CN101070346A - 一种制备双功能抗体的方法 - Google Patents

Abstract

一种制备双功能抗体的方法，其特征是：将小分子药物与病原或肿瘤特异性抗原进行化学偶联，制成小分子药物--特异蛋白的偶联物，免疫动物后，取该动物脾细胞，与相应的骨髓瘤细胞进行融合，制备单克隆抗体，再经过ELISA筛选出抗小分子药物的单克隆抗体，并从阳性杂交瘤中筛选出同时针对特异性载体蛋白的抗原也有良好反应的单克隆抗体。这种双功能单克隆抗体与小分子药物、特定病原的抗原都是通过非共价键的形式结合，且结合是可逆的，起到定向将小分子药物带到特定位置的作用，使病灶处药物浓度高于机体的其他部位。

Description

一种制备双功能抗体的方法

技术领域

本技术涉及双功能抗体的制备方法，特别涉及免疫学中可携带用于治疗小分子的药物，同时也具有定向功能的双功能单克隆抗体制备方法。

技术背景

免疫学中的抗体具有特异性，能特异性地识别目标抗原。随着杂交瘤技术的发展，人们很容易地就可以通过常规的免疫杂交瘤技术已经获得了大量的特异性的单克隆抗体，尤其是特异性的抗肿瘤的单克隆抗体的获得使单克隆抗体对肿瘤的诊断与医治起着非常重要的作用.然而由于单克隆抗体多数是鼠源抗体，因而必然存在异源性问题，也必然引起免疫的排斥反应.并且鼠源性抗体对激发人细胞免疫活力方面的作用也是有限的。

后来人们又发明了免疫毒素或放射免疫治疗技术，将毒蛋白或放射性同位与特异性的单克隆抗体通过共价偶联，制备出毒素与单克隆抗体的化学偶联物，由于单克隆抗体的导向作用，从而将毒蛋白或放射性同位带到靶细胞处，再利用毒蛋白毒性或放射性同位素射线将靶细胞杀死.这种免疫毒素或放射免疫技术，虽然对靶细胞有一定杀伤作用，但是同时毒蛋白质分子本身就是异源物质，是很好的免疫原，在免疫毒素发挥一段时间作用之后，机体产生抗毒蛋白的抗体，其治疗效果将大打折扣.再说放射免疫因同位素的污染性较强，对机体及环境都是有很大的危害，从而也限制了放射免疫技术的应用.

现实生活中许多化疗所涉及的化学药物虽然对癌症细胞具有极大的杀伤作用，但是由于化疗或放疗过程中药物的负作用很大，使得正常细胞在治疗期间也同时得到极大的伤害，这主要是由于正常组织细胞所能承受的药物浓度与肿瘤细胞治疗所用的浓度很接近，虽然杀死了肿瘤细胞，但同时也对正常细胞产生极大的杀伤，以至于许多放疗以及化疗患者都出现脱发、病体虚弱等现象。

于是人们想到了双功能抗体，希望抗体既具有特异性识别功能，同时也具有治疗功能.现在双功能抗体，多数集中在抗肿瘤特异性的抗体获得后，再通过诱导剂诱导杂交瘤，获得营养缺陷型的肿瘤细胞，再与抗第二种抗原的脾细胞进行细胞融合，并且第二种抗原通常是治疗中相关蛋白，这种双功能抗体研究与开发周期较长，并且双功能抗体自身也存在稳定性的问题，在实际中治疗效果存在不足.

人们急需要一种双功能抗体，用于治疗，并且研发周期长相对较短，稳定性好，治疗效果强，并且毒性与负作用小的双功能抗体.

虽然制备这种双功能抗体构思本人在数年前就已经形成，但苦于资金等条件所限而未能实施，并且为了筹款本人在其他方面也投入了许多精力。现将相关制备方法公开以便人们能从根本上解决医学上的难题，并且对其他疾病治疗带来启发.

发明内容

一种制备双功能抗体的方法，其内容是：将小分子药物作为半抗原与以特异性抗原作为载体蛋白进行化学偶联，其中治疗药物是小分子化合物，具有一定的化学结合为半抗原，而特异性抗原是大分子物质，直接用作载体蛋白；通过常规的化学偶联制备形成小分子药物与特异蛋白的偶联物，将其偶联物作为免疫原，免疫动物，然而取其脾细胞与相应的骨髓瘤细胞进行细胞融合，在HAT选择培养基的筛选下，只能融合细胞才能存活生长，再经过ELISA筛选出，抗药物小分子的单克隆抗体，所用筛选抗原为小分子药物与另一种蛋白载体的化学偶联物，这样可得到抗小分子药物的单克隆抗体，同时这种单克隆抗体对载体蛋白也呈阳性反应，再从这些阳性杂交瘤中筛选出针对特异性的载体抗原也具有良好的特异性的单克隆抗体。这样就得到抗药物小分子的特异性的单克隆抗体，而同时这个特异性的单克隆抗体对免疫原中的载体蛋白成分即特异性的病原抗原也具有良好的抗原抗体反应能力，即所获得具有双功能特点的单克隆抗体！

