CN101084315A

CN101084315A - 具有增加的贮藏碳水化合物含量的甘蔗植物

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Publication number: CN101084315A
Application number: CNA2005800440049A
Authority: CN
Inventors: E·赫尔维吉; K·克努特
Original assignee: Bayer CropScience AG
Current assignee: Bayer CropScience AG
Priority date: 2004-12-21
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2025-12-21
Also published as: US7807871B2; US20080127370A1; US8252976B2; EP1831378B1; ES2356053T3; BRPI0518889A2; WO2006066969A2; CN101084315B; AU2005318373A1; AR052059A1; WO2006066969A3; US20110061131A1; BRPI0518889B1; DE602005025158D1; EP1831378A2; ATE490329T1; AU2005318373B2; ZA200704655B

Abstract

本发明涉及增加甘蔗植物的贮藏碳水化合物含量的方法。

Description

具有增加的贮藏碳水化合物含量的甘蔗植物

本发明涉及增加甘蔗植物的贮藏碳水化合物含量的方法。

涉及农学和林学领域的那些人力求不断地提供高产量的植物，特别是用以保证持续增加的世界人口的食物供应和确保可再生原材料的供应。常规的尝试是通过育种的方法保持高产量的植物。但是这一方法是耗费时间和劳动的。在有些情况下，已经取得的进展是通过对植物进行遗传操作，即通过将外源(重组)核酸分子直接引入植物并在植物中表达。

除甜菜外，甘蔗是用来生产糖(蔗糖)的最重要的植物。为了得到甘蔗糖，以昂贵的制造方法收割甘蔗并且随后将其运输到工厂。在提取糖前，先清洁甘蔗。在常规方法中，随后将甘蔗粉碎并通过4-6个滚压机以从纤维(蔗渣)中分离糖汁。通过澄清、蒸发、分级结晶以及用离心从晶体中分离出母液(糖蜜)得到结晶的和离心的糖(蔗糖)。糖蜜通常是从甘蔗中获得糖中最主要的经济副产物，包含大约50％的糖(蔗糖和单糖)。它们用作发酵产品(其中乙醇是最重要的)的原材料，并且另外用作动物饲料以及在某些国家中也用作人的营养品(在埃及作为“黑蜂蜜”)。

现有的生物技术学方法允许产生这样的甘蔗植物，其除了合成甘蔗糖(蔗糖)和糖蜜之外还合成有价值的储存碳水化合物，例如果聚糖，果聚糖可以随后用于工业、化妆品或药用目的或用在食物工艺中。

因此，例如国际专利申请WO96/01904、WO96/21023、WO98/39460和WO/9924593意图在甘蔗中单独或与1-FFT基因联合表达1-SST基因，从而在转基因甘蔗中产生果聚糖。

以有效的方式从甘蔗植物中获得贮藏碳水化合物(蔗糖和果聚糖)需要使蔗糖植物中的贮藏碳水化合物含量增加的方法。

因此本发明的目标是提供这样的方法，所述方法使甘蔗植物中的贮藏碳水化合物含量比常规的甘蔗植物增加。

通过提供在专利权利要求书中详细说明的实施方案来实现此目标。

因此本发明涉及增加蔗糖植物的贮藏碳水化合物含量的方法，包括：

(a) 通过引入至少一种编码果糖基转移酶的外源核酸分子对甘蔗植物进行遗传修饰。

(b)与对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物相比，根据(a)的遗传修饰的甘蔗植物具有增加的贮藏碳水化合物含量。

为了本发明目的，将术语“贮藏碳水化合物含量”理解为意味着每克鲜重的总蔗糖和果聚糖含量。

为了本发明目的，术语“增加贮藏碳水化合物含量”或“增加的贮藏碳水化合物含量”意思是每克鲜重的蔗糖和果聚糖总含量总体上增加了2-100％，优选增加了5-80％，并且尤其优选增加了10-65％。

在本发明的上下文中，蔗糖和果聚糖含量优选通过在方法部分中另外描述的方法来确定。

在另一个实施方案中，本发明涉及增加甘蔗植物的总碳水化合物含量的方法，其包括：

(a)通过引入至少一种编码果糖基转移酶的外源核酸分子对甘蔗植物进行遗传修饰；

(b)与相对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物相比，根据(a)的遗传修饰的甘蔗植物具有增加的总碳水化合物含量。

在本发明的上下文中，将术语“总碳水化合物含量”理解为意味着每克鲜重的葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖总碳水化合物含量。

在本发明的上下文中，术语“增加总碳水化合物含量”或“增加的总碳水化合物含量”意思是每克鲜重的碳水化合物葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖总含量总体上增加5-100％，优选增加了8-80％，并且尤其优选增加了11-66％。

在本发明的上下文中，蔗糖、葡萄糖、果糖或果聚糖含量优选通过下列在方法部分中另外描述的方法来确定。

在本发明的上下文中，蔗糖植物的鲜重是使用常规标准，通过测量完全移除叶子后所有甘蔗植物的地上茎重量来确定的。

令技术人员惊讶地是，在甘蔗植物中植物果糖基转移酶基因的表达不仅导致果聚糖的合成，而且使得贮藏碳水化合物(蔗糖+果聚糖)含量也同时增加。

在甜菜中1-SST基因的表达数据的基础上(Sevenier等人，NatureBiotechnology 16，(1998)，843)，技术人员可以期望在甘蔗中相应的方法同样导致减少的贮藏碳水化合物和总碳水化合物含量以及导致显著减少的蔗糖含量，所述的甜菜中1-SST基因的表达数据表明转基因甜菜植物比对应的甜菜野生型植物表现出减少的贮藏碳水化合物含量(蔗糖+果聚糖)、减少的总碳水化合物(蔗糖+果聚糖+葡萄糖+果糖)含量和显著减少的蔗糖含量(＜野生型的10％)。

但是令人惊讶地，在甘蔗中没有观察到这些影响(减少的贮藏碳水化合物和总碳水化合物含量)。相反，转基因甘蔗植物的贮藏碳水化合物和总碳水化合物含量甚至超过了对应的野生型植物。同样地，根据本发明方法的遗传修饰的甘蔗植物与对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物相比，没有表现出蔗糖含量减少至野生型水平的10％。

这一令人惊讶的作用有巨大的经济重要性，这是因为根据本发明的方法可以使甘蔗植物在将来用于得到两种原材料，即甘蔗糖和果聚糖，而不会使甘蔗糖产量显著下降。

在根据本发明方法的另一实施方案中，遗传修饰的甘蔗植物与对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物相比具有增加的贮藏和/或总碳水化合物含量，并且与对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物的蔗糖含量相比，遗传修饰的甘蔗植物的蔗糖含量总计超过对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物蔗糖含量的15％，优选是20-130％并且特别优选是30-100％。

在另一实施方案中，因此本发明涉及增加甘蔗植物贮藏碳水化合物含量的方法，其包括：

(b)与相对应的非遗传修饰的甘蔗野生型植物相比，根据(a)的遗传修饰的甘蔗植物在节间10-18之间具有增加的贮藏碳水化合物含量。

在本发明的上下文中，术语“增加的节间10-18之间贮藏碳水化合物含量”意思是在节间10和18之间的区域中每克鲜重的蔗糖和果聚糖含量总体上增加了至少5％，特别是5-90％，优选是10-80％并且尤其优选是15-75％。

