CN101115993A

CN101115993A - 含硫的酯肽类化合物在确定adamts蛋白水解酶活性中的用途

Info

Publication number: CN101115993A
Application number: CNA2006800042898A
Authority: CN
Inventors: K-U·魏特曼; V·耶斯克
Original assignee: Sanofi Aventis SpA
Current assignee: Sanofi Aventis France; Sanofi Aventis SpA
Priority date: 2005-02-09
Filing date: 2006-02-10
Publication date: 2008-01-30
Also published as: EP1851542B1; BRPI0607059A2; CA2597862A1; DE502006006695D1; DE102005005972A1; EP1851542A1; US20090149332A1; KR20070120091A; IL184769A0; WO2006092203A1; AU2006220096A1; ATE464563T1; MX2007009380A; JP2008543273A

Abstract

本发明涉及通式R－(Xaa)_n－Pro－X－Gly－S－Y－Z－Gly－(Xaa)_m－R1(I)的含硫的酯肽类化合物作为底物在确定ADAMTS蛋白水解酶的活性中的用途，和发现ADAMTS蛋白水解酶调节剂，特别是抑制剂的方法。

Description

含硫的酯肽类化合物在确定ADAMTS蛋白水解酶活性中的用途

本发明涉及通式为R-(Xaa)_n-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa)_m-R1(I)的含硫的酯肽类化合物(thiopeptolide)作为底物用于确定ADAM-TS蛋白水解酶活性中的用途，并且涉及寻找ADAM-TS蛋白水解酶的调节剂，尤其是抑制剂的方法。

完整的关节软骨基质是人和动物体所有关节发挥功能具有决定意义的先决条件，关节软骨的损伤可以导致诸如骨关节病(骨关节炎)和风湿病等关节炎性疾病，这些疾病以患病的人或动物出现机能障碍且最终丧失活动能力为特征。

在以受损基质降解为特征的其它疾病中，还必须包括多种形式的癌症，尤其是肿瘤的转移。

已知基质金属蛋白酶(MMP)参与了软骨中的聚集蛋白聚糖和胶原的降解。这些基质金属蛋白酶包括诸如基质蛋白酶类，其包含从MMP-1、2等直到MMP-16所有已知MMP。另一类，称为ADAM-TS-家族的蛋白水解酶(Nagase，H.等人。(2003)，Arthritis Research Therapy，5，94-103)，同样在组织基质的降解中起到至关重要的作用，导致软骨基质的损伤。这些蛋白水解酶的活性，特别是ADAM-TS1、ADAM-TS4和ADAM-TS5(也称为“可聚蛋白聚糖”)，是以受损的基质降解为特征的疾病(例如骨关节病、风湿病和癌症)的病因。ADAM-TS能够特别切割蛋白聚糖，还能切割诸如乙酰透明质酸或胶原等其它基质组分。此外，ADAM-TS 1、4、5和11，还有ADAM-TS13对炎症过程、血管发生、细胞迁移和血液凝固(或凝血)至关重要(Apte，S.S.(2004)，The International Journal ofBiochemistry & Cell Biology，36，981-985)。

因此，一方面能够在有患病风险或已经患病的组织(例如软骨组织或血液中)检测与疾病有关的蛋白水解酶的酶促活性是药物研究的重要任务。而另一方面，开发能够抑制单个、多种或者所有相关蛋白水解酶的药物制剂有特别重要的意义。

通过将相应的蛋白水解酶与适当的高分子量基质组分(例如蛋白聚糖或胶原)一起孵育，并且测量降解产物的形成，可以在体外测量有关蛋白水解酶的酶(蛋白水解)活性。

本领域技术人员可以使用通常需要复杂操作的多种方法(例如特异性切割位点的抗体识别和质谱分析研究)用于分离和定量异质的降解产物，也就是说，例如胶原片段和蛋白质片段。

先前已有例如使用重组底物确定ADAM-TS 4活性的描述，所述重组底物包含天然聚集蛋白聚糖的球间结构域的重要结构组分。在COS细胞中表达该分子量为72千道尔顿的重组聚集蛋白聚糖。确定可聚蛋白聚糖的活性，在除了使用高分子量聚集蛋白聚糖分子之外，还需要更多的复杂步骤，例如结构元件CD5信号序列、M1单克隆抗体决定的FLAG表位、人IgG1的铰链区、所述重组底物的cDNA，包括其载体，如在EP 0785 274和在Hrber，Chr等人.(2000)Matrix Biology，19，533-543中所述。

聚集蛋白聚糖分子短片段的用途也已经被公开。WO 00/05256报道这些肽片段可能由20-40个氨基酸结构单元组成。但特别不利的是，聚集蛋白聚糖不能转化含有少于20个氨基酸的肽。这点已可以得到证实(见实验部分)。

为确定基质蛋白酶家族中的蛋白水解酶，根据以前的技术，将低分子量分子作为蛋白水解酶的底物切割以确定酶(蛋白水解)活性，所述低分子量分子能够较容易通过人工合成而获得，由于这些底物的特定性质，可通过切割而释放，例如一般在可见和紫外光波长范围内的可定量的光学信号。

一个众所周知的实例是(7-甲氧香豆素-4-基)乙酰-Pro-Leu-Gly-Leu-3-(2′，4′-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙酰-Ala-Arg-NH₂(Bachem，Heidelberg，德国)，由Knight，C.G.等人在(1992)FEBS，296，263-266中描述，其可以被特定的基质金属蛋白酶切割，并且因此释放可以用于计算酶活性的可测量的荧光信号。因此已经可以证实，应用蛋白水解酶MMP-3和MMP-8转化(7-甲氧香豆素-4-基)乙酰-Pro-Leu-Gly-Leu-3-(2′，4′-二硝基苯基)-L-2，3-二氨基丙酰-Ala-Arg-NH₂是可行的(见实验部分)。应用MMP-3和MMP-8转化此类型的许多其它底物也是可行的。

已经揭示了胶原酶和膜相关的基质金属蛋白酶可以转化来源于含硫的酯肽类化合物类物质的某些底物，参见EP 0149593和US 2002/0142362。但是，N端至可聚蛋白聚糖切割位点间短至16氨基酸的肽不再发生可聚蛋白聚糖切割。

一些实验中还证实了更短链的肽，即使其包含Glu-Ala序列，也可能不能被ADAM-TS切割。相反，已经发现其它蛋白水解酶家族的成员，例如基质蛋白酶或组织蛋白酶，可以切割寡肽。

这些实验中寡肽的应用特别受欢迎，因为它们可以通过化学合成容易地得到。寡肽的另一个优势是可以对单独的肽结构单元进行化学修饰，例如，也可以将其连接到那些发色团上，其允许在肽切割后可以直接或间接进行光谱测定，例如比色法。