本发明建立在一些常规的免疫学理论或技术的基础上，同时本人依据相关的免疫技术进而提出“定向免疫治疗论点”，该论点的基本内容是：

1、小分子化学药物与以病原的特异性抗原作载体能通过化学偶联的方法形成的半抗原-载体蛋白复合物，该复合物依然具有良好的免疫原

2、所得到的半抗原-病原特异性抗原的复合物可以诱发机体，产生抗小分子药物、同时也抗病原特异性抗原的双功能抗体

3、所产生的双功能抗体，能与自由的半抗原小分子药物通过非共价键的方式进行结合，同时也能通过非共价键的方式与肿瘤特异性抗原进行抗原-抗体亲和结合

4、该类双功能抗体能与半抗原药物预先结合，并且半抗原结合后，依然能与特定病原中的特异性抗原结合，从而从药物分子带到病灶处，由于半抗原药物分子与抗体结合是非共价键，这种结合是可逆反应的，因而小分子药物可以从抗体中脱落

5、由于小分子药物可以从双功能抗体中脱落的，是一种动态的可逆反应，这种双功能抗体在一定程度上具有“药泵”作用，将有效的治疗药物，定向地带到病原的特异性抗原周围，使得病灶周围药物的浓度远远大于血清中药物的浓度，这样就可以减轻药物对机体的毒害作用。

6、小分子药物与双功能抗体结合后，再结合病灶处特定的抗原时不脱落小分子药物也会随着病灶细胞上的特定抗原在细胞膜上的移动而进入目标细胞内。

7、采用病原特异抗原作为载体与抑制病毒复制小分子药物偶联时，所得到的特定的双功能抗体制备可以将药物定向带到病毒感染细胞的周围，提高化学治疗药物对病毒复制的干扰效果。

8、采用病原特异性抗原作载体时，与具有细胞毒性小分子药物进行偶联，所得到的特定的双功能抗体，可以实现将细胞毒性的药物带到病毒感染细胞周围，使病毒感染细胞死亡，限制了病毒的扩散.但机体的这类细胞不能是实质器官组织的细胞，避免给机体实质器官带来伤害.

9、采用病原细菌特异性抗原作为载体时，可以将杀死细菌的药物，定向带来病细菌的周围从而提高了药物的杀菌效果。

10、以其他病原微生物或寄生虫的特异性的抗原作为载体，并结合相关药物也具有类同的定向药泵作用。

11、针对不同药物半抗原分别与同一种特异性抗原偶联，制备不同的双功能单克隆抗体，将不同种的双功能分别与不同药物预先结合，再混合输入患者的机体内，有助于治疗效果的提高。

12、本双功能抗体也可以结合外用，将以非共价键结合有治疗药物的双功能抗体在缓冲液中，并在接近体温的条件上，将药物传送到病原处，对病原微生物构成杀伤.

本发明所涉及免疫学理论的基础是：1、半抗原只有免疫反应性而没有免疫原，2、以特异性抗原作为载体蛋白，所得到的抗体一定与特异性抗原有免疫学反应，只要进一步筛选人们就能从中筛选出良好的双功能抗体杂交瘤。所涉的基本技术包括：小分子药物与特异性抗原化学偶联技术、杂交瘤技术、酶联免疫吸附技术等免疫学技术。

使用本发明所得到的双功能单克隆抗体，使用前预先最好与小分子药物即半抗原进行免疫亲和结合，然而将这种复合物通过输液的方式经血液循环，利用双功能抗体对特异性抗原能进行特异性的亲和反应的特点，将双功能抗体送达特定的位置，同时也将治疗所用的药物带到病灶处，从而使得病灶处的药物浓度很高，较低血液中药物的浓度，因而对病人的身体健康不会构成毒害作用。虽然小分子药物与该双功能单克隆抗体在体内也可以结合，但是药泵的效果会不如将小分子药物与双功能单克隆抗体预先结合。同时将小分子药与双功能单克隆抗体输入体内，药物也能定向送到病灶处，传送药物的效果可能会低许多。

本发明虽然存在异源性的问题，但是本发明中的双功能抗体的研制方法，却能为人类开创一系列的治疗性双功能的单克隆抗体的研发提供帮助，同时也为人类构造人源化的基因工程抗体提供基础，促进人源杂交瘤技术以及体外免疫技术成熟，从而彻底解决免疫排异。

具体施实例

实施例1

将治疗人胃癌的化学药物，5-氟-尿嘧啶核糖与人胃癌特异性的抗原进行化学偶联，此处化学偶联的方法可以采用过碘酸钠氧化法，将适量的5-氟-尿嘧啶核糖与适量的过碘酸钠进行糖基的氧化反应，然后再加入适量乙二醇反应掉过量的过碘酸钠，再加入适量的胃癌特异性的抗原在偏碱性条件进行化学偶联反应，过夜后加入适量的硼氢化钠，消除化学偶联反应中产生的烯醇式结构，再经透析并反复多次换液，即可获得半抗原-胃癌特异性抗原的复合物，以此物作为免疫原，免疫BAL b/c小鼠，免疫按常规免疫方法进行，然后取脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到融合细胞再经过ELISA筛选，即可以获得双功能杂交瘤单克隆抗体。该双功能单克隆抗体，既有结合小分子治疗药物5-氟尿嘧啶核糖或小分子5-氟尿嘧啶能力，同时也能特

