CN101100651B

CN101100651B - 链霉菌属菌株及其应用方法

Info

Publication number: CN101100651B
Application number: CN200710072268A
Authority: CN
Inventors: 向文胜; 王相晶; 姜玲
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2007-05-28
Filing date: 2007-05-28
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2027-05-28
Also published as: CN101100651A

Abstract

本发明提供的是链霉菌属菌株、链霉菌属菌株的培养物及其培养方法。它是于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.1734，命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsissp.nov)的菌株。本发明的菌株除能产生米尔贝菌素A₃，A₄，还能产生五种新化合物和猎神霉素。且新化合物对螨虫和其他损害植物的昆虫具有很高的抑制活性。对我国农用抗生素的开发研究具有重要的意义。

Description

链霉菌属菌株及其应用方法

(一)技术领域

本发明涉及的是一种微生物，本发明还涉及一种微生物的培养物。

(二)背景技术

放线菌是自然界分布最广泛的微生物类群之一，而链霉菌(Streptanyces)是放线菌中最大的一个类群，也是抗生素的重要产生菌。目前，包括出现在专利中的种已经超过3000个，至1996年有效描述的种有464个和亚种45个。据统计，链霉菌产生的抗生素占抗生素的70％左右。占放线菌产生抗生素的90％以上。而目前我国发现的农用抗生素，无论是大面积应用还是局部地区商品化产品，或是有较大应用潜力的农用抗生素产生菌均为链霉菌。现已发现，在链霉菌的代谢产物中，包含多种在植物病害防治中有活性的物质，以及植物激素等。目前，人们在土壤放线菌中已发现了许多具有很高经济价值的新农用抗生素。应用最广泛的阿维菌素产生菌就是日木北里研究所从静岗县伊东市河奈地区土壤中分离获得的一种链霉菌。米尔贝(Milbemycin)其产生菌也是链霉菌。米尔贝霉素首先被日本科学家发现，由土壤放线菌Streptomyces hygroscopicus.subsp aureolacrimosus发酵液产生的十六元大环内酯混合物。米尔贝霉素对各种螨类都有高的防效；对农业害虫如蚜、螨、黄褐天幕毛虫也具有防治活性，而且对害虫的天敌伤害小；此外，它也是防治动物肠道寄生虫的优良药剂。米贝尔霉素化合物A3、A4与目前最广泛使用的生物农药阿维菌素比较，其对大鼠的毒性要低40倍。因此，2002年美国EPA批准米贝尔霉素是在草莓、西瓜、桃、梨、茄子、家庭观赏植物等中使用最安全的农药，日本还登记用于茶叶。除米尔贝霉素化合物A3、A4已商品化外；米尔贝霉素A3、A4肟(milbemycin oxime)的化合物也已商品化用于兽药，可有效预防犬心丝虫症及驱除肠内寄生虫(蛔、钩、鞭虫)，2004年又一米尔贝霉素A3、A4衍生的新化合物Lepimectin也已登记用于防治蔬菜、水果的鳞翅目、半翅类等害虫。

日本的产米尔贝菌株Streptomyces hygroscopicus.subsp aureolacrimosus未见报道生物合成聚醚类化合物(见表1)。在20世纪90年代，化合物的重复筛选率已经达到了90％～95％，尤其在链霉菌中更是超过了99％。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种既能产生米尔贝菌素A₃，A₄，还能产生五种新化合物和猎神霉素，且新化合物对螨虫和其他损害植物的昆虫具有很高的抑制活性的链霉菌属菌株。本发明的目的也在于提供这种链霉菌属菌株的培养物。本发明的目的还在于提供链霉菌属菌株的培养物的培养方法。

本发明的目的是这样实现的：一种链霉菌属菌株，是于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.1734，命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)的菌株。

该菌株的16S rDNA序列为：

ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCGGCTTCGGCTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAA

CACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCTGGTGAGGCATCT

CATTGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCG

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AGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGC

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CGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCAC

AAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACATCCAGAG

ATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCC

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GTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGTCGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTG

GGACGAAGTCGTAACAA。

它是于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.1734，命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)的菌株。

