结果相关。在许多实施例中，所关注的患者的预后性基因的表达水平的变化通过度量抗癌治疗开始后特定时间所关注的患者的外周血中基因表达水平与预后性基因的基线表达水平之间的改变来判定。

可选择确定所关注的患者的基因表达变化所使用的特定时间以使此段时间所度量的变化与患者结果之间在排列分析下存在显著相关性。排列分析评估所观察到的显著性检验的数目将在无风险的零假设下出现的频率。在一实例中，选择特定时间以使预定α置信水平(例如，0.05、0.01、0.005或更低)下名义上显著相关的数目等于或超过所观察到数目的排列百分率低于10％、5％、1％、0.5％或更低。在一非限定性实例中，特定时间为抗癌治疗开始后至少16周。也可使用抗癌治疗开始后小于16周的时间，诸如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周。

在许多实施例中，所关注的患者的预后所使用的参考变化为参考患者的基因表达变化。参考患者罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的抗癌治疗。参考患者也可为Cox成比例危险模型或另一相关模型所使用的“虚拟”患者。参考变化可使用与所关注的患者的相同或相当的方法来确定。所关注的患者的变化与参考变化之间的差值暗示所关注的患者与参考患者相比的相对预后。参考变化和所关注的患者的变化可同时或相继确定。

在一个实施例中，所关注的患者与参考患者均罹患RCC且这两种患者接受相同抗癌治疗(例如，CCI-779疗法)。所关注的患者和参考患者的基因表达的变化通过度量治疗开始后特定时间(例如，16周)各患者的外周血细胞中的一个或一个以上预后性基因的表达水平与预后性基因的基线表达水平之间的改变来确定。在Cox成比例危险模型下，接受相同抗癌治疗的RCC患者的PBMC中的这些改变的量值与这些患者的临床结果相关。

当预后性基因具有大于1的危险比率时，与参考患者相比所关注的患者的外周血细胞中较高的基因表达水平变化指示与参考患者相比所关注的患者的较差预后。相反地，与参考患者相比，所关注的患者的较小变化指示所关注的患者的较佳预后。

当预后性基因具有小于1的危险比率时，与参考患者相比所关注的患者的外周血细胞中较高的基因表达水平变化指示所关注的患者的较佳预后。相反地，所关注的患者的较小变化指示所关注的患者的较差预后。

适于此目的的预后性基因包括(但不限于)表4A、4B、5A及5B中所描绘的那些基因。选自表4A和4B中的基因可用于评定所关注的患者的相对TTP，而选自表5A和5B中的基因可用于评估所关注的患者的相对TTD。

也可使用其他预后性基因。在许多实施例中，本发明中所使用的各预后性基因展示抗癌治疗(例如，CCI-779疗法)开始后RCC患者的PBMC中表达水平的变化与这些患者的临床结果之间的统计上显著的相关性。在许多情况下，这一相关性的p值为至多0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001或更低。预后性基因的危险比率可为至多0.5、0.33、0.25、0.2、0.1或更低。危险比率也可为至少2、3、4、5、10或更高。

在许多实施例中，所关注的患者的预后所使用的参考变化具有经验上或实验上确定的值。如果所关注的患者的表达水平变化大于或小于经验上或实验上确定的值，那么视所关注的患者具有不良或良好预后。举例来说，当预后性基因具有小于1(或大于1)的危险比率时，所关注的患者的外周血细胞中基因的表达水平从基线的变化超过经验上确定的值的观察结果预示所关注的患者的良好(或不良)预后。

在一个实施例中，经验上或实验上确定的值代表抗癌治疗开始后特定时间参考患者的外周血细胞(例如，PBMC)中预后性基因的表达水平与基线表达水平之间的平均变化。用于此目的的合适平均法包括(但不限于)算术平均、调和平均、绝对值平均、log转换值平均或加权平均。参考患者罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗。在许多情况下，参考患者包含具有类似预后(例如，良好、中等或不良预后)的患者。

本发明的特征在于使用单变量或多变量Cox模型以用于所关注的患者的预后。单变量Cox分析(例如，等式(5))提供一个预测因子一个单位变化的时间相关事件(例如，死亡或疾病进展)的相对风险。在许多实施例中，预测因子代表抗癌治疗开始后实体肿瘤患者的外周血细胞中预后性基因的表达水平的变化。如上所述，可选择将所关注的患者划分到处于临界值的不同预后群组中，其中具有临界值以上的表达水平变化的患者具有较高风险，且具有临界值以下的表达水平变化的患者具有较低风险，或反之亦然，视基因是不良(RR＞1)还是良好(RR＜1)预后的指标而定。另外，模型拟合可提供基线危险H₀(t)或系数β的估计，从而能够更定量地评定所关注的患者的临床结果。由单变量Cox分析鉴别的预后性基因可个别或组合用于所关注的患者的预后。

在多变量Cox模型(例如，等式(1))中，可使用线性预测因子PI作为所关注的患者预后的风险指数。在许多情况下，多变量Cox模型可通过将各个别基因逐步输入模型中来建立，其中所输入的第一基因係预选自那些具有显著单变量p值的基因，且选择用于在各随后步骤输入模型中的基因为最佳改进模型对资料的拟合的基因。

可用训练集(training set)计算风险指数值的分布从而确定适当的割点来区分高风险和低风险。可检查割点的连续统。使用风险指数函数和训练集中所估计的高/低风险割点，可计算各检验实例的风险指数值且用于将所关注的患者指定为高或低风险群组。

在许多实施例中，预测所关注的患者的临床结果的精度(亦即，正确呼叫与正确和不正确呼叫的总和的比率)为至少50％、60％、70％、80％、90％或更高。临床结果预测的效力也可通过灵敏性和特异性度量。在许多实施例中，本发明中所使用的预后性基因的灵敏性和特异性为至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。此外，基于外周血的预后可与其他临床证据组合以提高最终临床结果预测的精度。