相应地，通过比较在加入相应的蛋白水解酶抑制剂后的蛋白水解活性与在加抑制剂之前测量的活性，可以容易地确定酶抑制剂或激活剂的效应。

它的一个实例为含硫的酯肽类化合物R-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-R1(EP 0149593)，其可以被脊椎动物胶原酶切割；和乙酰-脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰-[2-巯基4-甲基-戊酰基]-亮氨酰-甘氨酰-乙基酯(US 2002/0142362)，其可以被某些基质蛋白酶切割，从而形成能够通过已知方法(如与DTNB反应)定量的游离的SH基团。

已经发现，根据本发明的通式(I)的含硫的酯肽类化合物R-(Xaa)_n-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa)_m-R1可以被ADAM-TS蛋白水解酶(特别是ADAM-TS1、ADAM-TS4、ADAM-TS5、ADAM-TS11和/或ADAM-TS13，尤其是ADAM-TS1、ADAM-TS4或ADAM-TS5)切割，并且因此能够容易地经由游离SH基团得到检测。因为现有技术报道，包含少于16个氨基酸单位的肽不能被ADAM-TS切割，这更加令人惊奇。

因此，本发明一方面涉及以下通式(I)的含硫的酯肽类化合物或其盐作为ADAM-TS蛋白水解酶底物的用途，

R-(Xaa)_n-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa)_m-R1 (I)，

其中R是H或N-保护基团，优选羧基基团，特别是C₁-C₅-烷基的羧基基团，尤其是C₁-C₃-烷基的羧基基团，特别优选乙酰基，

Xaa＝任何天然存在的氨基酸，

n、m＝相同或不同的0-2415之间的整数，优选0-35，特别是0-14，尤其是0-11，且最特别优选等于0，

X＝亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，

Z＝亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，

R₁＝末端酰胺、羧基或酯的基团，优选C₁-C₅-烷基的上述基团，特别是C₁-C₃-烷基的上述基团，尤其是乙基酯，

其中R₂是一个天然存在的氨基酸的侧链，特别是

-CH₂CH(CH₃)₂，

-CH(CH₃)C₂H₅，

-CH₂C₆H₅，

-CH(CH₃)₂，或

-CH₃。

通常，适合的N-保护集团是所有常规氨基酸的保护基团，例如Fmoc(9-氟烯基甲氧羰基)(9-fluoroenylmethyloxycarbonyl)、Mtt(4-甲基三苯甲基)、 Pmc(2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基)、tBu(叔丁基)、Boc(叔丁氧羰基)、Tos(甲苯磺酰基)、Mbzl(甲苄基)、Bom(苄氧基甲基)、2-氯-Z(2-氯苄氧羰基)或For(甲酰基)，上述可以从例如Bachem DistributionServices GmbH，Weil am Rhein获得。

特别优选的通式I的含硫的酯肽类化合物是其中

X＝亮氨酸或丙氨酸，

Z＝亮氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸，且

R₂＝-CH₂CH(CH₃)₂的含硫的酯肽类化合物。

在另一个优选的实施方案中，(Xaa)_n和/或(Xaa)_m相应于SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列，代表人聚集蛋白聚糖的氨基酸序列。

其它优选的含硫的酯肽类化合物具有如下的结构：

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Leu-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂，且Ac一般是乙酰基。

或

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂，

或

Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂，

或

Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Ala-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂。

所有已知的ADAM-TS蛋白水解酶均适合于本发明，例如ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。优选ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，特别是ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。

本发明的用途特别适合确定ADAM-TS蛋白水解酶的活性；纯化ADAM-TS蛋白水解酶；编码ADAM-TS蛋白水解酶核苷酸序列的功能性克隆；寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂；或观察与受损组织基质相关的疾病(特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症)的发生和进展。在所有这些方法中，例如在ADAM-TS蛋白水解酶的酶纯化过程中或在将编码ADAM-TS蛋白水解酶的基因克隆至常规已知的表达载体之后，最终使用所述含硫的酯肽类化合物测量ADAM-TS蛋白水解酶的活性。

本发明因此还涉及确定ADAM-TS蛋白水解酶活性的方法，其中该方法包括如下步骤：

(a)将ADAM-TS蛋白水解酶与根据通式I或以上详述的含硫的酯肽类化合物底物一起孵育，且

(b)进行ADAM-TS蛋白水解酶的活性测量或确定。

适合且优选的ADAM-TS蛋白水解酶是上文已详述的ADAM-TS蛋白水解酶。优选分光光度测定法进行活性测量或确定。

在通过分光光度测定法确定活性中，经常使用巯基的检测试剂。在这一点上，已经证明的有利的检测试剂是4，4’-二硫联吡啶，或者特别是又被称为Ellmann′s试剂的5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。但是也可以使用任何其它的巯基反应试剂，诸如碘乙酰胺，例如5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF)；马来酰亚胺，例如荧光素-5-马来酰亚胺；或诸如N，N’-双丹磺酰-L-胱氨酸或5-(溴甲基)荧光素等其它的巯基反应试剂。可以从例如Invitrogen GmbH，Karlsruhe获得这些类型的试剂。

可以使用所述含硫的酯肽类化合物在适合的测定系统中寻找特别简单的ADAM-TS蛋白水解酶调节剂。本发明的调节剂具体而言意指ADAM-TS蛋白水解酶的激活剂和ADAM-TS蛋白水解酶的抑制剂，尤其是后者。

因此，本发明的另一个方面涉及寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的方法，其中该方法包含如下步骤：

(a)在存在测试化合物的情况下，将根据通式I或上文详述的含硫的酯肽类化合物底物与ADAM-TS蛋白水解酶一起孵育，且

(b)测量或确定测试化合物对ADAM-TS蛋白水解酶活性的影响。

适合和优选的蛋白水解酶上文是已详述的ADAM-TS蛋白水解酶。优选如以上详述，通过分光光度测定法进行活性测量或确定。上文所述的化合物也适合作为巯基基团的检测试剂，特别是4，4’-二硫联吡啶或5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。

测试化合物可以是任何可能的化学的、生化的、天然存在的或合成的、高分子量或低分子量的化合物。能够以化学化合物文库的形式获得测试化合物是特别有利的，可以使用本发明的方法从所述化学化合物文库找到想要的化合物，例如测试的ADAM-TS蛋白水解酶的抑制剂。

在另一个优选的实施方案中，在特别有利于寻找和分离想要的化合物的芯片上执行本发明的方法。应用自动机械实施本发明地方法同样使其更为便利，并可以增加其通量，因此也是特别有利的。也可以使用微观流体技术，其中与小型化的板凹槽(“孔”)适当组合，使测定系统小型化且进一步自动化，这同样也是特别有利的。本方法通常用于ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，尤其是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的高通量筛选。

