[go: up one dir, main page]

CN101102789B - 阿尔茨海默病的诊断和治疗 - Google Patents

阿尔茨海默病的诊断和治疗 Download PDF

Info

Publication number
CN101102789B
CN101102789B CN2005800415583A CN200580041558A CN101102789B CN 101102789 B CN101102789 B CN 101102789B CN 2005800415583 A CN2005800415583 A CN 2005800415583A CN 200580041558 A CN200580041558 A CN 200580041558A CN 101102789 B CN101102789 B CN 101102789B
Authority
CN
China
Prior art keywords
igf
insulin
receptor
brain
level
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2005800415583A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101102789A (zh
Inventor
S·M·德拉蒙特
J·R·万德斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rhode Island Hospital
Original Assignee
Rhode Island Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhode Island Hospital filed Critical Rhode Island Hospital
Publication of CN101102789A publication Critical patent/CN101102789A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101102789B publication Critical patent/CN101102789B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/62—Insulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及通过测定胰岛素、胰岛素样生长因子、它们的受体和/或它们的下游信号转导分子的水平或功能诊断阿尔茨海默病(AD)的方法。本发明还涉及通过给予胰岛素激动剂和胰岛素样生长因子激动剂治疗AD的方法。本发明还提供了AD的动物模型和筛选可用于治疗、改善或预防AD的物质的方法。