可使用多种血样类型确定所关注的患者或参考患者的基因表达变化。适于此目的血样的实例包括(但不限于)全血样品或包含高浓度PBMC的样品。也可使用其他血样，且患者结果与这些血样的基因表达变化之间存在统计上显著的相关性。

大量方法可用于检测所关注的血样中的基因表达水平。举例来说，基因的表达水平可通过度量基因的RNA转录的水平来确定。出于此目的的合适方法包括(但不限于)定量RT-PCT、RNA印迹法(Northern Blot)、原位杂交、狭缝印迹(slot-blotting)、核酸酶保护分析或核酸阵列(包括微珠阵列)。基因的表达水平也可通过度量基因所编码的多肽的水平来确定。出于此目的的合适方法包括(但不限于)免疫分析(诸如ELISA、RIA、FACS或蛋白印迹(Western Blot))、双向凝胶电泳(2-dimensional gelelectrophoresis)、质谱或蛋白质阵列。

一方面，通过度量外周血样中基因的RNA转录水平来确定预后性基因的表达水平。可使用多种方法将RNA从外周血样中分离。例示性方法包括异硫氰酸胍/酸酚法、TRIZOLReagent(Invitrogen)或Micro-FastTrack^TM 2.0或FastTrack^TM 2.0mRNAIsolation Kits(Invitrogen)。所分离的RNA可为总RNA或mRNA。所分离的RNA可扩增到cDNA或cRNA，随后检测或定量。扩增可为特异性的或非特异性的。合适的扩增方法包括(但不限于)逆转录酶PCR(RT-PCR)、等温扩增、连接酶链反应及Qβ复制酶。

在一个实施例中，扩增方案使用逆转录酶。可使用逆转录酶及由寡聚d(T)和编码噬菌体T7启动子的序列组成的引物将所分离的mRNA逆向转录为cDNA。所产生之cDNA为单链。使用与分解DNA/RNA杂合体的核糖核酸酶(RNase)组合的DNA聚合酶合成cDNA的第二条链。双链cDNA合成后，添加T7RNA聚合酶且然后从双链cDNA的第二条链转录cRNA。可通过与经标记的探针杂交检测或定量扩增的cDNA或cRNA。扩增过程期间也可标记cDNA或cRNA且然后检测或定量。

在另一实施例中，可使用定量RT-PCR(诸如TaqMan，ABI)检测或比较所关注的预后性基因的RNA转录水平。定量RT-PCR涉及将RNA逆转录(RT)为cDNA，接着相对定量PCR(RT-PCR)。

在PCR中，扩增的靶DNA的分子数目每个反应周期增加近两倍直到某试剂变得有限。此后，扩增速率变得逐渐减弱直到周期之间不存在扩增靶的增加。如果以周期数为X轴且扩增靶DNA的浓度log为Y轴作曲线图，那么通过连接作图点可形成具有特征形态的曲线。从第一周期起，线的斜率为正且为恒定的。此称为曲线的线性部分。某试剂变得有限后，线的斜率开始减小且最终变为0。此时，扩增靶DNA的浓度变得渐近某一固定值。此称为曲线的平坦部分。

PCR的线性部分中靶DNA的浓度与PCR开始之前靶的起始浓度成比例。通过测定已完成相同周期数且处于线性范围内的PCR反应中的靶DNA的PCR产物的浓度，有可能确定原始DNA混合物中特异性靶序列的相对浓度。如果DNA混合物为由从不同组织或细胞分离RNA所合成的cDNA，那么可测定各组织或细胞的从其得到靶序列的特异性mRNA的相对丰度。在PCR反应的线性范围部分，PCR产物的浓度与相对mRNA丰度之间确实成正比例关系。

曲线平坦部分中靶DNA的最终浓度通过反应混合物中可用的试剂来确定且与靶DNA的原始浓度无关。因此，在一个实施例中，当PCR反应处于其曲线的线性部分时，进行扩增PCR产物的取样及定量。另外，可使可扩增的cDNA的相对浓度归一化为某可基于内部存在的RNA物质或外部引入的RNA物质的独立标准物。特定mRNA物质的丰度亦可相对于样品中所有mRNA物质的平均丰度确定。

在一个实施例中，PCR扩增利用大致与靶一样丰富的PCR内标物。如果在PCR扩增的线性阶段期间取样其产物，那么这一策略有效。如果当反应接近平坦阶段时，取样产物，那么不太丰富的产物可能变得相对过量。许多不同RNA样品的相对丰度的比较以使所呈现的RNA的相对丰度的差值小于实际上的差值的方式变得不正常，当就差异表达检查RNA样品时通常就是这样。如果内标物比靶丰富得多，那么此可改进。如果内标物比靶丰富，那么可进行RNA样品之间的直接线性比较。

临床样品的固有问题在于其具有可变的数量或质量。如果用内标物执行相对定量RT-PCR，那么这一问题可得以克服，其中内标物为比靶cDNA片段大的可扩增的cDNA片段且其中编码内标物的mRNA的丰度比编码靶的mRNA高约5-100部。这一分析度量相对丰度，而不是各自mRNA物质的绝对丰度。

在另一实施例中，相对定量RT-PCR使用外标物方案。在这一方案中，在PCR产物扩增曲线的线性部分取样PCR产物。各靶cDNA片段的取样最佳PCR周期数可凭经验确定。另外，从各种样品分离的各RNA群的逆转录酶产物可归一化为等浓度的可扩增cDNA。虽然经验确定cDNA制剂的扩增曲线和归一化的线性范围是冗长且耗时的过程，但在某些情况下，所得RT-PCR分析可能优于那些源自用内标物相对定量RT-PCR的分析。