基于本发明的方法，本发明另一个方面涉及药物的制备。其包括如下步骤：

(a)实施上述方法以寻找ADAM-TS调节剂，特别是抑制剂，

(b)分离在步骤(a)中发现的适合的测试物质，并且

(c)将步骤(b)中分离的测试物质与一种或多种药用可接受的载体或佐剂一起配制。

使用本发明方法发现的药物活性的化合物，优选抑制剂，特别适合与受损组织基质相关疾病(特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症)的治疗。

通常用于药物制剂的所有已知试剂作为药物可接受的载体或佐剂都是适合的。

实例为氯化钠溶液，具体为等渗的盐溶液(浓度为0.9％的氯化钠溶液)、脱矿质水、稳定剂(例如蛋白水解酶抑制剂或核酸酶抑制剂，优选抑酶肽、ε-氨基己酸或胃酶抑制剂A)或掩蔽剂例如EDTA、凝胶制剂例如白凡士林、低粘度石蜡和/或黄蜡，由施用模式而定。

其他合适的添加剂有，诸如洗涤剂，例如triton X-100或脱氧胆酸钠；还有多元醇，例如聚乙二醇或甘油；糖例如蔗糖或葡萄糖；两性离子化合物诸如氨基酸，例如甘氨酸或牛磺酸或甜菜碱(特别是后二者)；和/或蛋白质，例如牛血清清蛋白或人血清清蛋白。特别优选洗涤剂、多元醇和/或两性离子化合物。

生理缓冲溶液优选具有约6.0-8.0的PH值，特别是约为6.8-7.8的PH值，尤其是约为7.4的PH值和/或约为200-400毫渗透分子/升的摩尔渗透压浓度，优选约为290-310毫渗透分子/升。通常使用适当的有机缓冲液或无机缓冲液调节药物的PH值，例如，优选使用磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。一般根据需要的缓冲液的摩尔浓度选择恰当缓冲液。例如磷酸盐缓冲液是适合用作注射和灌输的溶液。

本发明的另一方面是试剂盒，其基于根据通式I或如上文所详述的本发明的含硫的酯肽类化合物底物和上文所述的ADAM-TS蛋白水解酶，且其中包含合适的一种或多种缓冲液，例如TNCB缓冲液(见实施例)。该缓冲液作为实施本发明方法的稳定介质或反应介质。试剂盒优选额外包含巯基基团检测试剂，例如至少一种上文所述的检测试剂，特别是4，4’-二硫联吡啶或者5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。本试剂盒的另一个组分可以是用于执行本发明方法，特别是活性测定的使用说明。

下列陈述和实施例旨在详细解释本发明，而非限制：

序列表

SEQ ID NO：1相应于根据通式(I)的含硫的酯肽类化合物

SEQ ID NO：2代表聚集蛋白聚糖核心蛋白前体(软骨特异性蛋白聚糖核心蛋白(CSPCP)或硫酸软骨素蛋白聚糖核心蛋白1)的氨基酸序列。

实施例

实施例1(比较实施例)

测定条件

人类重组体MMP-3和MMP-8蛋白，MMP-3cd和MMP-8cd的催化结构域可以从例如Biomol International L.P.Pennsylvania，USA商购，分类号分别是SE-109和SE-255。同样可以从例如Invitek，Gesellschaft fürBiotechnik & Biodesign mbH，Berlin，德国买到ADAM-TS1和ADAM-TS4蛋白水解酶的截短形式，分类号分别是30400402和30400102。

缓冲液和溶液的制备

TNCB缓冲液：

100mM三羟甲基氨基甲烷，用盐酸调PH值至7.5

100mM NaCl

10mM CaCl₂·2H₂O

0.015％Brij 35

底物溶液：

10mM底物(见表)溶于DMSO中。使用之前立即用130μL的H₂O稀释2μL的底物贮存液。

酶溶液：

用TNCB缓冲液稀释MMP-3cd(2.3μg/mL)、MMP-8cd(0.6μg/mL)、ADAMTS-1(2.3μg/mL)和ADAMTS-4(3.3μg/mL)。

测定操作：

10μL的酶溶液与10μL的H₂O混合，然后加入10μL的底物溶液开始反应。

荧光分析

在TECAN Spectrafluor Plus荧光仪中测量荧光；激发/发射(见表)。要求每次测量荧光5分钟。

比较实施例1的结果

	+：观测5分钟以上的光学信号增强
	+：观测5分钟以上的光学信号增强						荧光物质		λ_激发/λ_发射	ADAMTS-4	ADAMTS-1	MMP-3cd	MMP-8cd
Dnp-P-L-G-L-W-A-R-NH₂	Bachem：M-1855	280/355	-	-	+	-	荧光物质		λ_激发/λ_发射	ADAMTS-4	ADAMTS-1	MMP-3cd	MMP-8cd
Dnp-P-L-G-L-W-A-R-NH₂	Bachem：M-1855	280/355	-	-	+	-	Mca-G-K-P-I-L-F-F-R-L-K-(Dnp)-R-NH₂	Sigma：M-0938	330/390	-	-	+	-
Mca-P-L-A-Q-A-V-Dap(Dnp)-R-S-S-S-R-NH₂	Bachem：M-2255/R&D：ES003	330/390	-	-	+	-	Mca-G-K-P-I-L-F-F-R-L-K-(Dnp)-R-NH₂	Sigma：M-0938	330/390	-	-	+	-
Mca-P-L-A-Q-A-V-Dap(Dnp)-R-S-S-S-R-NH₂	Bachem：M-2255/R&D：ES003	330/390	-	-	+	-	Mca-P-L-G-L-Dap(Dnp)-A-R-NH₂	Bachem：M-1895	330/390	-	-	+	+
Mca-P-β-环己基-A-G-Nva-H-A-Dpa-NH₂	Calbiochem：444235	330/390	-	-	+	+	Mca-P-L-G-L-Dap(Dnp)-A-R-NH₂	Bachem：M-1895	330/390	-	-	+	+
Mca-P-β-环己基-A-G-Nva-H-A-Dpa-NH₂	Calbiochem：444235	330/390	-	-	+	+	Mca-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K-(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2110/R&D：ES002	330/390	-	-	+	-
Mca-R-P-L-A-L-W-R-Dap(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2390	330/390	-	-	+	+	Mca-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K-(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2110/R&D：ES002	330/390	-	-	+	-