Description

阿尔茨海默病的诊断和治疗
发明背景
发明领域
本发明属于医学诊断和治疗领域。具体说，本发明涉及通过测定胰岛素、胰岛素样生长因子、它们的受体和/或它们的下游信号转导分子的水平或功能诊断阿尔茨海默病(AD)的方法。本发明还涉及通过给予胰岛素激动剂和胰岛素样生长因子激动剂治疗AD的方法。本发明还提供了AD的动物模型和筛选可用于治疗、改善或预防AD的物质的方法。
相关技术
与阿尔茨海默病(AD)的痴呆相关的特征性神经病理学和分子损伤包括过度磷酸化的和聚-泛素化的微管相关蛋白如tau的累积，导致形成神经纤维缠结、营养不良性神经炎和神经毡线丝。神经元的细胞骨架异常与伴随细胞和纤维损失的脑萎缩以及突触断开有关。脑膜和皮层管壁、皮层神经毡以及神经元核周体周围和其中淀粉样-β(Aβ)沉积增加是AD和正常衰老的特征。虽然在AD型痴呆中遗传因素可能使个体倾向于在脑中沉积未成熟和过量的Aβ，但大多数情况是散发性并且没有显示出清晰的家族或遗传聚集性。近年来对典型AD之前或伴随其发生的生化、分子和细胞学异常的研究证明，细胞损失与促死亡基因和信号传导途径的活化增加、能量代谢受损、线粒体功能障碍、慢性氧化应激和脑血管疾病/大脑供血不足有关。然而，不能在一种基础发病机理下将这些现象联系在一起导致各种互相严重冲突的理论的出现和传播，各理论都关注于AD的一个具体组分如何引发造成所有其它异常现象的级联反应。然而，对一些较早文献的再评价揭示出大脑葡萄糖利用和能量代谢的损伤代表了认知障碍的最初阶段之前或期间发生的非常早期的异常。此外，新的证据证明，受损的胰岛素信号转导可能对AD发病有重要作用。
目前，人们对阐明胰岛素抗性、高胰岛素血症、2型糖尿病和胰岛素降解酶在AD发病中的作用，以及脑中与其相关的神经元细胞骨架损伤和Aβ沉积越来越感兴趣。显示胰岛素受体底物-2或神经元的胰岛素受体基因缺陷的小鼠中脑生长减少和tau磷酸化升高的报道使这种新的热情更加热烈。(Schubert等，J.Neurosci.23：7084(2003)；Schubert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：3100(2004))。15-20年前检测到下丘脑-垂体轴的异常时，就提出了AD中的神经内分泌系统的潜在作用。(Beal等，Res.Publ Assoc.Res.Nerv.Merit.Dis.64：215(1986)；Reubi等，J.Neurol.233：370(1986)；Fisman等，J.Am.Geriatr.Soc.3(5：298(1988)；Hoyer，J.Neurol.234：266(1987)；Tham等，Acta Psychiatr.Scand.77：719(1988)；Bucht等，Acta Med.Scand.213：387(1983))。随着Aβ和tau方面加速研究的浪潮，该构思几乎绝迹，但最近，重新燃起的对神经内分泌机制的兴趣强调了系统性疾病，而非固有的中枢神经系统(CNS)内分泌功能障碍。然而，以前的研究揭示出，在AD中发生的CNS神经变性中的许多重要组分是由脑中受损的胰岛素信号转导介导的(de la Monte等，Cell.Mol Life Sci.58：1950(2001)；de la Monte等，Cell.MolLifeSci.59：882(2002)；de la Monte等，AlcoholClin.Exp.Res.24：716(2000)；Xu等，J.Biol.Chem.278：26929(2003))。
发明概述
AD患者脑中胰岛素和IGF表达受损的发现证明了AD和胰岛素/胰岛素样生长因子(IGF)信号传导途径之间的关系。也发现了AD患者中胰岛素和IGF信号转导的下游介导物受损。这些发现确定了AD和胰岛素/IGF信号传导途径之间的关系，可用于诊断和治疗目的。
因此，本发明的一个方面是在对象中诊断AD的方法，所述方法包括检测所述对象中胰岛素/IGF信号传导途径的至少一个因子的水平或功能降低，其中相对于健康对象一种或多种所述因子的水平或功能降低是AD的诊断指征。
另一方面，本发明涉及鉴定处于发生AD的风险中的对象的方法，所述方法包括测定所述对象中胰岛素/IGF信号传导途径的至少一个因子的水平或功能降低，其中相对于健康对象一种或多种所述因子的水平降低是发生AD的风险的诊断指征。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种用于诊断AD的诊断试剂盒。该试剂盒测定可用于测定对象中胰岛素/IGF信号传导途径的至少一个因子的水平或功能。
在本发明的一个方面，提供了在对象中治疗、改善或预防AD的方法。在某些实施方式中，该方法包括给予对象治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂。
本发明另一方面涉及一种改善AD患者的精神的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂。
本发明另一方面涉及一种减少AD患者的记忆力丧失的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂。
本发明另一方面提供了一种含有治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂的组合物。
本发明另一方面提供了筛选可能用于治疗、改善或预防AD的物质的方法，所述方法包括将该物质给予动物并测定所述动物的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中相对于未给予所述物质的对照动物，一种或多种所述因子的水平或功能增加表明所述物质可能用于治疗、改善或预防AD。
本发明另一方面提供了一种测试AD的可能治疗的方法，所述方法包括将可能治疗给予动物并测定所述动物的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中相对于未给予所述治疗的对照动物，一种或多种所述因子的水平或功能增加表明所述治疗可能用于治疗、改善或预防AD。
本发明另一方面提供了一种测试某物质对AD的发病和进展的潜在负面影响的方法，所述方法包括将所述物质给予动物并测定所述动物的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中相对于未给予所述物质的对照动物，一种或多种所述因子的水平或功能降低表明所述物质可能对AD的发病或进展有负面影响。
本发明还提供了一种向非人动物脑内注射链脲霉素(STZ)产生的AD动物模型，其中在小于1周龄时注射所述非人动物。在另一实施方式中，本发明提供了向非人动物脑内注射STZ产生的AD动物模型，其中给所述非人动物注射的STZ剂量至少约为10mg/kg体重。
本发明还涉及一种筛选可能用于治疗、改善或预防AD的物质的方法，所述方法包括将某物质给予向非人动物脑内注射STZ产生的AD动物模型并测定相对于未给予所述物质的对照动物AD的至少一种指征的水平或功能，其中AD的至少一种指征的水平或功能相对于未给予所述物质的对照动物改善表明所述物质可能用于治疗、改善或预防AD。
本发明还提供了一种测试AD的可能治疗的方法，所述方法包括将可能治疗给予向非人动物脑内注射STZ产生的AD动物模型并测定相对于未给予可能治疗的对照动物AD的至少一种指征的水平或功能，其中AD的至少一种指征的水平或功能相对于未给予可能治疗的对照动物改善则表明所述治疗可能用于治疗、改善或预防AD。
本发明另一方面提供了一种测试可能对AD的发病或进展有负面影响的物质的方法，所述方法包括将所述物质给予向非人动物脑内注射STZ产生的AD动物模型并测定相对于未给予可能治疗的对照动物AD的至少一种指征的水平或功能，其中AD的至少一种指征的水平或功能相对于未给予所述物质的对照动物降低表明所述物质可能对AD的发病或进展有负面影响。
附图简要说明
图1A-1D显示，用实时定量RT-PCR证明，AD脑中胰岛素、IGF-I和IGF-II受体表达水平降低。图中描述了从额叶皮层(A)、海马区(B)和下丘脑(C)获得的结果的平均值±S.E.M.。(D)为了更好地描述胰岛素受体表达的组间和区域差异，将这些数据按比例重复作图。在柱图上方标明了显著性P值(包括趋势)。
图2A-2D显示，用实时定量RT-PCR证明，AD中胰岛素、IGF-I和IGF-II的表达改变。图中描述了从额叶皮层(A)、海马区(B)和下丘脑(C)获得的结果的平均值±S.EM.。(D)为了更好地描述胰岛素基因表达的组间和区域差异，将这些数据按比例重复作图。在柱图上方标明了显著性P值(包括趋势)。
图3A-3H显示了用免疫组织化学染色测定的胰岛素(A-B)、IGF-I(C-D)、胰岛素受体(E-F)和IGF-I受体(G-H)的免疫反应性在AD(A，C，E，G)和老年对照(B，D，F，H)海马区中的定位。箭头指向标记的神经元。
图4A-4E显示了大鼠出生后小脑皮层(CBM)以及大鼠胎儿大脑皮层(CTX)、海马区(HIPPO)和下丘脑(HYPO)产生的分裂后分化的原代神经元培养物中检测的胰岛素、IGF-I和IGF-II受体表达。图中描述了获得的胰岛素受体(A)、IGF-I受体(B)和IGF-II受体(C)表达水平结果的平均值±S.E.M.。(D，E)为了更好地描述生长因子受体表达的组间和区域差异，将对应于小脑神经元(D)或皮层、海马区和下丘脑神经元(E)的数据按比例重复作图。
图5A-5E显示了大鼠出生后小脑皮层(CBM)以及大鼠胎儿大脑皮层(CTX)、海马区(HIPPO)和下丘脑(HYPO)产生的分裂后分化的原代神经元培养物中检测的胰岛素、IGF-I和IGF-II基因表达。图中描述了获得的胰岛素(A)、IGF-I(B)和IGF-II(C)表达水平结果的平均值±S.E.M.。(D，E)为了更好地描述生长因子表达的组间和区域差异，将对应于小脑神经元(D)或皮层、海马区和下丘脑神经元(E)的数据按比例重复作图。
图6A-6G显示了AD脑中1型胰岛素受体底物(IRS-1)水平降低以及胰岛素和IGF-I信号转导机制受损。用实时定量RT-PCR测定AD和老年对照的脑中额叶皮层(A)、海马区(B)和下丘脑(C)的IRS-1、2和4mRNA水平。通过Western印迹分析免疫沉淀物评价海马区组织样品中酪氨酸磷酸化的(PY)胰岛素(E)和IGF-I(G)受体的稳态水平，以及PI3激酶的催化活性p85亚基和IRS-1之间的相关性(D；反映出与PY-IRS-1相关的PI3激酶活性)。通过直接Western印迹分析检测海马区组织样品中的胰岛素受体(INR；F)和IGF-I受体(IGFI-R；H)蛋白表达。在柱图上方标明了显著性P值。
图7A-7E显示了AD脑中受损的存活信号转导机制。通过Western印迹分析评价海马区样品中的(A)磷酸化-Akt(p-Akt)、(B)总Akt、(C)磷酸化-糖原合酶激酶3β(p-GSK-3β)、(D)总GSK-3β和(E)β-肌动蛋白的稳态水平。在柱图上方标明了显著性P值。
图8A-8H显示了用实时定量RT-PCR检测的AD和对照海马区(A，C，E，G)和下丘脑(B，D，F，H)中tau(A，B)、淀粉样前体蛋白(APP；C，D)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4；E，F)和胰岛素降解酶(IDE；G，H)基因表达的测定值。在柱图上方标明了显著性P值。
图9A-9C显示了用实时定量RT-PCR证明在AD进展过程中胰岛素受体和IGF受体表达水平降低。图中描述了获得的胰岛素受体(A)、IGF-I受体(B)和IGF-II受体(C)结果的平均值±S.E.M.。用ANOVA对数据进行统计学分析，此后进行Tukey-Kramer显著性检验。在柱图上方标明了显著性P值。
图10A-10C显示了用实时定量RT-PCR证明在AD进展过程中胰岛素、IGF-I和IGF-II表达降低。图中描述了获得的胰岛素(A)、IGF-I(B)和IGF-II(C)多肽基因结果的平均值±S.E.M.。用ANOVA对数据进行统计学分析，此后进行Tukey-Kramer显著性检验。在柱图上方标明了显著性P值。
图11A-11C显示了用实时定量RT-PCR证明的AD进展和tau(A)或淀粉样前体蛋白(APP；B)mRNA表达之间的关系。图中描述了获得的tau(A)和APP(B)基因结果的平均值±S.E.M.。用ANOVA对数据进行统计学分析，此后进行Tukey-Kramer显著性检验。在柱图上方标明了显著性P值。
图12A-12C显示出，生长因子结合随AD神经变性进展而降低。图中描述了获得的胰岛素(A)，IGF-I(B)和IGF-II(C)结合结果的平均值±S.EM.。用ANOVA对数据进行统计学分析，此后进行Tukey-Kramer显著性检验。在柱图上方标明了显著性P值。
图13A-13L显示出，生长因子饱和结合水平随AD进展而降低。图中描述了在AD Braak阶段0-1(A、E、I)、2-3(B、F、J)、4-5(C、G、K)或6(D、H、L)的脑中对应于胰岛素(A-D)、IGF-I(E-H)和IGF-II(I-L)结合的特异性结合(fmol/mg蛋白质)±95％CI。
图14A-14B显示了AD进展与脑膜胆固醇含量(A)或稳态ATP水平(B)之间的关系。图中描述了荧光单位(FLU)/μg蛋白质(A)或发光(B)的平均值±S.E.M.。用ANOVA对数据进行统计学分析，此后进行Tukey-Kramer显著性检验。在柱图上方标明了显著性P值(包括趋势)。
图15A-15D显示出ic-STZ模型中不存在胰岛破坏。(A，B)苏木精和伊红染色的对照(A)和ic-STZ(B)处理的胰切片，两组中都显示出完整的组织结构和外观正常的胰岛(箭头)。(C，D)用胰岛素的单克隆抗体对相邻切片进行免疫染色。用二氨基联苯胺(棕色沉淀)作为色原，以ABC法揭示免疫反应性。用苏木精对切片进行复染。在对照(C)和ic-STZ处理的(D)大鼠的胰岛(箭头)中都检测到显著的胰岛素免疫反应性。插图(图C和D的右下角)显示胰岛素-免疫反应性胰岛的高倍放大图像。
图16A-16D显示了ic-STZ对血糖水平、体重和脑大小的影响。(A)恰好在处死前(第14天)用One-Touch Ultra Blood Glucose Meter测定血糖浓度(mg/dl)。(B)处死时测定体重(gm)和(C)脑重(mg)。图中描述了测定的每组20只大鼠的血糖水平、体重和脑重的平均值±S.D.。用斯氏t检验进行组间比较(在柱图上方标明了显著性P值)。(D)处理14天后对照(左)和ic-STZ处理的大鼠脑的代表性原始照片(gross photograph)。需要注意，ic-STZ-处理的脑中极小的小脑(箭头)和多处小脑膜出血(双箭头)。
图17A-17J显示了ic-STZ的神经病理学。固定从对照(左图)和ic-STZ(右图)大鼠(第14天)收获的脑，进行加工以进行组织病理学检测。用苏木精和伊红对石蜡切片进行染色。显示了在相同放大倍数下拍摄的对照(A，C，E)和ic-STZ处理的(B，D，F)大鼠的通过包括尾状核(cp)的额叶的冠状面(A，B)和具有海马结构和丘脑的颞叶(C，D)以及小脑皮层(E，F)的照片。在ic-STZ处理的脑中，大脑的尺寸较小与脑室(V)扩张，颞叶(T)显著变薄以及基底神经节(bg)、海马区(h)、下丘脑和丘脑(Th)减小有关。ic-STZ处理的大鼠小脑(F)相对于对照(E，G)显著减小。由于没有内部(igl)和外部(egl)颗粒细胞层和分子层，ic-STZ处理的大鼠小脑具有轮廓不清的简化叶和无组织的(disorganized)皮层叠状结构。然而，ic-STZ小脑皮层充满了类似Purkinje细胞(Pc)的大锥形神经元/成神经细胞元件的无组织集合(F，H)。用p53的单克隆抗体对相邻切片进行免疫染色。用DAB(棕色沉淀)作为色原，以ABC法检测免疫反应性。显微照片显示了对照(I)和ic-STZ(J)颞叶的代表性标记。需要注意，与对照皮层神经元中几乎不能检测到标记(I)相比，ic-STZ皮层神经元中p53免疫反应性增加(J)。
图18A-18D显示了ic-STZ-处理的脑颞叶中神经元和少突神经胶质损失，星形细胞和小胶质细胞群体增加(第14天)。用对应于(A)Hu神经元RNA结合蛋白、(B)髓磷脂相关性糖蛋白-1(MAG-1)、(C)星形细胞胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和(D)小胶质细胞AIF-1的mRNA转录物水平检测脑细胞类型在ic-STZ处理后的病理学改变。图中描述了从每组8-10个样品中获得的平均值±S.E.M.。用斯氏T检验对数据进行统计学分析。在柱图上方标明了显著性P值。
图19A-19I显示了ic-STZ对胰岛素和胰岛素样生长因子(IGF)基因和受体的CNS表达的影响(第14天)。图中描述了获得的(A)胰岛素受体(InR)、(B)IGF-I受体(IGF-IR)、(C)IGF-II受体(IGF-IIR)、(D)胰岛素、(E)IGF-I、(F)IGF-II、(G)1型胰岛素受体底物(ERS-I)、(H)IRS-2和(I)IRS-4的结果的平均值±S.E.M.。用斯氏T检验对数据进行统计学分析。在柱图上方标明了显著性P值。
图20A-20C显示了ic-STZ处理的大鼠中CNS生长因子结合降低。图中描述了获得的(A)胰岛素、(B)IGF-I和(C)IGF-II特异性结合结果的平均值±S.E.M.。用斯氏T检验对数据进行统计学分析。在柱图上方标明了显著性P值。
图21A-21G显示经Western印迹分析证明，ic-STZ-处理的脑中神经变性指数增加。用Western印迹分析在颞叶组织中检测(A)胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、(B)磷酸化-糖原合酶激酶3(p-GSK-3β/β(Ser21/9))、(C)总GSK-3β、(D)磷酸化-tau(pTau)、(E)tau、(F)泛素和(G)β-肌动蛋白(阴性对照)的稳态表达水平的代表性结果。各图左边的箭头表示分子量标记物的位置，各箭头下方标出了标记物的大小。
图22A-22F显示经免疫组织化学染色证明，ic-STZ-处理的脑中神经变性指数增加。用(A、B)GFAP、(C、D)磷酸化-tau或(E、F)泛素的单克隆抗体对脑的石蜡包埋切片进行免疫染色，以证明相对于对照(A、C、E)脑，ic-STZ-处理组(B、D、F)的神经胶质、tau磷酸化和蛋白质泛素化增加。所有这些图描述了颞叶中的代表性标记分布。(A，B)GFAP免疫反应性定位于星形细胞和神经毡胶质原纤维。(C，D)ic-STZ皮层神经元核周体中pTau免疫反应性增加。(E，F)ic-STZ皮层神经元以及其它细胞类型的细胞核中泛素免疫反应性增加。
图23A-23F显示出ic-STZ增加了脑中的淀粉样前体蛋白(APP)表达和Aβ累积，类似于AD。用实时定量RT-PCR测定(A)Tau和(B)APP基因表达，其中将值标准化至18S rRNA。图中描述了结果的平均值±S.E.M.。用斯氏T检验对数据进行统计学分析。在柱图上方标明了显著性P值。(C)对照脑对Aβ的免疫反应性很小或没有免疫反应性，而ic-STZ-处理的脑(D-F)的(D)神经元细胞小体(箭头)、(E，F)实质微血管(bv)和(E，F)胞外致密中心斑块样结构(箭头)中具有显著的Aβ免疫反应性。
图24A-24F显示出神经元损失和胰岛素/IGF信号转导机制受损与ic-STZ处理的脑中胆碱乙酰基转移酶(ChAT)表达降低有关。用实时RT-PCR检测并定量(A)ChAT和(B)乙酰胆碱脂酶(AChE)mRNA转录物，其中将数值标准化至同一样品中测定的18S核糖体RNA。图中描述了获得的(A)ChAT和(B)AChE基因的结果的平均值±S.E.M.。用斯氏T检验对数据进行统计学分析。在柱图上方标明了显著性P值。为了特征鉴定ic-STZ诱导的ChAT和AchE表达改变，用(C，D)ChAT或(E，F)AchE的抗体对脑的石蜡包埋切片进行免疫染色。用生物素化第二抗体、ABC试剂和DAB检测免疫反应性。在对照脑(C，E)中，ChAT免疫反应性相对较高，而AChE免疫反应性则低于ic-STZ处理的脑中观察到的结果(D，F)。在对照皮层神经元中检测到ChAT免疫反应性(C；箭头)，而在ic-STZ处理的脑的神经毡纤维和皮层神经元中检测到高水平的AChE(D；箭头)。
发明详述
本发明涉及脑中胰岛素/IGF信号传导途径在AD发病中起到的重要作用。与健康对象相比，在AD患者的脑中检测到参与这些信号转导途径的几种因子的水平显著降低。因此，本发明涉及通过检测对象中胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能的降低在所述对象中诊断AD的方法。本发明还涉及通过给予对象治疗有效量的胰岛素激动剂以及治疗有效量的IGF激动剂在所述对象中治疗、改善或预防AD的方法。
本文所用术语＂阿尔茨海默病＂指一种神经变性疾病，包括家族性和散发性AD。人对象中AD的指示性症状一般包括但不限于：中度至重度痴呆、进行性记忆力缺损(从中度健忘至定向障碍和严重的记忆力丧失)、视空定向能力差、性格改变、冲动控制能力差、判断能力差、不信任他人、倔强程度提高、坐立不安、计划能力差、作出决定的能力差和社交能力退化。脑组织内的特征性病理学包括胞外神经炎β-淀粉样斑块、神经纤维缠结、神经原纤维变性、颗粒血管神经元变性、突触减少和广泛神经元细胞死亡。
本文所用术语＂显示AD所产生病状的对象＂和＂怀疑显示AD所产生病状的对象＂指根据已知的AD症状和病理学，鉴定为患有或可能患有AD的对象。
本文所用术语＂处于显示AD所产生病状的风险中的对象＂指处于AD发生风险中的对象(如由于年龄或该对象的家族中有AD的家族遗传史)。
在一个方面，本发明涉及在对象中诊断AD的方法，所述方法包括在所述对象中检测胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能降低，其中一种或多种所述因子的水平或功能相对于健康对象降低是AD的诊断指征。
另一方面，本发明涉及鉴定处于发生AD的风险中的对象的方法，所述方法包括测定所述对象中胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中相对于健康对象一种或多种所述因子的水平降低是发生AD的风险的诊断指征。
在本发明的某些实施方式中，测定了胰岛素/IGF信号传导途径中至少2、3、4、5或6种因子的水平或功能。
可在显示AD所产生病状的对象、怀疑显示AD所产生病状的对象和处于显示AD所产生病状的风险中的对象中进行本发明诊断方法。
在本发明的一个实施方式中，测定了CNS中胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能。
在一个实施方式中，所述诊断方法在体内进行。例如，成像技术(如磁共振成像、计算机轴向体层摄影术、单光子发射计算机断层摄影术、正电子发射成像术、X射线、超声)可与可检测标记的抗体、配体、酶底物等联用，以测定对象中胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能。可检测标记的例子包括但不限于：放射性、荧光、顺磁性和超顺磁性标记。本领域已知的任何合适的体内成像技术都可用于本发明。成像技术的例子参见美国专利号6,737,247、6,676,926、6,083,486、5,989,520、5,958,371、5,780,010、5,690,907、5,620,675、5,525,338、5,482,698和5,223,242。
在另一实施方式中，(如)利用生物样品在体外进行所述诊断方法。生物样品可以是来自适用于检测胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能的对象的任何组织或液体。有用样品的例子包括但不限于：神经组织活检样品、血液(如脑部血液)、血浆、浆液、脑脊液、唾液、尿和淋巴。
可以进行检测和测定的胰岛素/IGF信号传导途径中的因子包括但不限于：胰岛素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体、IGF-II受体、酪氨酸磷酸化的胰岛素受体、酪氨酸磷酸化的IGF-I受体、酪氨酸磷酸化的IGF-II受体、胰岛素受体底物-1(IRS-1)、IRS-2、IRS-4、酪氨酸磷酸化的IRS-1、酪氨酸磷酸化的IRS-2、酪氨酸磷酸化的IRS-4、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3激酶)、PI3激酶的p85亚基、Akt、磷酸化-Akt、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)和磷酸化-GSK-3β。可测定的功能包括但不限于：胰岛素受体、IGF-I受体或IGF-II受体的配体结合能力，胰岛素受体、IGF-I受体或IGF-II受体的激酶活性，PI3激酶的p85亚基与磷酸化的IRS-1、IRS-2或IRS-4的相互作用，磷酸化的IRS-1、IRS-2或IRS-4与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)、SHPTP-2蛋白酪氨酸磷酸酶或PI3激酶的p85亚基的结合，促分裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKK)、Erk MAPK、Akt/蛋白激酶B、GSK-3β的酶活性。
健康对象中胰岛素/IGF信号传导途径中的因子的标准水平或功能可能代表合适数量的一般群体成员，一般至少10个，更优选50个，更优选100-500个一般群体成员的平均值。在一个实施方式中，以年龄匹配方式测定健康对象中的标准水平，如对其实施本发明方法的对象与相同年龄的健康对象相比。
可以在蛋白质水平或RNA(如mRNA)水平上测定胰岛素/IGF信号传导途径中各因子的水平。
用于定量生物样品中特定蛋白的本领域已知方法均可用于本发明方法。例子包括但不限于：免疫试验、Western印迹、免疫沉淀、免疫组织化学、凝胶电泳、毛细管电泳、柱层析、配体结合试验和酶试验。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibody：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY，(1988)；Ausubel等，《新编分子生物学方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley和Sons，New York第三版，(1995)。
在优选实施方式中，用免疫试验定量蛋白质。这种试验包括均相或非均相的结合试验。这些试验可以是非竞争结合试验的形式，或者是分析物与配体竞争的试验。本领域普通技术人员已知的检测分析物(如感兴趣的蛋白)和试剂之间结合的任何方法均可用于本发明。本发明所用试验优选简单和便宜的方法，也可包括能够快速筛选大量单个样品的高通量方法。这包括(例如)采用微珠或多孔板的方法。
胰岛素/IGF途径中的因子如胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体、IGF-II受体、IRS-1、IRS-2、PI3激酶的p85亚基、Gsk-3β、磷酸化-GSK-3β、Akt和磷酸化-Akt的抗体均可购得(参见例如，Cell Signaling(Beverly，MA)；UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY))。或者，可用本领域已知的标准技术产生抗体。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibody：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1988)；Ausubel等，《新编分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，New York第三版，(1995)。
用于测定胰岛素/IGF途径中的因子，包括胰岛素、胰岛素受体、IGF-I、IGF-II、IGF-I受体、IRS亚型1-4、磷酸化的IRS、Grb-2、SHPTP-2、p85、PI3激酶、Akt和Gsk-3β的水平和功能的试验(如免疫组织化学、放射性免疫试验、配体结合、蛋白：蛋白相互作用)的例子参见Frolich等，J.Neural Transm.105：423(1998)；Folli等，Mol.Neurobiol.73：155(1996)；Unger等，Prog.Neurobiol.36：343(1991)；Saltiel等，Trends CellBiol.12：65(2002)；Giovannone等，Diabetes Metab.Res.Rev.16：434(2000)；Shpakov等，Membr.CellBiol.75：455(2000)；Sun等，Mol.Cell.Biol.13：74181993)；Lam等，J.Biol.Chem.269：20648(1994)；Kulik等，Mol.Cell.Biol.77：1595(1997)；Delcommenne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：11211(1998)；Pap等，J.Biol.Chem.273：19929(1998)；Connor等，Brain Res.Mol.Brain Res.49：283(1997)；Jafferali等，Synapse38：450(2000)；Frolich等，Ann.NYAcad.Sci.893：290(1999)；Fernandes等，Endocrine16：221(2001)和美国专利号5,198,340，各自纳入本文作参考。
本领域熟知的任何均相试验均可用于本发明，以测定特定蛋白的水平。例如，可采用放射性试验、荧光偏振试验、时间分辨的荧光试验、生物素-抗生物素蛋白试验、酶联试验和电化学发光试验。当试剂被标记时，该试验可以是测定分析物(感兴趣的蛋白)与某试剂结合的能力的非竞争性结合试验。当分析物被标记时，该试验可以是测定一种蛋白取代结合于试剂的分析物的能力的竞争性结合试验。
本发明所用的均相结合试验利用荧光来检测分析物/蛋白质结合，它可采用荧光标记的分析物或荧光标记的试剂。可用本领域普通技术人员已知的任何方法将荧光团连接于感兴趣的多肽或试剂。参见例如，Richard P.Haugland，《分子探针：荧光探针和研究化学品的手册》(Molecular Probes：Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals)1992-1994(第五版，1994，Molecular Probes，Inc.)。
本发明的一个实施方式涉及非竞争性荧光试验。这种试验采用共价连接于荧光团的试剂。游离试剂比结合于分析物的试剂的荧光强度高(Hwang等，Biochemistry57：11536(1992))。一旦形成分析物/试剂复合物后，试剂旋转和翻滚得更慢，荧光强度更低(“荧光偏振概述”(Introduction to Fluorescence Polarization)，Pan Vera Corp.，威斯康星州麦迪逊，1996年6月17日；Perrin，J.Phys.Rad.1：390(1926))。因此，当分析物和试剂结合时，标记试剂的荧光强度随结合程度成比例降低。
竞争性均相荧光试验也可用于本发明。本领域熟知竞争性试验，并且本发明可采用任何方法。例如，美国专利号6,511,815描述了一种用荧光偏振定量受试化合物与蛋白质竞争性结合的试验。
用于本发明的其它均相试验包括美国专利号6,492,128；美国专利号6,406,913；美国专利号6,326,459；美国专利号5,928,862；美国专利号5,876,946；美国专利号5,612,221和美国专利号5,556,758所述试验。
本领域技术人员应认识到，均相竞争结合试验中也可采用放射性标记。在这种试验中，对试剂(如抗体)进行放射性标记，在溶液中将该试剂与蛋白质平衡。然后，将样品加入该溶液并平衡。然后，从未结合的抗原和未结合的样品中分离抗体(结合于放射性标记的抗原或结合于样品)。可通过闪烁计数、光电射线照相术或本领域熟知的其它技术检测它。
也可用非均相试验，通过结合于试剂检测和/或定量感兴趣蛋白质。用于本发明的非均相试验可以基于放射性试验、荧光偏振试验、时间分辨的荧光试验、生物素-抗生物素蛋白试验、酶联试验和电化学发光试验。在非均相试验中，将第一组分连接于固相如珠或其它固体基材，一种或多种其它组分在溶液中。例如，抗原可结合于珠或其它固体基材，以溶液形式加入加入标记抗体。所述标记可以是放射性标记、化学发光标记、荧光标记、色原标记或本领域熟知的其它标记。混合物平衡并形成抗原/抗体复合物后，加入样品溶液并使其平衡，以形成抗原/抗体复合物。从溶液中分离珠或固体组分。当珠是磁珠时可用(例如)磁场进行分离。或者，当抗原结合于固体基材时，可简单地用水或缓冲液冲洗固体基材以去除含有未结合的标记抗体或未结合的样品的任何溶液，从而进行分离。测定抗原保持与可检测标记抗体结合的程度。可以在抗原仍然结合于珠或固体基材时进行此测定。或者，可以在从珠或固体基材上去除抗原后进行此测定。在这种竞争性结合试验中，与可检测标记相关的信号降低与样品中的抗体通过抗体取代结合抗原的能力增加成正比。
本领域技术人员认识到，抗体也可以是结合于珠或固体基材的组分。在这种实验中，以溶液形式加入标记抗原并使其平衡，以形成抗原/抗体复合物。所述标记可以是放射性标记、化学发光标记、荧光标记、色原标记或本领域熟知的其它标记。然后，以溶液形式加入样品。如果样品取代了抗体，那么该抗原回到溶液中，并且不能通过抗体结合于珠或固体基材。如上所述，从溶液中取出珠或固体基材，但保留溶液，以测定可检测标记的浓度(extent)。本文中，与可检测标记相关的信号增加与样品结合抗原的能力成正比。
用于本发明的固相支持物包括本领域已知的能够结合抗原或抗体的任何不溶性支持物。包括例如，玻璃以及天然和合成聚合物如琼脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、右旋糖苷、尼龙、淀粉酶、天然或改性的纤维素、聚丙烯酰胺和磁铁矿。支持材料可以具有基本上任何一种可能的结构，只要支持物结合分子能够结合抗体或抗原。因此，支持物结构可以是球形(如珠)或圆柱形(如试管内表面或棒的外表面)或半球形(如微量滴定板孔)。或者，该表面可以是平面如片层、测试条等。本领域技术人员知道用于结合抗体或抗原的许多其它合适载体，或者能够通过常规试验确定合适载体。
用于本发明的非均相试验的例子是放射性试验。放射性试验的良好描述可参见《分子生物学中的实验室技术和生物化学》(Laboratory Techniques and Biochemistry inMolecular Biology)，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)，具体参见Chard，T编撰的题为“放射性免疫试验和相关技术概论”(An Introduction toRadioimmune Assay and Related Techniques)的章节。其它竞争性放射性试验的例子参见美国专利号3,937,799；4,102,455；4,333,918和6,071,705。这种试验中固有的特征是需要将珠或基材结合组分与溶液组分分离开。已经开发了完成所需分离的各种方式，包括美国专利号3,505,019；3,555,143；3,646,346；3,720,760和3,793,445所述的方式。本领域技术人员了解，分离可包括过滤、离心、洗涤或排出固体基材，以确保有效分离基材结合组分和溶液相。
可通过以下方式检测放射性同位素或放射性标记物，例如采用γ粒子计数器或闪烁计数器或采用放射性自显影。特别用于本发明目的的同位素是：3H、123I、125I、131I、35S、31P、14C、111In、97Ru、67Cu、67Ga、68Ga、72As、89Zr和201T1。本领域普通技术人员知道可用于本发明的其它合适的标记物。可用本领域普通技术人员一般了解的标准技术完成这些标记物与抗原或抗体的结合。典型技术参见Kennedy等(Clin.Chim.Acta70：1(1976))和Schurs等(Clin.Chim.Acta81：1(1977))。在具体实施方式中，用本领域熟知方法用3H和14C取代抗原或抗体的一个或多个氢和/或碳原子。
用于本发明非均相试验的其它标记物包括化学发光标记物(如美国专利号4,380,580所述)和酶底物标记物(如美国专利号4,492,751所述试验)。例如，可采用荧光标记。
用于本发明的另一种非均相试验是基于生物素/抗生物素蛋白的试验。可以在本发明中进行该试验的各种方式的例子参见例如，Blake等，Anal.Biochem.272：123(1999)；Cho等，Anal.Sci.15：343(1999)；Choi等，Bull.Korean Chem.Soc.22：417(2001)；美国专利号6,096,508；4,863,876；4,228,237。在本发明中，可用任何标记物标记抗生物素蛋白。优选将抗生物素蛋白荧光标记或偶联于酶。任何可检测标记的酶均可用于本发明。特定例子包括但不限于：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。
为了测定特定RNA的水平，本发明可以采用本领域已知用于检测核酸的任何试验。例子包括但不限于：逆转录和扩增试验、杂交试验、Northern印迹、点印迹、原位杂交、凝胶电泳、毛细管电泳和柱层析。参见例如，Ausubel等，《新编分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley和Sons，New York第三版，(1995)；Sambrook等，《分子克隆-实验室手册》(Molecular Cloning—ALaboratoryManual)，第2版，第1-3卷(1989)。该试验可检测RNA本身或通过逆转录RNA产生的cDNA。可以直接在生物样品上或者在分离自该样品的核酸上进行试验。
核酸检测试验可以基于核酸分子的任何特征，如其大小、序列，如果是DNA，还有对限制性核酸内切酶消化的易感性。可通过改变报道检测或观察者获得信号的方式提高这种试验的灵敏度。因此，例如，可通过采用可检测标记的试剂提高试验灵敏度。各种标记物可用于此目的。可检测标记物包括例如：放射性同位素、荧光标记物、化学发光标记物、生物发光标记物和酶标记物。美国专利号4,581,333描述了用酶标记提高检测试验的灵敏度的应用。美国专利号4,358,535和4,446,237中公开了放射性同位素标记物。荧光标记物(EP144，914)、化学标记物(美国专利号4,582,789和4,563,417)和修饰碱基(EP119,448)也可用于提高观察检测过程的有效性。
目前，鉴定和定量核酸的许多方法依赖于扩增和/或杂交技术。虽然这些方法中许多都包括了分离步骤，但已经开发了几种无需从反应中分离标记的引物或探针即可检测核酸的方法。与基于凝胶的方法如凝胶电泳和点印迹分析相比，这些方法具有许多优点，并且需要的时间较少、能进行高通量分析、防止残留物污染并能通过实时检测进行定量。这些现有方法中大部分是采用两种生色团的基于溶液的荧光法。这些方法利用荧光共振能量转移(FRET)的现象，即当两个分子相互足够靠近时，能量就从激发的荧光部分转移到受体分子上。这种转移防止了激发的荧光部分以光子形式释放能量，因此不会使荧光部分的荧光淬灭。当受体分子靠得不足够近时，不发生转移，则激发的荧光部分发荧光。基于FRET的系统的主要缺点是在检测寡核苷酸时需要存在两种修饰的核苷酸的成本和在给定的试验条件下淬灭效能可能不足以提供可用的信号差异。能够在不分离的情况下进行检测的其它已知方法是：发光共振能量转移(LRET)，其中能量转移发生在敏化的镧系金属和受体染料之间(Selvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：10024(1994))；以及在互补靶的存在下两个相邻芘环可形成激基缔合物(荧光二聚体)时形成激基缔合物的染料颜色改变，导致荧光峰发生可检测的偏移(Paris等，NucleicAcids Res.26：31S9(1998))。
本领域技术人员知道用于扩增核酸分子的各种方法。通常，将核酸靶分子用作聚合酶催化反应中寡核苷酸引物延伸的模板。例如，Panet等(J.Biol.Chem.249：5213(1974))证明了结合于纤维素的多脱氧核糖核苷酸模板的复制。Kleppe等(J.Mol.Biol.55：341(1971))公开了将双链和单链DNA分子用作合成互补DNA的模板。
其它已知的核酸扩增方法包括基于转录的扩增体系(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：1173(1989)；WO88/10315)。也采用基于在序列与连接反应产物的序列互补的靶核酸的存在下连接两种或多种寡核苷酸的方案(＂连接链反应＂)(Wu等，Genomics4：560(1989))。本领域已知基于退火至互补核酸后连接两种寡核苷酸的扩增核酸的其它合适方法。
WO89/06700公开了一种序列扩增方案，该方案基于将启动子/引物序列杂交于目标单链DNA(“ssDNA”)后转录该序列的许多RNA拷贝核酸。此方案不是循环的，即得到的RNA转录物中不产生新模板。
EP329,822公开了称为基于核酸序列的扩增(NASBA)的另一种扩增方法。NASBA是一种核酸扩增方法，其包括循环合成单链RNA(＂ssRNA＂)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。ssRNA是第一引物寡核苷酸的第一模板，它通过逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)延伸。然后，通过核糖核酸酶H(RNA酶H，它是对与DNA或RNA形成双链体的RNA特异的一种RNA酶)的作用从得到的DNA:RNA双链体中去除RNA。得到的ssDNA是第二引物的第二模板。第二引物包括位于引物序列5′的RNA聚合酶启动子(如T7RNA聚合酶)的序列，第二引物与ssDNA模板杂交。然后，用DNA聚合酶(例如大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I的大＂冈崎＂片段)延伸此引物，产生dsDNA分子，其序列与位于引物之间的原始RNA部分的序列相同，此外，它一端具有启动子序列。可通过合适的RNA聚合酶使用此启动子序列，以制备该DNA的许多RNA拷贝。然后，这些拷贝可以再次进入该循环，导致扩增非常迅速。通过适当地选择酶，可以等温方式完成此扩增方法，并且在各循环中无需加入酶。由于此方法的循环特性，可选择起始序列，使其为DNA或RNA形式。