在本发明的上下文中，将茎的节间从顶(＝1)到底(例如＝36)编号。在本发明的上下文中，“节间”在甘蔗植物中是指在两节(叶子长出来的地方)之间茎干轴的部分。

在本文上下文中，将术语“在节间10-18区域中每克鲜重的蔗糖和果聚糖含量”理解为意思是指确定了在节间10和节间18之间的茎区域中移除叶子后茎的蔗糖和果聚糖总含量和总鲜重。

在本发明的上下文中，将术语“甘蔗植物”理解为意思是指甘蔗属(Saccharum)的植物，优选是物种甘蔗(Saccharum officinarum)。

在本发明的上下文中，术语“遗传修饰”或“遗传修饰的”意思是指将至少一种编码果糖基转移酶的“外源核酸分子”引入到甘蔗植物细胞的基因组中或甘蔗植物的基因组中，其中所述的至少一种外源核酸分子的引入使得甘蔗植物合成果聚糖。不具有此遗传修饰的甘蔗植物不贮藏果聚糖，或果聚糖的量小以致于以优选地通过在下列方法部分(“果聚糖确定”)中另外描述的方法检测不到。

在本发明的上下文中，应当在至少具有10个节间，并且至少是6、优选10-18、尤其优选是15个月大的甘蔗植物上进行贮藏碳水化合物或总碳水化合物含量的确定。

在本发明的上下文中，将术语“外源核酸分子”理解为是指分子，优选是异源分子，其在对应的非遗传修饰的野生型植物/植物细胞中不天然存在或其在甘蔗野生型植物/植物细胞中不会以此特异性的空间排列天然存在或其位于甘蔗野生型植物/植物细胞基因组中的天然不存在它的位置上。

另外，通过如下实事将在本发明方法中使用的甘蔗植物/植物细胞与甘蔗野生型植物区别开来，即其包含至少一个稳定整合至其基因组中的外源核酸分子的拷贝(根据需要，除了天然存在于甘蔗野生型植物/植物细胞中的此类分子的拷贝之外)。在此情形中，特别是通过如下实事来区别根据本发明方法的甘蔗植物/植物细胞和甘蔗野生型植物/植物细胞，即此额外的拷贝或这些额外的拷贝位于在甘蔗野生型细胞中天然不存在它/它们的基因组中的位置上。例如这可以借助于Sounthern印迹分析来测试。

此外，本发明方法中采用的甘蔗植物/植物细胞优选地通过至少一个下列特征来区别于甘蔗野生型植物/植物细胞：如果被引入的外源核酸分子对于植物细胞或植物是异源的，那么被引入的核酸分子的转录物存在于在本发明方法中使用的甘蔗植物/植物细胞中。例如可以通过Northern印迹分析或通过RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)来检测这些核酸分子。

另外，本发明方法中采用的甘蔗植物/植物细胞形成了由被引入的外源核酸分子编码的蛋白质。例如通过免疫学方法特别是Western印迹分析来检测此蛋白质。

在本发明的上下文中，将术语“基因组”理解为意思是指在植物细胞中存在的遗传性物质的整体。技术人员已知，不仅是细胞核，而且还有其它细胞区室(例如质体、线粒体)包含遗传性物质。

外源核酸分子优选是由多种元件组成的重组分子，其组合或特异性空间排列在植物细胞中的天然不存在。

原则上，外源核酸分子可以是任何核酸分子，其编码至少一种果糖基转移酶并且其在甘蔗植物细胞或甘蔗植物中使得甘蔗植物合成果聚糖。

在本发明的上下文中，术语“甘蔗野生型植物细胞”意思是指作为本发明方法起始材料的甘蔗植物细胞，即其基因组没有通过引入编码至少一种果糖基转移酶的至少一种外源核酸分子来修饰。

在本发明的上下文中，术语“甘蔗野生型植物”意思是指作为本发明方法的起始材料的植物，即其基因组没有通过引入编码至少一种果糖基转移酶的至少一种外源核酸分子来修饰。

在本发明的上下文中，术语“对应的”意思是指当对比多个目标时，彼此对比的所讨论的目标保持在相同的条件下。在本发明的上下文中，在甘蔗野生型植物细胞或甘蔗野生型植物的背景中术语“对应的”意思是指彼此对比的甘蔗植物细胞或甘蔗植物在相同的培养条件下生长并且具有相同的年龄或培养了相同的时间。

在本发明的上下文中，术语“果糖基转移酶”是指在植物细胞中催化果聚糖合成并且也称作果糖基转移酶的植物酶。植物果糖基转移酶包括：

蔗糖：蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)(EC 2.4.1.99)，

果聚糖：果聚糖1-果糖基转移酶(1-FFT)(EC 2.4.1.100)，

果聚糖：果聚糖6G-果糖基转移酶(6G-FFT)(E.C.2.4.1.-)和

蔗糖：果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)(E.C.2.4.1.10)。

1-SST催化具有β-2，1-糖苷键的寡果聚糖(DP3-DP8)从底物蔗糖合成。1-SST催化下列反应：

2蔗糖＝葡萄糖+β-D-呋喃果糖基-(2→1)-β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡糖苷

技术人员已知，1-SST具有来自不同生物的编码序列并且可从例如下列NCBI GenBank登录号中获得：

洋葱(Allium cepa)AJ006066.1(Vijn，I.等人，Plant Physiol.117(4)，(1998)，1507-1513)；普通小麦(Triticum aestivum)AB029888.1(Kawakami，A.和Yoshida，M.，Biosci.Biotechnol.Biochem.66(11)，(2002)，2297-2305)；蒜(Allium sativum)AY098442.1；黑麦草(Lolium perenne)AY245431.1(Chalmers等人，J Plant Physiol.160(11)，(2003)，1385-91)；苇状羊茅(Festuca arundinacea)AJ297369.1，(Luescher等人，Plant Physiol.124(3)，(2000)，1217-1228)；大麦(Hordeum vulgare)AJ567377.2，(Nagaraj等人，New Phytologist.161(3)，(2004)，735-748)；药蒲公英(Taraxacumofficinale)(AS250634.1，van den Ende等人，Plant Physiol.123，(2000)，71-80)。

在本发明上下文中尤其优选地是来自洋蓟(Cynara scolymus)的1-SST(SEQ ID No.1)或来自菊芋(Helianthus tuberosus)的1-SST(见WO96/21023，图4(A)，GenBank登录号AJ009757.1，van der Meer等人，Plant J.15(4)，(1998)，489-500)。

1-FFT通过将果糖单位从寡果聚糖链转移到其它果聚糖或蔗糖上，催化具有达到DP＝200的聚合程度的菊粉类型长链β-2，1-连接的果聚糖的合成。1-FFT催化下列反应：