	+：观测5分钟以上的光学信号增强
	+：观测5分钟以上的光学信号增强						Mca-P-L-A-C(Mob)-W-A-R-Dap(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2510	330/390	-	-	+	+
Mca-R-P-K-P-Y-A-Nva-Met-K(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2105	330/390	-	-	+	+	Mca-P-L-A-C(Mob)-W-A-R-Dap(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2510	330/390	-	-	+	+
Mca-R-P-K-P-Y-A-Nva-Met-K(Dnp)-NH₂	Bachem：M-2105	330/390	-	-	+	+	Mca-P-L-A-Nva-Dap(Dnp)-A-R-NH₂	Bachem：M-2520	330/390	-	-	+	+
NBD-eAhx-R-P-K-P-L-A-Nva-W-K(DMACA)-NH₂	Bachem：M-2300	350/465	-	-	+	+	Mca-P-L-A-Nva-Dap(Dnp)-A-R-NH₂	Bachem：M-2520	330/390	-	-	+	+
NBD-eAhx-R-P-K-P-L-A-Nva-W-K(DMACA)-NH₂	Bachem：M-2300	350/465	-	-	+	+	Dnp-P-β-环己基-A-G-C(Me)-H-A-K-(N-Me-Abz)-NH₂	Bachem：M-2055	365/450	-	-	+	+

如所预期的，且与本技术水平一致，MMP底物不被ADAMTS转化。

实施例2

缓冲液和溶液的制备

TNCB缓冲液(见实施例1)

酶溶液：

ADAMTS(Invitek，Gesellschaft für Biotechnik & Biodesign mbH，Berlin，德国)

用2200μL的TNCB缓冲液稀释5μg的ADAMTS-1，并且用600μL的TNCB缓冲液稀释5μg的ADAMTS-1。

底物溶液：

1)DTNB溶液(5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸))：

制备溶于DMSO中的浓度为40mM的贮存液：

用522μL的水稀释27.5μL的DTNB贮存液。

2)含硫的酯肽类化合物溶液(Bachem Distribution Services GmbH，Weil am Rhein，德国)：

制备溶于DMSO中的浓度为100mM的贮存液。使用时，用500μL的TNCB缓冲液稀释55μL的含硫的酯肽类化合物贮存液。

使用之前，立即将550μL的DNTB与550μL的含硫的酯肽类化合物混合。

测定操作

在96多孔板(半面平板、平底、透明、聚苯乙烯平板，No.3695)(CorningCostar，Acton，美国)中进行测量。

将10μL的酶溶液与10μL的H₂O混合，然后加入10μL的底物溶液起始反应。

比色分析

微量滴定板光度计：Molecular Devices Sunnyvale，美国，SpectraMax190。在415nm波长观测光吸收5分钟。

实施例2的结果

Ellman′s反应中的比色底物		.(nm)	ADAMTS-4	ADAMTS-1	MMP-3cd	MMP-8cd
Ellman′s反应中的比色底物		.(nm)	ADAMTS-4	ADAMTS-1	MMP-3cd	MMP-8cd	Ac-P-L-G-[(S)-2-巯基-4-甲基戊酰基]-L-G-OEt	Bachem：H-7145	415	+	+	+	+
Ac-P-L-A-[(S)-2-巯基-戊酰基]-W-NH₂	Bachem：H-1326	415	-	-	+	+	Ac-P-L-G-[(S)-2-巯基-4-甲基戊酰基]-L-G-OEt	Bachem：H-7145	415	+	+	+	+

化合物1Bachem：H-7145	化合物2(比较例)Bachem：H-1326
化合物1Bachem：H-7145	化合物2(比较例)Bachem：H-1326	(同物异名)	(同物异名)
Ac-P-L-G-^SL-L-G-OEt	Ac-P-L-A-^SNva-W-NH₂	(同物异名)	(同物异名)
Ac-P-L-G-^SL-L-G-OEt	Ac-P-L-A-^SNva-W-NH₂	Ac-P-L-G-[(S)-2-巯基-4-甲基-戊酰基]-L-G-OEt	Ac-P-L-A-[(S)-2-巯基戊酰基]-W-NH₂
Ac-P-L-G-Sch[CH₂CH(CH₃)₂]-CO-L-G-OC₂H₅	Ac-P-L-A-[2-巯基戊酰基]-W-NH₂	Ac-P-L-G-[(S)-2-巯基-4-甲基-戊酰基]-L-G-OEt	Ac-P-L-A-[(S)-2-巯基戊酰基]-W-NH₂
Ac-P-L-G-Sch[CH₂CH(CH₃)₂]-CO-L-G-OC₂H₅	Ac-P-L-A-[2-巯基戊酰基]-W-NH₂	Ac-P-L-G-[2-巯基-4-甲基-戊酰基]-L-G-O C₂H₅

化合物1的结构式

化合物2的结构式(比较例)