美国专利号5,455,166和EP684315公开了称为链取代扩增(SDA)的方法。在单一温度下进行此方法，它采用聚合酶、核酸内切酶和修饰的三磷酸核苷的组合来扩增靶DNA序列的单链片段。使靶序列片段化，制成单链并杂交于含有核酸内切酶识别位点的引物。然后，用聚合酶以三磷酸核苷的混合物延伸引物：靶标复合物，其中一种是经过修饰的。结果是含有原始靶序列和核酸内切酶识别序列的双链体分子。构成识别序列的一条链衍生自引物，另一条链是延伸反应的结果。由于用修饰的核苷酸进行延伸反应，所以修饰了识别位点的一条链，该链对核酸内切酶消化有抗性。然后，使得到的双链体分子接触能切割未修饰链引起缺口的核酸内切酶。用缺少5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶延伸这种有缺口的链，导致替换了这种有缺口的链并产生了新的双链体分子。然后，这种新的双链体分子可进行多轮缺口和延伸步骤，以产生多个拷贝的靶序列。
使用最广泛的核酸扩增方法是聚合酶链反应(PCR)。以下文献中提供了PCR的详细描述：Mullis等，ColdSpringHarborSymp.Quant.Biol.57：263(1986)；EP50，424；EP84，796；EP258，017；EP237，362；EP20l，184；美国专利号4,683,202；4,582,788；4,683,194。在最简单的形式中，PCR包括扩增靶双链核酸序列。使双链序列变性，将寡核苷酸引物退火到得到的各条单链上。选择引物序列，使它们能杂交到待扩增双链核酸序列部分的侧翼部分中。用聚合酶、三磷酸核苷酸和合适的辅因子的反应延伸寡核苷酸，导致形成各自含有靶序列的两条双链分子。随后各轮变性、退火和延伸反应导致靶序列的拷贝数倍增，其中前一轮的延伸产物用作后一复制步骤的模板。因此，PCR提供了一种选择性增加具有特定序列的核酸分子浓度的方法，即使该分子之前未经纯化并且在特定样品中仅以单拷贝存在。该方法可用于扩增单链或双链核酸。该方法的本质包括采用两种寡核苷酸作为模板依赖性、聚合酶介导的复制所需核酸分子的引物。
检测核酸扩增产物的方法通常采用凝胶电泳，凝胶电泳能够根据大小差异区分扩增产物与引物。或者，可通过固定产物(可以洗涤掉游离引物(如在点印迹分析中))并用传统的固相杂交法杂交特异性探针来检测扩增产物。已经描述过无需先分离引物或探针而检测扩增过程的几种方法。所有这些方法都基于FRET。
美国专利号5,348,853和Wang等，Anal.Chem.67：1197(1995)中描述的一种方法采用能量转移体系，该体系中能量转移发生在两个探针上的荧光团之间。此方法中，在扩增反应器中检测扩增的分子，无需分离步骤。Wang等的方法采用与反向引物互补的＂能量下沉＂寡核苷酸。＂能量下沉＂和反向引物寡核苷酸分别具有供体和受体标记物。在扩增之前，标记的寡核苷酸形成其中能自由发生能量转移的引物双链体。然后，不对称PCR进行至晚对数期，其中靶链中的一条链显著过量产生。
不需要先分离引物和产物就可检测扩增产物的第二种方法是5′核酸酶PCR试验(也称为TAQMAN
Figure S05841558320070606D00016123210QIETU
试验)(Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：7276(1991)；Lee等，Nucleic Acids Res.27：3761(1993))。此试验通过扩增反应期间双标记的荧光探针(TAQMAN
Figure S05841558320070606D00016123214QIETU
探针)的杂交和切割检测特定PCR产物的累积。荧光探针由荧光报道染料和淬灭染料标记的寡核苷酸组成。在PCR过程中，如果此探针与扩增的节段杂交，就会被DNA聚合酶的5′-核酸外切酶活性切割。切割探针使得报道染料的荧光强度增加。在TAQMAN试验中，供体和淬灭物优选定位于探针的3′-和5′-端，因为在荧光团和淬灭物之间进行5′-3′水解的要求仅在这两部分互相不太靠近时才能被满足(Lyamichev等，Science260：778(1993))。
检测扩增产物的另一种方法(即MOLECULAR BEACONS)依赖于采用＂信标探针＂(beacon probe)的能量转移，如Tyagi和Kramer所述(Nature Biotech.14：303(1996))。此方法采用可形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5′-或3′-端)，有供体荧光团，但在另一端，有受体部分。在Tyagi和Kramer的方法中，受体部分是淬灭物，即受体吸收供体释放的能量，但它本身不发荧光。因此，当信标是开放构象时，可以检测到供体荧光团的荧光，但当信标是发夹(闭合)构象时，供体荧光团的荧光淬灭。用于PCR时，杂交于PCR产物的一条链的信标探针是＂开放构象＂并能检测到荧光，而仍未杂交的探针则不发荧光。结果是，荧光量将随PCR产物量增加而增加，因此可用于测定PCR进程。
另一种依赖于采用能量转移检测扩增产物的方法是Nazarenko等的SUNRISEPRIMER法(Nucleic Acids Res.25：2516(1997)；美国专利号5,866,336)。SUNRISEPRIMERS基于FRET和非荧光淬灭的其它机制。SUNRISE PRIMERS由5′端具有发夹结构的单链引物组成。用供体/淬灭物对标记发夹结构主干。聚合酶使发夹序列展开并复制它时产生信号。
另一种检测扩增产物的方法是实时定量PCR(Xu等，J.Biol.Chem.278：26929(2003)；Yeon等，Hepatology35：703(2003))。在此技术中，用荧光报道物(如嵌入性染料如SYBR Green(Molecular Probes))监测PCR反应的发生。产物随着各连续的扩增轮次累积，因此报道物分子的荧光增加。荧光略微高于基线的点可用于测定样品中模板的起始量。
在本发明的一个实施方式中，提供了用于诊断AD的诊断试剂盒。该试剂盒可用于测定获自对象的生物样品中胰岛素/IGF信号传导途径的至少一种因子的水平或功能。在此实施方式中，提供了包括一个或多个容器的试剂盒，所述容器中含有可用于测定胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能的至少一种检测试剂。检测试剂包括但不限于：特异性结合于胰岛素/IGF信号传导途径中的因子的一种或多种抗体，能够杂交于编码胰岛素/IGF信号传导途径中的因子的多核苷酸的一种或多种寡核苷酸，可用于扩增编码胰岛素/IGF信号传导途径中的因子的多核苷酸的一对或多对引物，或者胰岛素/IGF信号传导途径中的因子可对其起作用的一种或多种酶底物。在各种其它实施方式中，试剂盒也可包括(例如)缓冲剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒也可包括检测检测试剂所必需的组件(如酶或底物)。试剂盒也可包含可测定并与受试样品作比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒的各个组件通常装在单独的容器中，所有各种容器都在一个包装中，该包装中还包括观察受试对象是否患有AD或处于发生AD的风险中的说明书。
本发明一方面提供了一种在对象中治疗、改善或预防AD的方法。在某些实施方式中，该方法包括给予所述对象治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂。
本发明另一方面涉及一种改善AD患者的精神的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂。
本发明另一方面涉及一种减少AD患者的记忆力丧失的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂。
在本发明的一个实施方式中，将治疗有效量的胰岛素激动剂和治疗有效量的IGF激动剂给予出现AD早期症状或提示前AD病症的症状的对象，以防止对象发生AD的进一步进展或发生AD。这种对象包括诊断有中度或轻度认知障碍的对象，所述中度或轻度认知障碍的特征是认知缺陷的严重程度不足以分类为痴呆，但可能是AD的先兆或其早期阶段。可以拯救对象的AD早期阶段包括对应于Braak阶段1-3的阶段。在这些阶段，脑中生长因子和生长因子受体的表达开始改变，但其表达还不属于AD严重阶段(如Braak阶段4-6)的水平。因此，仍可通过给予生长因子和其它治疗剂拯救处于AD早期阶段的对象。
本文所用术语＂胰岛素激动剂＂指已经使用、目前使用或已知可用于通过提高胰岛素水平或对胰岛素的敏感性而治疗糖尿病的物质。
在一个实施方式中，胰岛素激动剂是已经使用、目前使用或已知可用于刺激胰岛素依赖性信号传导途径的胰岛素受体的任何激动剂。胰岛素激动剂的例子包括：纯化的天然产生胰岛素(如ILETIN)，重组胰岛素(如HUMULIN)，胰岛素功能性衍生物以及胰岛素类似物和模拟物(即能够结合于胰岛素受体并刺激胰岛素刺激的一种或多种相同信号的衍生物、类似物和模拟物)。胰岛素类似物和模拟物的例子包括胰岛素aspart(NOVOLOG)、胰岛素glargine(LANTUS)、胰岛素lispro(HUMALOG)、LysB28ProB29-胰岛素、AspB28-胰岛素、desPro828-胰岛素、desProB28desThrB30-胰岛素desPheB25desThrB30-胰岛素、desTyrB26desThrB30-胰岛素、SerA21desProB28-胰岛素、GlyA21desProB28-胰岛素、GlyA21desPheB25-胰岛素、AspA21desPheB25-胰岛素、HisB25desTyrB26desThrB30-胰岛素、AsnB25desTyrB26desThrB30-胰岛素、AspA21desPheB25desThrB30-胰岛素、AspB28desPheB25-胰岛素、AspB3desPheB25-胰岛素、LysB28ThrB29-胰岛素、ArgB28desLysB29-胰岛素、GlyA21desThrB27-胰岛素、GlyA21TrrB3desThrB27-胰岛素、AlaA21ThrB3desThrB27-胰岛素、GlyA21AspB3desThrB27-胰岛素、AlaA21AspB3desThrB27-胰岛素、desThrB27desThrB30-胰岛素、GluB27-胰岛素、IleB12-胰岛素、TyrB12-胰岛素、AspA21GluB27-胰岛素、AspB9-胰岛素、AspA21AspB9GluB27-胰岛素、AspB9GluB27-胰岛素、GlyA12-胰岛素、ThrA12-胰岛素、GlyA12HisA19-胰岛素、PheA14-胰岛素、GlyA14-胰岛素、ThrA12GlyA14-胰岛素、ProA10TrpA13-胰岛素、LysB28-胰岛素、desPheB25desThrB30-胰岛素、desPheB25-胰岛素和AspA21desPheB25desThrB30-胰岛素。这种物质的其它例子参见美国专利号6,800,606、6,686,177、6,630,348、6,620,780、6,610,649、6,451,762、6,444,641、6,329,431、6,323,311、6,251,856、6,221,837、6,221,633、6,197,926、6,100,376、6,093,697、6,011,007、5,970,973、5,962,267、5,952,297、5,922,675、5,851,988、5,840,680、5,834,422、5,830,918、5,750,497、5,747,642、5,716,927、5,693,609、5,656,722、5,650,486、5,618,913、5,597,893、5,559,094、5,547,930、5,547,929、5,514,646、5,506,202、5,504,188、5,474,978、5,461,035、5,461,031、5,268,453、5,208,217、5,164,366、5,157,021、5,149,777、5,149,716、5,049,545、5,028,586、5,008,241、4,992,418、4,992,417、4,959,351、4,946,828、4,701,440、4,639,332和4,489,064，以及WO95/13823，各自纳入本文作参考。
在另一实施方式中，胰岛素激动剂是已经使用、目前使用或已知可用于治疗胰岛素抗性和/或II型糖尿病的物质。在一个实施方式中，该物质是胰岛素增敏剂。胰岛素增敏剂包括但不限于：双胍(如二甲双胍(GLUCOPHAGE))、噻唑烷二酮(如罗西格列酮(AVANDIA)、吡格列酮(ACTOS)、曲格列酮(REZULIN)、恩格列酮和环格列酮)和MBX-102(卤化物的对映异构体)。其它有用的噻唑烷二酮包括以下文献所述的噻唑烷二酮：美国专利号6,787,551、6,288,096、6,130,216、6,046,202、5,990,139、5,965,589、5,811,439、5,716,975、5,489,602、5,478,852、5,457,109、5,441,971、5,326,770、4,725,610、4,697,020和4,687,777，以及Hulin等，J.Med.Chem.35：1853(1992)。可用于治疗胰岛素抗性的其它物质包括胰岛素促分泌素，包括氯茴苯酸类(如瑞格列奈(PRANDIN)和那格列奈(STARLIX))、磺酰脲(如甲苯磺丁脲、氯磺丙脲(DIABINASE)、妥拉磺脲(TOLINASE)、格列本脲(MICRONASE、DIABETA)、glypizide(GLUCOTROL)和格列美脲(AMARYL))，以及α-葡糖苷酶抑制剂(如阿卡波糖(PRECOSE)和米格列醇(GLYSET))。其它有用的物质包括过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂，包括PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-δ的激动剂，如美国专利号6,713,514、6,677,298、6,462,046、5,925,657和5,326,770以及Combs等，J.Neurosci.20:558(2000)所述。在AD患者中使用PPAR-δ激动剂可能具有提高I型肌纤维数量的额外优点，这可能产生对肥胖的抗性并提高代谢水平，即使是在缺少锻炼的情况下(Wang等，PLoS Biol.2：3294(2004))。其它有用的物质包括β3-肾上腺素能受体激动剂(美国专利号6,649,603、6,605,618、6,583,140、6,569,873、6,537,994、6,525,202、6,514,991、6,509,358、6,506,901、6,498,170、6,465,501、6,458,817、6,451,814、6,444,685、6,410,734、6,395,762、5,972,881)和类视黄醇X受体激动剂(美国专利号6,593,493、6,521,633、6,316,404、6,228,862、6,028,052)。可以采用的其它物质包括铬、多巴胺激动剂(美国专利号5,468,755、5,597,832、5,602,120、5,602,121)、丙酮酸和丙酮酸前体(美国专利号5,472,980、5283,260)以及苯并噻二嗪(如二氮嗪)。可用于治疗胰岛素抗性的物质的其它例子参见美国专利号6,787,556、6,765,021、6,765,013、6,713,508、6,699,896、6,693,094、6,683,107、6,677,352、6,673,815、6,649,628、6,646,004、6,645,997、6,624,194、6,613,802、6,521,665、6,521,633,6,515,003、6,509,360、6,451,845、6,451,827、6,444,670、6,414,002、6,391、897、6,376,495、6,369,072、6,310,081、6,284,787、6,262,118、6,251,936、6,251,924、6,248,764、6,232,322、6,221,902、6,214,877、6,214,842、6,207,714、6,166,069、6,117,899、6,110,962、6,103,708、6,063,815、6,015,558、5,948,810、5,730,975、5,693,664、5,646,168、5,641,796、5,545,672、5,463,070和4,980,350，以及Shinkai等，J.Med.Chem.41：1921(1998)，各自纳入本文作参考。
本文所用术语＂IGF激动剂＂指已经使用、目前使用或已知可用于刺激IGF依赖性信号传导途径的IGF受体的任何激动剂。
IGF激动剂的例子包括纯化的天然或重组IGF蛋白、IGF功能性衍生物以及IGF类似物和模拟物(即能够结合于IGF受体并刺激IGF刺激的一种或多种相同信号的衍生物、类似物和模拟物)。IGF类似物的例子包括IGF-I的D类似物、长-Arg3-IGF-I、Val59-IGF-I、AlaGlu-IGF-I、Ala63-IGF-I、Ser1Ala63Val70-IGF-I、Leu24，59，60Ala31-IGF-II、Gln6Ala7Tyr18Leu19Leu27-IGF-II、Gly1-IGF-II、Leu27-IGF-II和Gln37Gln38-IGF-II。也包括干扰IGF与IGF结合蛋白结合、从而增加可用于结合IGF受体的循环IGF的量的物质。其它IGF功能性衍生物、激动剂和模拟物的例子参见美国专利号6,750,321、6,743,894、6,723,699、6,716,586、6,713,451、6,693,079、6,693,078、6,693,076、6,689,751、6,683,053、6,680,298、6,677,305、6,645,775、6,635,619、6,632,794、6,620,789、6,608,031、6,608,028、6,509,443、6,506,874、6,420,518、6,403,764、6,358,916、6,342,227、6,251,865、6,235,874、6,121,416、5,854,025、5,776,897、5,736,363、5,708,134、5,703,045、5,652,214、5,622,932、5,473,054、5,470,828、5,273,966、5,028,531、5,019,500、4,876,242和4,745,179，各自纳入本文作参考。
本文所用术语＂治疗有效量＂指足以改善疾病的一种或多种症状、或预防疾病进展、或引起疾病消退的治疗剂的量。例如，治疗AD时，治疗有效量优选指治疗剂的一种量，与不用本发明时相比，该量能减轻AD症状、延长AD症状进展的时间或使存活期延长至少5％、优选至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。
本文所用术语“预防”指减小对象出现AD病状的概率。预防可以是完全预防，如对象完全不出现AD病状。预防也可以是部分预防，使对象出现AD病状的概率小于不用本发明时的概率。
本文所用术语＂协同性＂指当第一种物质和第二种物质一起给予(如同时或相继给予)时获得的效果大于单独给予第一种物质和第二种物质的效果之和。协同作用能够允许给予的第一种物质和/或第二种物质剂量较低，或在剂量相同时提供更大的功效。获得的协同作用可以比单独给予第一种物质和第二种物质的效果之和高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％或至少500％。
可在显示AD所产生病状的对象、怀疑显示AD所产生病状的对象和处于显示AD所产生病状的风险中的对象中进行本发明治疗方法。例如，可对具有发生AD的遗传倾向的对象进行预防性治疗。可治疗显示AD症状的对象，以减轻症状、或者减缓或防止症状的进一步发展。本文中显示，与AD的严重程度增加相关的身体改变为进行性。因此，在本发明的一个实施方式中，可治疗显示AD病状轻微症状(如对应于轻微认知障碍或Braak阶段1-3)的对象，以改善症状和/或防止症状的进一步发展。
可通过几种测试(参见Gershon等，《精神药品的临床评价：原理和指南》(ClinicalEvaluation of Psychotropic Drugs：Principles and Guidelines)，Prien和Robinson(编)，Raven Press，Ltd.，New York，1994，第467页)中的任何一种测定AD的认知行为(如精神、记忆力)。一种这样的测试是BCRS，它经设计能仅测定认知功能：关注、近期记忆、远期记忆、方向感、机能和自我护理能力。此测试以及Weschler记忆力尺度和阿尔茨海默病-相关性尺度可用于测定治疗性治疗后的改善。如果Weschler记忆力尺度测试中常态定向(direction of normality)有统计学显著性差异，则存在精神改善或记忆力丧失减少。例如，将治疗患者的表现的测试结果与安慰剂组成员相比，或在给予同一患者的后续测试之间进行比较。
可以任何合适方式给予胰岛素激动剂和IGF激动剂，如脑室内(如用脑室内支架)、颅内、腹膜内、静脉内、动脉内、鼻内或口服。在一个实施方式中，胰岛素激动剂和IGF激动剂能够穿过血脑屏障。常常发现AD患者的血脑屏障的情况恶化，这有利于胃肠道外给予的物质穿过该屏障。在另一实施方式中，该物质可偶联于靶分子如转铁蛋白，血脑屏障上有它们的受体。参见例如，美国专利号4,902,505。在另一实施方式中，可修饰所述物质，使其极性降低或疏水性升高，因为疏水性更高(极性更低)的物质，更易于穿过血脑屏障。参见例如，美国专利号5,260,308。在其它实施方式中，可选择和采用疏水(非极性)物质。在另一实施方式中，可以在脂质体，尤其是靶向血脑屏障的脂质体中给予该物质。参见例如，美国专利号6,372,250。在脂质体中给予药物是已知的。
在一个实施方式中，可将表达胰岛素激动剂和/或IGF激动剂(如重组表达)的细胞给予中枢神经系统。在另一实施方式中，细胞既表达胰岛素激动剂又表达IGF激动剂。可采用可通过遗传改变表达胰岛素激动剂和/或IGF激动剂的任何细胞类型。在一个实施方式中，所述细胞是干细胞，如胚胎、青少年或成年人干细胞，神经干细胞，祖细胞，多能细胞等。准备给予的细胞可以是接受者的异体、自体或异种细胞。
可通过以下方法获得胚胎干细胞：从胚泡的内细胞群分离细胞，在抑制细胞分化的生长因子(如白血病抑制因子)的存在下、在饲养细胞层(如成纤维细胞)上培养细胞。参见例如，美国专利号6,200,806、5,843,780、5,690,926，和5,453,357。或者，可以在用饲养细胞任选地调节的培养基存在下、在细胞外基质(如来自裂解的饲养细胞层)上培养分离的内细胞群细胞，如美国专利号6,800,480和6,642,048所述。分离胚胎干细胞的其它方法参见美国专利号5,166,065。
神经干细胞可分离自已知含有干细胞的CNS的任何区域，如前脑、大脑皮层、小脑、中脑、海马区、脑干、脊髓和脑室组织，以及其中的特定亚区域，如基底神经节、前亚脑室区、间脑、端脑或室管膜/亚室管膜区。人神经干细胞可获自流产的胎儿组织、青少年或成年人器官捐献者、神经组织活检样品或神经手术中切除的组织。可以通过在悬液中或在基质上培养以体外增殖获自神经组织的细胞，优选采用指定的培养基以避免细胞分化。可将增殖诱导性生长因子加入培养基，如表皮生长因子、双调蛋白、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子α和它们的组合。加入分化诱导性生长因子，如神经生长因子、血小板衍生生长因子、促甲状腺素释放激素、转化生长因子β或胰岛素样生长因子后，细胞也可在体外分化(例如)成神经元、星形细胞和/或少突胶质细胞。也可通过在引起分化的基质，如MATRIGEL、胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白或聚-L-赖氨酸上培养使细胞分化。合适的神经干细胞和分离方法的例子包括美国专利号6,812,027、6,787,353、6,734,015、6,497,872、6,251,669、5,968,829、5,851,832、5,753,505、5,589,376和5,411,883所述的例子。可分化为神经细胞的非神经干细胞的例子包括美国专利号6,749,850和美国公开申请号2004/0107453所述的例子。
可用本领域已知的任何方法对细胞进行遗传工程改造，以使其表达胰岛素激动剂和/或IGF激动剂。参见例如，Ausubel等，《新编分子生物学方法》(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley和Sons，New York第三版，(1995)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，第2版，(1989)。编码胰岛素激动剂和/或IGF激动剂的核酸(DNA或RNA)可以是合成的、天然产生的或是它们的组合，并可含有基因、基因部分或其它有用DNA序列，如可选择标记物或调节序列如启动子、增强子等。启动子可以是外源性启动子，如巨细胞病毒或猿病毒40，非特异性内源性启动子如胶原、或神经细胞特异性启动子如酪氨酸羟化酶、苯基乙醇胺N-甲基转移酶或胆碱乙酰基转移酶。不难获得胰岛素、IGF-I和IGF-II的核苷酸和氨基酸序列。可用本领域熟知方法修饰核苷酸序列，以编码胰岛素激动剂和/或IGF激动剂，如上所述。编码胰岛素激动剂和/或IGF激动剂的核酸可掺入任何合适载体以递送入细胞，这些载体如质粒、病毒、人工染色体、同源重组序列等。可通过病毒载体(如逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒)或直接转染(如脂质转染、磷酸钙转染、电穿孔)将核酸引入细胞中。制备核酸构建物并将构建物递送至干细胞，尤其是胚胎干细胞或神经干细胞的方法的例子参见美国专利号6,713,247、6,541,255、6,528,306、6,514,761、6,399,384、6,392,118、6,312,949、6,284,539、6,281,009、6,054,575、5,958,767、5,849,553、5,750,376、5,032,407和4,959,313。
可将表达胰岛素激动剂和/或IGF激动剂的细胞直接给予中枢神经系统，如直接给予脑、脑室或硬膜下。在一个实施方式中，将细胞移植入损伤或功能障碍的区域。将细胞给予中枢神经系统以表达治疗性蛋白或其它因子的方法是本领域已知的。优选将细胞给予特定区域，优选正在发生或已经发生神经变性的区域。细胞可单独引入或与合适的生物相容性运载体、基质、物理屏障等一起引入。可以单次注射或多次注射到一个或多个部位的方式给予细胞。在一个实施方式中，给予大约104-108个细胞。将细胞给予CNS的合适方法包括美国专利号6,497,872、5,871,767、5,762,926、5,650,148和5,082,670所述的方法。
本发明的一些实施方式提供了给予治疗有效量的胰岛素激动剂和IGF激动剂的方法。在一些实施方式中，预计胰岛素激动剂和IGF激动剂的组合的效果优于单独给予其中一种物质。在其它实施方式中，预计与单独给予一种物质相比，胰岛素激动剂和IGF激动剂的组合能产生协同作用(即大于加成作用)。
在本发明的一些实施方式中，将胰岛素激动剂和IGF激动剂分别给予对象，如作为两种分开的组合物。在其它实施方式中，作为单一组合物的一部分给予胰岛素激动剂和IGF激动剂。
在本发明的一些实施方式中，在以下一种或多种条件下将胰岛素激动剂和IGF激动剂给予对象：不同周期、不同持续时间、不同浓度、不同给药途径等。在一些实施方式中，在IGF激动剂之前给予胰岛素激动剂，如在给予IGF激动剂前0.5、1、23、4、5、10、12或18小时，1、2、3、4、5或6天，或者1、2、3或4周。在一些实施方式中，在IGF激动剂之后给予胰岛素激动剂，如在给予IGF激动剂后0.5、1、2、3、4、5、10、12或18小时，1、2、3、4、5或6天，或者1、2、3或4周。在一些实施方式中，胰岛素激动剂和IGF激动剂同时给予但具体方案不同，如胰岛素激动剂每天给药，而IGF激动剂每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次或每四周给药一次。在其它实施方式中，胰岛素激动剂每周给药一次，而IGF激动剂每天给药、每周给药一次、每两周给药一次、每三周给药一次或每四周给药一次。
可以在给予IGF激动剂的同时连续给予胰岛素激动剂。此外，可以在给予IGF激动剂后继续给予胰岛素激动剂，反之亦然。
在本发明的某些实施方式中，与IGF激动剂联合给予胰岛素激动剂的方法可重复至少一次。可按照需要重复该方法多次，以达到或维持治疗反应，如1-10次或更多次。每次重复该方法时，胰岛素激动剂和IGF激动剂可以与前一次重复中所用的相同或不同。此外，各次重复中给予胰岛素激动剂和IGF激动剂的时间以及给予它们的方式可以不同。
本发明物质可连接于载体分子以提高化合物的分子摄取。这种载体分子的例子包括如Fulda等，Nature Med.5：808(2002)，Arnt等，J.Biol.Chem.277：44236(2002)和Yang等，Cancer Res.63：831(2003)所述的载体肽、促融肽(参见例如美国专利5,965,404)以及病毒和病毒部分，如空衣壳和病毒血凝素(参见例如，美国专利号5,547,932)。其它载体分子包括细胞表面受体的配体如脱唾液酸糖蛋白(结合于脱唾液酸糖蛋白受体；参见美国专利号5,166,320)以及细胞表面受体的抗体，例如T细胞特异性抗体如抗-CD4抗体(参见美国专利号5,693,509)。
本发明范围内的组合物包括其中本发明物质的含量能有效实现所需目的的所有组合物。虽然个体需求不同，但本领域技术人员能够测定各组分的有效量的最优范围。本领域普通医生考虑了给药途径，对象的年龄、体重和健康状况，以及AD阶段，当然还有该物质的任何副作用、该物质的功效并按照医疗方法和实践惯例不难确定实际剂量和治疗方案。一般地，可将该物质给予哺乳动物如人，口服剂量为每天按准备治疗AD的哺乳动物体重给予0.0025-50mg/kg(或其药学上可接受的盐的等效量)。优选地，口服给予约0.01-10mg/kg，以治疗、改善或预防AD。对于肌肉内注射，该剂量通常约为口服剂量的一半。例如，合适的肌肉内剂量约为0.0025-25mg/kg，最优选约为0.01-5mg/kg。在某些实施方式中，由于组合的加成或协同作用，给予胰岛素激动剂和IGF激动剂中一种或两种的剂量可低于本领域所用剂量。
单位口服剂量可包含约0.01-50mg，优选约0.1-10mg各物质。作为各自含有约0.1-10、通常约0.25-50mg该物质的一个或多个片剂或胶囊，单位剂量每天可给予一次或多次。
除了作为原始化学品给予本发明物质外，还可作为含有合适的药学上可接受的载体的药物制剂的一部分给予该物质，所述载体包含赋形剂和助剂，它们有利于将化合物加工成可进行药学应用的剂型。该剂型，尤其是可口服或局部给予和可用于优选给药形式的剂型，如片剂、糖衣锭剂、缓释锭剂和胶囊、漱口液和漱口水、凝胶、悬浮液、洗发液、发胶、洗发精以及可直肠给予的剂型如栓剂，还有用于注射给药、局部给药或口服给药的合适溶液，优选含有约0.01-99％，优选约0.25-75％的活性化合物，还含有赋形剂。
本发明药物组合物可给予可获得本发明化合物的有益效果的任何对象。所述对象主要是哺乳动物，如人，但本发明不限于此。其它动物包括兽医动物(牛、绵羊、猪、马、犬、猫等)。
该化合物和其药物组合物可通过能实现其所需目的的任何方式给药。例如，给药可以是胃肠道外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、透皮、含服、鞘内、颅内、鼻内或局部途径。或者或同时，给药可以是口服途径。给药剂量取决于接受者的年龄、健康状况和体重，同时治疗的种类(如果有)，治疗频率以及所需效果的特性。
本发明药物制剂的制造方式本身是已知的，例如以下常规方式：混合、造粒、糖衣锭剂制备、溶解或冻干方法。因此，可通过以下方式获得用于口服的药物剂型：将活性化合物与固体赋形剂混合，任选地，加入合适助剂(如果需要或必要)后研磨得到的混合物并加工该颗粒混合物，获得片剂或糖衣锭剂芯。
具体说，合适赋形剂是填料如糖(如乳糖或蔗糖、甘露醇或山梨糖醇)、纤维素制剂和/或磷酸钙(如磷酸三钙或磷酸氢钙)以及粘合剂如淀粉糊，例如用玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮制备的淀粉糊。如果需要，可加入崩解剂，如上述淀粉以及羧甲基-淀粉、交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐(如藻酸钠)。首先，助剂是流动调节剂和润滑剂，例如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸或其盐(如硬脂酸镁或硬脂酸钙)和/或聚乙二醇。给糖衣锭剂芯提供合适的糖衣，如果需要该糖衣能抵抗胃酸。出于这个目的，可采用浓缩的糖溶液，其中可任选地含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。为了产生能抵抗胃酸的糖衣，采用了合适的纤维素制剂如乙酰基纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基-纤维素邻苯二甲酸的溶液。可将染料或颜料加入片剂或糖衣锭剂糖衣，用于(例如)区分识别或表征活性化合物剂量组合。
可口服使用的其它药物剂型包括由明胶制成的推入装配(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。推入装配胶囊可含有颗粒形式的活性化合物，其中可以混有填料如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁，以及任选的稳定剂。在软胶囊中，活性化合物优选溶解或悬浮于合适的液体，如脂肪油或液体石蜡中。此外，可加入稳定剂。
可能进行直肠应用的药物制剂包括例如：栓剂，它由一种或多种活性化合物与栓剂基料的组合组成。合适的栓剂基料是(例如)天然或合成的甘油三酯，或烷属烃。此外，也可能采用由活性化合物与基料的组合组成的明胶直肠胶囊。可能的基料包括例如：液体甘油三酯、聚乙二醇或烷属烃。
胃肠道外给药的合适剂型包括水溶形式如水溶性盐和碱溶液的活性化合物的水溶液。此外，活性化合物悬液可作为合适的油性注射悬液给药。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油如芝麻油，或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或聚乙二醇-400。水性注射悬液可含有能提高悬液粘度的物质，包括例如：羧甲基纤维素钠、山梨糖醇和/或右旋糖苷。任选地，悬液也可含有稳定剂。
本发明另一方面提供了筛选可能用于治疗、改善或预防AD的物质的方法，所述方法包括将所述物质给予动物并测定所述动物的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中一种或多种所述因子的水平或功能相对于未给予所述物质的对照动物增加表明所述物质可能用于治疗、改善或预防AD。本发明还提供了测试AD的可能治疗的方法，所述方法包括将可能治疗给予动物并测定所述动物的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中一种或多种所述因子的水平或功能相对于未给予所述治疗的对照动物增加表明所述治疗可能用于治疗、改善或预防AD。
本发明另一方面提供了一种测试可能对AD的发病或进展有负面影响的物质的方法，所述方法包括将所述物质给予动物，并测定所述动物的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能，其中一种或多种所述因子的水平或功能相对于未给予所述物质的对照动物降低表明所述物质可能对AD的发病或进展有负面影响。
用于筛选试验的动物可以是不显示AD特征的任何动物，包括非人动物(如小鼠、大鼠、犬或灵长动物)。或者，可采用已知的AD动物模型。动物模型的例子参见美国专利号6,717,031、6,710,226和5,811,633。最后，可采用患有AD的个体。
测定对象的胰岛素/IGF信号传导途径中至少一种因子的水平或功能的方法与上述对AD诊断的讨论相同。可在给予某种物质之前和之后测定同一对象中的水平和功能。在其它实施方式中，将给予某物质的对象中的水平或功能与没有给予该物质的一个或多个对象相比。
可筛选的物质包括蛋白质、多肽、肽、抗体、核酸、有机分子、天然产物、化学物质文库等。
本发明另一方面提供了通过大脑内注射链脲霉素(STZ)产生的AD的实验动物模型。该动物可以是哺乳动物，如啮齿动物、犬、猫、马、绵羊、牛、非人灵长动物(如黑猩猩、猕猴、狐猴、猩猩、大猩猩、倭黑猩猩)。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物，如大鼠或小鼠。该动物优选在幼年时，例如小于一周龄，如2、3或4日龄时注射STZ。可以在适用于给予动物脑的任何制剂，如盐水或人工脑脊液中制备STZ。STZ注射量足以诱导动物发生AD-样病状和/或症状。在一个实施方式中，STZ的注射剂量至少约为10mg/kg体重(BW)，如约20-80mg/kg BW，如约30-60mg/kgBW，如约40mg/kg BW。可用微量注射器如装有30号针头的Hamilton微升注射器在前囟点双侧注射STZ，例如前囟点后1.0mm和侧面1.0mm处，深度为各半球的颅骨表面以下2.5mm。可通过注射染料如亚甲蓝验证注射的准确性。在注射STZ约1-8周后，如注射约1-3周后，如注射后约2周研究STZ-注射的动物。
本发明的另一方面提供了用AD的STZ注射动物模型筛选可能用于治疗、改善或预防AD的物质的方法。在一个实施方式中，提供了筛选能抑制AD中的神经变性的物质的方法。在另一实施方式中，提供了筛选能抑制AD中的认知障碍的物质的方法。本发明还提供了测试AD的可能治疗的方法，所述方法包括将可能治疗给予AD的STZ注射动物模型。该方法包括将所述物质给予动物和相对于未给予所述物质的对照动物测定AD的至少一种指征的水平或功能。可测定的AD指征包括胰岛素/IGF信号传导途径中一种或多种因子的水平或功能，AD的组织病理学特征如脑重、神经变性、神经纤维缠结或斑块，凋亡相关因子或细胞死亡的其它指标(如p53)的水平，不同细胞类型的细胞数量改变，AD相关蛋白或核酸如tau、磷酸化-tau、泛素、淀粉样前体蛋白、淀粉样的水平，乙酰胆碱、乙酰胆碱脂酶或胆碱乙酰基转移酶的水平，以及认知障碍。可通过本领域已知的任何方法测定认知障碍(如Morris水迷宫、记忆力相关性饲喂行为、空间识别记忆力、运动活力、情感反应性、物体识别)。一种或多种所述指标的水平或功能相对于没有给予所述物质或治疗的对照动物增加表明所述物质或治疗可能用于治疗、改善或预防AD。可以在给予物质或治疗之前和之后在同一动物中测定水平或功能。在其它实施方式中，将给予某物质或治疗的动物中的功能或水平与没有给予所述物质或治疗的一个或多个动物作比较。
本发明还提供了检测AD的可能治疗的方法，所述方法包括将所述可能治疗给予向非人动物脑内注射STZ产生的AD动物模型，并相对于未给予可能治疗的对照动物测定AD的至少一种指征的水平或功能，其中AD的至少一种指征的水平或功能相对于未给予可能治疗的对照动物增加表明所述治疗可能用于治疗、改善或预防AD。
本发明另一方面提供了一种检测可能对AD的发病或进展有负面影响的物质的方法，所述方法包括将所述物质给予向非人动物脑内注射STZ产生的AD动物模型，并相对于未给予可能治疗的对照动物测定AD的至少一种指征的水平或功能，其中AD的至少一种指征的水平或功能相对于未给予所述物质的对照动物降低表明所述物质可能对AD的发病或进展有负面影响。
可筛选的物质包括蛋白质、多肽、肽、抗体、核酸、有机分子、天然产物、化学物质文库等。
以下实施例为说明性，而非限制本发明的方法和组合物。本领域技术人员了解的通常在临床治疗中碰到的各种条件和参数的其它合适修饰和改变属于本发明构思和范围。
实施例1
总方法
组织来源
死后的脑获自马萨诸塞州总医院(Massachusetts General Hospital)阿尔茨海默病研究中心脑库、布朗大学(Brown University)脑库和杜克大学(Duke University)医学中心的Kathleen Price Bryan脑库。通过回顾临床史和死后脑的组织病理切片，包括额叶前部皮层、颞叶皮层、杏仁核和海马区的Bielschowsky染色切片和磷酸化-Tau、泛素和淀粉样-β免疫染色切片验证AD(Braak和Braak阶段5-6)和正常衰老(Braak和Braak阶段0-1)的诊断。(Braak等，Neurobiol.Aging75：S85(1997)；Nagy等，Dement.Geriatr.Cogn.Disord.9：140(1998))。用海马区、下丘脑和额叶(Brodmann区域11)的速冻组织(各约100mg)提取RNA和蛋白质。用相邻的、福尔马林固定的石蜡包埋组织块进行免疫组织化学染色。本研究共包括28例AD和26例对照。死后间隔均小于14小时。如果用实时定量RT-PCR检测到RNA降解，则拒绝该例。
实时定量RT-PCR
按照厂商说明用TRIzol试剂(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)从脑组织中分离总RNA。通过260nm和280nm处的吸光度测定RNA浓度。用AMV第一链cDNA合成试剂盒(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)和随机寡聚脱氧核苷酸引物逆转录RNA(2μg)。用实时定量RT-PCR扩增测定胰岛素、IGF-I和IGF-II生长因子，它们的相应受体，胰岛素受体底物(IRS亚型1、2和4)，Tau，淀粉样前体蛋白(APP)，葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)以及胰岛素降解酶(DDE)的mRNA水平。在平行反应中测定的核糖体18S RNA水平被用于计算各mRNA转录物的相对丰度。(Xu等，J.Biol.Chem.278：26929(2003)；Yeon等，Hepatology35：703(2003))。
在25μL反应中进行PCR扩增，所述反应中含有2.5ng初始RNA模板产生的cDNA，人类基因(表1)或大鼠基因(表2)的基因特异性正向引物和反向引物各300nM，以及12.5μL2x QuantiTect SYBR Green PCR混合物(Qiagen Inc.，Valencia，CA)。用BIO-RAD iCycler iQ多色实时PCR检测系统(Bio-Rad，Hercules，CA)连续检测扩增信号。所用的扩增方案如下：首先在95℃进行15分钟的变性和酶激活，然后是40个下述循环：95℃30秒，55-60℃45秒，72℃60秒。用iCycler软件提供的温度梯度程序优化退火温度。用20ng含有所研究靶序列的重组质粒DNA的10倍连续稀释液产生回归线等式，以此等式确定mRNA水平。从特定mRNA与18S的纳克比测定相对mRNA丰度。(Xu等，J.Biol.Chem.278：26929(2003)；Yeon等，Hepatology38：703(2003))。
表1.
 
引物 序列(5’-->3’) 位置(mRNA) 扩增子大小(bp)
胰岛素 TTC TAC ACA CCC AAG TCC CGT C(SEQ ID NO：1)             189 134
ATC CAC AAT GCC ACG CTT CTG C(SEQ ID NO：2)             322
胰岛素受体 GGT AGA AAC CAT TAC TGG CTT CCT C(SEQ ID NO：3)                1037 125
CGT AGA GAG TGT AGT TCC CAT CCA C(SEQ ID NO：4)                1161
IGF-I CAC TTC TTT CTA CAC AAC TCG GGC(SEQ ID NO：5)               1032 147
CGA CTT GCT GCT GCT TTT GAG(SEQ ID NO：6)            1178
IGF-I受体 AGG GCG TAG TTG TAG AAG AGT TTC C(SEQ ID NO：7)                395 101
TAC TTG CTG CTG TTC CGA GTG G(SEQ ID NO：8)             295
IGF-II CTG ATT GCT CTA CCC ACC CAA G(SEQ ID NO：9)             996 76
TTG CTC ACT TCC GAT TGC TGG C(SEQ ID NO：10)            1071
IGF-II受体 CAC GAC TTG AAG ACA CGC ACT TAT C(SEQ ID NO：11)               403 132
GCT GCT CTG GAC TCT GTG ATT TG(SEQ ID NO：12)             534
IRS-1 TGC TGG GGG TTT GGA GAA TG(SEQ ID NO：13)          3559 68
GGC ACT GTT TGA AGT CCT TGA CC(SEQ ID NO：14)             3626
IRS-2 AAA ATT GGC GGA GCA AGG C(SEQ ID NO：15)         753 64
ATG TTC AGG CAG CAG TCG AGA G(SEQ ID NO：16)            816
IRS-4 CCG ACA CCT CAT TGC TCT TTT C(SEQ ID NO：17)            570 74
TTT CCT GCT CCG ACT CGT TCT C(SEQ ID NO：18)            643
Tau AGA AGC AGG CAT TGG AGA CAC C(SEQ ID NO：19)            543 81
AAG CAG CCA CTT TGG GTT CC(SEQ ID NO：20)          251
 
APP CAA TCC AGG CAC AGA AAG AGT CC(SEQ ID NO：21) 478 96
TTC CAT AAC CAA GAG AGG CTG C(SEQ ID NO：22) 573
GLUT4 GTA TCA TCT CTC AGT GGC TTG GAA G(SEQ ID NO：23) 394 111
TTT CAT AGG AGG CAG CAG CG(SEQ ID NO：24) 504
IDE TGA TGA ATGATG CCT GGA GAC TC(SEQ ID NO：25) 635 130
TCA ATC CCT TCT TGG TTT GGT C(SEQ ID NO：26) 764
18S GGA CAC GGA CAG GAT TGA CA(SEQ ID NO：27) 1278 50
ACC CAC GGA ATC GAG AAA GA(SEQ ID NO：28) 1327
28S GGT AAA CGG CGG GAG TAA CTA TG(SEQ ID NO：29) 3712 107
TAG GTA GGG ACA GTG GGA ATC TCG(SEQ ID NO：30) 3818
表2
 
引物 序列(5’-->3’) 位置(mRNA) 扩增子大小(bp)
胰岛素 TTC TAC ACA CCC AAG TCC CGT C(SEQ ID NO：1) 189 134
ATC CAC AAT GCC ACG CTT CTG C(SEQ ID NO：2) 322
胰岛素受体 GGT AGA AAC CAT TAC TGG CTT CCT C(SEQ ID NO：3) 1037 125
CGT AGA GAG TGT AGT TCC CAT CCA C(SEQ ID NO：4) 1161
IGF-I CAC TTC TTT CTA CAC AAC TCG GGC(SEQ ID NO：5) 1032 147
CGA CTT GCT GCT GCT TTT GAG(SEQ ID NO：6) 1178
IGF-I受体 AGG GCG TAG TTG TAG AAG AGT TTC C(SEQ ID NO：7) 395 101
TAC TTG CTG CTG TTC CGA GTG G(SEQ ID NO：8) 295
IGF-II CTG ATT GCT CTA CCC ACC CAA G(SEQ ID NO：9) 996 76
TTG CTC ACT TCC GAT TGC TGG C(SEQ ID NO：10) 1071
IGF-II受体 CAC GAC TTG AAG ACA CGC ACT TAT C(SEQ ID NO：11) 403 132
GCT GCT CTG GAC TCT GTG ATT TG(SEQ ID NO：12) 534
在预研究中，用琼脂糖凝胶电泳评价SYBR Green-标记的PCR产物，用核酸测序验证各扩增子的保真度。含有特定靶序列的已知量重组质粒DNA的连续稀释液用作PCR反应中的标准物，用标准物的Ct值产生的回归线计算mRNA丰度。根据18SRNA标准化结果，因为18S RNA水平非常丰富且基本不变，而持家基因随疾病状态变化。用计算的mRNA/18S比进行组间统计学比较。
Western印迹分析
用Western印迹分析评价Akt、磷酸化-Akt、GSK-3β、磷酸化-GSK-3β、Tau和β-肌动蛋白的水平。在5体积放射性免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，2mM EGTA)中匀浆新鲜的冷冻组织(～100mg)，缓冲液中含有蛋白酶抑制剂(1mM PMSF、0.1mMTPCK、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml抑胃酶肽A、0.5μg/ml亮抑肽酶、1mMNaF、1mMNa4P2O7)和磷酸酶抑制剂(2mM Na3VO4)。用二辛可宁酸(BCA)试验(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分辨含有100μg蛋白质的样品。(Ausubel等，《新编分子生物学方法》(Current Protocols inMolecular Biology)，(2000))。将蛋白质转移到Immobilon-P(Millipore Corporation，Bedford，MA)PVDF膜上，用SuperBlock-TBS(Pierce，Rockford，IL)吸附非特异性结合位点。在4℃下将膜与用Tris-缓冲盐水(TBS；50mM Tris，150mM NaCl，pH7.4)稀释的第一抗体(0.5-1μg/ml)一起孵育过夜，Tris-缓冲盐水中含有1％牛血清白蛋白和0.05％吐温-20(TBST-BSA)。用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的IgG(Pierce，Rockford，IL)、Western Lightning化学发光试剂(Perkin Elmer Life Sciences Inc.，Boston，MA)和胶片放射自显影检测免疫反应性。所有孵育都在温和摇动的摇床上进行。免疫反应性用Kodak Digital Science Imaging Station(NEN Life Sciences，Boston，MA)定量。
免疫沉淀
用免疫沉淀研究检测PI3激酶的p85亚基与1型和2型胰岛素受体底物(IRS)之间的相互作用。组织样品在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(1μg/ml抑肽酶、0.5μg/ml亮抑肽酶、1mM PMSF、0.1mM TPCK、1μg/ml抑胃酶肽A、2mM钒酸钠)的RIPA缓冲液中匀浆，并用含有10mM HEPES、100mM NaCl、1mM EDTA和0.1％TritonX-100的HEPES裂解缓冲液稀释，随后立即用于免疫沉淀试验。预先清洁后，含有250μg蛋白质的样品与第一抗体一起4℃孵育2小时，期间不断摇动。通过4℃温和摇动孵育2小时将免疫复合物捕获到UltraLink固定蛋白A/G(Pierce，Rockford，IL)上。用0.5ml Hepes裂解缓冲液洗涤免疫沉淀3次，然后用于激酶试验。(Ausubel等，《新编分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，(2000))。
免疫组织化学染色
用胰岛素受体、IGF-I受体、胰岛素和IGF-I的抗体对下丘脑和颞叶或额叶新皮层的福尔马林缓冲液固定的石蜡包埋切片(8μM厚)进行免疫染色，采用的是抗生物素蛋白生物素辣根过氧化物酶法，将NovaRed或二氨基联苯胺(Vector Laboratories，Burlingame，CA)用作色原。(de la Monte等，Lab.Invest.80：1323(2000))。切片用苏木精复染，并用光学显微镜检测。
试剂来源
胰岛素受体、IGF-I受体、IRS-1、IRS-2和PI3激酶的p85亚基的抗体获自CellSignaling(Beverly，MA)。GSK-3β和Akt的抗体以及GSK-3β和Akt的磷酸化特异性抗体购自Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)。蛋白A/G琼脂糖获自PierceChemical Company(Rockford，IL)。用于免疫组织化学染色的试剂购自VectorLaboratories，(Burlingame，CA)。所有其它精细化学品均购自CalBiochem(加利福尼亚州卡尔斯巴德)或Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)。
统计学分析
图中所示数据代表各组的平均值±S.E.M.。用斯氏T检验或方差的重复测定分析(ANOVA)进行组间比较，此后进行Tukey-Kramer显著性检验。用Number CruncherStatistical System(Dr.Jerry L. Hintze，Kaysville，UT)进行统计学分析。图中标明了产生P值的计算机软件。P-值<0.05被认为有统计学显著性。
实施例2
AD中生长因子受体表达降低
实时定量RT-PCR研究显示了对应于对照和AD脑的大脑皮层、海马区和下丘脑中胰岛素、IGF-I和IGF-II受体的mRNA转录物(图1)。胰岛素、IGF-I和IGF-II受体在海马区和下丘脑中的表达比额叶皮层中的表达高400至2000倍。总体来看，IGF-I和IGF-II受体的表达丰度高于胰岛素受体，在对照脑中，IGF-I受体的表达丰度高于IGF-II受体。在AD中，IGF-I和IGF-II mRNA转录物的表达水平相似，除了在额叶皮层中IGF-I受体表达水平高于IGF-II受体，在对照组中情况相同。在对照的额叶皮层、海马区和下丘脑中，胰岛素和IGF-I受体表达水平显著高于AD脑的对应区域中的表达水平，而对照和AD样品中IGF-II受体mRNA的平均水平相似(图1)。对胰岛素受体数据再作图以凸显区域和组间差异后，可明显看出AD的海马区和下丘脑中胰岛素和IGF-I受体mRNA转录物的平均水平比对照脑的对应区域低8至10倍，而在额叶皮层中，AD中胰岛素和IGF-I受体mRNA转录物减少约40％，所以组间差异小得多(图1D)。
胰岛素和IGF-I受体表达水平降低不能仅仅根据神经元损失进行解释，因为AD脑中许多组织学完整的神经元的免疫反应性水平很低或没有免疫反应性。而且，下丘脑不显示广泛的细胞损失或神经变性，直到疾病晚期，AD的下丘脑中受体mRNA表达和免疫反应性显著降低。生长因子受体表达水平降低可能阻碍信号转导，并在脑中有效产生胰岛素/IGF-I抗性。本文中重要的是，强调了AD中的异常不限于胰岛素信号传导途径，因为它们显然也包括IGF-I并可能包括IGF-II刺激的机制。第二个结论是在受体水平存在生长因子激活级联反应中的异常。
实施例3
AD脑中局部生长因子表达降低
实时定量RT-PCR研究检测了衰老的对照和AD脑中胰岛素、IGF-I和IGF-IImRNA表达。在海马区和下丘脑中观察到生长因子表达的最高水平，其中平均水平比额叶皮层中高30～50倍(图2)。海马区中胰岛素基因表达最高，但在额叶皮层中检测不到其表达。海马区的IGF-I mRNA表达比下丘脑或额叶皮层高10～30倍。海马区和下丘脑中IGF-II mRNA的高水平表达相似，都比额叶皮层高约40倍。再次分析各区域数据显示，海马区中胰岛素和IGF-II的水平相对高，在下丘脑和额叶皮层中IGF-II>IGF-I>>>胰岛素表达(图2)。
在AD中，相对于对照，海马区和下丘脑中的胰岛素基因表达显著降低(额叶皮层中检测不到胰岛素基因表达)。海马区和下丘脑中胰岛素mRNA转录物的平均水平比对照低4-5倍。AD下丘脑和额叶皮层中IGF-I基因表达的平均水平显著(4-5倍)低于对照脑中的相应区域(图2)。最后，AD额叶皮层、海马区和下丘脑中IGF-II mRNA水平也显著降低。再一次在海马区和下丘脑中观察到最大的组间差异(4-5倍)，而在AD额叶皮层中，IGF-II的表达仅中度降低(～35％)。
因此，在AD中，问题不仅是胰岛素/IGF-I抗性，因为局部CNS生长因子的产生也有显著缺陷。预计，CNS生长因子基因表达的缺乏一定会大大阻碍生长因子信号转导。而且，如果CNS依赖于局部生长因子的产生，那么供应减少会导致生长因子戒断(withdrawal)状态，这是良好建立的神经元细胞死亡机制。为了维持胰岛素/IGF-I依赖性CNS功能的完整性，必须提高受体敏感性或表达水平，或者必须激活或增强能增加CNS从外周血中摄取生长因子的机制。应强调：1)AD的问题不仅是胰岛素抗性，因为也影响了相关生长因子；和2)胰岛素、IGF-I和可能的IGF-II抗性起源于与CNS生长因子生产受阻相关的问题，以及相应受体基因的下调或携带这些受体的神经元的进行性损失。
实施例4
AD脑中神经元的胰岛素、IGF-I、胰岛素受体和IGF-I受体免疫反应性降低
通过14个AD脑和10个对照的额叶皮层、海马区和下丘脑的福尔马林固定的石蜡包埋切片的免疫组织化学染色，检测胰岛素、IGF-I和对应受体的细胞分布。在神经元和神经炎过程中观察到对应于胰岛素或IGF-I多肽的免疫反应性，而发现胰岛素和IGF-I受体在神经元、神经毡神经突、胶质细胞以及实质和柔脑膜(leptomeningeal)血管的平滑肌细胞中表达。对应于实时定量RT-PCR结果，与正常衰老的对照海马区样品比较，AD中胰岛素-、IGF-I-、胰岛素受体-和IGF-I受体-阳性神经元丰度较低(图3)。AD病例中神经元标记减少可归因于神经元损失以及生长因子和对应生长因子受体的神经元表达减少。后者可由组织学上完整显示的神经元中观察到的阴性免疫染色反应(图3)得到证实。相反，在AD和对照样品中，血管的生长因子受体标记程度相似。
免疫组织化学染色研究证明CNS神经元中表达生长因子和生长因子受体。虽然主要在神经元中鉴定到生长因子免疫反应性，但其它细胞类型包括胶质细胞也可表达这些相同的生长因子以及相应受体。相对于对照脑，AD中观察到生长因子和受体表达分布改变的一种可能的解释是胶质细胞活化与细胞损失合并起来可起到重要作用。在脉管系统以及脉络丛上皮细胞、神经元和胶质细胞中检测到胰岛素和IGF-I受体表达。以前报道了脉管系统中的胰岛素/IGF-I受体表达，这说明CNS血管可能对循环生长因子水平的改变起反应。AD和对照组的血管中生长因子受体表达之间没有显著差异，这表明与正常衰老相比，AD中胰岛素或IGF-I的外周血水平改变可能不会对CNS功能造成更大程度的负面影响。但是，局部内源性CNS产生可能与CNS神经元功能的生长因子调节相关性最高。
实施例5
检测原代神经元培养物中的胰岛素、IGF-I、IGF-II和相应的受体mRNA转录物
为了验证在CNS中发现神经元生长因子和生长因子受体表达，用大鼠基因特异性引物以实时定量RT-PCR测定培养的CNS神经元中相同mRNA转录物的水平，从而扩展研究(表2)。原代神经元培养物由大鼠胎儿大脑皮层、下丘脑和海马区以及出生后大鼠小脑颗粒神经元产生，如前所述(de la Monte等，Cell.Mol.LifeSci.55：1950(2001)；de la Monte等，Cell.Mol.LifeSci.59：882(2002)；Xu等，J.Biol.Chem.278：26929(2003)；Chen等，JAlzheimers Dis.5：209(2003)；Nillni等，Endocrinology137：5651(1996))。在收获时，神经元是分裂后细胞，并具有丰富的分化细胞过程特征。实时定量RT-PCR研究证明，培养的神经元中表达胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体mRNA转录物(图4)。小脑颗粒神经元中胰岛素、IGF-I和IGF-II受体的表达水平显著高于大脑来源的神经元(图4A-4C)。在大脑结构中，胰岛素和IGF-I受体在皮层神经元中的表达水平较高，其次是下丘脑神经元，而海马区神经元的胰岛素和IGF-I受体表达水平最低。皮层、海马区和下丘脑培养物具有类似的低水平IGF-II受体表达，但皮层神经元的表达水平最高。进一步分析数据以凸显生长因子受体表达的区域差异证明，在小脑中，胰岛素受体表达丰度最高，其次是IGF-I受体，然后是IGF-II受体，然而在皮层和下丘脑神经元中，受体丰度的顺序是IGF-I>IGF-II>胰岛素(图4D和4E)。在海马区神经元中，IGF-II受体mRNA丰度最高，其次是胰岛素受体，然后是IGF-I受体。
与分离自海马区、下丘脑或大脑皮层的神经元相比，小脑神经元中的胰岛素、IGF-I和IGF-II基因表达水平显著较高。在所研究的大脑结构中，海马区神经元中胰岛素基因表达最高，其次是下丘脑神经元(图5A)。皮层神经元的胰岛素基因表达水平非常低但可检测到。相反，在海马区和下丘脑神经元中IGF-I mRNA转录物表达水平相对低，而在培养的皮层神经元中高水平表达(图5B)。在海马区神经元中IGF-II基因表达最高，其次是皮层和下丘脑神经元(图5C)。进一步分析生长因子基因表达的区域差异揭示出，IGF-II是小脑和海马区神经元中表达丰度最高的生长因子，其次是IGF-I和胰岛素。在皮层和下丘脑神经元中，生长因子mRNA丰度的顺序是：IGF-I>IGF-II>胰岛素。(图5D和5E)。
实施例6
胰岛素/IGF-I受体下游的关键信号转导分子的分析
胰岛素和IGF-I通过激活复杂的胞内信号转导途径介导其作用，所述信号转导途径是通过配体结合于细胞表面受体、伴随着激活固有的受体酪氨酸激酶启动的。(Ullrich等，Nature313：156(1985)；Myers等，Trends Biochem.Sci.19：289(1994)；O′Hare等，IntJBiochem22：315(1990))。胰岛素/IGF-I受体酪氨酸激酶能磷酸化IRS分子。(Myers等，Trends Biochem.Sci.19：289(1994)；Sun等，Nature352：73(1991)；White等，Nature318：183)1985)；Sun等，Mol.Cell.Biol.13：7418(1993))。酪氨酰磷酸化的IRS-1(PY-IRS-1)通过与下游含有src-同源物2(SH2)的分子相互作用传递介导生长、代谢功能和存活的胞内信号，所述相互作用是通过位于IRS-1的C末端区的特定基序发生的，伴随着激活Erk MAPK和PI3激酶/Akt，并抑制GSK-3β。(Giovannone等，Diabetes Metab.Res.Rev.16：434(2000))。在这个方面，PY-IRS-1与p85的结合刺激了葡萄糖转运，并通过激活Akt/蛋白激酶B或抑制GSK-3β而抑制凋亡。(Kulie等，Mol.Cell.Biol.17：595(1997)；Dudek等，Science275：661(1997)；Burgering等，Nature376：599(1995)；Delcommenne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：11211(1998)；Kido等，J.Clin.Endocrinol.Metab.86：972(2001))。Akt激酶能磷酸化GSK-3β和BAD使它们失活，从而抑制凋亡。(Delcommenne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：11211(1998)；Datta等，Cell91：231(1997)；Kennedy等，Mol.Cell.Biol.79：5800(1999)；Brunet等，Cell9(5：857(1999))。低水平的Akt激酶和高水平的GSK-3β活性或活化BAD与神经元细胞的凋亡增加和线粒体功能障碍有关。BAD破坏了线粒体膜的通透性并促进细胞色素c释放，这会激活胱冬酶。(Kennedy等，Mol Cell.Biol79：5800(1999)；Brunet等，Cell96：857(1999))。扰乱线粒体膜的通透性可增加引起线粒体DNA损伤的细胞自由基、损伤线粒体功能并活化促调亡级联反应。Jaeschke等，ToxicolSci.65：166(2002)；Pastorino等，J.Biol.Chem.273：1110(1998))。
为了检测被胰岛素/IGF-I激活的信号传导途径的完整性，测定了IRS-1、IRS-2和IRS-4基因表达。没有检测IRS-3，因为该同种型仅在啮齿动物脂肪组织中表达。由于胰岛素/IGF-I信号转导下游通过IRS激活的关键信号传导途径之一是PI3激酶-Akt，而PI3激酶-Akt是通过PI3激酶的p85亚基与位于IRS蛋白的羧基端区域内的特定基序结合介导的，所以我们研究了AD中该通路的完整性。Giovannone等，Diabetes Metab.Res.Rev.16：434(2000))。通过免疫沉淀/Western印迹分析检测酪氨酸磷酸化的(PY)胰岛素和IGF-II受体水平、胰岛素和IGF-I蛋白表达的水平，以及PI3激酶的p85亚基与PY-IRS相互作用的程度(图6)，来研究AD中上述通路的完整性。通过直接Western印迹分析结合数字图像光密度测定法评价了Akt、磷酸化-Akt、GSK-3β、磷酸化-GSK-3β和β-肌动蛋白(对照)的水平(图7)。此外，测定了tau和淀粉样前体蛋白mRNA水平(图8)，因为这两种分子都在AD中异常表达或加工，以前的研究证明，tau，而非APP表达受胰岛素/IGF-I刺激的调节，(de la Monte等，Cell.Mol.LifeSci.60：2679(2003)；Hong等，J.Biol.Chem.272：19547(1997))。分析集中于海马区和下丘脑区域，因为与额叶皮层相比，它们的生长因子和生长因子受体表达水平较高。
IRS-1mRNA转录物的丰度显著高于IRS-2或IRS-4(P<0.001)。IRS-4的丰度其次，而IRS-2的表达水平非常低(图6A-6C)。相对于对照，AD中额叶皮层、海马区和下丘脑中IRS-1mRNA水平显著降低，而AD和对照样品中IRS-4表达水平相似。免疫沉淀/Western印迹分析证明，酪氨酸磷酸化的胰岛素和IGF-I受体水平显著降低，胰岛素和IGF-I受体表达也降低(图6E-6G)。不出所料，相对于对照海马区和下丘脑组织，AD中酪氨酸磷酸化的胰岛素/IGF-I受体和受体蛋白表达的水平降低伴随着与p85相关的IRS-1水平显著降低(图6D)，这反映出通过IRS分子的信号转导下游受阻。没有继续检测IRS-2和IRS-4与p85的相互作用，因为这些分子表达水平太低，难以用Western印迹分析检测。
用海马区和下丘脑组织样品进一步研究胰岛素和IGF-I刺激的存活信号转导机制，因为与额叶皮层相比，它们的生长因子和生长因子受体表达水平相对较高。PI3激酶存活信号转导下游与磷酸化-Akt和磷酸化-GSK-3β的水平升高有关，因为磷酸化导致Akt激酶激活和GSK-3β活性抑制。Western印迹分析结合光密度法证明，海马区组织中磷酸化-Akt(图7A)和磷酸化-GSK-3β的平均水平显著降低(图7C)，但总Akt(图7B)和GSK-3β(图7D)蛋白的平均水平相似。用海马区组织样品获得相似结果。磷酸化-Akt和磷酸化-GSK-3β的水平相对降低反映出AD中Akt激酶活性水平组成性降低和GSK-3β活性水平升高。相反，与衰老对照脑相比，AD的β-肌动蛋白表达并未显著降低(图7E)。
由于tau表达受胰岛素/IGF-I调节，Aβ的周转部分受胰岛素降解酶(IDE)介导，所以进行研究以测定tau和IDE的mRNA水平。此外，由于葡萄糖摄取和利用部分受葡萄糖转运分子(包括GLUT4)调节，并且APP表达增加可能引起脑中Aβ累积，所以延伸了实时RT-PCR研究，以测定海马区和下丘脑组织中的GLUT4和APPmRNA转录物的mRNA水平。这些研究证明，相对于对照病例，AD中tau水平显著降低，APP mRNA转录物水平显著升高(图8A-8D)。相反，在AD和对照组中没有观察到GLUT4或IDE mRNA转录物的平均水平的显著性差异(图8E-8H)。
研究证明，IRS-1mRNA的表达丰度高于IRS-2或IRS-4，并且在AD中，IRS-1mRNA水平显著降低。虽然IRS-1表达减少的机制未知，但在神经元细胞系中进行的探索性研究证明，IRS-1表达受胰岛素和IGF-I刺激的调节(Carter等，2004，未发表)。IRS-1基因表达水平显著降低使人想起鼠IRS-1和胰岛素受体敲除模型，该模型由于胰岛素刺激的生长和存活信号转导受损，脑重和体重减小。(Schubert等，J.Neurosci.23：7084(2003)；Doublier等，Growth Horm.IGF Res.10：267(2000)；Nishiyama等，Gene141：187(1994))。此外，患有2型糖尿病和X综合征的患者的IRS-1表达水平显著降低，这与通过PI3激酶和Akt的胰岛素信号转导下游受损有关。(Smith等，Ann.NYAcad.Sci.892：119(1999))。
由于胰岛素和IGF-I通过IRS分子传递促存活和促生长的信号，所以IRS表达水平降低可能在CNS中产生生长因子抗性。对应于生长因子、生长因子受体和IRS基因表达水平降低，进一步分析下游信号传导途径显示出:IRS-相关的PI3激酶活性水平降低(由p85-相关性IRS-1水平降低反映)，磷酸化-Akt水平降低(反映Akt活性降低)和磷酸化-GSK-3β水平降低(反映GSK-3β活性增加)。因此，生长因子和受体表达受损与AD的存活信号转导机制受损有关。
人们对AD中tau mRNA水平降低的发现很感兴趣，因为以前的研究证明，IGF-I和胰岛素能调节神经元中的tau mRNA表达(de la Monte等，Cell.Mol.Life Sci.60：2679(2003))。因此，低水平tau mRNA与胰岛素和IGF-I信号转导机制受损有关。而且，AD脑中磷酸化-tau水平提高也可反映出胰岛素/IGF-I信号转导受阻，伴随着GSK-3β活性水平升高，因为GSK-3β是负责使tau过度磷酸化的主要激酶之一。(Hong等，J.Biol.Chem.272：19547(1997))。人们对AD脑中APP mRNA水平升高很感兴趣，因为这提示了脑中淀粉样-β沉积增加是基于转录的机制。此结果也与以前APP表达随氧化应激而增加(Chen等，JAlzheimers Dis.5：209(2003))、淀粉样-β水平升高可能有神经毒性(Lorenzo等，Ann.NYAcad.Sci.777：89(1996)；Niikura等，J.Neurosci.Res.70：380(2002)；Tsukamoto等，J.Neurosci.Res.73：627(2003))的结果一致。胰岛素信号转导受阻已经与神经元细胞中氧化应激增加和线粒体功能障碍产生联系(de laMonte等，Cell.MolLifeSci.59：882(2002)；Hoyer等，Ann.NY Acad.Sci.920：256(2000)；Hoyer等，Ann.NYAcad.Sci.893：301(1999))。其它研究证明胰岛素/IGF-I信号转导机制中与AD相关的异常并不伴随着GLUT4或IDE表达水平降低。总之，结果表明，胰岛素/IGF-I刺激的存活信号转导受阻和伴随的慢性氧化应激代表了AD中的主要异常。
实施例7
AD进展期间生长因子受体表达减少
通过检测患有不同严重程度的AD的死后脑组织，进一步分析生长因子受体表达的减少。用前额叶皮层的速冻组织(各约100mg)提取RNA和蛋白质。将样品分成四组：对照(Braak0-1)、Braak2-3、Braak4-5和Braak6。实时定量RT-PCR研究显示了对照和AD脑中额叶皮层的胰岛素、IGF-I和IGF-II受体的mRNA转录物(图X)。在Braak0-1病例中，IGF-I受体mRNA转录物的丰度最高，比IGF-II受体基因的丰度高了将近10倍，比胰岛素受体的丰度高500倍。随着Braak阶段/AD神经变性严重程度逐渐增加，胰岛素和IGF-I受体mRNA的平均水平下降，显著低于对照，即使在Braak2-3疾病严重性的脑中(图9A和9B)。在Braak6AD的脑中观察到胰岛素和IGF-I受体表达的最低平均水平。因此，Braak2-3组的胰岛素和IGF-I受体mRNA平均水平显著高于Braak4-5和Braak6。相对于对照，任何AD组中的IGF-II受体表达都没有显著变化(图9C)。
AD中胰岛素和IGF-I受体表达降低的发现与以前研究的结果一致，以前的研究证明，相对于对照脑，晚期AD中的两种mRNA转录物水平都显著降低。在该研究中，也获得了证据证明：胰岛素和IGF-I受体在CNS神经元中表达，在AD中，受体表达减少与神经元损失和基因下调有关。本文的发现提示，携带胰岛素和IGF-I受体的神经元损失发生在AD神经变性过程的早期，但在Braak阶段6或疾病末期迅速减少。生长因子受体表达水平降低可能损害信号转导，并有效引起脑中的胰岛素/IGF-I抗性。重要的是，这些结果证明，AD中的异常不限于胰岛素信号传导途径，因为它们也明显包括IGF-I刺激的机制。
实施例8
AD进展期间生长因子表达减少
实时定量RT-PCR研究检测了衰老对照和AD脑中的胰岛素、IGF-I和IGF-II多肽mRNA转录物(图10A-10C)。在Braak0-1脑中，IGF-II mRNA水平最高，其次是胰岛素，然后是IGF-I。在Braak阶段2-3中观察到胰岛素和IGF-II基因表达显著减少，虽然随着AD严重性增加，其水平进一步下降，但相对于Braak2-3，它们并未显著减少(图10A和10C)。在Braak2-3组中IGF-I mRNA表达仅略微减少，但Braak4-5和Braak6组相对于对照显著减少(图10B)。
研究证明，随着AD神经变性的严重性增加，生长因子基因表达水平进行性降低。因此在AD中，问题不仅是胰岛素/IGF-I抗性，因为局部CNS生长因子生产中也有缺陷。重要的是，在Braak阶段2-3的脑中检测到生长因子基因表达水平显著降低，这表明在疾病过程的早期发生了异常。
生长因子基因表达随疾病严重程度而降低表明，这些异常随着疾病进展而恶化。至少对于胰岛素和IGF-II，生长因子基因表达水平相对降低的速率比对应受体表达更快，这表明局部生长因子减少可能在携带生长因子受体的神经元损失之前发生。局部生长因子基因表达的缺乏可显著损害CNS中的生长因子信号转导。而且，如果CNS依赖于局部生长因子产生，供应减少就会产生生长因子戒断的状态，这是良好建立的神经元死亡机制。为了维持胰岛素/IGF-I依赖性CNS功能的完整性，必须提高受体敏感性或表达水平，或者必须激活或增强能增加CNS从外周血中摄取生长因子的机制。
实施例9
AD进展期间Tau和淀粉样前体蛋白表达改变
实时RT-PCR研究发现，Braak0-1对照案例中tau mRNA转录物丰度最高，随着Braak阶段增加，即AD神经变性严重性增加，其水平进行性显著降低(图11A)，对应于胰岛素和IGF-I多肽基因中观察到的趋势。Braak0-1组中APP mRNA的平均水平最低。在Braak阶段2或更高级阶段的脑中，APP mRNA水平相似地升高，比对照约高4倍(图11B)。
人们对AD中观察到的tau表达减少感兴趣，因为以前的研究证明，神经元taumRNA表达受IGF-I和胰岛素刺激的调节。因此，tau mRNA的AD相关性降低与AD中胰岛素和IGF-I多肽和受体基因表达水平显著减少有关。尤其值得注意的是，胰岛素和胰岛素受体表达的AD阶段-相关性降低与tau的趋势平行。
目前的工作显示，在Braak阶段2-3中APP表达显著增加，这表明此异常在AD过程的早期发生。在这个方面，AD脑中普遍存在的淀粉样-β沉积增加可能受APPmRNA水平升高介导，因为丰度更高的转录物能为可能异常的酶切割和蛋白质加工提供额外底物。之前的研究证明，APP表达和切割随着氧化应激而增加，胰岛素信号转导受阻会在神经元细胞中引起氧化应激和线粒体功能障碍。由于高水平的淀粉样-β可能有神经毒性，所以在淀粉样-β累积后氧化应激诱导的APP表达可以补充性地增强AD神经变性级联反应。总之，结果表明，胰岛素/IGF-I刺激的信号转导受阻和伴随的慢性氧化应激代表了在AD过程的早期发生的主要异常。
实施例10
AD进展期间结合于生长因子受体的配体的分析
胰岛素和IGF-I通过激活综合的胞内信号转导途径介导其作用，所述信号转导途径是通过配体结合于相应的细胞表面受体启动的。因此，有效的配体结合对信号转导级联反应至关重要，在AD脑中鉴定的胰岛素信号转导受阻的许多下游效应，包括神经元存活降低、GSK-3β激活水平上升和tau磷酸化增加，都可由CNS中胰岛素结合减少介导。为了检测生长因子信号转导的这个方面，用[125I]-标记的胰岛素、IGF-I或IGF-II作为示踪物、并用死后额叶组织的膜提取物作为受体来源，进行竞争性平衡和亲和力结合试验。
在5体积放射性免疫沉淀试验(RIPA)缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠，150mM NaCl，1mM EDTA，2mM EGTA)中匀浆新鲜的冷冻组织(～100mg)，缓冲液中含有蛋白酶抑制剂(1mM PMSF，0.1mM TPCK，1μg/ml抑肽酶，1μg/ml抑胃酶肽A，0.5μg/ml亮抑肽酶，1mM NaF，1mM Na4P2O7)和磷酸酶抑制剂(2mM Na3VO4)。用二辛可宁酸(BCA)试验(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白质浓度。预研究测定了实现20％特异性结合所需的放射性标记配体的蛋白量和浓度。
用200μg蛋白质进行胰岛素受体结合试验。IGF-I结合试验需要25μg蛋白质/样品，用10μg蛋白质进行IGF-II受体结合试验。用平衡结合试验评价相对于AD阶段严重程度的生长因子结合水平。可通过以下方法完成评价：在存在或不存在过量冷配体的情况下将蛋白质样品与固定量的放射性配体4℃孵育过夜后，测定净特异性结合，然后用对应于总结合的值减去获得的非特异性结合的值。为了测定总结合，在100μl反应中孵育单个蛋白质样品，所述反应中含有结合缓冲液(100mM HEPES，pH8.0，118mM NaCl，1.2mM MgSO4，8.8mM右旋糖，5mM KCl，1％牛血清白蛋白)和100nCi/ml[125I](2000Ci/mmol；50pM)的胰岛素、IGF-I或IGF-II。为了测定非特异性结合，如上所述制备重复的样品，加入0.1μM未标记(冷)配体。
进行饱和结合试验，以相对于AD阶段严重程度评价最高水平(最大值)的结合和结合亲和力。以相同比例收集来自每Braak阶段组8-12例脑的样品，用于产生结合曲线。用BCA试验测定收集的匀浆物的蛋白质浓度。样品一式两份在100μl反应体积中孵育，所述反应中含有结合缓冲液和0.0031-1μCi/ml[125I](2000Ci/mmol)的胰岛素、IGF-I或IGF-II。为了测定非特异性结合，将一式两份的反应与相同浓度的放射性标记配体加上0.1μM未标记(冷)的竞争性配体一起孵育。将数据做图，并用GraphPad Prism4软件分析，以计算Bmax、kD(解离常数)及其标准差和95％置信区间。
在温和摇动的摇床上，1.5ml Eppendorff管中4℃反应16小时。然后向各管中加入500μl0.15％牛γ球蛋白(用100mM Tris-HCl，pH8.0配制)，再加入400μl37.5％聚乙二醇6000(PEG-6000；用100mM Tris-HCl，pH8.0配制)，从而沉淀结合的放射性标记示踪物配体。彻底涡旋该样品，并在冰上孵育至少2小时。15,000xg室温离心样品15分钟，以收集沉淀。将含有未结合(游离)配体的上清组分全部转移到单个γ计数管(Sarstedt)中。切下含有沉淀的Eppendorff管尖头，并直接放入分离的γ计数管中。用LKB CompuGamma CSγ计数器对各样品计数1分钟。用总结合CPM或fmol数(没有未标记的竞争性配体)减去非特异性结合的样品的CPM或fmol数(即冷配体存在下结合量)计算特异性结合。确定数据适合单位点而非双位点模型后，用非线性回归分析结果，以计算饱和结合(Bmax)和结合亲和力(kD)，进行斯卡查德分析以用GraphPad Prism4软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)测定饱和结合和结合亲和力。
平衡结合研究证明，相对于AD脑，对照(Braak0-1)中胰岛素受体的特异性结合水平明显较高。在Braak阶段2-3脑中检测到结合水平显著降低，随着AD的严重程度提高，胰岛素结合的平均水平(fmol/mg蛋白质)进一步降低(图12A)。与Braak2-3或AD的更晚阶段相比，Braak0-1中IGF-I结合也明显较高。然而，对应于随着AD进展受体表达进一步减少的程度轻微或不存在这种减少，随着神经变性严重程度提高IGF-I结合的平均水平(fmol/mg)也不显著降低(图12B)。关于IGF-II结合的AD-相关性分布特征更类似于已经描述的胰岛素。与所有其它AD组相比，对照脑(Braak0-1)的IGF-II结合平均水平(fmol/mg)明显较高(图12C)。此外，随着AD神经变性的进展，IGF-II结合平均水平下降，以致于在Braak6病例中观察到最低水平。相对于对照脑，AD中IGF-II结合并未降低。但是，在Braak2-3或AD的更高级阶段的脑中检测到特异性结合平均水平明显升高(图12C)。与胰岛素结合中获得的结果相反，没有观察到随着AD严重程度提高IGF-I结合进行性减少(图12B)。
用斯卡查德分析测定除了受体表达减少以外，较低水平的配体结合是否与受体亲和力改变相关。斯卡查德曲线揭示出相对于对照组，在所有AD中胰岛素、IGF-I和IGF-II的Bmax(最高水平)结合较低(图13A-13L和表3-5)。对于胰岛素和IGF-II，随着AD严重程度提高Bmax水平进行性下降的趋势都有统计学显著性(P<0.001)。用Graphpad Prism4软件计算受体结合亲和力(kD)。分析显示，相对于对照脑，AD中胰岛素、IGF-I和IGF-II受体结合亲和力较高(kD较低)。此外，相关性分析揭示出，Braak阶段与胰岛素或IGF-II结合亲和力明显负相关，即，较高级的AD与较低水平的最大/饱和结合和较高的结合亲和力(kD较低)相关(表3-5)。相反，对于IGF-I受体的Bmax或kD，这些趋势线没有统计学显著性。
表3.脑中胰岛素结合的斯卡查德分析
Figure S05841558320070606D000441
*通过Pearson相关分析检验，BMAX(最高结合水平降低)和KD(亲和力增加)的AD阶段相关性降低的P<0.001。
表4.脑中IGF-I结合的斯卡查德分析
Figure S05841558320070606D000442
*通过Pearson相关分析检验，BMAX(最高结合水平降低)和KD(亲和力增加)的AD阶段相关性降低的P<0.001。
表5.脑中IGF-II结合的斯卡查德分析
Figure S05841558320070606D000451
*通过Pearson相关分析检验，BMAX(最高结合水平降低)和KD(亲和力增加)的AD阶段相关性降低的P<0.001。
这些研究证明，相对于对照脑，AD中胰岛素、IGF-I和IGF-II受体的饱和(最大)结合显著降低。随着AD严重性阶段提高，胰岛素和IGF-II结合水平降低，而在不同AD神经变性阶段，IGF-I结合的平均水平相似地降低。胰岛素、IGF-I和IGF-II数据的斯卡查德分析表明，在AD中结合亲和力较高(解离常数-kD较低)，饱和结合和受体表达水平较低。因此，AD中胰岛素、IGF-I和可能的IGF-II信号转导机制受阻可能由受体表达下降以及配体的局部可用性降低介导，而不是由结合亲和力降低介导。
实施例11
AD进展期间胆固醇含量改变
膜胆固醇含量可影响细胞表面受体的配体结合。例如，膜中胆固醇含量降低或升高与生长因子结合和信号转导改变或受阻有关。为了测定观察到的受体结合亲和力变化是否与膜胆固醇含量相关，按照生产商说明书用Amplex Red测定试剂盒(Molecular Probes，Eugene，Oregon)测定了额叶提取物中的胆固醇水平。简要说，如上所述，用RIPA缓冲液制备组织匀浆物。用1x反应缓冲液(试剂盒提供)连续稀释样品，并在100μl的最终反应体积中与150μM Amplex Red试剂、1U/ml辣根过氧化物酶、1U/ml胆固醇氧化酶和0.1U/ml胆固醇酯酶一起孵育。在37℃孵育该反应30分钟，用Fluorocount微板阅读器(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)(Ex560nm/Em590nm)测定荧光。同时用试剂盒提供的胆固醇标准品产生标准曲线。将胆固醇水平标准化成样品中的蛋白质浓度。预研究证明，如生产商所述，在脂质提取物和RIPA缓冲液提取物中测定的胆固醇水平和组间差异相同。因此，不必用脂质提取物进行该分析。该研究证明，相对于Braak阶段0-1或2-3的脑，Braak阶段4-5或6的脑中胆固醇水平显著提高(图14A)。在AD的Braak4-5和Braak6阶段的脑中，胆固醇平均水平相似。
实施例12
AD进展期间ATP水平改变
胰岛素和IGF-I信号转导受阻可导致线粒体功能、能量代谢和ATP产生水平降低。为了研究AD中胰岛素/和IGF-I功能障碍的影响，用ATPLite测定系统(PerkinElmer，Boston，MA)检测额叶皮层匀浆物中的ATP稳态水平。连续稀释裂解物，每150μl裂解物加入50μl ATP底物。在3体积的PBS中用Polytron(Glen Mills Inc.，Clifton，New Jersey)匀浆速冻的脑组织样品，所述PBS中含有20mM甘氨酸、50mMMgSO4和4mM EDTA。将100μl等份转移到96孔黑色板中，将50μl ATPLite裂解缓冲液加入各样品。用粘性塑料板盖上该板，室温下700rpm振荡5分钟。然后，将50μl ATPLite底物加入各样品，将覆有铝箔的密封板再振荡5分钟(700rpm，室温)。在TopCount机器(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)中测定发光，将ATP发光值标准化至蛋白质浓度。研究证明，相对于对照脑，AD(所有组)中ATP水平显著降低(～50％)(图14B)。在AD中，ATP平均水平一致地降低，随着神经变性的进展或严重程度升高，并不显著降低。
实施例13
阿尔茨海默病的诊断试验
筛选显示AD所产生病状或处于显示AD所产生病状的风险中的对象以诊断AD。脑组织样品获自各对象。然后，从样品中分离RNA，并进行如上述实施例2和3所述的实时定量RT-PCR，以测定脑组织中胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体的表达水平。然后，将测定的表达水平与年龄匹配的健康对象的表达水平作比较。如果发现两种或多种测定因子的测定表达水平比健康对象的表达水平低至少2倍，则认为该受试对象患有AD。
实施例14
阿尔茨海默病的动物模型
在以前的研究中，用脑内链脲霉素(ic-STZ)处理产生成年大鼠AD-型神经变性模型。Plaschke等，Int.J.Dev.Neurosci.11：477(1993)；Duelli等，Int.J.Dev.Neurosci.72：737(1994)；Hoyer等，J.Neural Transm.Suppl.44：259(1994)；Lannert等，Behav.Neurosci.112：1199(1998)。STZ的化学名为2-脱氧-2{[甲基-亚硝基氨基]羰基}氨基}D-吡喃葡萄糖(C8H15N3O7)，其分子量为265道尔顿。STZ是葡糖胺-亚硝基脲化合物，代谢时，它产生优先破坏胰岛β细胞并产生糖尿病的细胞毒性产物。虽然细胞毒性的确切机制未知，STZ代谢物的烷化特性产生活性氧物质并引起氧化应激和DNA损伤。这些作用导致采用脑室内STZ产生神经变性模型。在成年大鼠中，脑室内注射STZ会引起大脑皮层和海马区中的葡萄糖和糖原代谢慢性降低(10-30％)。Plaschke等，Int.J.Dev.Neurosci.11：477(1993)。这些效果与脑氧化代谢显著降低(Duelli等，Int.J.Dev.Neurosci.12：737(1994))，胰岛素受体功能抑制(Hoyer等，Ann.NY Acad.Sci.920：256(2000))以及学习、记忆、认知行为、脑能量平衡的进行性缺陷(Lannert等，Behav.Neurosci.112：1199(1998)；Hoyer等，Ann.NYAcad.Sci.893：301(1999)有关。因此，此模型至少部分匹配了AD中发生的生化和生理异常。然而，以前的研究没有特征鉴定与胰岛素和IGF-1信号转导有关的神经病理学、分子病理学、基因表达异常，或者胰的结构完整性和胰岛素表达。
本实施例证明，脑内(ic)STZ处理青年动物能产生与散发性AD的分子和病理学特征十分相似的神经变性，包括胰岛素和IGF信号转导机制受阻。此模型与以前鉴定的ic-STZ模型的主要区别特征是此模型是大鼠幼崽，而非成年大鼠。采用幼崽的理由如下。我们产生ic-STZ模型的初始目的是证明胰岛素和IGF信号转导在小脑发育期间的重要作用，因为我们已经发现，妊娠期长期接触乙醇引起的小脑发育不全与胰岛素信号转导和胰岛素基因表达障碍有关，de la Monte等，Cell Mol.Life Sci.52：1131(2005)。然而，我们对脑进行神经病理评价揭示出，ic-STZ处理的大鼠的大脑皮层中产生显著的脑萎缩、神经元损失和老年性斑块样结构。这些发现促使我们追随此研究线路，以进一步表征ic-STZ模型的神经病理学异常和分子异常，与我们目前在患有AD的人脑中的发现相关联。Rivera等，J.Alzheimers Dis.7(2005)，(印刷中)；Steen等，J.Alzheimers Dis.7：63(2005)。
实验模型：
三日龄Long Evans大鼠幼崽双侧脑内(ic)注射STZ。用装有30号针头的Hamilton微升注射器将STZ注射到前囟点后1.0mm和侧面1.0mm处，深度为各半球的颅骨表面以下2.5mm。用无菌盐水同样注射对照大鼠。初始研究评价了以前报道的不同剂量(5-70mg/kg)的STZ产生糖尿病模型的效果。Andican等，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.32：663(2005)；Saad等，Arch.Toxicol.(2005)；Srinivasan等，Pharmacol.Res.52：313(2005)；Karabatas等，Pancreas J0：318(2005)；Mabley等，Pancreas2S：E39(2004)。预研究显示了所有测试剂量下STZ-介导神经变性，但用至少25mg/kg才能获得一致的结果。本文所述结果获自用40mg/kg ic-STZ处理的大鼠幼崽。注射在3分钟内完成，将针头从脑中缓慢拔出。所有幼崽迅速恢复，因此迅速返回给母鼠(dam)，被母鼠100％接受。通过注射染料如亚甲蓝验证注射的准确性，发现其定位于皮层下白质和侧脑室中。所有动物经过注射都能存活，对其进行每日监测，在STZ或盐水处理后7、14或21天时处死。
在试验结束时，称重大鼠，然后通过异氟烷吸入处死。通过心脏穿刺取血，以用OneTouch Ultra血糖计(Lifescan，Inc)测定葡萄糖浓度。收获胰脏，浸入Histofix(Amresco Corp，Solon，OH)固定，以用于石蜡包埋。称重新鲜脑，然后在冠状面切开，获得垂体漏斗侧面约3mm厚的切片。将此3-mm的脑切片速冻于两块干冰厚片之间，并储存于-80℃，用于随后的RNA和蛋白质抽提。浸入固定(Histofix)残留组织，并包埋入石蜡，以进行组织病理研究和免疫组织化学染色。在约20％的病例中，称脑的重量，浸入固定整个脑，然后，在冠状面沿标准标志切片，用于石蜡包埋和组织病理切片。在采用180只大鼠幼崽的4次独立试验中产生ic-STZ模型。平行研究了数量相当的对照。
组织病理和免疫组织化学染色研究
石蜡包埋的胰(5μm厚)和脑(8μm厚)的组织切片用苏木精和伊红(H&E)染色，并检测组织病理病变，即炎症、坏死和岛细胞变性。对相邻的胰切片进行免疫染色，以检测胰岛中的胰岛素免疫反应性。用磷酸化-tau、Aβ、p53、泛素、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、胆碱乙酰基转移酶(ChAT)和乙酰胆碱脂酶(AChE)的单克隆或多克隆抗体对脑的石蜡切片进行免疫染色，以鉴定ic-STZ-诱导的AD-型神经变性的特征。作为免疫染色反应的阴性对照，省去第一抗体，或者用非相关性乙肝病毒单克隆抗体代替相关性抗体。
在免疫染色之前，用0.1mg/ml皂苷的磷酸盐缓冲盐水(10mM磷酸钠，0.9％NaCl，pH7.4；PBS)溶液在室温下依次处理脱蜡的再水化组织切片20分钟。用3％过氧化氢的甲醇溶液处理组织切片10分钟，以去除内源性过氧化物酶活性，在SuperBlock-TBS(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)中室温孵育30分钟以封闭非特异性结合位点。与稀释至0.1-1μg/ml(按照生产商推荐条件)的抗体4℃孵育过夜后，用预吸附大鼠组织的生物素化第二抗体，抗生物素蛋白生物素辣根过氧化物酶复合物(ABC)试剂和用作色原的二氨基联苯胺(Vector Laboratories，Burlingame，CA)检测免疫反应性。de la Monte等，Lab.Invest.50：1323(2000)。用苏木精复染该切片，并用封固剂和盖玻片保存。规范地检测所有切片。
RT-PCR
如上所述用实时定量RT-PCR扩增并采用表6所示引物测定胰岛素、IGF-I和IGF-II生长因子，它们的相应受体，胰岛素受体底物(IRS)亚型1、2和4，tau，淀粉样前体蛋白(APP)，AchE以及ChAT的mRNA水平。此外，进行研究以检测与ic-STZ-介导的神经变性相关的细胞类型的病理改变，如AD.Steen等，J Alzheimers Dis7：63(2005)的前述研究所述。简要说，设计用于进行实时定量RT-PCR的基因特异性引物对，以检测Hu(神经元)、GFAP(星形细胞)、髓磷脂-相关糖蛋白(MAG-1；少突神经胶质细胞)和同种异体移植物炎性因子-1(AIF-I；小胶质细胞)mRNA转录物，如表6所示。
表6
 