此链霉菌属菌株特征是：该菌株的16S rDNA序列为：

GGACGAAGTCGTAACAA。

本发明的链霉菌属菌株用于米尔贝霉素A3、A4及五种新米尔贝霉素化合物和一种聚醚类抗生素的制备。

所述的五种新米尔贝霉素化合物和一种聚醚类抗生素的结构式分别为：

本发明的链霉菌属菌株用于米尔贝霉素A3、A4及五种新米尔贝霉素化合物和一种聚醚类抗生素的制备的具体方法为(本方法用于制备前两种新化合物)：

发酵菌种为分类命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)，于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏登记号为：CGMCCNO.1734；

(a)斜面培养：采用由可溶性淀粉20g、KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、FeSO₄·7H₂O 0.01g、琼脂20g和蒸馏水1000ml的比例组成的，pH值7.2～7.4的高氏一号培养基，于1×10⁵Pa下灭菌30min，接菌后在28～32℃下培养4d；

(b)种子培养：采用葡萄糖5～10g、可溶性淀粉5～10g、牛肉膏5～10g、蛋白胨10～18g、氯化钠5～8g和蒸馏水1000ml的比例组成的，pH值7.2的培养基，用250ml的三角瓶每瓶分装100ml，然后用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1×10⁶～1×10⁷个/ml，每瓶加1ml孢子悬浮液，置于摇床上28～32C培养24～36h；

(c)发酵：采用液体摇瓶发酵，培养基为小米10～30g加蒸馏水1000ml煮沸15min后滤去米粒，加入葡萄糖15～30g、碳酸钙2～15g、氯化钠5～12g、蛋白胨5～15g，pH值7.2～7.4，于1×10⁵Pa下灭菌30min，分装于250ml三角瓶，每瓶20～100ml，接种量10％(V/V)，摇床转速150～240r/min，28～32℃振荡培养4～5d；

(d)发酵液处理：发酵液经100～200目筛网过滤后，用95％甲醇浸提；将得到的浸提物进行溶剂萃取，硅胶柱层析和RP-18层析后，得到二种无色的粉末状化合物。

本发明的链霉菌属菌株用于米尔贝霉素A3、A4及五种新米尔贝霉素化合物和一种聚醚类抗生素的制备的具体方法为(本方法用于制备后三种新化合物)：

(a)斜面培养：将0.4％的蔗糖、0.2％的酵母粉、0.5％的麦芽提取物、0.1％和脱脂奶粉溶于水中，用1mol NaOH调pH至7.0，加2.0％的琼脂，再调pH至7.2后121℃灭菌30min，28℃培养7-8天，用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液；

(b)种子培养：培养基由质量比为1％的蔗糖、0.4％的蛋白冻、0.05％的K₂HPO₄溶于水中，用250ml的三角瓶每瓶分装25ml，将1ml孢子悬浮液加入25ml种子培养基中，置于摇床上28℃，250rpm培养42h；

后将蔗糖8％、大豆饼粉1％、酵母粉0.2％、牛肉膏0.1％、CaCO₃ 0.3％、K₂HPO₄ 0.03％、MgSO₄·7H₂O 0.1％、FeSO₄·7H₂O 0.005％溶于水中所组成的培养基，调节pH至7.2，每100ml分装于1L三角瓶，121℃灭菌30min，接种8ml含孢子悬浮液的种子培养基，至于摇床28℃，250rpm培养8天；

(c)发酵液处理：50L发酵液经200目筛网过滤，并且用水清洗发酵液，发酵液和清洗用的水全都弃掉，用30升甲醇浸提过滤后得到的滤渣，通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到大约2升，再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次，将得到的EtOAc相，减压蒸馏会产生25g油状物质；将所得油状物上粒径200～300目的硅胶柱进行层析，分别用石油醚∶丙酮为95∶5-50∶50的混合物洗脱，蒸馏得到不含A3和A4的粗制品，将粗制品分别用石油醚∶丙酮为9∶1-3∶1两种洗脱液进行洗脱，得到了五个组分，将组分四上RP-C₁₈硅胶柱进行层析，用甲醇∶水＝70∶30-85∶15二种洗脱液进行洗脱，得到新化合物3、4；将组分三上RP-C₁₈硅胶柱进行层析，用甲醇∶水＝70∶30-95∶5洗脱得到新化合物5。