在又一实施例中，可使用核酸阵列(包括微珠阵列)检测或比较所关注的预后性基因的表达分布。核酸阵列可为商业寡核苷酸或cDNA阵列。其也可为包含用于本发明的预后性基因的浓探针的定制阵列。在许多实例中，本发明的定制阵列上至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多的总探针为用于RCC或其他实体肿瘤预后性基因的探针。这些探针可在严格或核酸阵列杂交条件下与相应预后性基因的RNA转录物或其补体杂交。

如本文所使用，“严格条件”至少与(例如)表6中所展示的条件G-L一样严格。“高度严格条件”至少与表6中所展示的条件A-F一样严格。杂交在杂交条件(杂交温度和缓冲液)下进行约4小时，接着在相应洗涤条件(洗涤温度和缓冲液)下进行两次20分钟的洗涤。

表6.严格条件

严格条件	聚核苷酸杂合体	杂合体长度(bp)1	杂交温度和缓冲液H	洗涤温度和缓冲液H
					A	DNA:DNA	＞50	65℃；1×SSC或42℃；1×SSC，50％甲醯胺	65℃；0.3×SSC
B	DNA:DNA	＜50	TB *；1×SSC	TB *；1×SSC
					C	DNA:RNA	＞50	67℃；1×SSC或45℃；1×SSC，50％甲醯胺	67℃；0.3×SSC
D	DNA:RNA	＜50	TD *；1×SSC	TD *；1×SSC
					E	RNA:RNA	＞50	70℃；1×SSC或50℃；1×SSC，50％甲醯胺	70℃；0.3×SSC
F	RNA:RNA	＜50	TF *；1×SSC	TF *；1×SSC
					G	DNA:DNA	＞50	65℃；4×SSC或42℃；4×SSC，50％甲醯胺	65℃；1×SSC
H	DNA:DNA	＜50	TH *；4×SSC	TH *；4×SSC
					I	DNA:RNA	＞50	67℃；4×SSC或45℃；4×SSC，50％甲醯胺	67℃；1×SSC
J	DNA.-RNA	＜50	TJ *；4×SSC	TJ *；4×SSC
					K	RNA:RNA	＞50	70℃；4×SSC或50℃；4×SSC，50％甲醯胺	67℃；1×SSC
L	RNA.-RNA	＜50	TL *；2×SSC	TL *；2×SSC

¹：杂合体长度为杂交聚核苷酸的杂交区所预期的长度。当将聚核苷酸与未知序列的靶聚核苷酸杂交时，假定杂合体长度为杂交聚核苷酸的长度。当杂交已知序列的聚核苷酸时，杂合体长度可通过比对聚核苷酸的序列且鉴别具有最佳序列互补性的区加以确定。

^H：杂交和洗涤缓冲液中，可用SSPE(1×SSPE为0.15M NaCl、10mM NaH₂PO₄和1.25mM EDTA(pH 7.4))代替SSC(1×SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)。

T_B ^*-T_R ^*：预期长度小于50个碱基对的杂交的杂交温度应小于杂合体的熔融温度(T_m)5-10℃，其中T_m根据以下等式确定。对长度小于18个碱基对的杂合体来说，T_m(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(G+C碱基的#)。对长度在18个与49个碱基对之间的杂合体来说，T_m(℃)＝81.5+16.6(log₁₀[Na⁺]+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂合体中碱基的数目，且[Na⁺]为杂交缓冲液中钠离子的摩尔浓度(1×SSC的[Na⁺]＝0.165M)。

在一实例中，本发明的核酸阵列包括至少2、5、10或更多个不同探针。这些探针中的每一个均能够在严格或核酸阵列杂交条件下与本发明的各个不同预后性基因(例如，选自表4A、4B、5A和5B的基因)杂交。可使用相同预后性基因的多个探针。核酸阵列的探针密度可在任何范围内。

本发明的预后性基因的探针可为DNA、RNA、PNA或其经修饰形式。各探针中的核苷酸残基可为天然存在的残基(诸如脱氧腺苷酸、脱氧胞苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胸苷酸、腺苷酸、胞苷酸、鸟苷酸及尿苷酸)或能够形成想要的碱基对关系的合成产生的类似物。这些类似物的实例包括(但不限于)氮和去氮嘧啶类似物、氮和去氮嘌呤类似物和其他杂环碱基类似物，其中嘌呤和嘧啶环的一个或一个以上碳和氮原子经诸如氧、硫、硒及磷的杂原子取代。类似地，探针的聚核苷酸主链可为天然存在的(诸如通过5′到3′的键)或经修饰的。举例来说，核苷酸单元可经由诸如5′到2′的键的非典型键连接，只要键不干扰杂交。另一实例，可使用肽核酸，其中构成碱基通过肽键而非磷酸二酯键结合。

预后性基因的探针可与核酸阵列上的离散区稳定连接。“稳定连接”意谓杂交和信号检测期间探针相对于所连接的离散区保持其位置。核酸阵列上各离散区的位置可为已知的或可测定的。可使用所属领域中已知的任何方法制造本发明的核酸阵列。

在另一实施例中，可使用核酸酶保护分析定量外周血样中的RNA转录水平。存在许多不同版本的核酸酶保护分析。这些核酸酶保护分析的共同特征在于其涉及使反义核酸与待定量的RNA杂交。然后用分解单链核酸比分解双链分子更有效的核酸酶分解所得的杂交双链分子。分解生存的反义核酸的量为待定量的靶RNA物质的量的量度。合适核酸酶保护分析的实例包括由Ambion，Inc.(Austin，Texas)提供的核糖核酸酶保护分析。

本发明的预后性基因的杂交探针或扩增引物可通过使用所属领域中已知的任何方法制备。对染色体组位置尚未确定或一致性仅基于EST或mRNA资料的预后性基因来说，这些基因的探针/引物可源自相应合格者的靶序列或相应EST或mRNA序列。