引物 方向 序列(5’→3’) 位置(mRNA) 扩增子大小(bp)  
18S 正向 GGA CAC GGA CAG GAT TGA CA(SEQ ID NO：27)          1278 50
18S 反向 ACC CAC GGA ATC GAG AAA GA(SEQ ID NO：28)          1327
胰岛素 正向 TTC TAC ACA CCC AAG TCC CGTC(SEQ IDNO：1)           145 135
胰岛素 反向 ATC CAC AAT GCC ACG CTT CTGC(SEQ ID NO：2)           279
胰岛素受体       正向 TGA CAA TGA GGA ATG TGG GGAC(SEQ ID NO：31)          875 129
胰岛素受体       反向 GGG CAA ACT TTC TGA CAA TGACTG(SEQ ID NO：32)        1003
IGF-I 正向 GAC CAA GGG GCT TTT ACT TCAAC(SEQ ID NO：33)         65 127
IGF-I 反向 TTT GTA GGC TTC AGC GGA GCAC(SEQ IDNO：34)          191
IGF-I受体 正向 GAA GTC TGC GGT GGT GAT AAAGG(SEQ ID NO：35)         2138 113
IGF-I受体 反向 TCT GGG CAC AAA GAT GGA GTTG(SEQ IDNO：36)          2250
IGF-II 正向 CCAAGAAGAAAG GAAGGGGACC(SEQ IDNO：37)          763 95
 
IGF-II 反向 GGC GGC TAT TGT TGT TCA CAGC(SEQ IDNO：38)          857
IGF-II受体       正向 TTG CTA TTG ACC TTA GTC CCTTGG(SEQ ID NO：39)        1066 91
IGF-II受体       反向 AGA GTG AGA CCT TTG TGT CCCCAC(SEQ ID NO：40)        1156
IRS1 正向 GAT ACC GAT GGC TTC TCA GACG(SEQ IDNO：41)          604 134
IRS1 反向 TCG TTC TCA TAA TAC TCC AGGCG(SEQ ID NO：42)         737
IRS2 正向 CAA CAT TGA CTT TGG TGA AGGGG(SEQ ID NO：43)         255 109
IRS2 反向 TGAAGC AGG ACTACT GGC TGAGAG(SEQ ID NO：44)        363
IRS4 正向 ACC TGA AGA TAA GGG GTC GTCTGC(SEQ ID NO：45)        2409 132
IRS4 反向 TGT GTG GGG TTT AGT GGT CTGG(SEQ IDNO：46)          2540
Tau 正向 CGC CAG GAG TTT GAC ACA ATG(SEQ ID NO：47)           244 65
Tau 反向 CCT TCT TGG TCT TGG AGC ATAGTG(SEQ ID NO：48)        308
APP 正向 GCA GAA TGG AAA ATG GGA GTCAG(SEQ ID NO：49)         278 199
APP 反向 AAT CAC GAT GTG GGT GTG CGTC(SEQ IDNO：50)          476
AChE 正向 TTC TCC CAC ACC TGT CCT CAT C(SEQ ID NO：51)            420 123
AChE 反向 TTC ATA GAT ACC AAC ACG GTTCCC(SEQ ID NO：52)        542
ChAT 正向 TCA CAG ATG CGT TTC ACA ACTACC(SEQ ID NO：53)        478 106
ChAT 反向 TGG GAC ACA ACA GCA ACC TTG(SEQ ID NO：54)           583
Hu 正向 CAC TGT GTG AGG GTC CAT CTTCTG(SEQ ID NO：55)        271 50
Hu 反向 TCA AGC CAT TCC ACT CCA TCT G(SEQ ID NO：56)            320
GFAP 正向 TGG TAA AGA CGG TGG AGA TGCG(SEQ IDNO：57)          1245 200
GFAP 反向 GGCACTAAAACAGAAGCAAGGGG(SEQ ID NO：58)         1444
MAG-1 正向 AAC CTT CTG TAT CAG TGC TCCTCG(SEQ ID NO：59)        18 63
MAG-1 反向 CAG TCA ACC AAG TCT CTT CCGTG(SEQ ID NO：60)         80
AIF-1 正向 GGA TGG GAT CAA CAA GCA CT(SEQ ID NO：61)          168 158
AIF-1 反向 GTT TCT CCA GCA TTC GCT TC(SEQ ID NO：62)          325
受体结合试验：
进行研究，以测定ic-STZ处理是否阻碍了脑中胰岛素、IGF-I和IGF-II受体结合。用Polytron(Glen Mils Inc.，Clifton，New Jersey)匀浆提取新鲜冷冻颞叶组织(～100mg)中的膜蛋白，匀浆是在5体积NP-40裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mM EDTA，2mM EGTA，1％NP-40)中进行的，其中含有蛋白酶抑制剂(1mMPMSF、0.1mM TPCK、1μg/ml抑肽酶、1μg/ml抑胃酶肽A、0.5μg/ml亮抑肽酶、1mM NaF、1mM Na4P2O7)和磷酸酶抑制剂(2mM Na3VO4)。10,000×g4℃离心样品15分钟后获得的上清组分用于结合试验。Steen等，JAlzheimers Dis7：63(2005)。用二辛可宁酸(BCA)试验(Pierce，Rockford，IL)检测蛋白质浓度。
用竞争平衡结合试验相对于ic-STZ处理评价生长因子结合。对于总结合，在100μl反应中孵育一式两份的单个蛋白质样品，所述反应中含有结合缓冲液(100mMHEPES，pH8.0，118mM NaCl，1.2mM MgSO4，8.8mM右旋糖，5mM KCl，1％牛血清白蛋白)和100nCi/ml[125I](2000Ci/mmol；50pM)胰岛素、IGF-I或IGF-II。为了测定非特异性结合，分别制备重复样品，但采用0.1μM未标记(冷)配体。用探索性研究测定实现20％特异性结合所需的放射性配体的蛋白量和浓度。用100μg蛋白质进行胰岛素受体结合试验。IGF-I结合试验需要25μg蛋白质/样品，用10μg蛋白质进行IGF-II受体结合试验。
所有反应都在1.5ml Eppendorff管中进行，在温和摇动的摇床上4℃孵育16小时。然后向各管中加入500μl0.15％牛γ球蛋白(用100mM Tris-HCl，pH8.0配制)，再加入400μl37.5％聚乙二醇8000(PEG-8000；用100mM Tris-HCl，pH8.0配制)，从而沉淀结合的放射性标记示踪物。通过涡旋彻底混合该样品，然后在冰上孵育至少2小时。15,000xg室温离心样品5分钟，以收集沉淀。将含有未结合(游离)配体的上清组分转移到γ计数管(Sarstedt，Newton，NC)中。切下含有沉淀的Eppendorff管尖头，并直接放入独立的γ计数管中。用LKB CompuGamma CSγ计数器对各样品计数1分钟。用总结合fmol数(没有未标记的竞争性配体)减去非特异性结合的fmol数(即过量冷配体存在下的结合量)计算特异性结合。用GraphPad Prism4软件(GraphPad Software，Inc.，San Diego，CA)分析结合试验结果。
Western印迹分析：
用Western印迹分析评价tau、磷酸化-tau、泛素、GSK-3β、磷酸化-GSK-3β、GFAP和β-肌动蛋白的水平，如上所述。
ic-STZ处理后胰岛保持完整：
虽然在ic-STZ或载体处理后以各种间隔检测脑和胰，但显示的大部分数据获自第14天处死的大鼠，因为直到ic-STZ处理至少7天后才能够一致地检测到胰岛素/IGF信号转导受阻引起的显著AD-型神经变性和分子指数。由于人们对鉴定1型和2型糖尿病在认知障碍和AD型神经变性的发病机制中的作用越来越感兴趣，进行研究以测定ic-STZ-介导的神经变性是否与胰岛中的炎症、变性、坏死和胰岛素免疫反应性缺失相关，这些反应是胃肠道外给予40mg/kg STZ后发生的特征性事件。Mythili等，Microsc.Res.Tech.63：274(2004)。组织病理研究显示，在对照和ic-STZ-处理的大鼠中有完整的外分泌和内分泌结构，同时没有证据显示发生炎症、坏死或岛细胞变性(图15A和15B)。此外，免疫组织化学染色显示，在对照和ic-STZ处理的大鼠的所有胰岛中都有显著的胰岛素免疫反应性(图15C和15D)。对应的是，相对于对照大鼠，ic-STZ-处理的大鼠的平均随机血糖浓度并未升高(图16A)，ic-STZ处理的大鼠的随机血糖浓度不超过180mg/dl。实际上，ic-STZ处理组的平均血糖水平显著低于对照，可能由于平均体重显著降低引起的进食减少(P＝0.04；图16B)。
脑内STZ引起神经变性：
ic-STZ-处理组的平均脑重相对于对照显著减小(P＝0.002；图16C)。ic-STZ-注射的脑显然更小，并倾向于具有多个急性蛛网膜下出血小病灶(图16D)，这表明脑血管脆性增加。这种现象的一种可能解释是Aβ免疫反应性增加(见下)使血管更易受外伤和流动相关性损伤。然而，ic-STZ-处理大鼠或对照大鼠中均没有出现脑内出血。
ic-STZ处理大鼠中，大脑和小脑都显著减小，但小脑相对于对照严重缩小(图16D)。小脑更易受ic-STZ-介导的神经变性的影响可能是由于在啮齿动物中，该结构主要在出生后头10天发育。Sotelo等，Philos.Trans.R.Soc.Lond.BBiol.Sci.331：307(1991)。组织病理研究揭示出ic-STZ处理的大鼠的大脑半球有显著异常，包括：1)皮层带的弥散性狭窄；2)脑白质体积减少；3)丘脑和下丘脑减小；和4)脑室扩大，即脑积水-可能是真空外(ex vacuo)(图17A-17D)。ic-STZ处理的大鼠小脑中观察到的最显著的异常是：1)皮层叶状结构减少和简化；2)外部和内部颗粒细胞层的发育不全或不发育；3)Purkinje细胞层的扩展和混乱；和4)皮层下白质纤维/管道的减少(图17E-17H)。处理后第7天样品的免疫组织化学染色揭示出，在ic-STZ-处理的整个脑中，尤其是颞叶皮层、海马区、下丘脑/丘脑、白质和小脑(图17I-17J)中p53免疫反应性(促调亡分子)显著提高。然而，在处理后第14天和第21天，ic-STZ处理的脑中p53免疫反应性水平仅略高于对照，这表明凋亡波在AD型神经变性的分子指数的早期和之前发生。
因为神经变性常常与结构改变和实质重塑相关，所以难以用原位组织学方法表征和定量细胞损失和细胞对损伤的反应。例如，导致组织萎缩的细胞损失可能与由于重塑引起的细胞密度显然正常或增加有关。为了对付这个问题，开发了一种检测和定量与脑中的损伤或变性相关的细胞类型病理学改变的分子方法，该方法是测定特定细胞类型中表达的基因的mRNA相对丰度。Steen等，J Alzheimers Dis7：63(2005)。在本研究中，检测了神经元(Hu)、星形细胞(GFAP)、小胶质细胞(AIF-I)和少突神经胶质细胞(MAG-1)中选择性表达的基因的表达水平。由于18S水平被用作分母，这种方法能够测定具体细胞类型的相对丰度是否被ic-STZ处理降低或提高。结果证明，ic-STZ处理的脑中Hu(图18A)和MAG-1(图18B)基因表达显著减少，GFAP(图18C)和AIF-1(图18D)表达增加。相反，在18S核糖体RNA的平均水平中没有显著性组间差异(图18E)。
脑内STZ阻碍了脑中的胰岛素和胰岛素样生长因子信号转导机制：
探索性研究证明，STZ能显著阻碍几个脑区的生长因子和生长因子受体表达，这些脑区包括下丘脑、海马区、颞叶皮层和小脑。因此，显示了用颞叶样品产生的结果作为总趋势的代表。此外，由于ic-STZ处理后头7天基因表达的改变是可变的，但在第14天-第21天保持稳定，所以显示和讨论了处理后第14天收获的脑的结果。
实时定量RT-PCR研究显示了对照和ic-STZ处理的大鼠的颞叶皮层中对应于胰岛素、IGF-I和IGF-II受体的mRNA转录物的表达。然而，相对于对照，ic-STZ-处理组的脑中胰岛素和IGF-I受体表达水平显著降低(图19A和19B)，而在ic-STZ处理的脑和对照脑中检测到相似水平的IGF-II受体mRNA转录物(图19C)。在对照和ic-STZ处理的脑中检测到胰岛素、IGF-I和IGF-II多肽mRNA转录物，但相对于对照，ic-STZ处理的脑中胰岛素(图19D)和IGF-II(图19F)mRNA转录物的平均水平显著降低。相反，ic-STZ处理组和对照组的IGF-I mRNA转录物丰度相似(图19E)。
为了检测胰岛素/IGF-I激活的信号传导途径的完整性，测定了IRS-1、IRS-2和IRS-4表达水平。没有测定IRS-3，因为它仅在啮齿动物脂肪组织中表达。实时定量RT-PCR检测了IRS-1、IRS-2和IRS-4mRNA转录物在对照和ic-STZ-处理的脑中的表达。如以前所报道，IRS-1mRNA转录物的丰度显著高于IRS-2和IRS-4(P＝0.001)。在ic-STZ-处理的脑中，IRS-1mRNA平均水平相对于对照显著降低(P＝0.004)，而IRS-2和IRS-4的平均水平与对照相似(图19G-19I)。
结合于生长因子受体的配体的分析：
有效的配体结合对信号转导级联反应至关重要，在AD中鉴定到胰岛素信号转导受阻的许多下游效应，包括神经元存活减少、GSK-3β激活增加和tau磷酸化增加，这些效应可能是由CNS中胰岛素或IGF受体结合减少介导的。为了检测ic-STZ注射的脑中生长因子信号转导的这个方面，用[125I]-标记的胰岛素、IGF-I或IGF-II作为示踪物、用颞叶组织的膜提取物作为受体来源，进行竞争性平衡结合试验。结果证明，相对于ic-STZ处理的脑，对照中胰岛素受体的特异性结合水平明显更高。与对照脑相比，ic-STZ处理的脑中胰岛素受体的平均平衡结合降低了大约85％(图20A)。ic-STZ处理的脑中IGF-II结合也显著降低(图20C)，而IGF-I结合增加，尽管由于平均值的标准差很大该差异不具有统计学显著性(图20B)。
ic-STZ处理后的AD型神经变性：
进行研究，以测定ic-STZ-诱导的神经变性是否与GSK-3β激活增加(磷酸化-GSK-3β/总GSK-3β比降低)和磷酸化-tau水平升高有关。由于AD型神经变性的特征也包括蛋白质，包括tau的泛素化增加(Godbolt等，Arch.Neurol.62：1097(2005)；Kosik等，Biochim.Biophys.Acta1739：29％(2005)；de Vrij等，Prog.Neurobiol.74：249(2004))和与细胞损失相关的胶质增生，也用Western印迹分析测定泛素和GFAP免疫反应性，β-肌动蛋白表达用作阴性对照。
Western印迹分析显示，相对于对照脑，ic-STZ处理的脑中GFAP、总GSK-3β、磷酸化-tau和泛素的水平显著提高，磷酸化-GSK-3β水平降低(图21和表7)。相反，这两组中tau和β-肌动蛋白的蛋白表达相似(图21和表7)。ic-STZ-处理组中计算的(光密度单位)磷酸化-GSK-3β/总GSK-3β和磷酸化-tau/tau的平均比值也显著降低(表7)，这反映出GSK-3β显著激活和tau磷酸化增加。免疫组织化学染色显示，ic-STZ-处理的脑中GFAP免疫反应性整体增加，颞叶(图22A和22B)、海马区、下丘脑/丘脑和小脑中出现显著标记，对应于p53免疫反应性显著增加的分布情况。在ic-STZ-处理的脑中，在颞叶皮层、海马区、下丘脑/丘脑和小脑皮层中观察到磷酸化-tau和泛素免疫反应性增加。增加的磷酸化-tau免疫反应性定位于大脑皮层中分布的神经元细胞体和神经毡神经突簇(图22C和22D)。没有观察到磷酸化-tau免疫反应性神经元内包含体(神经纤维缠结)。增加的泛素免疫反应性定位于灰质和白质的各种细胞类型中。除了细胞标记密度较高以外，ic-STZ和对照组之间的主要差异是ic-STZ处理的脑的细胞核中泛素免疫反应性的定位增加(图22E和22F)。
表7：
 