在含有C、N和无机盐的可同化源的水液培养基中培育保藏编号为CGMCC NO.1734的菌株，或其产生的猎神霉素和米尔贝霉素A₃、A₄的突变体或变异体。直至米尔贝菌素A₃、A₄及包括新化合物1、新化合物2、新化合物3、新化合物4、新化合物5和猎神霉素在内的至少一种化合物出现。

本发明不仅筛选到一株新链霉菌，并从该菌株中得到米尔贝霉素A3、A4及五种新米尔贝霉素化合物和1种聚醚类抗生素，这对我国农用抗生素的开发研究具有重要的意义。

本发明的菌株属于一株产米尔贝菌素A₃，A₄及五种新化合物和猎神霉素的菌株，对其进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分及16SrDNA序列(DQ449953)等鉴定，并与其它菌株进行比较，鉴定为一新种链霉菌(Streptomyces)，命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)，此菌除能产生米尔贝菌素A₃，A₄，还能产生五种新化合物。且对新化合物螨虫和其他损害植物的昆虫具有很高的抑制活性。

菌落在高氏培养基表面生长紧密，菌落颜色随着时间的推移逐渐变深，即由白色最终变为灰色。在油镜下观察菌丝：基丝分枝，无横隔，不断裂；气丝分枝较多，较基丝粗；孢子丝为3-8圈紧密螺旋，如图1。成熟菌丝直径约为0.8-1.2μm。透射电镜观察孢子：孢子卵圆形，孢子表面有明显的疣，如图2。从这些形态特征看，该菌种可归为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

菌株的鉴定：

配制高氏合成一号、葡萄糖天门冬素琼脂、察氏琼脂、苹果酸钙琼脂、营养琼脂、马铃薯浸汁琼脂、淀粉铵琼脂、燕麦粉琼脂等八种培养基各100ml，灭菌后铺平板，凝固后，用划线法涂上待观察的菌种孢子悬浮液。28℃下培养7、15和30d，记录培养特征。

菌种冰城链霉菌在八种培养基上的培养特征如表1示。

表1链霉菌在8种不同培养基上的培养特征比较

新化合物1和2的杀虫活性

对植物有致命性的螨类的触杀作用：OP-敏感的棉红蜘蛛。

在试验开始前16小时，用一片长满了棉红蜘蛛的叶片放在菜豆植株上，使菜豆植株感染上红蜘蛛后，再将叶子移走，在侵染的植株上就会出现有各种龄期和虫态的红蜘蛛，于是用含有试验化合物0.4ppm或1.6ppm的溶液喷雾至有药液滴下为止。室温的温度大约是25摄氏度。

七天后，在立体显微镜下统计活动期(成虫和若虫)和卵的为分率。新化合物1和2在0.4ppm时能使红蜘蛛全部杀死。

新化合物3、4、5的杀虫活性

新的化合物3、4、5具有强大的杀灭螨虫和线虫的活性，见表2、3。实验证明，这些新化合物比以往所知的米尔贝菌素活性更强。一般来说，α型米尔贝霉素比β型活性强。但是，更高活性的半成品仍在不断的研究中。

表2.米尔贝新化合物杀灭二斑叶螨成虫和虫卵的活性

表3.米尔贝新化合物杀灭线虫的活性

^*米尔贝 A3 and A4混合(30∶70)

(四)附图说明

图1是油镜下观察的菌丝形态；

图2和图3是菌株的孢子；

图4是DNA提取结果；

图5是16S rDNA的PCR电泳结果。

(五)具体实施方式

下面举例对本发明做更详细地描述：

本发明的链霉菌属菌株，是于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.1734，命名为冰城链霉菌(Streptomycesbingchengsis sp.nov)的菌株。

该菌株的16S rDNA序列为：

GGACGAAGTCGTAACAA。

其中新化合物1的结构式为：

新化合物2的结构式为：

新化合物3的结构式为：

新化合物4的结构式为：

新化合物5的结构式为：

米尔贝菌素A₄的结构式：

米尔贝菌素A₃的结构式：

猎神霉素的结构式：

具体培养方法为：

发酵菌种：发酵菌种的分类命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)，于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏登记号为：CGMCC NO.1734。