化合物2不被ADAMTS转化。而令人惊讶的是，化合物1被ADAMTS转化。

SEQ ID NO：1

Xaa-Pro-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly-Xaa

SEQ ID NO：2

1 MTTLLWVFVT LRVITAAVTV ETSDHDNSLS VSIPQPSPLR VLLGTSLTIP CYFIDPMHPV

61 TTAPSTAPLA PRIKWSRVSK EKEVVLLVAT EGRVRVNSAY QDKVSLPNYP AIPSDATLEV

121 QSLRSNDSGV YRCEVMHGIE DSEATLEVVV KGIVFHYRAI STRYTLDFDR AQRACLQNSA

181 IIATPEQLQA AYEDGFHQCD AGWLADQTVR YPIHTPREGC YGDKDEFPGV RTYGIRDTNE

241 TYDVYCFAEE MEGEVFYATS PEKFTFQEAA NECRRLGARL ATTGHVYLAW QAGMDMCSAG

301 WLADRSVRYP ISKARPNCGG NLLGVRTVYV HANQTGYPDP SSRYDAICYT GEDFVDIPEN

361 FFGVGGEEDI TVQTVTWPDM ELPLPRNITE GEARGSVILT VKPIFEVSPS PLEPEEPFTF

421 APEIGATAFA EVENETGEAT RPWGFPTPGL GPATAFTSED LVVQVTAVPG QPHLPGGVVF

481 HYRPGPTRYS LTFEEAQQAC PGTGAVIASP EQLQAAYEAG YEQCDAGWLR DQTVRYPIVS

541 PRTPCVGDKD SSPGVRTYGV RPSTETYDVY CFVDRLEGEV FFATRLEQFT FQEALEFCES

601 HNATATTGQL YAAWSRGLDK CYAGWLADGS LRYPIVTPRP ACGGDKPGVR TVYLYPNQTG

661 LPDPLSRHHA FCFRGISAVP SPGEEEGGTP TSPSGVEEWI VTQVVPGVAA VPVEEETTAV

721 PSGETTAILE FTTEPENQTE WEPAYTPVGT SPLPGILPTW PPTGAETEES TEGPSATEVP

781 SASEEPSPSE VPFPSEEPSP SEEPFPSVRP FPSVELFPSE EPFPSKEPSP SEEPSASEEP

841 YTPSPPEPSW TELPSSGEES GAPDVSGDFT GSGDVSGHLD FSGQLSGDRA SGLPSGDLDS

901 SGLTSTVGSG LTVESGLPSG DEERIEWPST PTVGELPSGA EILEGSASGV GDLSGLPSGE

961 VLETSASGVG DLSGLPSGEV LETTAPGVED ISGLPSGEVL ETTAPGVEDI SGLPSGEVLE

1021 TTAPGVEDIS GLPSGEVLET TAPGVEDISG LPSGEVLETT APGVEDISGL PSGEVLETAA

1081 PGVEDISGLP SGEVLETAAP GVEDISGLPS GEVLETAAPG VEDISGLPSG EVLETAAPGV

1141 EDISGLPSGE VLETAAPGVE DISGLPSGEV LETAAPGVED ISGLPSGEVL ETAAPGVEDI

1201 SGLPSGEVLE TAAPGVEDIS GLPSGEVLET AAPGVEDISG LPSGEVLETA APGVEDISGL

1261 PSGEVLETAA PGVEDISGLP SGEVLETTAP GVEEISGLPS GEVLETTAPG VDEISGLPSG

1321 EVLETTAPGV EEISGLPSGE VLETSTSAVG DLSGLPSGGE VLEISVSGVE DISGLPSGEV

1381 VETSASGIED VSELPSGEGL ETSASGVEDL SRLPSGEEVL EISASGFGDL SGVPSGGEGL

1441 ETSASEVGTD LSGLPSGREG LETSASGAED LSGLPSGKED LVGSASGDLD LGKLPSGTLG

1501 SGQAPETSGL PSGFSGEYSG VDLGSGPPSG LPDFSGLPSG FPTVSLVDST LVEVVTASTA

1561 SELEGRGTIG ISGAGEISGL PSSELDISGR ASGLPSGTEL SGQASGSPDV SGEIPGLFGV

1621 SGQPSGFPDT SGETSGVTEL SGLSSGQPGV SGEASGVLYG TSQPFGITDL SGETSGVPDL

1681 SGQPSGLPGF SGATSGVPDL VSGTTSGSGE SSGITFVDTS LVEVAPTTFK EEEGLGSVEL

1741 SGLPSGEADL SGKSGMVDVS GQFSGTVDSS GFTSQTPEFS GLPSGIAEVS GESSRAEIGS

1801 SLPSGAYYGS GTPSSFPTVS LVDRTLVESV TQAPTAQEAG EGPSGILELS GAHSGAPDMS

1861 GEHSGFLDLS GLQSGLIEPS GEPPGTPYFS GDFASTTNVS GESSVAMGTS GEASGLPEVT

1921 LITSEFVEGV TEPTISQELG QRPPVTHTPQ LFESSGKVST AGDISGATPV LPGSGVEVSS

1981 VPESSSETSA YPEAGFGASA APEASREDSG SPDLSETTSA FHEANLERSS GLGVSGSTLT

2041 FQEGEASAAP EVSGESTTTS DVGTEAPGLP SATPTASGDR TEISGDLSGH TSQLGVVIST

2101 SIPESEWTQQ TQRPAETHLE IESSSLLYSG EETHTVETAT SPTDASIPAS PEWKRESEST

2161 AAAPARSCAE EPCGAGTCKE TEGHVICLCP PGYTGEHCNI DQEVCEEGWN KYQGHCYRHF

2221 PDRETWVDAE RRCREQQSHL SSIVTPEEQE FVNNNAQDYQ WIGLNDRTIE GDFRWSDGHP

2281 MQFENWRPNQ PDNFFAAGED CVVMIWHEKG EWNDVPCNYH LPFTCKKGTV ACGEPPVVEH

2341 ARTFGQKKDR YEINSLVRYQ CTEGFVQRHM PTIRCQPSGH WEEPRITCTD ATTYKRRLQK

2401 RSSRHPRRSR PSTAH

序列表

<110>塞诺菲-安万特股份有限公司

<120>含硫的酯肽类化合物在确定ADAMTS蛋白水解酶活性中的用途

<130>DE 2005/006

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>8

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：肽

<400>1

Xaa Pro Xaa Gly Xaa Xaa Gly Xaa

1 5

<210>2

<211>2415

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Thr Thr Leu Leu Trp Val Phe Val Thr Leu Arg Val Ile Thr Ala

1 5 10 15

Ala Val Thr Val Glu Thr Ser Asp His Asp Asn Ser Leu Ser Val Ser

20 25 30

Ile Pro Gln Pro Ser Pro Leu Arg Val Leu Leu Gly Thr Ser Leu Thr

35 40 45

Ile Pro Cys Tyr Phe Ile Asp Pro Met His Pro Val Thr Thr Ala Pro

50 55 60

Ser Thr Ala Pro Leu Ala Pro Arg Ile Lys Trp Ser Arg Val Ser Lys

65 70 75 80

Glu Lys Glu Val Val Leu Leu Val Ala Thr Glu Gly Arg Val Arg Val

85 90 95

Asn Ser A1a Tyr Gln Asp Lys Val Ser Leu Pro Asn Tyr Pro Ala Ile

100 105 110

Pro Ser Asp Ala Thr Leu Glu Val Gln Ser Leu Arg Ser Asn Asp Ser

115 120 125

Gly Val Tyr Arg Cys Glu Val Met His Gly Ile Glu Asp Ser Glu Ala

130 135 140

Thr Leu Glu Val Val Val Lys Gly Ile Val Phe His Tyr Arg Ala Ile

145 150 155 160

Ser Thr Arg Tyr Thr Leu Asp Phe Asp Arg Ala Gln Arg Ala Cys Leu

165 170 175

Gln Asn Ser Ala Ile Ile Ala Thr Pro Glu Gln Leu Gln Ala Ala Tyr

180 185 190

Glu Asp Gly Phe His Gln Cys Asp Ala Gly Trp Leu Ala Asp Gln Thr

195 200 205

Val Arg Tyr Pro Ile His Thr Pro Arg Glu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys

210 215 220

Asp Glu Phe Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Ile Arg Asp Thr Asn Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Ala Glu Glu Met Glu Gly Glu Val Phe