[β-D-果糖基-(2→1)-]_m+[β-D-果糖基-(2→1)-]_n＝[β-D-果糖基-(2→1)-]_m-1+[β-D-果糖基-(2→1)-]_n+1

除了[β-D-果糖基-(2→1)-]_n外，蔗糖也可以在上述反应中作为β-2，1-连接的果糖残基受体。

来自不同生物的1-FFT编码序列是技术人员已知的并且从例如下列GenBank登录号中获得：

菊苣(Cichorium intybus)U84398.1。

在本发明上下文中尤其优选地是来自洋蓟的1-FFT(SEQ ID No.2)或来自菊芋(Helianthus tuberosus)的1-FFT(见WO96/21023，图4(B)，GenBank登录号AJ009757.1，van der Meer等人，Plant J.15(4)，(1998)，489-500)。

在本发明方法的另一优选的实施方案中，除了编码1-SST的外源核酸分子外，将编码FFT的另一外源核酸分子也引入到甘蔗植物的基因组中。就是说，在根据本发明的这一实施方案中，第一外源核酸分子编码1-SST并且第二外源核酸分子编码1-FFT。

为了遗传修饰目的引入到甘蔗植物细胞或甘蔗植物中的外源核酸分子可以是单核酸分子形式或多个核酸分子形式。因此它们可以是在一个核酸分子中编码1-SST蛋白质和1-FFT蛋白质的外源核酸分子的形式，还可以是1-SST编码核酸序列和1-FFT编码核酸序列存在于不同的核酸分子上的核酸分子形式。编码1-SST蛋白质的核酸序列和编码1-FFT蛋白质的核酸序列例如可以同时存在于载体、质粒或线性核酸分子中，或可以是彼此分离的两个载体、质粒或线性核酸分子的成分。

如果编码1-SST蛋白质的核酸序列和编码1-FFT蛋白质的核酸序列存在于彼此分开的两个核酸分子中，可以将它们同时(共转化)或相继(即一个接一个(超转化))引入到植物细胞或植物的基因组中。

还可以将彼此分开的核酸分子引入到不同的单个甘蔗植物细胞或甘蔗植物中，它们随后彼此杂交以产生同时表达1-SST和1-FFT的甘蔗植物。

在本发明上下文中尤其优选地是洋蓟1-SST和洋蓟1-FFT组合、洋蓟1-SST和菊芋1-FFT组合、菊芋1-SST和洋蓟1-FFT组合或菊芋1-SST和菊芋1-FFT的组合。

在本发明的另一实施方案中，植物果糖基转移酶编码6G-FFT蛋白质，其可以利用1-酮糖作为果糖基供体从而将果糖单位转移到蔗糖的葡萄糖残基(葡萄糖C6碳原子)上或转移到存在的寡果聚糖(例如新菊粉系列的寡果聚糖)，这是通过形成β-2，6-糖苷键来进行的。果糖单位到蔗糖的葡萄糖残基的转移导致形成称作新菊粉系列(例如三糖新蔗果三糖(6G-蔗果三糖))的菊粉。

来自不同生物的6G-FFT编码序列是技术人员已知的并且例如可以从下列GeneBank登录号中获得：

洋葱Y07838.1(Vijn等人，Plant J.11(3)，(1997)，387-398)。

在根据本发明方法的优选的实施方案中，使用洋葱6G-FFT(SEQ IDNo.3)。

在本发明的另外实施方案中，植物果糖基转移酶编码6-SFT蛋白质，其从三糖1-蔗果三糖和蔗糖形成四糖二果糖(也称作1，6-蔗果四糖)，该四糖比1-蔗果三糖具有额外的β-2，6-连接的果糖单位。还讨论了6-SFT参与更长链的支链或直链果聚糖的合成(Vijn和Smeekens，Plant Physiology 120，(1999)，351-359)。6-SFT催化下列反应：

蔗糖+(2，6-β-D-果糖基)_n＝葡萄糖+(2，6-β-D-果糖基)_n+1

如果蔗糖是提供的唯一底物，那么6-AFT催化形成6-蔗果三糖。

来自不同生物的6-SFT编码序列是技术人员已知的并且例如可以从下列GeneBank登录号中获得：

普通小麦AB029887.1(Kawakami和Yoshida，Biosci.Biotechnol.Biochem.66(11)，(2002)，2297-2305)；偏生早熟禾(Poasecunda)AF192394.1(Wei等人，J.Plant Physiol.159(7)，(2002)，705-715)；冰草(Agropyron cristatum)AF211253.1(Wei和Chatterton，J.Plant Physiol.158，(2001)，1203-1213)。

在本发明方法的优选的实施方案中，使用大麦6-SFT(SEQ ID No.4)。

在每种情形中，外源核酸编码的1-SST、1-FFT、6G-FFT或6-SFT蛋白质共有一些特征。这些可以包括例如生物学活性、分子量、免疫反应性、构象、结构和/或功能性结构域等的存在，以及物理性质例如当进行凝胶电泳时的迁移性质、层析性质、沉降系数、溶解性、光谱性质、稳定性、最优pH，最优温度等。

在本发明方法的另外一个实施方案中，所使用的外源核酸分子编码的1-SST蛋白质与在SEQ ID No.1中所示的1-SST蛋白质具有至少40％、优选至少60％、尤其优选至少80％并且特别优选至少90％的同一性。

在本发明方法的另外一个实施方案中，所使用的外源核酸分子编码的1-FFT蛋白质与在SEQ ID No.2中所示的1-FFT蛋白质具有至少40％、优选至少60％、尤其优选至少80％并且特别优选至少90％的同一性。

在本发明方法的另外一个实施方案中，所使用的外源核酸分子编码的6G-FFT蛋白质与在SEQ ID No.3中所示的6G-FFT蛋白质具有至少70％、优选至少80％、尤其优选至少90％并且特别优选至少95％的同一性。

在本发明方法的另外一个实施方案中，所使用的外源核酸分子编码的6-SFT蛋白质与在SEQ ID No.4中所示的6-SFT蛋白质具有至少50％、优选至少80％、尤其优选至少90％并且特别优选至少95％的同一性。

使用在SEQ ID No.1、2、3或4中说明的序列信息，技术人员现在能够从其它植物物种中分离同源序列。例如，这可以借助于常规方法如使用适当的杂交探针筛选cDNA文库或基因组文库来进行。技术人员已知同源序列还可以借助于(简并)寡核苷酸以及使用基于PCR的方法来分离。还可以使用例如EMBL( http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm)或NCBI国家生物技术信息中心( National Center for BiotechnologyInformation， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的筛选数据库来鉴定同源序列。在此，将一个或多个序列设置为查询序列。之后通过计算机程序将此搜索序列对比在所选择的数据库中描述的已知序列比较。此类数据库搜索(例如blast或fasta搜索)是技术人员已知的。

如果在例如NCBI(国家生物技术信息中心( National Center forBiotechnology Information)， http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，国家生物技术信息中心国家医学图书馆(National Center for Biotechnology InformationNational Library of Medicine)，38A楼，Bethesda，MD 20894，美国)中进行此类数据库搜索，可以使用为数据库搜索设定的标准设置。

对于蛋白质序列比对(blastp)，这些设置如下：限制入口(limit entrez)＝未激活；滤器(filter)＝低复杂性激活；期望值＝10；字长＝3；矩阵＝BLOSUM62；空位代价：存在(existence)＝11，延伸(extension)＝1。

对于核酸序列比对(blastn)，将下列参数设置为：限制入口＝未激活；滤器＝低复杂性激活；期望值＝10；字长＝11.