蛋白质 对照 ic-STZ P值
GFAP 308370±77143 983591±113549 P＝0.002
GSK-3β 68131±12374 149945±15588 P＝0.0043
p-GSK-3β 4326±496 2811±296 P＝0.009
p-GSK-3β/GSK-3β 0.066±0.014 0.0204±0.0022 P＝0.0168
泛素 765286±61857 1390824±133586 P＝0.0011
Tau 606944±24733 686442±65138 P＝0.03
p-Tau 1129±147 3378±920 P＝0.04
p-Tau/Tau 0.0016±0.011 0.0025±0.038 P＝0.02
β-肌动蛋白 188261±6302 196548±14314 N.S.
值对应于任意光密度单位(平均值±S.E.M.)。用斯氏T检验分析结果。
实时RT-PCR研究显示出ic-STZ处理的脑中tau(图23A)和APP(图23B)的mRNA水平明显较高。此外，免疫组织化学染色显示出，相对于对照，ic-STZ-处理的脑的神经元(图23C和23D)、柔脑膜血管、脑微血管(图23E和23F)和散在的胞外斑块样沉积物(图23F)中Aβ免疫反应性增加。可通过H&E染色观察斑块样沉积物，在所有ic-STZ处理的脑中，它们深浅不同。Aβ-免疫反应性斑块样沉积物具有致密核心，但没有神经炎或原纤维形态。＂斑块＂主要分布在大脑皮层，尤其是颞叶(离注射位点相当远)中，但它们也存在于皮层下结构，包括下丘脑/丘脑中。皮层和皮层下灰质结构和脑白质中分布的许多薄壁微血管具有增加的Aβ免疫反应性。然而，与AD不同，Aβ沉积物并不位于紧接的(immediate)血管周围空间。观察到散发性柔脑膜微出血与Aβ血管病有关，但在ic-STZ处理的脑中没有检测到实质出血或明显的缺血性或出血性损伤。
ic-STZ处理的脑中胰岛素/IGF信号转导受阻与乙酰胆碱生产之间的关系：
AD中认知障碍的一个主要相关事件是大脑皮层中缺乏乙酰胆碱。近年来证明，ChAT基因表达受胰岛素和IGF-I刺激的调节，在AD脑中，胰岛素/IGF-1信号转导机制受阻与乙酰胆碱生产不足有关。Steen等，JAlzheimers Dis7：63(2005)。因此，感兴趣的是确定ic-STZ处理的脑的ChAT表达水平是否降低。颞叶组织的实时定量RT-PCR分析显示，相对于对照脑，ic-STZ处理的脑中ChAT水平显著降低，AChEmRNA转录物水平显著增加(图24A和24B)。免疫组织化学染色研究显示，相对于对照脑，ic-STZ处理的脑中ChAT免疫反应性水平降低(图24C和24D)和AChE(图24E和24F)免疫反应性水平升高，因此确证了实时RT-PCR的结果。在ic-STZ处理的大鼠的下丘脑、海马结构(hippocampal formation)和小脑皮层中观察到ChAT和AchE表达有相似的改变。
结论
在以前的报道中，用ic-STZ在成年啮齿动物中产生散发性AD模型，强调了氧化应激作为神经变性介导物的作用。这些研究探索了ic-STZ对胰岛素和IGF信号传导途径中基因的影响，并检测了最近报道的内容中关于AD的相关性分子病理学。在这个方面，结果证明，ic-STZ处理引起CNS中表达胰岛素、IGF-II、胰岛素受体和IGF-I受体的细胞耗尽，但不引起高血糖症、胰岛变性或胰脏中的胰岛素免疫反应性损失。因此，ic-STZ模型产生CNS疾病，但不产生胰脏疾病，这表明外周和CNS来源的胰岛素被分别和区别地调节。而且，此模型很好地证明，在胰岛素/IGF生物合成和功能没有任何外周异常的情况下，CNS中胰岛素/IGF信号转导机制可能受阻。最后，在最近对能够在处理后存活4周或更长时间的大鼠进行的预研究中，Morris水迷宫测试揭示出，相对于对照，ic-STZ组的学习能力和记忆力显著受损。总之，该模型支持了以下假说：散发性AD代表了胰岛素和IGF多肽基因以及受体表达和反应性(抗性)的固有CNS缺陷引起的神经-内分泌疾病。
总之，用ic-STZ模型获得的结果将脑中胰岛素/IGF作用受阻与显著痴呆相关性异常连系起来，所述痴呆相关性异常紧密地模拟散发性AD中观察到的特征性神经变性的分子和病理学指数。而且，此研究提供了确定的证据表明，胰岛素/IGF信号转导受阻和相应生长因子的缺乏可能发生在独立于1型或2型糖尿病的CNS中。在这个方面，数据强烈证明以下设想：AD型神经变性代表了胰岛素和IGF信号转导机制选择性受阻，包括局部胰岛素生产不足引起的内在神经内分泌疾病。由该研究产生的三种其它设想为：1)tau表达和磷酸化异常可由胰岛素和IGF信号转导受阻介导；2)APP基因上调伴随着散发性AD和ic-STZ实验模型(与散发性AD相似)；和3)持续的氧化应激以及小神经胶质细胞的激活是在使AD神经变性级联反应加剧并持续进行中起到重要作用的早期事件。ic-STZ模型似乎是研究散发性AD型神经变性级联反应的出色的体内研究工具，可用于合理设计治疗或预防AD的药物。本文所述ic-STZ表型的明显特征是它确实是进行性神经变性模型。最初事件是促调亡分子的激活(第3-5天)。随后发生胰岛素/IGF信号转导受阻和相关基因的表达。这表明在脑中产生胰岛素和IGF的细胞损失后发生AD型神经变性。ic-STZ实验模型和早期AD中的发现提供的证据表明，如果想要在治疗和预防散发性AD中取得显著进展，就必须解决胰岛素/IGF信号转导受阻的机制和病因。
STZ是连接于D-葡萄糖的C2位的亚硝基酰胺甲基亚硝基脲(MNU)。MNU可用作引起DNA损伤的烷化剂，而葡萄糖部分作为葡萄糖被产生胰岛素(可能也产生IGF)的细胞接受。一旦代谢后，则释放N-亚硝基脲基，通过产生活性氧物质如超氧化物、过氧化氢和氮氧化物引起DNA损伤。神经变性的ic-STZ模型不同于氧化应激诱导的CNS损伤的效果，因为除了线粒体DNA损伤和代谢功能障碍以外，ic-STZ还引起脑中胰岛素和IGF信号转导机制显著受阻。患有真性(genuine)AD的人脑具有氧化应激、线粒体功能障碍和DNA损伤的明确证据，由于在疾病过程早期可以检测到许多氧化应激指数，所以氧化损伤可能在AD发病机理中起重要(如果不是核心)作用。氧化应激、缺氧或缺血的实验模型中AD型生化和分子异常，以及在脑Aβ沉积增加的情况下氧化应激增加(并不足以引起AD)的发现支持了这种推理。然而，有三个原因使得推断氧化应激正是答案的似乎合乎逻辑的步骤中止：1)可以明显区分人脑中缺氧、缺血或急性缺血-再灌注引起的神经病理损伤与AD的认知障碍相关的神经变性改变；2)缺氧和缺血损伤是全局性的，或者它们遵循血管分布，而对细胞类型的选择性相对较小，但是AD优先损伤脑中corticolimbic结构中的神经元；和3)近年来对患有AD的人脑的研究显示出，胰岛素和IGF信号转导机制显著受阻从疾病过程早期开始，随疾病进展恶化。
虽然传递胰岛素和IGF-I信号的CNS神经元胰岛素受体或IRS-2在试验中耗尽引起的分子和生化异常类似于AD中观察到的结果，但有关的神经病理明显不同于AD。可以解释为：遗传胰岛素受体耗尽模型缺少在AD发病机理中起到核心作用的脑衰老和线粒体功能障碍。此外，这些研究证明，在AD以及不同于AD的我们的ic-STZ模型中，胰岛素和IGF信号转导机制受阻。
最后，必须将突触可塑性受损的作用掺入假定等式中。据提示，AD需要三种重要的CNS功能紊乱：1)营养因子缺陷和/或胰岛素抗性引起的胰岛素/IGF信号转导紊乱；2)进行性氧化应激与线粒体功能障碍；和3)乙酰胆碱生物合成和稳态的抑制引起的神经元可塑性受损。假定本研究中所用的ic-STZ模型产生了散发性AD表型，因为该处理：1)由于选择性杀伤脑中产生特定生长因子的细胞以及生长因子反应性细胞而阻碍了胰岛素/IGF信号转导；2)由于药物的烷化特性引起进行性氧化应激、DNA损伤和线粒体功能障碍；和3)在CNS神经元可塑性的重要时期抑制乙酰胆碱的产生。STZ的烷化特性可能模拟了衰老对线粒体功能和线粒体DNA完整性的影响，采用幼崽代替成年大鼠可能有利于产生表型，因为出生后早期发育期间存在较高天然水平的CNS神经元可塑性。
经过对本发明的完全描述，本领域技术人员应理解，可以在不影响本发明范围或其任何实施方式的条件、配方和其它参数的宽泛和等效范围内实施该发明。本文引用的所有专利、专利申请和发表物都以全文完全纳入本文作参考。
序列表
<110>罗得岛医院(Rhode Island Hospital)
S.M.德拉蒙特(De la Monte，Suzanne Marie)
J.R.万德斯(Wands，Jack Raymond)
<120>阿尔茨海默病的诊断和治疗
<130>2306.001PC03
<150>US 60/731,862
<151>2005-11-01
<150>US 60/654,080
<151>2005-02-18
<150>US 60/632,619
<151>2004-12-03
<160>62
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增胰岛素基因的化学合成的引物
<400>1
ttctacacac ccaagtcccg tc                                        22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增胰岛素基因的化学合成的引物
<400>2
atccacaatg ccacgcttct gc                                        22
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增胰岛素受体基因的化学合成的引物
<400>3
ggtagaaacc attactggct tcctc                                     25
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增胰岛素受体基因的化学合成的引物
<400>4
cgtagagagt gtagttccca tccac                                        25
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I基因的化学合成的引物
<400>5
cacttctttc tacacaactc gggc                                         24
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I基因的化学合成的引物
<400>6
cgacttgctg ctgcttttga g                                            21
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I受体基因的化学合成的引物
<400>7
agggcgtagt tgtagaagag tttcc                                        25
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I受体基因的化学合成的引物
<400>8
tacttgctgc tgttccgagt gg                                           22
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II基因的化学合成的引物
<400>9
ctgattgctc tacccaccca ag                                        22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II基因的化学合成的引物
<400>10
ttgctcactt ccgattgctg gc                                        22
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II受体基因的化学合成的引物
<400>11
cacgacttga agacacgcac ttatc                                     25
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II受体基因的化学合成的引物
<400>12
gctgctctgg actctgtgat ttg                                       23
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS-1基因的化学合成的引物
<400>13
tgctgggggt ttggagaatg                                           20
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS-1基因的化学合成的引物
<400>14
ggcactgttt gaagtccttg acc                      23
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS-2基因的化学合成的引物
<400>15
aaaattggcg gagcaaggc                           19
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS-2基因的化学合成的引物
<400>16
atgttcaggc agcagtcgag ag                       22
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS-4基因的化学合成的引物
<400>17
ccgacacctc attgctcttt tc                       22
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS-4基因的化学合成的引物
<400>18
tttcctgctc cgactcgttc tc                       22
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Tau基因的化学合成的引物
<400>19
agaagcaggc attggagaca cc                      22
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Tau基因的化学合成的引物
<400>20
aagcagccac tttgggttcc                         20
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增APP基因的化学合成的引物
<400>21
caatccaggc acagaaagag tcc                     23
<210>22
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增APP基因的化学合成的引物
<400>22
ttccataacc aagagaggct gc                      22
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增GLUT4基因的化学合成的引物
<400>23
gtatcatctc tcagtggctt ggaag                   25
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增GLUT4基因的化学合成的引物
<400>24
tttcatagga ggcagcagcg                      20
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IDE基因的化学合成的引物
<400>25
tgatgaatga tgcctggaga ctc                  23
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IDE基因的化学合成的引物
<400>26
tcaatccctt cttggtttgg tc                   22
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增18S基因的化学合成的引物
<400>27
ggacacggac aggattgaca                      20
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增18S基因的化学合成的引物
<400>28
acccacggaa tcgagaaaga                      20
<210>29
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增28S基因的化学合成的引物
<400>29
ggtaaacggc gggagtaact atg                      23
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增28S基因的化学合成的引物
<400>30
taggtaggga cagtgggaat ctcg                     24
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增胰岛素受体基因的化学合成的引物
<400>31
tgacaatgag gaatgtgggg ac                       22
<210>32
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增胰岛素受体基因的化学合成的引物
<400>32
gggcaaactt tctgacaatg actg                     24
<210>33
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I基因的化学合成的引物
<400>33
gaccaagggg cttttacttc aac                      23
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I基因的化学合成的引物
<400>34
tttgtaggct tcagcggagc ac                      22
<210>35
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I受体基因的化学合成的引物
<400>35
gaagtctgcg gtggtgataa agg                     23
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-I受体基因的化学合成的引物
<400>36
tctgggcaca aagatggagt tg                      22
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II基因的化学合成的引物
<400>37
ccaagaagaa aggaagggga cc                      22
<210>38
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II基因的化学合成的引物
<400>38
ggcggctatt gttgttcaca gc                      22
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II受体基因的化学合成的引物
<400>39
ttgctattga ccttagtccc ttgg                      24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IGF-II受体基因的化学合成的引物
<400>40
agagtgagac ctttgtgtcc ccac                      24
<210>41
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS 1基因的化学合成的引物
<400>41
gataccgatg gcttctcaga cg                        22
<210>42
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS 1基因的化学合成的引物
<400>42
tcgttctcat aatactccag gcg                       23
<210>43
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS 2基因的化学合成的引物
<400>43
caacattgac tttggtgaag ggg                       23
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS 2基因的化学合成的引物
<400>44
tgaagcagga ctactggctg agag                      24
<210>45
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS 4基因的化学合成的引物
<400>45
acctgaagat aaggggtcgt ctgc                      24
<210>46
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增IRS 4基因的化学合成的引物
<400>46
tgtgtggggt ttagtggtct gg                        22
<210>47
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Tau基因的化学合成的引物
<400>47
cgccaggagt ttgacacaat g                         21
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Tau基因的化学合成的引物
<400>48
ccttcttggt cttggagcat agtg                      24
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增APP基因的化学合成的引物
<400>49
gcagaatgga aaatgggagt cag                      23
<210>50
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增APP基因的化学合成的引物
<400>50
aatcacgatg tgggtgtgcg tc                       22
<210>51
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增AChE基因的化学合成的引物
<400>51
ttctcccaca cctgtcctca tc                       22
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增AChE基因的化学合成的引物
<400>52
ttcatagata ccaacacggt tccc                     24
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ChAT基因的化学合成的引物
<400>53
tcacagatgc gtttcacaac tacc                     24
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增ChAT基因的化学合成的引物
<400>54
tgggacacaa cagcaacctt g                      21
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Hu基因的化学合成的引物
<400>55
cactgtgtga gggtccatct tctg                    24
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增Hu基因的化学合成的引物
<400>56
tcaagccatt ccactccatc tg                     22
<210>57
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增GFAP基因的化学合成的引物
<400>57
tggtaaagac ggtggagatg cg                     22
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增GFAP基因的化学合成的引物
<400>58
ggcactaaaa cagaagcaag ggg                    23
<210>59
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增MAG-1基因的化学合成的引物
<400>59
aaccttctgt atcagtgctc ctcg                      24
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增MAG-1基因的化学合成的引物
<400>60
cagtcaacca agtctcttcc gtg                       23
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增AIF-1基因的化学合成的引物
<400>61
ggatgggatc aacaagcact                           20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增AIF-1基因的化学合成的引物
<400>62
gtttctccag cattcgcttc                           20

Claims (6)

1.一种用于诊断AD的诊断试剂盒，其包括用于测定中枢神经系统组织或液体中胰岛素/IGF信号传导途径中至少六种因子的水平或功能的各种检测试剂和一组进行诊断测试的说明书，所述因子包括胰岛素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、胰岛素样生长因子-II(IGF-II)、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体，当其中至少两种因子的水平或功能比年龄匹配的对照低至少2倍，则指示患AD。
2.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其包含特异性结合胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体的一种或多种抗体。
3.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其包含杂交编码胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体的多核苷酸的一种或多种寡核苷酸。
4.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其包含用于扩增编码胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体的多核苷酸的一对或多对引物。
5.如权利要求1所述的诊断试剂盒，其包含胰岛素、IGF-I、IGF-II、胰岛素受体、IGF-I受体和IGF-II受体可对其起作用的一种或多种酶底物。
6.如权利要求1所述的诊断试剂盒，所述中枢神经系统组织或液体选自：海马区、下丘脑、额叶、脑部血液、浆液和脑脊液。
CN2005800415583A 2004-12-03 2005-12-05 阿尔茨海默病的诊断和治疗 Expired - Fee Related CN101102789B (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US63261904P 2004-12-03 2004-12-03
US60/632,619 2004-12-03
US65408005P 2005-02-18 2005-02-18
US60/654,080 2005-02-18
US73186205P 2005-11-01 2005-11-01
US60/731,862 2005-11-01
PCT/US2005/043856 WO2006060753A2 (en) 2004-12-03 2005-12-05 Diagnosis and treatment of alzheimer's disease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101102789A CN101102789A (zh) 2008-01-09
CN101102789B true CN101102789B (zh) 2012-05-30

Family

ID=36565828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2005800415583A Expired - Fee Related CN101102789B (zh) 2004-12-03 2005-12-05 阿尔茨海默病的诊断和治疗

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP1817050B1 (zh)
JP (1) JP5921052B2 (zh)
CN (1) CN101102789B (zh)
AU (1) AU2005311601B2 (zh)
CA (1) CA2587601C (zh)
ES (1) ES2540754T3 (zh)
WO (1) WO2006060753A2 (zh)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233429A1 (en) 2005-09-16 2010-09-16 Yamatake Corporation Substrate for Biochip, Biochip, Method for Manufacturing Substrate for Biochip and Method for Manufacturing Biochip
JP4763402B2 (ja) * 2005-09-26 2011-08-31 株式会社山武 バイオチップの製造方法及びバイオチップ用基板
KR101729986B1 (ko) * 2006-09-22 2017-04-25 노보 노르디스크 에이/에스 프로테아제 내성 인슐린 유사체
ES2579229T3 (es) 2007-03-13 2016-08-08 Jds Therapeutics, Llc Procedimientos y composiciones para la liberación sostenida de cromo
WO2009002867A2 (en) 2007-06-26 2008-12-31 Nutrition 21, Inc. Multiple unit dosage form having a therapeutic agents in combination with a nutritional supplement
ES2618073T3 (es) 2008-03-14 2017-06-20 Novo Nordisk A/S Análogos de insulina estabilizados frente a proteasas
EP2910569B1 (en) 2008-03-18 2016-10-05 Novo Nordisk A/S Protease stabilized, acylated insulin analogues
CN101738468B (zh) * 2008-11-24 2013-03-27 中国医学科学院阜外心血管病医院 胰岛素样生长因子ⅱ受体在检测心力衰竭中的应用及试剂盒
EP4070801A1 (en) * 2011-03-01 2022-10-12 Nutrition 21, LLC Compositions of insulin and chromium for the treatment and prevention of diabetes, hypoglycemia and related disorders
DK2885641T3 (da) * 2012-08-16 2018-01-29 Critical Care Diagnostics Inc Fremgangsmådeer til forudsigelse af risiko for udvikling af hypertension
ES2495266B8 (es) * 2013-02-13 2015-11-12 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Uso de igf-1 como reactivo de diagnóstico y/o pronóstico precoz de la enfermedad de alzheimer
PL3055325T3 (pl) 2013-10-07 2018-06-29 Novo Nordisk A/S Nowa pochodna analogu insuliny
WO2016172952A1 (zh) 2015-04-30 2016-11-03 江苏挪贝肽医药科技有限公司 PI4KIIIα蛋白及相关的膜蛋白复合体在治疗阿尔茨海默病中的应用
JOP20200228A1 (ar) 2015-12-21 2017-06-16 Novartis Ag تركيبات وطرق لخفض تعبير البروتين tau
CN105494263B (zh) * 2015-12-25 2018-11-30 哈尔滨医科大学 一种产生ho-1/app/psen1三转基因阿尔茨海默病小鼠模型的方法
AU2017217466A1 (en) 2016-02-11 2018-08-23 Nutrition 21, Llc Chromium containing compositions for improving health and fitness
HRP20221324T1 (hr) 2016-12-16 2022-12-23 Novo Nordisk A/S Farmaceutski pripravci koji sadrže inzulin
CN116612833B (zh) * 2023-06-19 2025-02-14 江西德上制药股份有限公司 一种智能筛选治疗阿尔茨海默病的中药活性成分的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5817623A (en) * 1995-03-06 1998-10-06 Univ Colorado State Res Found Method for treating diabetic peripheral neuropathy with IGF-I or IGF-II
JP2000253774A (ja) * 1999-03-12 2000-09-19 Mitsubishi Chemicals Corp タウ蛋白のリン酸化が亢進された実験用マウス
JP2002040023A (ja) * 2000-07-28 2002-02-06 Mitsubishi Chemicals Corp アルツハイマー病の検出方法
MXPA04000906A (es) * 2001-08-03 2004-11-22 Novo Nordisk As Nuevos derivados de 2,4-diaminotiazol.
US20030162290A1 (en) * 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
ES2207387B1 (es) * 2002-02-28 2005-07-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas Composicion quimica de igf-i para el tratamiento y prevencion de enfermedades neurodegenerativas.
US7655619B2 (en) * 2002-05-06 2010-02-02 Thomas Jefferson University Insulin-associated peptides with effects on cerebral health

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
E. Grunblatt et al.Gene expression profile in streptozotocin ratmodelforsporadicAlzheimer＇s disease.J Neural Transm111.2003,111367-386. *
L. Frolich et al.Brain insulin and insulin receptors in agingandsporadicAlzheimer＇s disease.J Neural Transm105.1998,105423-438. *
张钦传 等.胰岛素在阿尔茨海默病发病中的作用.《中华内分泌代谢杂志》.2004,第20卷(第2期),176-177. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101102789A (zh) 2008-01-09
EP1817050A4 (en) 2009-08-26
JP2008522199A (ja) 2008-06-26
WO2006060753A2 (en) 2006-06-08
EP1817050A2 (en) 2007-08-15
ES2540754T3 (es) 2015-07-13
JP5921052B2 (ja) 2016-05-24
WO2006060753A3 (en) 2006-11-16
CA2587601A1 (en) 2006-06-08
AU2005311601B2 (en) 2011-12-01
AU2005311601A1 (en) 2006-06-08
CA2587601C (en) 2017-11-07
EP1817050B1 (en) 2015-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101102789B (zh) 阿尔茨海默病的诊断和治疗
US7833513B2 (en) Treatment of Alzheimer&#39;s Disease
Peters et al. Neurobiological bases of age-related cognitive decline in the rhesus monkey
Arluison et al. Distribution and anatomical localization of the glucose transporter 2 (GLUT2) in the adult rat brain—an immunohistochemical study
Fort et al. Differential roles of hyperglycemia and hypoinsulinemia in diabetes induced retinal cell death: evidence for retinal insulin resistance
D’intino et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non‐human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism
El Messari et al. Expression of insulin-responsive glucose transporter GLUT4 mRNA in the rat brain and spinal cord: an in situ hybridization study
Niwa et al. A novel molecule “shati” is involved in methamphetamine-induced hyperlocomotion, sensitization, and conditioned place preference
Sindelar et al. Neuropeptide Y is required for hyperphagic feeding in response to neuroglucopenia
Huang et al. The essential role of endothelial nitric oxide synthase activation in insulin-mediated neuroprotection against ischemic stroke in diabetes
Sucquart et al. Neurokinin 3 receptor antagonism ameliorates key metabolic features in a hyperandrogenic PCOS mouse model
Lu et al. Repeated administration of amphetamine or cocaine does not alter AMPA receptor subunit expression in the rat midbrain
Henley et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons
CN106659766A (zh) 烯醇酶1(eno1)组合物及其用途
Sanuki et al. Normal aging hyperactivates innate immunity and reduces the medical efficacy of minocycline in brain injury
Germano et al. The GLP-1 medicines semaglutide and tirzepatide do not alter disease-related pathology, behaviour or cognitive function in 5XFAD and APP/PS1 mice
Kim et al. Development of a zebrafish larvae model for diabetic heart failure with reduced ejection fraction
KR20090066289A (ko) 알코올 유발성 뇌 질환의 치료, 예방 및 역행
KR20140054369A (ko) 당뇨병 치료를 위한 ｍｇ２９를 조정하는 조성물 및 방법
Conversi et al. DeltaFosB accumulation in ventro‐medial caudate underlies the induction but not the expression of behavioral sensitization by both repeated amphetamine and stress
Desjardins et al. Increased “peripheral-type” benzodiazepine receptor sites and mRNA in thalamus of thiamine-deficient rats
KR102603135B1 (ko) 장내 뉴로펩타이드 및 뉴로트로핀을 포함하는 파킨슨병의 진단 및 치료용 조성물
CN118685502B (zh) 小胶质细胞akap8l在糖尿病相关认知障碍诊断、治疗中的应用
CN116334216B (zh) Cldn5基因在调控认知障碍中的功能及应用
US20230210858A1 (en) Podosomes as a therapeutic target for intracranial aneurysm

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20120530

Termination date: 20191205