(1)产生新化合物1和2的发酵

(a)斜面培养：采用高氏一号培养基(可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH值7.2～7.4)于1×10⁵Pa下灭菌30min，接菌后在28～32℃下培养4d；

(b)种子培养培养基(葡萄糖5～10g，可溶性淀粉5～10g，牛肉膏5～10g，蛋白胨10～18g，氯化钠5～8g，蒸馏水1000ml，pH值7.2)，用250ml的三角瓶每瓶分装100ml，然后用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1×10⁶～1×10⁷个/ml。每瓶加1ml孢子悬浮液，置于摇床上28～32C培养24～36h；

(c)发酵采用液体摇瓶发酵，培养基(小米10～30g加蒸馏水1000ml煮沸15min后滤去米粒，加入葡萄糖15～30g，碳酸钙2～15g，氯化钠5～12g，蛋白胨5～15g，pH值7.2～7.4)于1×10⁵Pa下灭菌30min，分装于250ml三角瓶，每瓶20～100ml。接种量10％(V/V)，摇床转速150～240r/min，28～32℃振荡培养4～5d。

(2)发酵液处理

(a)发酵液经100～200目筛网过滤后，用95％甲醇浸提；

(b)将得到的浸提物进行溶剂萃取，硅胶柱层析和RP-18层析后，得到二种无色的粉末状化合物。

(2)产生新化合物3、4、5的发酵

(a)斜面培养：将0.4％的蔗糖，0.2％的酵母粉，0.5％的麦芽提取物，0.1％和脱脂奶粉，溶于水中，用1mol NaOH调pH至7.0，加2.0％的琼脂，再调pH至7.2后121℃灭菌30min，28℃培养7-8天，用1ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液。

(b)种子培养：培养基质量百分比为蔗糖1％；蛋白冻0.4％；K₂HPO₄0.05％溶于水中。用250ml的三角瓶每瓶分装25ml，将1ml孢子悬浮液加入25ml种子培养基中，置于摇床上28℃，250rpm培养42h。

后将培养基(蔗糖8％；大豆饼粉1％；酵母粉0.2％；牛肉膏0.1％；CaCO₃ 0.3％；K₂HPO₄ 0.03％，MgSO₄·7H₂O 0.1％，FeSO₄·7H₂O 0.005％溶于水中调节pH至7.2)每100ml分装于1L三角瓶，121℃灭菌30min，接种8ml含孢子悬浮液的种子培养基，至于摇床28℃，250rpm培养8天。

(c)发酵液处理：50L发酵液经200目筛网过滤，并且用水清洗发酵液，发酵液和清洗用的水全都弃掉，用30升甲醇浸提过滤后得到的滤渣，通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓缩到大约2升，再将浓缩液用相同体积的EtOAc浸提3次，将得到的EtOAc相，减压蒸馏会产生25g油状物质。将所得油状物上硅胶柱(粒径200～300目)进行层析，分别用石油醚∶丙酮(95∶5-50∶50)洗脱，蒸馏得到不含A3和A4的粗制品10g。将粗制品分别用石油醚∶丙酮(9∶1-3∶1)两种洗脱液进行洗脱，得到了五个组分，将组分四上RP-C₁₈硅胶柱进行层析，用甲醇∶水＝70∶30-85∶15二种洗脱液进行洗脱，会得到化合物3(20mg)和化合物4(11mg)。将组分三上RP-C₁₈硅胶柱进行层析，用甲醇∶水(70∶30-95∶5)洗脱得到化合物522mg。

序列表

16S rDNA序列为：

GGACGAAGTCGTAACAA。

Claims

1.一种链霉菌属菌株，其特征是：它是于2006年06月12日保藏于“中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为：CGMCC NO.1734，命名为冰城链霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)的菌株。

2.根据权利要求1所述的链霉菌属菌株，其特征是：该菌株的16S rDNA序列为：ACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCGGCTTCGGCTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACCTGGTGAGGCATCTCATTGGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACATCCAGAGATGGGTGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGTCGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA。