CN101105491B - 定量测定人体丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸 - Google Patents

Abstract

本发明属于体外临床诊断试剂领域，具体为一种定量测定人体丙氨酸氨基转移酶活性的干化学试纸。试纸由长条形的上、下支持层组成，在测试区从上到下依次为加样孔、底物层、显色层和测试孔。底物层可选用玻璃纤维、滤纸和无纺布等材料，浸渍有底物等试剂；显色层为各种滤纸、无纺布或合成膜，浸渍有色原等试剂。样品从加样孔进入底物层，转运至显色层的样品面，含有被检测成分的液体渗透至显色层的检测面，通过化学反应引起色原颜色的改变，通过下支持层上的测试孔在显色层的检测面即可测定光密度的变化。该试纸用于快速测定人体全血、血清或血浆中的丙氨酸氨基转移酶的活性，是肝功能检测的重要指标之一。

Description

定量测定人体丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸

技术领域

本发明属于体外临床诊断试剂技术领域，具体涉及一种适用于测定人体全血、血清或血浆等中的丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶等生化指标的干化学试纸。

技术背景

丙氨酸氨基转移酶又称谷丙转氨酶，它催化L—丙氨酸和L—谷氨酸之间氨基的转移。丙氨酸氨基转移酶主要存在于肝细胞的胞浆中，在心肌、骨骼肌及其它组织中的含量较低。丙氨酸氨基转移酶是肝脏的特异性酶，血清值升高表明肝细胞质膜存在渗漏并退化，其升高的程度与受累细胞的数量有关。

临床上测定丙氨酸氨基转移酶的试剂可分为液体试剂和干化学试纸两类。干化学试纸主要用于快速检测。同液体试剂相比，干化学试纸具有方便、灵活、污染小、操作简便等优点。

目前，检测丙氨酸氨基转移酶的的干化学试纸多为国外产品，主要有纵向和横向两类。第一类是以强生公司和富士公司为代表的多层膜干片法，利用感光胶片的涂层技术将试剂层、辅助试剂层、光漫射层和分布层等试剂涂布在透明支持层上，从支持层的反面测定光密度的变化。如专利：U.S.PAT.NO.5,508,173。第二类是罗氏公司的干化学产品，U.S.PAT.NO.4,604,264将试剂涂布在多丝的纤维或织物上，全血通过玻璃纤维横向过滤后与上试剂层接触反应，通过上部覆盖的一透明薄膜测定光密度的变化。

上述这些产品，有的生产工艺复杂，需要专门的技术；有的可能存在某些缺陷，如加样和测定在同一侧可能会造成干扰。而且目前应用的干式生化分析仪为大中型设备，它将若干个生化项目集中在一台仪器上测定。在测定单一的丙氨酸氨基转移酶项目时，如流动采血车等场合，其功能和速度会受到限制。本发明旨在提供独立的小型机和试纸，更适合丙氨酸氨基转移酶的大规模快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种使用方便、快速的定量测定人体全血、血清或血浆中的丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸。

本发明提供的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，为长条形，一端为手持区，另一端为测试区，其结构如图1和图2所示。它由上支持层1、下支持层2、底物层5和显色层6组成。其中，上支持层1和下支持层2通过自带的胶层粘合在一起。在上支持层1的测试区开有加样孔3，下支持层2的对应位置开有测试孔4。底物层5和显色层6迭合，位于加样孔和测试孔处的上支持层1和下支持层2之间。

本发明中，上支持层1和下支持层2可采用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纤维等。其中优选聚酯纤维。单片支持层的厚度为100-250μm，大小为6×50mm-12×80mm。上下支持层上的加样孔和测试孔为圆形，直径相同，为4-8mm。加样孔3用于滴加样品，测试孔4用于观察和测定反应区颜色的变化。

本发明中，底物层5用来接受样品，样品在底物层扩散，将浸渍在底物层上的试剂溶解，样品中的可检测部分被转运到显色层的样品面。底物层5优选反应区面积能容纳大约10-30μl血液，并能将大约6-10μl样品转运至显色层的材料。适合做底物层的材料包括玻璃纤维、各种滤纸或无纺布等，特别优选玻璃纤维，其结构疏松，血液样品中的可检测部分和试剂能快速渗透至显色层，缩短了反应时间。