在一个实施例中，预后性基因的探针/引物显著偏离其他预后性基因的序列。此可通过对照诸如NCBI的Entrez资料库的人类基因组序列资料库检查潜在探针/引物序列来实现。适于此目的的一种算法为BLAST算法。这一算法涉及首先通过在询问序列中鉴别长度W的短字来确定高计分序列对(HSP)，当短字与资料库序列中的相同长度的字比对时，匹配或符合某个正值临界值计分T。T称作邻近字计分临界值。最初邻近字匹配充当引发寻找含有其的更长HSP的检索的开端。然后沿各序列双向延伸字匹配以增加累积比对计分。对核苷酸序列使用参数M(一对匹配残基获得计分；总＞0)和N(错配残基处罚计分；总＜0)计算累积计分。BLAST算法参数W、T及X确定比对的灵敏性和速度。如所属领域的技术人员所了解，这些参数可随不同目的而调整。

另一方面，通过度量预后性基因所编码的多肽的水平确定本发明的预后性基因的表达水平。适于此目的的方法包括(但不限适于)免疫分析(诸如ELISA、RIA、FACS、点印迹、蛋白印迹)、免疫组织化学及基于抗体的放射成像。另外，可使用高产量蛋白定序、双向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱或蛋白阵列。

在一个实施例中，使用ELISA检测靶蛋白的水平。在例示性ELISA中，将能够与靶蛋白结合的抗体固定在所选择的展示蛋白亲和性的表面上，诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯微量滴定板的孔。然后，将待测试的样品添加到孔中。结合且洗涤以移除非特异性结合的免疫复合体后，可检测所结合的抗原。检测可通过添加对靶蛋白具有特异性且与可检测标记联结的第二抗体实现。检测也可通过添加第二抗体，接着添加对第二抗体具有结合亲和性的第三抗体实现，其中第三抗体与可检测标记联结。在样品中的细胞添加到微量滴定板之前，可将其溶解或萃取以从潜在性干扰物质中分离靶蛋白。

在另一例示性ELISA中，将怀疑含有靶蛋白的样品固定于孔表面上且然后与抗体接触。结合且洗涤以移除非特异性结合的免疫复合体后，检测所结合的抗原。当最初抗体与可检测标记联结时，可直接检测免疫复合体。也可使用对第一抗体具有结合亲和性的第二抗体检测免疫复合体，其中第二抗体与可检测标记联结。

另一例示性ELISA涉及在检测中使用抗体竞争。在这一ELISA中，将靶蛋白固定在孔表面。将经标记的抗体添加到孔中，使其与靶蛋白结合且借助于其标记检测。然后，通过在与涂布孔一起培养之前或期间将样品与标记抗体混合测定未知样品中靶蛋白的量。未知样品中的靶蛋白的存在作用于减少可与孔结合获得的抗体的量，且从而降低最终信号。

不同ELISA格式可具有某些共同特征，诸如涂布、培养或结合、洗涤以移除非特异性结合的物质和检测所结合的免疫复合体。举例来说，在用抗原或抗体涂布板期间，可将板的孔与抗原或抗体溶液一起培养整夜或数小时的特定时间。然后，洗涤板的孔以移除不完全吸附的物质。然后，用对测试样品来说为抗原性中性的非特异性蛋白“涂布”孔的任何剩余可用表面。这些非特异性蛋白的实例包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白及奶粉溶液。涂布可阻断固定表面上的非特异性吸附部位且因此降低由表面上抗血清的非特异性结合引起的本底(background)。

在ELISA中，可使用第二或第三检测方法。在蛋白或抗体与孔结合，用非反应性物质涂布以降低本底，以及洗涤以移除未结合的物质后，使固定表面与待测试的对照或临床或生物样品在有效允许免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下接触。这些条件可包括(例如)用诸如BSA、牛γ球蛋自(BGG)及磷酸盐缓冲盐水(PBS)/Tween的溶液稀释抗原和抗体，以及在室温下将抗体和抗原培养约1到4小时或在4℃培养整夜。通过使用经标记的第二结合配位体或抗体或第二结合配位体或抗体与经标记的第三抗体或第三结合配位体的组合使得免疫复合体的检测变得方便。

紧跟着ELISA中所有培养步骤，可洗涤接触表面以移除非复合的物质。举例来说，可用诸如PBS/Tween或硼酸酯缓冲液的溶液洗涤表面。测试样品与最初结合的物质之间形成特异性免疫复合体且随后洗涤后，可测定存在的免疫复合体的量。

为提供检测方法，第二或第三抗体可具有相关标记以允许检测。在一个实施例中，标记为与适当发色底物一起培养后产生显色的酶。因此，例如，使第一或第二免疫复合体与尿素酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶或过氧化氢酶结合的抗体接触且将两者可在有利于进一步形成免疫复合体的条件下一起培养一段时间(例如，在室温下在诸如PBS-Tween的含PBS的溶液中培养2小时)。

在与经标记的抗体一起培养且随后洗涤以移除未结合的物质后，可(例如)通过与诸如尿素和溴甲酚紫或2，2′-叠氮基-二-(3-乙基)-苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)和H₂O₂(在过氧化酶的情况下，作为酶标记)的发色底物一起培养来定量标记的量。可通过(例如)使用分光光度计度量所产生的色度实现定量。

适于检测多肽水平的另一方法为RIA(放射免疫分析)。例示性RIA基于经放射性标记的多肽与未标记的多肽之间与有限数量的抗体结合的竞争。合适的放射性标记包括(但不限于)I¹²⁵。在一个实施例中，将固定浓度的经I¹²⁵标记的多肽与一系列对多肽具有特异性的抗体的稀释液一起培养。当将未标记的多肽添加到系统中时，与抗体结合的I¹²⁵多肽的量减少。因此，可构造标准曲线以代表随未标记的多肽的浓度变化的抗体结合的I¹²⁵多肽的量。由这一标准曲线，可确定未知样品中多肽的浓度。执行RIA的方案在所属领域中为熟知的。

本发明的合适抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人化抗体、单链抗体、Fab片段或通过Fab表达库产生的片段。也可使用中和抗体(亦即，那些抑制二聚体形成的抗体)。制备这些抗体的方法在所属领域中为熟知的。在一个实施例中，本发明的抗体可与相应预后性基因产物或其他想要的抗原以至少10⁴M^-1、10⁵M^-1、10⁶M^-1、10⁷M^-1或更高的结合亲和性结合。

本发明的抗体可用一个或一个以上可检测部分标记以允许检测抗体-抗原复合体。可检测部分可包括可通过光谱法、酶法、光化学法、生物化学法、生物电子法、免疫化学法、电法、光学法或化学法检测的组合物。可检测部分包括(但不限于)放射性同位素、化学发光化合物、经标记的结合蛋白、重金属原子、诸如荧光标记以及染料的光谱标记、磁标记、联结酶、质谱标记、自旋标记、电子转移供体和受体等等。

本发明的抗体可用作构造检测预后性基因的表达分布的蛋白阵列的探针。制造蛋白阵列或生物芯片的方法在所属领域中为熟知的。在许多实施例中，本发明的蛋白阵列上的探针的本质部分为对预后性基因产物具有特异性的抗体。举例来说，蛋白阵列上的至少10％、20％、30％、40％、50％或更多探针可为对预后性基因产物具有特异性的抗体。

又一方面，通过度量这些基因的生物功能或活性来确定预后性基因的表达水平。当已知预后性基因的生物功能或活性时，可开展合适的活体外或活体内分析来评估这一功能或活性。接着，可使用这些分析来评定预后性基因的表达水平。

本发明中所使用的基因表达水平可为绝对水平、归一化水平或相对水平。合适的归一化进程包括(但不限于)那些常规核酸阵列分析中所使用的进程或那些由Hill等人在Genome Biol，2：research0055.1-0055.13(2001)中所述的进程。在一实例中，使表达水平归一化以致平均值为0且标准偏差为1。在另一实例中，使表达水平基于内部或外部对照归一化。在又一实例中，使表达水平相对于一个或一个以上在血样中具有已知丰度的对照转录物归一化。在许多实施例中，使用相同或相当的方法学确定用于评定所关注的患者和参考患者的基因表达变化的表达水平。

本发明的特征也在于适用于RCC或其他实体肿瘤的预后的电子系统。这些系统包括用于接收或计算所关注的实体肿瘤患者的基因表达变化和参考表达变化的输入或计算装置。参考表达变化也可存储在资料库或另一媒体中，且可通过本发明的电子系统取回。所关注的患者的基因表达变化与参考表达变化之间的比较可诸如通过处理器或计算机来电子化执行。在许多实施例中，系统也包括或能够从另一资源(例如，互联网服务器)下载的一个或一个以上程序，诸如Cox模型、k-最近邻体分析或加权投票算法。这些程序可用于比较所关注的患者的基因表达变化与参考变化，或用于使实体肿瘤患者的基因表达变化与这些患者的临床结果相关。在一实例中，本发明的电子系统耦连于核酸阵列以接收或处理由阵列所产生的表达资料。

又一方面，本发明提供适用于RCC或其他实体肿瘤的预后的试剂盒。各试剂盒包括至少一个用于RCC或实体肿瘤预后性基因(例如，选自表4A、4B、5A或5B的基因)的探针或大体上由其组成。也可包括有助于试剂盒使用的试剂或缓冲液。本发明中可使用任何类型的探针，诸如杂交探针、扩增引物、抗体或其他高亲和性结合剂。

在一个实施例中，本发明的试剂盒包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个聚核苷酸探针或引物或大体上由其组成。可使各探针/引物在严格或核酸阵列杂交条件下与不同实体肿瘤预后性基因(诸如选自表4A、4B、5A或5B的那些基因)杂交。如本文所使用，如果聚核苷酸可与基因的RNA转录物或其补体杂交，那么聚核苷酸可与基因杂交。

在另一实施例中，本发明的试剂盒包括一个或一个以上抗体或大体上由其组成，其中各抗体均能够与由不同实体肿瘤预后性基因(诸如，那些选自表4A、4B、5A或5B的基因)编码的多肽结合。

本发明中所使用的探针可经标记或未标记。经标记的探针可通过光谱法、光化学法、生物化学法、生物电子法、免疫化学法、电法、光学法、化学法或其他合适方法检测。用于探针的例示性标记部分包括放射性同位素、化学发光化合物、经标记的结合蛋白、重金属原子、诸如荧光标记以及染料的光谱标记、磁标记、联结酶、质谱标记、自旋标记、电子转移供体和受体等。

本发明的试剂盒也可具有含有缓冲液或报导基因构件的容器。另外，试剂盒可包括执行阳性或阴性对照的试剂。在一个实施例中，本发明中所使用的探针稳定地与一个或一个以上底物支撑物连接。核酸杂交或免疫分析可直接在底物支撑物上进行。出于此目的的合适底物支撑物包括(但不限于)玻璃、二氧化硅、陶瓷、尼龙、石英晶片、凝胶、金属、纸、微珠、管、纤维、胶片、膜、管柱基质或微量滴定板孔。在许多实施例中，本发明的试剂盒中至少5％、10％、20％、30％、40％、50％或更多的总探针为用于实体肿瘤预后性基因的探针。

另一方面，本发明的特征在于使用罗吉斯回归、ANOVA(方差分析)、ANCOVA(协方差分析)、MANOVA(方差多重分析)或其他用于所关注的患者的实体肿瘤的预后的相关法或统计法。这些方法包含：

检测抗癌治疗期间特定时间所关注的患者的外周血细胞中至少一个实体肿瘤预后性基因的表达水平；和

将表达水平输入相关模型或统计模型中以确定所关注的患者的预后。

相关模型或统计模型定义罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的患者的PBMC中实体肿瘤预后性基因的表达水平与这些患者的临床结果之间的统计上显著的相关性。在许多实例中，相关模型或统计模型能够产生所关注的患者的临床结果的定性预测(例如，良好或不良预后)。适合此目的的统计模型或分析包括(但不限于)罗吉斯回归或基于等级的相关性量度。在许多其他实例中，相关模型或统计模型能够产生所关注的患者的临床结果的定量预测(例如，估计TTD或TTP)。适于这一目的的统计模型或分析包括(但不限于)多种回归、ANOVA或ANCOVA模型。

用于建立相关模型/统计模型或预测所关注的患者的表达水平可为从基线或从相应患者治疗开始后另一特定参考时间点起度量的相对表达水平。也可使用绝对表达水平建立相关模型/统计模型或预测所关注的患者。在后一种情况中，可使用基线或另一特定参考时间的表达水平作为预测模型中的协变量。

IV.抗癌治疗功效的评估

本发明允许个性化治疗RCC或其他实体肿瘤。可在抗癌治疗期间预测所关注的患者。良好的预后指示治疗可继续，而不良预后暗示治疗可停止且应使用不同方法治疗患者。这一分析帮助患者避免不必要的不利反应。此也提供改进的安全性和增加的治疗效益/风险比。

在一个实施例中，在CCI-779疗法期间预测所关注的RCC患者。适于此目的的预后性基因包括(但不限于)表4A、4B、5A及5B中所描绘的那些基因。所关注的患者的外周血细胞中这些预后性基因的表达水平的变化可通过使用RT-PCR、ELISA、核酸阵列、蛋白阵列、蛋白质功能分析或其他合适方法确定。将这些变化与参考变化比较以确定所关注的患者的预后。良好预后指示CCI-779治疗适用于所关注的RCC患者。

任何类型的抗癌治疗均可由本发明评估。在一个非限定性实例中，抗癌治疗为药物疗法。抗癌药物的实例包括(但不限于)细胞激素，诸如干扰素或介白素2；和化学疗法药物，诸如CCI-779、AN-238、长春碱(vinblastine)、氟尿苷(floxuridine)、5-氟尿嘧啶或他莫昔芬(tamoxifen)。AN238为具有与生长抑素(SST)载剂八肽连接的2-吡咯啉并阿霉素(2-pyrrolinodoxorubicin)的细胞毒素剂。AN238可标靶RCC肿瘤细胞表面上的SST受体。化学疗法药物可个别使用或与其他药物、细胞激素或疗法组合使用。另外，也可使用单克隆抗体、抗血管生成药物或抗生长因子药物治疗RCC或其他实体肿瘤。

抗癌治疗也可为手术。适用于RCC的手术选择包括(但不限于)根治性肾切除术(radical nephrectomy)、部分肾切除(partial nephrectomy)、转移的移除(removal ofmetastases)、动脉栓塞术(arterial embolization)、腹腔镜肾切除术(laparoscopicnephrectomy)、刀冷冻术(cryoablation)和保留肾单位手术(nephron-sparing surgery)。此外，可使用放射、基因疗法、免疫疗法、过继性免疫疗法或其他常规或实验疗法治疗实体肿瘤。

应了解上述实施例及其后实例以说明的方式而非限定性方式给出。由本发明说明书，本发明的范畴内的多种变化和修改对所属领域的技术人员来说将变得显而易见。

V.实例

实例1.PBMC和RNA的纯化

在CCI-779疗法开始之前及疗法8或16周后从RCC患者收集全血。将血样抽取到CPT Vacutainer细胞制备管(Cell Preparation Vacutainer Tube)(Becton Dickinson)中。对各样品来说，目标体积为8ml。根据制造商的方案(Becton Dickinson)经菲科尔梯度(Ficoll gradient)分离PBMC。将PBMC小球存储在-80℃下直到加工样品用于RNA。

使用QIA切碎机和Qiagen Rneasy^迷你试剂盒执行RNA纯化。将样品采集在含0.1％β-巯基乙醇的RLT溶解缓冲液(Qiagen，Valencia，CA，USA)中且使用RNeasy迷你试剂盒(Qiagen，Valencia，CA，USA)加工用于总RNA分离。使用96孔板UV读数器在A260/280下监测来定量洗脱的RNA。通过琼脂糖凝胶电泳以2％琼脂糖凝胶核对RNA的质量(波段为18S和28S)。将剩余RNA存储在-80℃下直到加工用于Affymetrix基因芯片杂交。

实例2.RNA扩增和基因芯片杂交探针的产生

使用Lockhart等人在NATURE Biotechnology，14：1675-1680(1996)中所述的程序的修正制备寡核苷酸阵列的经标记的靶。使用在5′末端含有T7DNA聚合酶启动子的寡聚-d(T)24引物使2微克总RNA转化为cDNA。将cDNA用作模板用于使用T7DNA聚合酶试剂盒(Ambion，Woodlands，TX，USA)和经生物素标记的CTP和UTP(Enzo，Farmingdale，NY，USA)活体外转录。使经标记的cRNA在94℃下在40mM Tris-乙酸盐(pH 8.0)、100mM KOAc、30mM MgOAc中以40mL的最终体积成为碎片历时35分钟。将10微克经标记的靶以具有100mg/mL鲱鱼精DNA和50mg/mL乙酰化BSA的IX MES缓冲液稀释。为相对彼此归一化阵列且估计寡核苷酸阵列的灵敏性，如Hill等人在Genome Biol.，2：research0055.1-0055.13(2001)中所述，在各杂交反应中包括11个细菌基因的活体外合成转录物。这些转录物的丰度以每总转录物的对照转录物的数目为单位陈述在1∶300000(3ppm)到1∶1000(1000ppm)范围内。如这些对照转录物的信号反应所判定，阵列的检测灵敏性介于每百万份2.33与4.5复本之间的范围内。

使经标记的序列在99℃下变性5分钟且然后在45℃下变性5分钟且与由大量人类基因组成的寡核苷酸阵列(HG-U95A或HG-U133A，Affymetrix，Santa Clara，CA，USA)杂交。在以60rpm旋转下，使阵列在45℃下杂交16小时。杂交后，移出且存储杂交混合物，洗涤阵列且使用GeneChip Fluidics Station 400用抗生蛋白链菌素R-藻红素(分子探针(Molecular Probe))染色且按照制造商的说明书用Hewlett Packard GeneArrayScanner扫描。这些杂交及洗涤条件共同称为“核酸阵列杂交条件”。

实例3.基因表达频率的测定和表达资料的处理

使用Affymetrix MicroArray Suite软件(MAS)处理阵列图像以使用MAS的桌面版本将通过阵列扫描机产生的原始阵列图像资料(.dat)文件变为探针特征水平的强度概述(.eel文件)。使用基因表达资料系统(GEDS)作为图形用户界面，用户提供表达分布信息和知识系统(EPIKS)奥雷克尔资料库(Oracle database)的样品描述且使修正.eel文件与描述相关联。资料库处理然后调用MAS软件产生探针集概述值；对各探针集使用Affymetrix Average Difference算法和Affymetrix Absolute Detection量度(不存在、存在或临界)概述每次信息的探针强度。也使用MAS通过将截尾均值调整为值100首过归一化。资料库处理也会计算一系列芯片质量控制量度且将所有原始资料和质量控制计算值存储于资料库中。

使用MAS软件(Affymetrix)以原始荧光强度值执行数据分析和不存在/存在呼叫测定。通过基于与本底相比的基因信号的强度估计样品中是否检测到转录物由MAS软件计算“存在”呼叫。使用成比例频率归一化法(Hill，等人，Genome Biol，2：research0055.1-0055.13(2001))使各转录物的“平均差”值归一化为“频率”值，其中使用示踪于各杂交溶液中的具有已知丰度的11个对照cKNA的平均差值产生总校正曲线。然后，使用这一校正将所有转录物的平均差值转化为在1∶300,000(约百万分之3(ppm))到1∶1000(1000ppm)范围内的以百万分之几为单位陈述的频率估计值。归一化将各芯片的平均差值归为由示踪于各杂交溶液中的具有已知丰度的11个对照转录的平均差值所构造的校正曲线。在许多情况中，归一化法利用截尾均值归一化，接着拟合遍及所有芯片的汇集标准曲线，这一曲线用于计算“频率”值和每芯片的灵敏性估计。所得量度称为成比例频率且在所有阵列之间归一化。

由资料比较排除并不具有任何相关信息的基因。在无疾病PBMC与RCC PBMC的比较中，此使用两个资料简化过滤器实现：1)从资料集中移除所有GeneChip中呼叫为不存在(如由MAS中的Affymetrix Absolute Detection量度所判定)的任何基因；2)从资料集中移除所有GeneChip中以＜10ppm的归一化频率表达的任何基因以确保分析集中所保留的任何基因以至少10ppm的频率检测至少一次。执行这些过滤步骤后，分析中的探针集的总数目为5,469。对一些多变量预测分析来说，使用更严格的资料简化过滤器(P为25％且平均频率＞5ppm)以减小鉴别低水平或不经常检测到的转录物的似然性。

实例4.异常样品的基于皮尔逊评定(Pearson′s-Based Assessment)

为鉴别异常样品，使用Splus(5.1版本)计算所有样品对中的成对皮尔逊相关系数的平方(r2)。具体来说，由表达值的G×S矩阵开始计算，其中G为探针集的总数目且S为样品的总数目。计算这一矩阵中样品间的r2值。结果为r2值的对称S×S矩阵。这一矩阵度量各样品与分析中的所有其他样品之间的类似性。因为所有这些样品均来自根据共同方案采集的人类PBMC，所以通常期望相关系数揭示高度的类似性(亦即，大部分转录序列的表达水平在所分析的所有样品中类似)。为概述样品的类似性，计算研究中各样品与其他样品的所有MAS信号之间的r2值的平均值且在热图中作曲线图以有助于快速观测。平均值r2的值越接近于1，样品与分析中的其他样品越类似。低平均r2值指示样品的基因表达分布对总基因表达模式来说为“异常值”。异常状况可指示样品具有显著偏离分析中的其他样品的基因表达分布或样品的技术质量为低质量。

实例5.临床研究方案概述

从参与II期研究的20位无疾病志愿者(12位女性和8位男性)和45位肾细胞癌瘤患者(18位女性和27位男性)的外周血中分离PBMC。收到临床研究的药物基因组学部分的同意书且项目得到参与临床场所的地方伦理审查委员会(Institutional ReviewBoard)批准。将RCC肿瘤在各场所分类为常规(透明细胞)癌(24)、颗粒状(1)、乳头状(3)或混合亚型(7)。10个肿瘤的分类不能确定。也通过多变量Motzer评定法计分签署基线PBMC表达分布的药物基因组学分析的书面同意书的45位患者。加入这一研究的同意的患者中，在这一研究中，6位指定为良好风险评定，17位患者拥有中等风险计分且22位患者收到不良预后分类。

用CCI-779的三种剂量(25mg、75mg或250mg)中的一种治疗罹患晚期RCC病例的患者，试验整段时间内每周一次投与30分钟的CCI-779静脉内输液。治疗之前及CCI-779疗法开始后每8周记录残余、复发性或转移性疾病的临床病期及尺寸。肿瘤尺寸以厘米度量且报导为最长直径与其垂直直径的乘积。可度量疾病定义为通过CT扫描、X射线或触诊这两个直径均大于1.0cm的任何二维可度量病变。肿瘤反应(完全反应、部分反应、微小反应、疾病稳定或疾病进展)通过所有可度量病变的垂直直径的乘积的和判定。本发明药物基因组学研究中所使用的两个主要临床结果量度为进展时间(TTP)和生存或死亡时间(TTD)。TTP定义为最初CCI-779治疗日期到度量疾病进展的第一天或经检查称为无进展的最后日期之间的间隔。生存或TTD定义为最初CCI-779治疗的日期到死亡时间或经检查为已知活着的最后日期之间的间隔。

实例6.统计分析

使用Eisen等人，Proc Natl Acad Sci U.S.A.，95：14863-14868(1998)的进程执行基于表达分布类似性的基因和/或阵列的无监督分级聚类。在这些分析中，仅使用那些经过非严格资料简化过滤器的转录物(至少1个存在呼叫，整个资料集中至少1个大于或等于10ppm的频率)。使表达资料进行log转换且标准化以使平均值为0且方差为1，且使用具有非中心相关类似性量度的平均联接聚类法(average linkage clustering)产生分级聚类结果。

为用完全时程鉴别所有CCI-779治疗患者中随时间变化的转录物(n＝21)，使用标准ANOVA且计算各时间点(基线、8周、16周)之间的平均倍数变化。

为鉴别展示与临床结果相关的变化的转录物，使用Spearman秩相关性计算各转录物的临床结果的连续量度(TTP和TTD)与从基线到8到16周的基因表达的变化之间的相关性。也使用Cox成比例危险回归模型用临床结果的检查量度(TTP、TTD)评定基线和8或16周之间的基因表达资料的改变。

通过卡普兰-迈耶分析(Kaplan Meier analysis)评定各组患者的生存资料，且使用Wilcoxon检验建立显著性。

本发明的上述描述提供对本发明的说明和描述，但不希望详尽本发明或将本发明局限于所揭示的精确实例中。修改和改变可能与以上教示一致或可从本发明的实践中获得。因此，应注意本发明的范畴由权利要求书和其等价物界定。

Claims (20)

1.一种用于所关注的患者的实体肿瘤的预后或评估所关注的患者的实体肿瘤的治疗效力的方法，所述方法包含：

检测所关注的患者治疗期间所述患者的外周血细胞中至少一个基因的表达水平变化，其中在相关模型下，罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的患者的所述变化与所述患者的临床结果相关；和

将所关注的患者的所述变化与参考变化加以比较，

其中所关注的患者的所述变化与所述参考变化之间的差值指示所关注的患者的所述实体肿瘤的预后或治疗效力。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述相关模型为Cox成比例危险模型(Coxproportional hazards model)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述实体肿瘤为RCC且所述治疗包含CCI-779疗法。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所关注的患者的所述变化为所关注的患者的治疗开始后特定时间所述患者的外周血细胞中所述至少一个基因的表达水平与所关注的患者的外周血细胞中所述至少一个基因的基线表达水平之间的变化，且其中所述参考变化为参考患者的治疗开始后所述特定时间时所述参考患者的外周血细胞中所述至少一个基因的表达水平与所述参考患者的外周血细胞中所述至少一个基因的基线表达水平之间的变化，所述参考患者罹患所述实体肿瘤。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述特定时间为所述治疗开始后约16周。

6.根据权利要求4所述的方法，其中所述外周血细胞包含全血细胞。

7.根据权利要求4所述的方法，其中所述外周血细胞包含高浓度(enriched)PBMC。

8.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一个基因具有小于1的危险比率，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较大值暗示所关注的患者具有比所述参考患者好的预后，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较小值暗示所关注的患者具有比所述参考患者差的预后。

9.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一个基因具有大于1的危险比率，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较大值暗示所关注的患者具有比所述参考患者差的预后，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较小值暗示所关注的患者具有比所述参考患者好的预后。

10.根据权利要求4所述的方法，其中所述至少一个基因各选自表4A、4B、5A或5B。

11.根据权利要求2所述的方法，其中所述参考变化具有凭经验或凭实验确定的值。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述实体肿瘤为RCC，且所述治疗包含CCI-779疗法，且其中所关注的患者的所述变化为所关注的患者治疗开始后特定时间时所述患者的外周血细胞中所述至少一个基因的表达水平与所述患者的外周血细胞中所述至少一个基因的基线表达水平之间的变化。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述特定时间为所述治疗开始后约16周。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个基因各选自表4A、4B、5A或5B，且所述外周血细胞包含全血细胞或高浓度PBMC。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个基因具有小于1的危险比率，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较大值暗示所关注的患者的良好预后，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较小值暗示所关注的患者的不良预后。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个基因具有大于1的危险比率，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较大值暗示所关注的患者的不良预后，且与所述参考变化相比所关注的患者的所述变化的较小值暗示所关注的患者的良好预后。

17.根据权利要求12所述的方法，其中所述参考变化为所述参考患者的治疗开始后所述特定时间时参考患者的外周血细胞中所述至少一个基因的表达水平与所述参考患者的外周血细胞中所述至少一个基因的相应基线表达水平之间的变化，所述参考患者各罹患所述实体肿瘤。

18.一种用于所关注的患者的实体肿瘤的预后或评估所关注的患者的实体肿瘤的治疗效力的方法，所述方法包含：

检测所关注的患者治疗期间所述患者的外周血细胞中两个或两个以上基因的表达分布变化，其中在相关模型下，罹患相同实体肿瘤且接受与所关注的患者相同的治疗的患者的所述变化与所述患者的临床结果相关；和

将所关注的患者的所述变化与参考变化加以比较，

其中所关注的患者的所述变化与所述参考变化之间的差值指示所关注的患者的所述实体肿瘤的预后或治疗效力。

19.一种用于所关注的患者的实体肿瘤的预后或评估所关注的患者的实体肿瘤的治疗效力的试剂盒，所述试剂盒包含一个或一个以上用于选自表4A、4B、5A或5B的基因的表达产物的探针。

20.一种鉴别实体肿瘤预后标志的方法，其包含：

在患者抗癌治疗期间，检测所述患者的外周血细胞中基因表达分布的变化，所述患者各罹患所述实体肿瘤；和

在相关模型下，鉴别所述患者的基因的所述变化与所述患者的临床结果相关。