在此类数据库搜索中，例如在SEQ ID No.1、2、3或4中描述的序列可以用作查询序列从而鉴别编码1-SST(SEQ ID No.1)、1-FFT(SEQ IDNo.2)、6G-FFT(SEQ ID No.3)或6-SFT(SEQ ID No.4)的同源蛋白质。

在本发明的上下文中，术语“同一性”意思是指与其它蛋白质氨基酸相同的氨基酸的数量(同一性)，表示为百分数。借助于计算机程序优选地确定同一性。如果彼此比较的序列长度不同，那么以较短序列与较长序列共有的氨基酸数量确定百分数同一性的方式来确定同一性。优选地，通过已知和公开可用的计算机程序ClustalW(Thompson等人，Nucleic AcidsResearch 22(1994)，4673-4680)来确定同一性。

通过欧洲分子生物学实验室(European Molecular BiologyLaboratory，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，德国)的JulieThompson( Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和Toby Gibson( Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)，，ClustalW是公开可用的。

ClustalW同样可以从多个网站上下载，其中有the IGBMC(Institut deGénétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 IllkirchCedex，France ； ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI( ftp:/ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及EBI欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，英国)所有的镜像网站。

优选地使用ClustalW计算机程序版本1.8确定同一性。将下列参数设置为：KTUPLE＝1、TOPDIAG＝5、WINDOW＝5、PAIRGAP＝3、GAPOPEN＝10、GAPEXTEND＝0.05、GAPDIST＝8、MAXDIV＝40、MATRIX＝GONNET、ENDGAPS(关闭)、NOPGAP、NOHGAP。

同一性还意味着，外源核酸分子编码的各个蛋白质之间功能和/或结构等效。与在SEQ ID No.1、2、3或4中描述的蛋白质同源的并且因此组成催化同一酶促反应的这些分子的衍生物的蛋白质可以是天然存在的变异(例如来自其他植物物种的蛋白质)的形式，或突变体(这些突变体可能是天然产生的或通过直接诱变产生)的形式。这些衍生物可以为合成序列的形式。

外源核酸分子可以是任何核酸分子，特别是DNA或RNA分子，例如cDNA、基因组DNA、mRNA等。它们可以是天然存在的分子，或由重组或化学合成方法生成的分子。它们可以是包含编码或非编码链的单链分子，或双链分子。

甘蔗转化可以用基因枪(粒子轰击)进行(Bower和Birch，Plant Journal2(3)，(1992)，409-416；Franks和Birch，Aust.J.Plant Physiol.18，(1991)，471-480；Gallo-Meagher和Irvine，Crop Science 36(5)，(1996)，1367-1374；Bower等人，Molecular Breeding 2(3)，(1996)，239-249；Snyman等人，S.Afr.J.Bot.62(3)，(1996)，151-154)或用土壤杆菌介导的基因转移(Arencibia等人，Transgenic Research 7，(1998)，An efficient protocol for sugarcane(Saccharum spp.L.)transformation mediated by Agrobacteriumtumefaciens，213-222)。

甘蔗植物再生也是技术人员已知的(见，例如Bower和Birch，PlantJournal 2(3)，(1992)，409-416；Gallo-Meagher和Irvine，Crop Science 36(5)，(1996)，1367-1374；Bower等人，Molecular Breeding 2(3)，(1996)，239-249；Ho和Vasil，Ann.Bot.51，(1983)，719-726)。

为了在甘蔗植物中表达编码果糖基转移酶的外源核酸分子，将这些分子优选地与在植物细胞中确保转录的调节DNA序列连接。这些具体包括启动子。原则上，在甘蔗植物/植物细胞中有活性的任何启动子适合于表达。

以这样的方式选择启动子，即表达组成型发生或仅在特定的组织、植物发育特定的时间点或由外部因素确定的时间点发生。相对于植物和外源核酸分子而言，启动子可以是同源的或异源的。

适当的组成型启动子的实例是花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子，称作35S启动子(Odell等人，1985，Nature，313，810-812)和玉米泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.18，(1992)，675-689)或稻泛素启动子(Liu等人，Plant Science 165，(2003)，High transgene expression levels insugarcane(Saccharum officinarum L.)driven by the rice ubiquitinpromoter RUBQ2，743-750)。

另外，可以使用在甘蔗茎中介导基因表达的启动子，如香蕉条斑badna病毒启动子(Schenk等人，Plant Mol.Biol.47，(200/1)，399-412)。

另外可以存在作为向转录物添加聚A尾的终止序列(聚腺苷酸化信号)。认为聚A尾具有稳定转录物的功能。此类元件在文献(参考Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)中描述并且可以根据需要被置换。

在启动子和编码区之间还可以存在内含子序列。此类内含子序列可以导致植物中表达稳定和提高表达(Callis等人，1987，Genes Devel.1，1183-1200；Luehrsen和Walbot，1991，Mol.Gen.Genet.225，81-93；Rethmeier等人，1997；Plant Journal.12(4)：895-899；Rose和Beliakoff，2000，Plant Physiol.122(2)，535-542；Vasil等人，1989，Plant Physiol.91，1575-1579；XU等人，2003，Science in China Series C第46卷No.6，561-569)。适当的内含子序列的实例是玉米sh-1基因的第一个内含子(Werr等人，EMBO J.4，(1985)，1373-1380)、玉米聚泛素基因1的第一个内含子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.18，(1992)，675-689)、稻肌动蛋白基因内含子(McElroy等人，Plant Cell 2，(1990)，Isolation of an efficient actinpromoter for use in rice transformation，163-172)，或拟南芥(Arabidopsis)PAT1基因的前两个内含子中的一个(Rose和Last，Plant J.11，(1997)，Introns act post-transcriptionally to increase expression of theArabidopsis thaliana tryptophan pathway gene PAT1，455-464)。

用在本发明上下文中的方法：

1.果聚糖的取样和糖确定

收获12到15个月大并且具有多于10个节间的甘蔗植物茎。在移除了所有叶子后，将茎的节间从顶(＝1)到底(例如＝36)编号。将重量为大约1-2克的茎盘从每个节间的中间切除。之后将3个节间的茎盘组合成一个样品并且在液体氮中冷冻。

对于糖和果聚糖的提取，首先将茎盘在韦林氏搀合器(来自Waring，New Hartford，Connecticut，美国)中切碎成粉末。通过在10mM pH7.0的磷酸钠缓冲液中于95℃下摇动一小时来提取糖和果聚糖。其后，通过经由30μm的筛过滤移除固体。随后将得到的溶液用于果聚糖和糖的确定(见下文)。

2.果聚糖确定

通过来自Megazyme的“果聚糖测定步骤”试剂盒来确定糖和果聚糖提取(见方法1)得到的溶液的果聚糖含量。此测定的原理是基于果聚糖水解成其还原单体葡萄糖和果糖以及随后在用称为“PAHBAH方法”(此方法的细节见下文)染色后，光测确定(波长＝410nm)这些还原的糖(葡萄糖、果糖)的含量。