本发明中，显色层6为浸渍有检测试剂和色原的各种滤纸、无纺布或合成膜等，优选聚砜、聚醚砜或尼龙等材料的合成膜，特别优选具有孔径大小呈梯度变化的孔的合成膜，合成膜上的小孔孔径范围为0.2-10μm。合成膜有一个用于点样的样品面，和一个可观察到颜色变化的检测面。当血液渗透到膜的大孔面上后，样品逐渐穿过膜，流过的孔径越来越小。最后，红细胞等物质到达膜的某个位置就不再往下渗透。含有丙氨酸氨基转移酶的剩余样品渗透到小孔面，通过一系列反应，使色原颜色发生变化，从而指示样品中丙氨酸氨基转移酶的浓度。

本发明中，反应试剂分布于底物层和显色层上。定量全血或血清/血浆滴加于加样孔内，样品均匀分布并渗入试剂层中。样品中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化底物L—丙氨酸和α—酮戊二酸钠，产生L—谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化产生过氧化氢。在过氧化物酶作用下，过氧化氢氧化无色色原生成有色产物，颜色变化与样品中的丙氨酸氨基转移酶活性成正比，用反射光度计可测定之。

本发明中，反应试剂包括缓冲体系、底物、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、色原、激活剂、稳定剂等。缓冲体系可以是磷酸盐缓冲液、Tris-HCL或Good's缓冲液等，浓度为0.05M—1.0M，反应最佳pH值在6.5-8.0。底物采用L—丙氨酸和α—酮戊二酸钠，底物在丙氨酸氨基转移酶的催化下产生L—谷氨酸和丙酮酸。L—丙氨酸的浓度为0.5M-1.5M，α—酮戊二酸钠的浓度为5mM-50mM。生成的丙酮酸被丙酮酸氧化酶在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及硫胺素焦磷酸(TPP)存在下氧化产生过氧化氢。丙酮酸氧化酶的适宜浓度为30-100U/ml，FAD浓度为0.1mg/ml-0.2mg/ml，TPP浓度为0.4mg/ml-0.8mg/ml；丙酮酸氧化酶的激活剂采用Mg²⁺，Mg²⁺的浓度为1.0g/L-3.0g/L；酶的稳定剂采用二糖、多糖类或蛋白类稳定剂等，如蔗糖、海藻糖和牛血清白蛋白等，在体系中的重量浓度为0.1-2.0％。在过氧化物酶作用下，过氧化氢氧化无色色原生成有色产物。过氧化物酶浓度为30-100U/ml。色原作为指示剂，可以是单一组分或两种组分的色原物质，优选色原强吸收处的波长不同于样品的强吸收处的波长，特别优选强吸收处的波长为610-650nm的色原，浓度为0.03％-0.5％。

为定量测定丙氨酸氨基转移酶活性，发明人还研制了反射式分光光度计(另案申请专利)，与本发明试纸条配套使用。6-30μl血样滴加于试纸条上，反应温度控制在37±0.3℃，用该光度计测定试纸反应后在630±20nm波长下反射光密度的变化，测试在3.5-5分钟内完成。自动报告和存储实验结果，并打印。

本发明使用丙酮酸氧化酶法测定丙氨酸氨基转移酶活性，采用底物层和显色层迭合的结构，试剂稳定性好，显色强度高，均匀度好，减少了加样端测定产生的气泡、过量液体、红细胞等造成的干扰，可使用全血和血清/血浆作为标本。本发明制造工艺简单，与专门设计的小型反射式光度计配套，使用更为方便快速。

附图说明

图1为本发明的干化学试纸图示。

图2为本发明的干化学试纸剖面图示。

图中标号：1为上支持层，2为下支持层，3为加样孔，4为测试孔，5为底物层，6为显色层。

图3为实施例1的测定结果的回归直线方程。

具体实施方式

实施例1：上、下支持层采用PVC片，用打孔机打出加样孔3和测试孔4，孔直径为4mm，孔距为8mm。底物层5采用玻璃纤维，粘贴于上支持层。显色层6采用尼龙膜，粘贴于下支持层。将配制好的底物溶液和显色液用BIO-DOT喷点仪分别点样于底物层5和显色层6，每孔6μl。将喷点后的试纸放入30-50℃的真空干燥箱中，干燥后取出。将上、下支持层对合粘帖在一起，加样孔3与测试孔4对齐。用滚刀机将试纸切成8mm宽的试纸条即成。

试剂组成如下：

磷酸盐缓冲液：               50mM

L—丙氨酸：                  500mM

α—酮戊二酸钠：               10mM

MgCl₂*6H₂O：                  2.4g/L

过氧化物酶：                  30U/ml

丙酮酸氧化酶：                30U/ml

黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)：     0.1mg/ml

硫胺素焦磷酸(TPP)：           0.4mg/ml

4-氨基安替比林：              1.2g/L

DAOS(色原)：                  0.85g/L

(N-乙基—N—(2—羟基—3—磺酸基丙基)—3，5—二甲氨基苯胺)

牛血清白蛋白：                0.2％

将6μl7％牛血清白蛋白配制的丙氨酸氨基转移酶校准品滴加于加样孔，用反射式光度计进行测定，读取2.5—4分钟时的反射强度的变化。结果见表1：

以此建立直线回归方程为Y(反射强度变化)＝0.0004X(ALT浓度)+0.0245，r²＝0.9987。如图3所示。

实施例2：上、下支持层采用PET片，用打孔机打出加样孔3和测试孔4，孔直径为4mm，孔距为8mm。底物层5采用玻璃纤维，显色层6采用PES膜，宽度为8mm。将底物层5和显色层6分别浸泡于底物溶液和显色液中，完全浸湿后取出，刮平。将浸湿的试纸放入30-50℃的真空干燥箱中，干燥后取出。将底物层5粘贴于上支持层，显色层6粘贴于下支持层。将上、下支持层对合粘帖在一起，加样孔3与测试孔4对齐。用滚刀机将试纸切成8mm宽的试纸条即成。

试剂组成如下：

Good's缓冲液：                       200mM

L—丙氨酸：                          1000mM

α—酮戊二酸钠：                      20mM

MgCl₂*6H₂O：                         2.0g/L

过氧化物酶：                         100U/ml

丙酮酸氧化酶：                       100U/ml

黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)：            0.2mg/ml

硫胺素焦磷酸(TPP)：                  0.8mg/ml

KH₂PO₄：                             20mM

3’，3’，5’，5，-四甲联苯胺(色原)：0.1％

海藻糖：                             0.5％

用高浓度的丙氨酸氨基转移酶血清稀释红细胞，得到红细胞压积为20％、30％、40％、50％和60％的全血标本，加样量为20μl，分别滴加于加样孔，用反射式光度计进行测定，读取3—4分钟时的反射强度的变化。结果见表2：

结果说明红细胞压积在30％—50％的全血标本在测定时几乎不受红细胞的干扰。

Claims (2)

1.一种定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于形状为长条形，一端为手持区，另一端为测试区，由上支持层(1)、下支持层(2)、底物层(5)和显色层(6)组成；其中，上支持层(1)和下支持层(2)通过自带的胶粘层粘合在一起；在上支持层(1)的测试区开有加样孔(3)，下支持层(2)的对应位置开有测试孔(4)；底物层(5)和显色层(6)迭合，位于加样孔(3)和测试孔(4)处的上支持层(1)和下支持层(2)之间；底物层(5)和显色层(6)上浸渍有反应试剂，并经39-50℃真空干燥箱干燥；

所述的底物层(5)的材料采用玻璃纤维；

所述的显色层(6)的材料为合成膜；所述合成膜为聚砜、聚醚砜或尼龙；所述合成膜具有孔径大小呈梯度变化的孔，其中小孔的孔径范围为0.2-10μm；

所述反应试剂包括缓冲体系、底物、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶、色原、激活剂和稳定剂，其中，缓冲体系是磷酸盐缓冲液、Tris-HCL或Good’s缓冲液，浓度为0.05M-1.0M，反应pH值在6.5-8.0；

底物为L-丙氨酸和α-酮戊二酸钠，L-丙氨酸的浓度为0.5M-1.5M；α-酮戊二酸钠的浓度为5mM-50mM；

丙酮酸氧化酶的浓度为30-100U/ml；过氧化物酶浓度为30-100U/ml；

色原是DAOS或3’，3’，5’，5’-四甲联苯胺，色原吸收波长为610nm-650nm，浓度为0.03％-0.5％；

丙酮酸氧化酶的辅酶采用黄素腺嘌呤二核苷酸和硫胺素焦磷酸，黄素腺嘌呤二核苷酸浓度为0.1mg/ml-0.2mg/ml，硫胺素焦磷酸浓度为0.4mg/ml-0.8mg/ml；

丙酮酸氧化酶的激活剂采用Mg²⁺，浓度为1.0g/L-3.0g/L；

酶的稳定剂为蔗糖、海藻糖或牛血清白蛋白，在体系中的重量浓度为0.1-2.0％。

2.根据权利要求1所述的定量测定丙氨酸氨基转移酶的干化学试纸，其特征在于所述的上支持层和下支持层的材料为聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纤维，单片支持层的厚度为100-250μm，大小为6×50-12×80mm，上支持层和下支持层的规格相同，其上的加样孔(3)和测试孔(4)为圆形，直径为4-8mm。

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