245 250 255

Tyr Ala Thr Ser Pro Glu Lys Phe Thr Phe Gln Glu Ala Ala Asn Glu

260 265 270

Cys Arg Arg Leu Gly Ala Arg Leu Ala Thr Thr Gly His Val Tyr Leu

275 280 285

Ala Trp Gln Ala Gly Met Asp Met Cys Ser Ala Gly Trp Leu Ala Asp

290 295 300

Arg Ser Val Arg Tyr Pro Ile Ser Lys Ala Arg Pro Asn Cys Gly Gly

305 310 315 320

Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Val His Ala Asn Gln Thr Gly

325 330 335

Tyr Pro Asp Pro Ser Ser Arg Tyr Asp Ala Ile Cys Tyr Thr Gly Glu

340 345 350

Asp Phe Val Asp Ile Pro Glu Asn Phe Phe Gly Val Gly Gly Glu Glu

355 360 365

Asp Ile Thr Val Gln Thr Val Thr Trp Pro Asp Met Glu Leu Pro Leu

370 375 380

Pro Arg Asn Ile Thr Glu Gly Glu Ala Arg Gly Ser Val Ile Leu Thr

385 390 395 400

Val Lys Pro Ile Phe Glu Val Ser Pro Ser Pro Leu Glu Pro Glu Glu

405 410 415

Pro Phe Thr Phe Ala Pro Glu Ile Gly Ala Thr Ala Phe Ala Glu Val

420 425 430

Glu Asn Glu Thr Gly Glu Ala Thr Arg Pro Trp Gly Phe Pro Thr Pro

435 440 445

Gly Leu Gly Pro Ala Thr Ala Phe Thr Ser Glu Asp Leu Val Val Gln

450 455 460

Val Thr Ala Val Pro Gly Gln Pro His Leu Pro Gly Gly Val Val Phe

465 470 475 480

His Tyr Arg Pro Gly Pro Thr Arg Tyr Ser Leu Thr Phe Glu Glu Ala

485 490 495

Gln Gln Ala Cys Pro Gly Thr Gly Ala Val Ile Ala Ser Pro Glu Gln

500 505 510

Leu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Tyr Glu Gln Cys Asp Ala Gly Trp

515 520 525

Leu Arg Asp Gln Thr Val Arg Tyr Pro Ile Val Ser Pro Arg Thr Pro

530 535 540

Cys Val Gly Asp Lys Asp Ser Ser Pro Gly Val Arg Thr Tyr Gly Val

545 550 555 560

Arg Pro Ser Thr Glu Thr Tyr Asp Val Tyr Cys Phe Val Asp Arg Leu

565 570 575

Glu Gly Glu Val Phe Phe Ala Thr Arg Leu Glu Gln Phe Thr Phe Gln

580 585 590

Glu Ala Leu Glu Phe Cys Glu Ser His Asn Ala Thr Ala Thr Thr Gly

595 600 605

Gln Leu Tyr Ala Ala Trp Ser Arg Gly Leu Asp Lys Cys Tyr Ala Gly

610 615 620

Trp Leu Ala Asp Gly Ser Leu Arg Tyr Pro Ile Val Thr Pro Arg Pro

625 630 635 640

Ala Cys Gly Gly Asp Lys Pro Gly Val Arg Thr Val Tyr Leu Tyr Pro

645 650 655

Asn Gln Thr Gly Leu Pro Asp Pro Leu Ser Arg His His Ala Phe Cys

660 665 670

Phe Arg Gly Ile Ser Ala Val Pro Ser Pro Gly Glu Glu Glu Gly Gly

675 680 685

Thr Pro Thr Ser Pro Ser Gly Val Glu Glu Trp Ile Val Thr Gln Val

690 695 700

Val Pro Gly Val Ala Ala Val Pro Val Glu Glu Glu Thr Thr Ala Val

705 710 715 720

Pro Ser Gly Glu Thr Thr AlaIle Leu Glu Phe Thr Thr Glu Pro Glu

725 730 735

Asn Gln Thr Glu Trp Glu Pro Ala Tyr Thr Pro Val Gly Thr Ser Pro

740 745 750

Leu Pro Gly Ile Leu Pro Thr Trp Pro Pro Thr Gly Ala Glu Thr Glu

755 760 765

Glu Ser Thr Glu Gly Pro Ser Ala Thr Glu Val Pro Ser Ala Ser Glu

770 775 780

Glu Pro Ser Pro Ser Glu Val Pro Phe Pro Ser Glu Glu Pro Ser Pro

785 790 795 800

Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Val Arg Pro Phe Pro Ser Val Glu Leu

805 810 815

Phe Pro Ser Glu Glu Pro Phe Pro Ser Lys Glu Pro Ser Pro Ser Glu

820 825 830

Glu Pro Ser Ala Ser Glu Glu Pro Tyr Thr Pro Ser Pro Pro Glu Pro

835 840 845

Ser Trp Thr Glu Leu Pro Ser Ser Gly Glu Glu Ser Gly Ala Pro Asp

850 855 860

Val Ser Gly Asp Phe Thr Gly Ser Gly Asp Val Ser Gly His Leu Asp

865 870 875 880

Phe Ser Gly Gln Leu Ser Gly Asp Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly

885 890 895

Asp Leu Asp Ser Ser Gly Leu Thr Ser Thr Val Gly Ser Gly Leu Thr

900 905 910

Val Glu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Asp Glu Glu Arg Ile Glu Trp Pro

915 920 925

Ser Thr Pro Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Gly Ala Glu Ile Leu Glu

930 935 940

Gly Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu

945 950 955 960

Val Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro

965 970 975

Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser

980 985 990

Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu

995 1000 1005

Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro

1010 1015 1020

Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr

1025 1030 1035 1040

Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val

1045 1050 1055

Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser

1060 1065 1070

Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly

1075 1080 1085

Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp

1090 1095 1100

Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly

1105 1110 1115 1120

Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala

1125 1130 1135

Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu

1140 1145 1150

Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly

1155 1160 1165

Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu

1170 1175 1180

Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile

1185 1190 1195 1200

Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val

1205 1210 1215

Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Ala Ala

1220 1225 1230

Pro Gly Val Glu AspIle Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu

1235 1240 1245

Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu

1250 1255 1260

Val Leu Glu Thr Ala Ala Pro Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro

1265 1270 1275 1280

Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Glu Glu Ile Ser

1285 1290 1295

Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro Gly Val Asp

1300 1305 1310

Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr Thr Ala Pro

1315 1320 1325

Gly Val Glu Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Gly Glu Val Leu Glu Thr

1330 1335 1340

Ser Thr Ser Ala Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu

1345 1350 1355 1360

Val Leu Glu Ile Ser Val Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro

1365 1370 1375

Ser Gly Glu Val Val Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ile Glu Asp Val Ser

1380 1385 1390

Glu Leu Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Glu

1395 1400 1405

Asp Leu Ser Arg Leu Pro Ser Gly Glu Glu Val Leu Glu Ile Ser Ala

1410 1415 1420

Ser Gly Phe Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu

1425 1430 1435 1440

Glu Thr Ser Ala Ser Glu Val Gly Thr Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser

1445 1450 1455

Gly Arg Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Glu Asp Leu Ser

1460 1465 1470

Gly Leu Pro Ser Gly Lys Glu Asp Leu Val Gly Ser Ala Ser Gly Asp

1475 1480 1485

Leu Asp Leu Gly Lys Leu Pro Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly Gln Ala

1490 1495 1500

Pro Glu Thr Ser Gly Leu Pro Ser Gly Phe Ser Gly Glu Tyr Ser Gly

1505 1510 1515 1520

Val Asp Leu Gly Ser Gly Pro Pro Ser Gly Leu Pro Asp Phe Ser Gly

1525 1530 1535

Leu Pro Ser Gly Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Ser Thr Leu Val

1540 1545 1550

Glu Val Val Thr Ala Ser Thr Ala Ser Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr

1555 1560 1565

Ile Gly Ile Ser Gly Ala Gly Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Ser Glu

1570 1575 1580

Leu Asp Ile Ser Gly Arg Ala Ser Gly Leu Pro Ser Gly Thr Glu Leu

1585 1590 1595 1600

Ser Gly Gln Ala Ser Gly Ser Pro Asp Val Ser Gly Glu Ile Pro Gly

1605 1610 1615

Leu Phe Gly Val Ser Gly Gln Pro Ser Gly Phe Pro Asp Thr Ser Gly

1620 1625 1630

Glu Thr Ser Gly Val Thr Glu Leu Ser Gly Leu Ser Ser Gly Gln Pro

1635 1640 1645

Gly Val Ser Gly Glu Ala Ser Gly Val Leu Tyr Gly Thr Ser Gln Pro

1650 1655 1660

Phe Gly Ile Thr Asp Leu Ser Gly Glu Thr Ser Gly Val Pro Asp Leu

1665 1670 1675 1680

Ser Gly Gln Pro Ser Gly Leu Pro Gly Phe Ser Gly Ala Thr Ser Gly

1685 1690 1695

Val Pro Asp Leu Val Ser Gly Thr Thr Ser Gly Ser Gly Glu Ser Ser

1700 1705 1710

Gly Ile Thr Phe Val Asp Thr Ser Leu Val Glu Val Ala Pro Thr Thr

1715 1720 1725

Phe Lys Glu Glu Glu Gly Leu Gly Ser Val Glu Leu Ser Gly Leu Pro

1730 1735 1740

Ser Gly Glu Ala Asp Leu Ser Gly Lys Ser Gly Met Val Asp Val Ser

1745 1750 1755 1760

Gly Gln Phe Ser Gly Thr Val Asp Ser Ser Gly Phe Thr Ser Gln Thr

1765 1770 1775

Pro Glu Phe Ser Gly Leu Pro Ser Gly Ile Ala Glu Val Ser Gly Glu

1780 1785 1790

Ser Ser Arg Ala Glu Ile Gly Ser Ser Leu Pro Ser Gly Ala Tyr Tyr

1795 1800 1805

Gly Ser Gly Thr Pro Ser Ser Phe Pro Thr Val Ser Leu Val Asp Arg

1810 1815 1820

Thr Leu Val Glu Ser Val Thr Gln Ala Pro Thr Ala Gln Glu Ala Gly

1825 1830 1835 1840

Glu Gly Pro Ser Gly Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ala His Ser Gly Ala

1845 1850 1855

Pro Asp Met Ser Gly Glu His Ser Gly Phe Leu Asp Leu Ser Gly Leu

1860 1865 1870

Gln Ser Gly Leu Ile Glu Pro Ser Gly Glu Pro Pro Gly Thr Pro Tyr

1875 1880 1885

Phe Ser Gly Asp Phe Ala Ser Thr Thr Asn Val Ser Gly Glu Ser Ser

1890 1895 1900

Val Ala Met Gly Thr Ser Gly Glu Ala Ser Gly Leu Pro Glu Val Thr

1905 1910 1915 1920

Leu Ile Thr Ser Glu Phe Val Glu Gly Val Thr Glu Pro Thr Ile Ser

1925 1930 1935

Gln Glu Leu Gly Gln Arg Pro Pro Val Thr His Thr Pro Gln Leu Phe

1940 1945 1950

Glu Ser Ser Gly Lys Val Ser Thr Ala Gly Asp Ile Ser Gly Ala Thr

1955 1960 1965

Pro Val Leu Pro Gly Ser Gly Val Glu Val Ser Ser Val Pro Glu Ser

1970 1975 1980

Ser Ser Glu Thr Ser Ala Tyr Pro Glu Ala Gly Phe Gly Ala Ser Ala

1985 1990 1995 2000

Ala Pro Glu Ala Ser Arg Glu Asp Ser Gly Ser Pro Asp Leu Ser Glu

2005 2010 2015

Thr Thr Ser Ala Phe His Glu Ala Asn Leu Glu Arg Ser Ser Gly Leu

2020 2025 2030

Gly Val Ser Gly Ser Thr Leu Thr Phe Gln Glu Gly Glu Ala Ser Ala

2035 2040 2045

Ala Pro Glu Val Ser Gly Glu Ser Thr Thr Thr Ser Asp Val Gly Thr

2050 2055 2060

Glu Ala Pro Gly Leu Pro Ser Ala Thr Pro Thr Ala Ser Gly Asp Arg

2065 2070 2075 2080

Thr Glu Ile Ser Gly Asp Leu Ser Gly His Thr Ser Gln Leu Gly Val

2085 2090 2095

Val Ile Ser Thr Ser Ile Pro Glu Ser Glu Trp Thr Gln Gln Thr Gln

2100 2105 2110

Arg Pro Ala Glu Thr His Leu Glu Ile Glu Ser Ser Ser Leu Leu Tyr

2115 2120 2125

Ser Gly Glu Glu Thr His Thr Val Glu Thr Ala Thr Ser Pro Thr Asp

2130 2135 2140

Ala Ser Ile Pro Ala Ser Pro Glu Trp Lys Arg Glu Ser Glu Ser Thr

2145 2150 2155 2160

Ala Ala Ala Pro Ala Arg Ser Cys Ala Glu Glu Pro Cys Gly Ala Gly

2165 2170 2175

Thr Cys Lys Glu Thr Glu Gly His Val Ile Cys Leu Cys Pro Pro Gly

2180 2185 2190

Tyr Thr Gly Glu His Cys Asn Ile Asp Gln Glu Val Cys Glu Glu Gly

2195 2200 2205

Trp Asn Lys Tyr Gln Gly His Cys Tyr Arg His Phe Pro Asp Arg Glu

2210 2215 2220

Thr Trp Val Asp Ala Glu Arg Arg Cys Arg Glu Gln Gln Ser His Leu

2225 2230 2235 2240

Ser Ser Ile Val Thr Pro Glu Glu Gln Glu Phe Val Asn Asn Asn Ala

2245 2250 2255

Gln Asp Tyr Gln Trp Ile Gly Leu Asn Asp Arg Thr Ile Glu Gly Asp

2260 2265 2270

Phe Arg Trp Ser Asp Gly His Pro Met Gln Phe Glu Asn Trp Arg Pro

2275 2280 2285

Asn Gln Pro Asp Asn Phe Phe Ala Ala Gly Glu Asp Cys Val Val Met

2290 2295 2300

Ile Trp His Glu Lys Gly Glu Trp Asn Asp Val Pro Cys Asn Tyr His

2305 2310 2315 2320

Leu Pro Phe Thr Cys Lys Lys Gly Thr Val Ala Cys Gly Glu Pro Pro

2325 2330 2335

Val Val Glu His Ala Arg Thr Phe Gly Gln Lys Lys Asp Arg Tyr Glu

2340 2345 2350

Ile Asn Ser Leu Val Arg Tyr Gln Cys Thr Glu Gly Phe Val Gln Arg

2355 2360 2365

His Met Pro Thr Ile Arg Cys Gln Pro Ser Gly His Trp Glu Glu Pro

2370 2375 2380

Arg Ile Thr Cys Thr Asp Ala Thr Thr Tyr Lys Arg Arg Leu Gln Lys

2385 2390 2395 2400

Arg Ser Ser Arg His Pro Arg Arg Ser Arg Pro Ser Thr Ala His

2405 2410 2415

Claims

1.通式为R-(Xaa)_n-Pro-X-Gly-S-Y-Z-Gly-(Xaa)_m-R1(I)的含硫的酯肽类化合物或其盐作为ADAM-TS蛋白水解酶底物的用途，其中R是H或N-保护基团，优选羧基基团，特别是C₁-C₅-烷基的羧基基团，尤其是C₁-C₃-烷基的羧基基团，特别优选乙酰基，Xaa是任何氨基酸，

n、m是相同或不同的从0-2415的整数，优选从0-35，特别是从0-14，尤其是从0-11，且最特别优选等于0，

X是亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，

Z是亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸，

R₁是末端酰胺、羧基或酯基团，优选C₁-C₅-烷基的上述基团，尤其是C₁-C₃-烷基的上述基团，特别是乙基酯，

其中R₂是天然存在的氨基酸的侧链，特别是

-CH₂CH(CH₃)₂，

-CH(CH₃)C₂H₅，

-CH₂C₆H₅，

-CH(CH₃)₂，或

-CH₃。

2.权利要求1的用途，其特征在于

X＝亮氨酸或丙氨酸，

Z＝亮氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸，且

R₂＝-CH₂CH(CH₃)₂。

3.权利要求1或2的用途，其特征在于(Xaa)_n和/或(Xaa)_m是SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列。

4.权利要求1的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构：

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Leu-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂且Ac是乙酰基。

5.权利要求1的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构：

Ac-Pro-Leu-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂且Ac是乙酰基。

6.权利要求1的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构：

Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Phe-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂且Ac是乙酰基。

7.权利要求1的用途，其特征在于含硫的酯肽类化合物有如下结构：

Ac-Pro-Ala-Gly-S-Y-Ala-Gly-OC₂H₅，

其中R₂＝CH₂CH(CH₃)₂且Ac是乙酰基。

8.权利要求1-7中至少一项的用途，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。

9.权利要求1-8中至少一项的用途，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。

10.权利要求1-9中至少一项的用途，用于确定ADAM-TS蛋白水解酶活性；纯化ADAM-TS蛋白水解酶；对编码ADAM-TS蛋白水解酶的核苷酸序列的功能性克隆；寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂；或观察受损组织基质相关疾病，特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症的发生或进展。

11.确定ADAM-TS蛋白水解酶活性的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(a)将ADAM-TS蛋白水解酶与根据如权利要求1-7中任一项所限定的通式I的含硫的酯肽类化合物底物一起孵育，并且

(b)进行ADAM-TS蛋白水解酶的活性测量或确定。

12.权利要求11的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。

13.权利要求11或12的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。

14.权利要求11-13中至少一项的方法，其特征在于使用分光光度测定法测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶的活性。

15.权利要求14的方法，其特征在于在巯基检测试剂的存在下测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶，所述巯基检测试剂优选碘乙酰胺，特别是5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF)；马来酰亚胺，特别是荧光素-5-马来酰亚胺；或N，N’-双丹磺酰-L-胱氨酸；5-(溴甲基)荧光素或特别是4，4’-二硫联吡啶或5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。

16.用于寻找ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

(a)在测试化合物的存在下，将ADAM-TS蛋白水解酶与根据如权利要求1-7中任一项所限定的通式I的含硫的酯肽类化合物底物一起孵育，和

(b)测量或确定测试化合物对ADAM-TS蛋白水解酶活性的影响。

17.权利要求16的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。

18.权利要求16或17的方法，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。

19.权利要求16-18中至少一项的方法，其特征在于应用分光光度测定法测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶的活性。

20.权利要求19的方法，其特征在于在巯基检测试剂的存在下测量或确定ADAM-TS蛋白水解酶，所述检测试剂优选碘乙酰胺，特别是5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF)；马来酰亚胺，特别是荧光素-5-马来酰亚胺；或N，N’-双丹磺酰-L-胱氨酸；5-(溴甲基)荧光素或特别是4，4’-二硫联吡啶或5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。

21.权利要求16-20中至少一项的方法，其特征在于可以以化合物文库的形式获得测试化合物。

22.权利要求16-21中至少一项的方法，其特征在于在芯片上实施该方法。

23.权利要求16-22中至少一项的方法，其特征在于通过自动机械实施该方法。

24.权利要求16-23中至少一项的方法，其特征在于以微观流体技术辅助实施该方法。

25.权利要求16-24中至少一项的方法，其特征在于该方法是对ADAM-TS蛋白水解酶调节剂，特别是ADAM-TS蛋白水解酶抑制剂的高通量筛选。

26.制备用于与受损组织基质相关的疾病的治疗药物的方法，所述疾病特别是骨关节炎、风湿病、癌症、炎症、血管发生、细胞迁移、血液凝固和/或凝血，尤其是骨关节炎、风湿病或癌症，所述方法特征在于包括如下步骤：

(a)实施权利要求16-25中任一项的方法，

(b)分离在步骤(a)中发现的适合的测试物质，和

27.试剂盒，其包含根据如权利要求1-7中任一项所限定通式I的含硫的酯肽类化合物的底物、ADAM-TS蛋白水解酶和其中适当的一种或多种缓冲液。

28.权利要求27的试剂盒，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和/或20。

29.权利要求27或28的试剂盒，其特征在于ADAM-TS蛋白水解酶是ADAM-TS蛋白水解酶1、4、5、11和/或13，优选ADAM-TS蛋白水解酶1、ADAM-TS蛋白水解酶4或ADAM-TS蛋白水解酶5。

30.权利要求27-29中至少一项的试剂盒，其特征在于额外存在至少一种巯基检测试剂，优选碘乙酰胺，特别是5-碘乙酰胺荧光素(5-IAF)；马来酰亚胺，特别是荧光素-5-马来酰亚胺；或N，N’-双丹磺酰-L-胱氨酸；5-(溴甲基)荧光素或特别是4，4’-二硫联吡啶或5，5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。