在第一步中，通过特异性的酶蔗糖酶将提取物中存在的蔗糖水解，得到葡萄糖和果糖。另外，用高度纯化的酶β淀粉酶、支链淀粉酶和麦芽糖酶的混合物降解提取物中存在的淀粉和麦芽糖糊精，同样得到葡萄糖。其后，用碱性氢硼化物溶液处理将得到的还原糖将其还原成糖醇，并且因此从溶液中移除。将溶液中和并且通过添加稀释的乙酸移除过量的氢硼化物。其后，用纯化的果聚糖酶(外切复旋花粉酶)水解果聚糖得到果糖和葡萄糖，并且通过PAHBAH方法确定得到的单糖的含量。

试剂盒中的化学试剂和溶液：

1.50U蔗糖酶(酵母)、500Uβ淀粉酶(蜡状芽孢杆菌(B.cereus))、

100U支链淀粉酶(脑炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae))和

1000U麦芽糖酶(酵母)作为冻干的粉末存在；测量时，将它们溶解在22ml的pH6.5的0.1M的马来酸钠缓冲液中(在下文中称作“酶1”)。

2.8000U果聚糖酶以冻干粉末的形式存在；测量时，将它们溶解在22ml的pH4.5的0.1M乙酸钠缓冲液中(在下文中称作“酶2”)。

3.溶解在0.2％苯甲酸中的果糖标准溶液(1.5mg果糖/ml)。

4.果聚糖对照

具有已知果聚糖含量的氯仿洗涤的菊芋粉末。

试剂盒中不存在的溶液：

I.PAHBAH试剂

溶液A：在250ml玻璃烧杯中将10g的PAHBAH(对羟基苯甲酸酰肼，Sigma Bestell号H-9882)加入到60ml蒸馏水中，并且边搅拌边将10ml浓盐酸加入到上清液中。将溶液补足到200ml并且储存于室温。

溶液B：依次将24.9g柠檬酸三钠、2.20g氯化钙和40g氢氧化钠溶解在500ml蒸馏水中，同时搅拌。在加入氢氧化钠后，溶液是不透明的，但是当用水将溶液补足到2l时变成澄清的。将溶液储存于室温。

在即刻使用之前，将20ml溶液A加入到180ml溶液B中并且充分混合(＝PAHBAH试剂)。溶液必须储存于冰上并且可以使用4小时。

II.50mM氢氧化钠溶液

III.碱性氢硼化钠溶液

溶于50mM氢氧化钠的10mg/ml氢硼化钠(Sigma，Bestell No.S-9125)

IV.100mM乙酸

检测方法：

1.在95℃加热器中，在1ml蒸馏水中抽提20mg的果聚糖对照样品1小时。离心(13000×g下5分钟)后，将上清液转移到新的反应管中并且将沉淀物在次置于1ml蒸馏水中并且在加热器中于5℃抽提1小时。再次离心后(见上)，将上清液移出并且与第一次上清液混合。

2.将200μl样品(提取物，果聚糖标准和果聚糖对照)与200μl酶1混合并且在40℃下温育40分钟(温育时间比在Megazyme方法中说明的时间长10分钟)。

3.加入200μl碱性氢硼化钠溶液，并且将溶液充分混合并且于40℃时温育30分钟以实现从还原糖到糖醇的完全转化。

4.通过加入500μl的100mM乙酸并且充分混合，移除过量的氢硼化物并且将溶液恢复到pH＝4.5。

5.将200μl溶液的等分式样与100μl的酶2混合并且于40℃温育60分钟(比在Megazyme试剂盒中说明的温育时间长40分钟以实现果聚糖完全水解)。

6.果糖标准作为另一样品同时测试。用900μl的pH4.5的100mM乙酸钠缓冲液处理存在于试剂盒中的200μl果糖标准溶液并且混合。将4×200μl的此混合物移出并且用另一100μl的pH4.5的100mM乙酸钠缓冲液处理。

7.将所有的样品与额外的空白样品(300μl的pH4.5的100mM乙酸钠缓冲液)与5ml的PAHBAH试剂混合并且将混合物在沸水浴中精确温育6分钟。

8.其后，在冷水(10-15℃)中将样品立即冷却大约5分钟。

9.在410nm的波长时在分光光度计中对照空白样品测量所有溶液的吸收。

下列等式用于计算：

果聚糖(％w/w)＝ΔE×F×5×V_Ex×1.1/0.2×100/W×1/1000×162/180

ΔE＝对照着空白样品测量的样品PAHBAH吸收

F＝将果糖的吸收转变成μg果糖的因子(54.5μg果糖/吸收)

5＝200μl转变成1ml温育体积的系数

V_Ex＝提取物体积

1.1/0.2＝将总共1.1ml的酶水解液的0.2ml用于分析

100/W＝以重量(W)％指示果聚糖的系数

1/1000＝从μg到mg的转变

162/180＝将测量的游离果糖转变成果聚糖中的果糖的系数

3.糖(葡萄糖、果糖和蔗糖)的确定

在通过NAD⁺(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)到NADH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)转变的酶测定中，光测确定根据方法1得到的提取物中葡萄糖、果糖和蔗糖的含量。在还原过程中，烟酰胺环的芳族特征丧失，因此吸收谱改变。在吸收谱中的这一改变可以通过光度测定检测到。通过己糖激酶和腺苷三磷酸(ATP)将存在于提取物中的葡萄糖和果糖转化为葡糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸。然后通过酶葡糖-6-磷酸脱氢酶将葡糖-6-磷酸氧化得到6-磷酸葡糖酸。在此反应中，将NAD⁺还原产生NADH，并且通过光度测定确定形成的NADH的量。形成的NADH和存在于提取物中的葡萄糖的比例是1∶1，所以可以使用NADH的摩尔吸收系数(6.3lmmol^-1cm^-1)从NADH含量中计算葡萄糖含量。在葡糖-6-磷酸完全氧化后，同样在溶液中形成的果糖-6-磷酸，通过酶葡糖磷酸异构酶转变产生葡糖-6-磷酸，其顺次被氧化产生6-磷酸葡糖酸。同样地，果糖和形成的NADH的量是1∶1。其后，通过蔗糖酶(Megazyme)切割提取物中存在的蔗糖产生葡萄糖和果糖。之后在依赖NAD⁺的反应中用上述酶将释放的葡萄糖和果糖分子转变产生6-磷酸葡糖酸。1个蔗糖分子到6-磷酸葡糖酸的转变产生2个NADH分子。同样将形成的NADH的量通过光度测定确定并且用来计算蔗糖含量(使用NADH的摩尔吸收系数)。

4.总碳水化合物含量的确定

通过将葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖含量相加确定总碳水化合物含量。

5.贮藏碳水化合物含量的确定

通过将蔗糖和果聚糖含量相加确定贮藏碳水化合物含量。

实施例1：表达来自洋蓟(Cynara scolymus)的1-sst基因的转基因甘蔗植物(pML1植物)的产生

使用PCR引物P5(5′-aattcagctgttatccctaggcggacc-3′)(SEQ ID No.5)和P7(5′-agtcagctgggaatttaaatttaattaaggcg-3′)(SEQ ID No.6)，将载体pMCS5(MoBiTec GmbH，Gttingen，德国)的262bp片段扩增(1.5mMMgCl₂，25个循环，在每个循环中循环参数为：94℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，1U TaqI聚合酶/50μl)，并且将PCR产物用PvuH切割并且克隆到PvuH切割的载体pSK(-)(Stratagene)中。将得到的载体命名为pSK(-)-MCS。将2个PCR产物组合得到完成的载体。通过使用引物P5(见上)和P6(5′-ggtaactgtcagaccaagtttac-3′)扩增pSK(-)-MCS上的1266bp片段(1.5mM MgCl₂，30个循环，在每个循环中循环参数为：94℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，1U PwoI聚合酶/50μl)，得到第一个片段。使用引物Asd1(AAA ATTTAA ACA TAA TCA ggA TCA ATA AAA C)(SEQ ID No.7)和Asd2(AAA ATT TAA ACA TCT gCg CTT ACT CCT)(SEQ ID No.8)，在大肠杆菌(E.coli)DNA上扩增包含asd基因(Haziza等人EMBO J.1，1982，379-384；GenBank登录号V00262.1)的第二个PCR产物(1.5mMMgCl₂，25个循环，在每个循环中循环参数为：94℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟，1U TaqI聚合酶/50μl)，并且将其用DraI再切割。连接两个片段。将得到的质粒命名为pML11。将携带asd基因作为选择性标记的所有质粒在G6MD2细胞中增殖(Schwartz，M.，J.Biol. Chem.92，(1966)，1083-1089)，并且在没有二氨基庚二酸的培养基上选择。

将两个片段同时连接到BglII切割开的pMCS5载体中。片段1包含根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)nos终止子(Depicker等人，1982，Journal of Molecular and Applied Genetics 1，561-573)，并且使用引物P9(ACT TCT gCA gCg gCC gCg ATC gTT CAA ACA TTT ggC AATAAA gTT TC)(SEQ ID No.9)和P10(TCT AAg CTT ggC gCC gCT AgCAgA TCT gAT CTA gTA ACA TAg ATg ACA CC)(SEQ ID No.10)在pBinAR上扩增(1.5mM MgCl₂，25个循环，在每个循环中循环参数为：94℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，1U PwoI聚合酶/50μl)，并且用BgIII和PvuI再次切割。片段2通过用BglII和PvuI消化从质粒pBinAR得到。2674bp片段包含根瘤土壤杆菌nos启动子(Depicker等人，Journal ofMolecular and Applied Genetics 1，1982，561-573)和大肠杆菌nptII基因(Beck等人Gene 19，1982，327-336；Gen-Bank登录号V00618)的可读框。将两个片段同时克隆到BglII切割的pMCS5(MoBiTec)中，并且选择在每种情形中包含两个片段之一的质粒。将得到的质粒命名为pML7.

为了移除载体pMCS5(MoBiTec GmbH，Gttingen，德国)中的NotI切割位点，将载体用限制性内切酶BamHI和BglII切割并且将载体再次连接。将得到的质粒命名为pML4.将根瘤土壤杆菌nos终止子(见上文)克隆到所得到载体的限制性切割位点HindIII和PstI之间。为此目的，将对应的DNA片段使用引物P9(ACT TCT gCA gCg gCC gCg ATC gTT CAA ACA TTTggC AAT AAA gTT TC)和P10(TCT AAg CTT ggC gCC gCT AgC AgATCT gAT CTA gTA ACA TAg ATg ACA CC)在pBinAR(见上文)上扩增，并且用HindIII和PstI再切割。将得到的载体命名为pML54-nos。将包含玉米(Zea mays)泛素启动子(Gen-Bank登录94464，Christensen等人，PlantMol.Biol.18，1992，675)和同一基因的第一个内含子(该内含子已经通过ClaI消化截短并且再连接)的1986bp PstI片段克隆到pML54-nos的PstI切割位点中。在得到的载体中，将此片段的3’末端定向在nos终止子方向。将得到的质粒命名为pML8。

将来自载体pCy21的NotI片段克隆到pML8中，该片段包含洋蓟蔗糖-蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)(Hellwege等人，Plant Journal 12，1997，1057-1065；Genbank登录Y09662.1)的可读框。将得到的质粒命名为pML10。

将载体pML11用NarI切割并且用来自pML10的4048 bpNarI片段连接。将得到的质粒称作pML11-SST。将其用AvrII切割并且克隆来自pML7的2068bp片段，该片段是通过用XbaI和SpeI的限制性消化得到的。将得到的载体称作pML1。

用1-sst构建体(pML1)对甘蔗植物的转化。

通过Snyman等人(Snyman等人，1996，S.Afr.J.Bot 62，151-154)的方法进行愈伤组织的诱导和甘蔗的转化。将pML1构建体与载体pEmuKN共转化，所述载体pEmuKN在pEmu启动子(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81，581-588)的调控下表达nptII基因(Beck等人Gene 19，1982，327-336；Gen-Bank登录号V00618)。通过Snyman等人2001(ActaHorticulturae 560，(2001)，105-108)的方法再生植物。

实施例2：用来自洋蓟的1-sst基因转化的转基因甘蔗植物(PML1植物)

2.1材料和方法

如实施例1中所述，通过基因枪轰击用洋蓟sst基因转化品系NCo310的甘蔗植物。寡果聚糖合成品系2-1-5-3和野生型品系NCo310的转基因甘蔗植物在温室中生长。从大约12个月大的植物中收获茎。在移除叶子后，将茎的节间从顶(＝1)到底(例如＝36)编号。将重量为大约1-2g的茎盘从每个节间的中间切开。将3个节间的茎盘组合成一个样品并且冷冻。

在方法部分中更详细描述的方法用于提取蔗糖和果聚糖。

2.2结果

与NCo310对照植物相比，用洋蓟sst基因转化并且除了贮藏蔗糖外还贮藏寡果聚糖蔗果三糖和蔗果四糖的甘蔗植物栽培品种NCo310的茎中具有更高的贮藏碳水化合物含量和更高的总碳水化合物含量(见表1)。

样品		鲜重[g]	蔗糖+果聚糖[mg/g FW]	总碳水化合物[mg/g FW]
样品		鲜重[g]	蔗糖+果聚糖[mg/g FW]	总碳水化合物[mg/g FW]	NCo310		1008	105	109
2-1-5-3	1	1134	170	175	NCo310		1008	105	109
2-1-5-3	1	1134	170	175		2	945	116	124
	3	1069	170	175		2	945	116	124
	3	1069	170	175		4	920	173	180

表1：在甘蔗植物茎中总碳水化合物含量(葡萄糖+果糖+蔗糖+果聚糖)的确定；

NCo310＝野生型对照，2-1-5-3＝用洋蓟sst基因转化的NCo310甘蔗植物；编号“1”、“2”、“3”和“4”是指从转基因事件2-1-5-3的四个不同茎中得到的样品。

在转基因甘蔗植物茎中贮藏碳水化合物(蔗糖+果聚糖)含量

图1：野生型NCo310和转基因寡果聚糖合成品系2-1-5-3的甘蔗茎中贮藏碳水化合物(蔗糖和果聚糖)含量。三个相邻的节间材料组合成1个样品。将节间从顶(＝1)到底(＝36)编号。

在野生型植物NCo310的茎的最上面的节间中观察到，从节间1-3到节间10-12蔗糖含量升高。在其它节间(＞12)中蔗糖贮藏为最大值。在这些茎段中，蔗糖含量在鲜重的10-14％之间变化。果聚糖在甘蔗野生型植物中检测不到。

同样，在转基因植物2-1-5-3的茎中，贮藏碳水化合物(蔗糖和果聚糖)含量从节间1-3到节间7-9升高，并且其后达到饱和。令人惊讶地是，在转基因茎的更低段中，贮藏碳水化合物含量比对应的野生型植物中显著更高，即鲜重的15-26％。

因此，甘蔗中洋蓟sst基因的表达总体上使得甘蔗植物中贮藏碳水化合物显著增加。如果对比野生型植物(NCo310)的蔗糖含量与表达1-SST的转基因甘蔗植物(2-1-5-3)的蔗糖含量，得到下列结果：

样品		蔗糖含量[mg/g FW]	蔗糖[野生型的％]
样品		蔗糖含量[mg/g FW]	蔗糖[野生型的％]	NCo310		105	100
2-1-5-3	1	126	120	NCo310		105	100
2-1-5-3	1	126	120		2	86	82
	3	122	116		2	86	82
	3	122	116		4	123	113

表2：野生型NCo310和转基因寡果聚糖合成品系2-1-5-3的甘蔗茎中蔗糖含量；编号“1”、“2”、“3”和“4”是指从转基因事件2-1-5-3四个不同的茎中得到的样品。确定了单独节间段蔗糖含量的平均数。将野生型中的蔗糖含量设定为100％，并且将转基因品系中的蔗糖含量与野生型相比。

实施例3：表达来自洋蓟的1-sst基因和1-fft基因的转基因甘蔗植物(pML2植物)的产生

将在实施例1中描述的载体pML11用作克隆包含来自洋蓟的1-sst和1-fft的构建体的基本载体。

1.1-fft基因的表达盒

将来自包含洋蓟果聚糖-果聚糖1-果糖基转移酶(fft)(Hellwege等人，FEBS Lett.427，1998，25-28；登录号AJ000481.2)的可读框的pCy3的NotI片段克隆到载体pML8(见实施例1)中。将得到的质粒命名为pML9。

2.最终载体

将载体pML11用NheI切割并且与来自pML9的3877bp NheI片段连接。来自pML9的NheI片段是通过部分消化得到的并且包含1-fft的完整表达盒(泛素启动子、泛素内含子、fft的可读框和nos终止子)。在得到的载体中，1-fft盒与asd基因在同一方向中。将得到的质粒命名为pML11-FFT。将此质粒用NarI切割并且与来自pML10的4048bp NarI片段连接，载体中的1-sst盒与1-fft盒在同一方向中。将得到的质粒命名为pML11F+S。将其用AvrII切割并且克隆来自pML7的2068bp片段，该片段是通过用XbaI和SpeI的限制性消化得到的。插入的盒与1-sst和1-fft盒在同一方向中。将得到的载体命名为pML2并且用于产生表达来自洋蓟的1-SST和1-FFT基因的转基因甘蔗植物。与在实施例1中描述的方法类似，使用载体pEmuKN，进行甘蔗的转化和再生。

实施例4：用来自洋蓟的1-sst和1-fft基因转化的转基因甘蔗植物(pML2植物)

1.1材料

如在实施例3中描述产生并且表达来自洋蓟的1-SST和1-FFT基因的转基因甘蔗植物在温室中生长12个月。在每种情形中，将转基因品系1-2-3-3和野生型甘蔗植物的一个甘蔗茎脱叶，并且将茎分成3个节间的段，并且将这些节间段在密封的50ml塑料容器中于液氮中冷冻。确定样品的鲜重。如方法部分中描述提取，用于确定果聚糖和蔗糖。

1.2结果

如上述，将甘蔗茎分为三个节间的段。将节间从顶到底编号(顶＝节间1，底＝节间21)。

在甘蔗野生型植物中，甘蔗含量从节间1-3到节间10-12上升。所有之后节间的蔗糖含量均类似高(鲜重的13-15％)。甘蔗野生型植物中的平均蔗糖含量是121mg/g鲜重。

在包含来自洋蓟的sst和fft基因并且积累菊粉的转基因品系1-2-3-3中，在茎中的贮藏碳水化合物含量同样从节间4-6到节间10-12上升，并且在最底部节间(＞12)中在鲜重的17和19％之间变化。平均贮藏碳水化合物含量是166mg/g鲜重，其高于甘蔗野生型植物中的蔗糖含量。

总体上，令人惊讶地观察到，在转基因甘蔗品系1-2-3-3的节间中的贮藏碳水化合物(蔗糖+果聚糖)含量在所有分析的节间中高于野生型的贮藏碳水化合物含量。这一差异反应在完整植物的平均贮藏碳水化合物含量中(表2)和在每个节间的贮藏碳水化合物含量中(图2)。因此，在甘蔗中来自洋蓟的1-sst和1-fft基因的同时表达总体上使得遗传修饰的甘蔗植物比甘蔗野生型植物的碳水化合物含量增加。

	蔗糖+果聚糖[mg/g FW]
	蔗糖+果聚糖[mg/g FW]	野生型	121
1-2-3-3	166	野生型	121

表3：在野生型品系NCo310和转基因的积累果聚糖的品系1-2-3-3的甘蔗茎中的平均贮藏碳水化合物含量。

在转基因甘蔗植物/收获2003中的贮藏碳水化合物(蔗糖+果聚糖)含量

图2：在野生型品系NCo310和转基因果聚糖合成品系1-2-3-3的甘蔗茎中的贮藏碳水化合物(蔗糖和果聚糖)含量。三个相邻节间材料组合成一个样品。

如果对比野生型植物(NCo310)的蔗糖含量和1-2-3-3植物的蔗糖含量，得到下列结果：

样品	蔗糖含量[mg/g FW]	蔗糖[野生型的％]
样品	蔗糖含量[mg/g FW]	蔗糖[野生型的％]	野生型	121	100
1-2-3-3	41	34	野生型	121	100

表4：在野生型NCo310和转基因果聚糖合成品系1-2-3-3的蔗糖含量。确定了单个节间段的蔗糖含量的平均数，将野生型平均蔗糖含量设定为100％，并且将转基因品系中的蔗糖含量以与之相比来表示。

序列表

<110>拜尔作物科学股份公司(BAYER CROPSCIENCE AG)

<120>具有增加的贮藏碳水化合物含量的甘蔗植物

<130>BCS 04-5013-PCT

<160>10

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>637

<212>PRT

<213>洋蓟(Cynara scolymus)

<300>

<308>CAA70855

<309>1997-10-09

<313>(1)..(637)

<400>1

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His Leu Gln

1 5 10 15

Asn Pro Gln Gln Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala His Arg Leu Ser Arg

20 25 30

Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu Val Ser Val Leu Val Ile Cys Ala

35 40 45

Leu Val Ala Val Ile His Asn Gln Ser Gln Gln Pro Tyr His Asp Gly

50 55 60

Gly Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe Pro Thr Ala

65 70 75 80

Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lys Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lys Thr Asn

85 90 95

Ala Glu Val Glu Trp Gln Arg Ser Ala Tyr His Phe Gln Pro Asp Lys

100 105 110

Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Asp Gly Pro Met Tyr His Met Gly Trp Tyr

115 120 125

His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly Asn Ile

130 135 140

Thr Trp Gly His Ser Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe His Leu

145 150 155 160

Pro Phe Ala Met Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Met

165 170 175

Thr Gly Ser Ala Thr Val Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Leu Tyr

180 185 190

Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Cys Leu Ala Tyr Ala

195 200 205

Val Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr Glu Gly

210 215 220

Asn Pro Ile Leu Phe Pro Pro Pro Gly Val Gly Tyr Lys Asp Phe Arg

225 230 235 240

Asp Pro Ser Thr Leu Trp Leu Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg Met Val

245 250 255

Met Gly Ser Lys His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile Tyr His

260 265 270

Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu His Ala

275 280 285

Val Pro His Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser

290 295 300

Thr Thr His Thr Asn Gly Leu Asp Met Val Asp Asn Gly Pro Asn Val

305 310 315 320

Lys His Val Leu Lys Gln Ser Gly Asp Glu Asp Arg His Asp Trp Tyr

325 330 335

Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp

340 345 350

Pro Glu Asn Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly Lys Phe

355 360 365

Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln His Lys Lys Arg Arg Val Leu

370 375 380

Trp Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Val Tyr Lys

385 390 395 400

Gly Trp Ala Asn Ile Leu AsnIle Pro Arg Thr Ile Val Leu Asp Thr

405 410 415

Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Ile Ala Glu Val Glu Asn

420 425 430

Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Val Glu Leu Lys Pro

435 440 445

Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gln Leu Asp Ile

450 455 460

Thr Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Thr Met Leu Glu Ser Thr Leu Glu

465 470 475 480

Ala Asp Val Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala Gly Arg

485 490 495

Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Val Val Leu Ala Asp Ala Glu Arg

500 505 510

Ser Glu Gln Leu Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr Asp Gly

515 520 525

Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser Asn Asp

530 535 540

Val Asp Ile Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro Val Leu Glu

545 550 555 560

Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu

565 570 575

Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val Tyr Pro

580 585 590

Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn Asn Ala

595 600 605

Thr Gly Ile Ser Val Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Lys Met Lys Glu

610 615 620

Ala Gln Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser

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<211>617

<212>PRT

<213>洋蓟

<300>

<308>CAA04120

<309>2002-11-13

<313>(1)..(617)

<400>2

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Arg Leu Leu Ile Arg Val Ser Ser Ser Ile Thr Leu Val Ser Leu Phe

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Phe Val Ser Ala Phe Leu Leu Ile Leu Leu Tyr Gln His Asp Ser Thr

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<212>PRT

<213>洋葱(Allium cepa)

<300>

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<309>2004-09-09

<313>(1)..(612)

<400>3

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Pro Arg Arg Arg Ala Leu Arg Ser Leu Ser Ile Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Leu Leu Leu Gly Leu Val Leu Phe Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ser Gly

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165 170 175

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275 280 285

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305 310 315 320

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325 330 335

Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Phe Tyr Ala Ser Arg Thr

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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Val Arg Ile Leu Val Asp His Ser Val Ile Glu Ser Phe Ala Met Gly

545 550 555 560

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565 570 575

Ser Ala Ala Arg Val Phe Leu Phe Asn Asn Ala Thr Gly Val Asp Val

580 585 590

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610

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<212>PRT

<213>大麦(Hordeum vulgare)

<300>

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<309>2000-07-21

<313>(1)..(625)

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115 120 125

Ala Val Ser Arg Asn Leu Val Gln Trp Arg Thr Leu Pro Ile Ala Met

130 135 140

Val Ala Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Leu Gly Val Leu Ser Gly Ser Met

145 150 155 160

Thr Val Leu Pro Asn Gly Thr Val Ile Met Ile Tyr Thr Gly Ala Thr

165 170 175

Asn Ala Ser Ala Val Glu Val Gln Cys Ile Ala Thr Pro Ala Asp Pro

180 185 190

Asn Asp Pro Leu Leu Arg Arg Trp Thr Lys His Pro Ala Asn Pro Val

195 200 205

Ile Trp Ser Pro Pro Gly Val Gly Thr Lys Asp Phe Arg Asp Pro Met

210 215 220

Thr Ala Trp Tyr Asp Glu Ser Asp Glu Thr Trp Arg Thr Leu Leu Gly

225 230 235 240

Ser Lys Asp Asp His Asp Gly His His Asp Gly Ile Ala Met Met Tyr

245 250 255

Lys Thr Lys Asp Phe Leu Asn Tyr Glu Leu Ile Pro Gly Ile Leu His

260 265 270

Arg Val Val Arg Thr Gly Glu Trp Glu Cys Ile Asp Phe Tyr Pro Val

275 280 285

Gly Arg Arg Ser Ser Asp Asn Ser Ser Glu Met Leu His Val Leu Lys

290 295 300

Ala Ser Met Asp Asp Glu Arg His Asp Tyr Tyr Ser Leu Gly Thr Tyr

305 310 315 320

Asp Ser Ala Ala Asn Thr Trp Thr Pro Ile Asp Pro Glu Leu Asp Leu

325 330 335

Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Trp Gly Lys Phe Tyr Ala Ser Thr Ser

340 345 350

Phe Tyr Asp Pro Ala Lys Asn Arg Arg Val Leu Met Gly Tyr Val Gly

355 360 365

Glu Val Asp Ser Lys Arg Ala Asp Val Val Lys Gly Trp Ala Ser Ile

370 375 380

Gln Ser Val Pro Arg Thr Val Ala Leu Asp Glu Lys Thr Arg Thr Asn

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Leu Leu Leu Trp Pro Val Glu Glu Ile Glu Thr Leu Arg Leu Asn Ala

405 410 415

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420 425 430

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Cys Ser Ser Ser Gly Gly Ala Val Asn Arg Gly Ala Leu Gly Pro Phe

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Gly Leu Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Arg Arg Gly Glu Gln Thr Ala

485 490 495

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<212>DNA

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<211>27

<212>DNA

<213>PCR引物

<400>8

aaaatttaaa catctgcgct tactcct 27

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<212>DNA

<213>PCR引物

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<212>DNA

<213>PCR引物

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tctaagcttg gcgccgctag cagatctgat ctagtaacat agatgacacc 50

Claims

1.增加甘蔗植物的贮藏碳水化合物含量的方法，其包括

2.如权利要求1中所述的方法，其中外源核酸分子编码1-SST。

3.如权利要求2中所述的方法，其中将编码1-FFT的另外的外源核酸分子引入到甘蔗植物的基因组中。

4.如权利要求1中所述的方法，其中外源核酸分子编码1-SST和1-FFT。

5.如权利要求2中所述的方法，其中将编码6G-FFT的另外的外源核酸分子引入到甘蔗植物的基因组中。

6.如权利要求1中所述的方法，其中外源核酸分子编码1-SST和6G-FFT。

7.如权利要求1中所述的方法，其中外源核酸分子编码6-SFT。