异性地结合胃癌细胞中的肿瘤特异性抗原。

实施例2

利用柔红霉素与白血病特异性抗原进行化学偶联得到柔红霉素-白血病特异性抗原的复合物进行免疫、细胞融合、筛选出特定的双功能单克隆抗体，制备单克隆抗体的方法同常规杂交瘤融合技术。柔红霉素与白血病特异性蛋白的偶联方法如下：将适量的柔红霉素与适量的水合碳化二亚胺混合，再与适量的白血病特异性的抗原混合，利用柔红霉素中的氨基进行活化反应，与载体蛋白进行共价结合，获取柔红霉素-白血病的特异性抗原复合物。然后再按常规免疫学方法免疫、进行细胞融合，获得杂交瘤，并从中筛选出特定的双功能的单克隆抗体，由于这种抗体同时具有抗柔红霉素、抗白血病特异性的功能，在化疗时就可以将相关化学药物富集到病灶周围，这些药物之所以能富集到病灶周围，是由于双功能抗体所识别的另一个抗原就是肿瘤特异性的抗原，而这种特异性的抗原只有病灶处较多。病灶处存在许多肿瘤细胞，这些肿瘤细胞中都存在特异性的肿瘤抗原，而机体的正常组织是没有这种特异性的抗原，因而药物就会被定向富集到肿瘤细胞周围，而机体血液中的药物浓度就可以降低许多而不会影响药物的疗效，这样就可拉开了病灶组织与机体细胞所接触到的药物浓度，降减药物的负作用。或者在原有的治疗浓度下，通过定向送药的效应将更高浓度的药物定向送到病灶处，提高药物的治疗效果。

实施例3

阿霉菌素与肺癌特异性抗原通过碳化二亚胺进行化学偶联，制备成阿霉菌素与肺癌特异性蛋白化学偶联的免疫复合物，该免疫复合物免疫小鼠之后，经细胞融合即可得以杂交瘤细胞，在得到的杂交瘤细胞培养上清中通过ELISA检测进行筛选，将抗阿霉菌素的杂交瘤筛选出来，再进一步对所得到的杂交瘤进行特异性筛选与单克隆化处理，从而筛选出稳定的、抗阿霉菌素同时也抗肺癌特异性抗原的单抗杂交瘤，该杂交瘤经克隆处理将是双阿霉菌素，同时也会抗肺癌的双功能单克隆抗体。

实施例4

将抗生素与细菌特异性抗原化学偶联。利用化学偶联的方法将特定的治疗性的抗生素链霉素与细菌特异性的抗原进行化学偶联，获得半抗原-载体蛋白复合物免疫动物，制备特异性的双功能杂交瘤来分泌单克隆抗体，所得到的双功能抗体能与抗生素反应，同时也能与特定的病原细菌结合，具备双功能抗体。

使用这种双功能抗体时，抗体与抗生素结合后，再随着血液循环将药物带到病原菌处，使得特定的病菌周围的抗生素浓度远远高于环境，从而干扰了细菌的生长，提升药物的疗效。

将相关药物与载体蛋白进行化学偶联制备免疫原方法是成熟的，但人们主要考虑免疫学的检测低分子化合物含量，进而进行测定分析等。而特异性抗原在市场上早有供应的，但是人们也是采用它的特异性用于免疫学检测分析、免疫学诊断与特定蛋白在细胞结构中的定位研究，而将低分子的药物与特异性抗原结合起来考虑问题，制备直接双功能单克隆抗体的并未见到。

现实中应用的治疗性的药物很多，所涉及到特异性抗原的研究与开发也很多，人们可采用一种小分子药与多种特异性抗原物质进行化学偶联，这样就做到一种疾病采用同种小分子药物进行化学治疗反应，但是特异性的蛋白载体，人们可以一种特异性的载体蛋白质与多种小分子药物进行偶联，实行小分子药物的多元化，做到以多种药物合用抗击一种疾病，此处不再一一列举。

Claims (5)

1、一种制备双功能抗体的方法，其特征是：将小分子药物与特异性抗原进行化学偶联，其中治疗药物是小分子化合物，为半抗原，而特异性抗原是大分子物质蛋白，直接用作载体蛋白；通过常规的化学偶联的方法制备小分子药物与特异蛋白的偶联物，将该偶联物作为免疫原，免疫动物，然而取免疫动物脾细胞与相应的骨髓瘤细胞进行细胞融合，在HAT选择培养基的筛选下，只能融合细胞才能存活生长，再经过ELISA筛选出，抗药物小分子的单克隆抗体，所用筛选抗原为小分子药物与另一种蛋白载体的化学偶联物，这样可得到抗小分子药物的单克隆抗体，同时这种单克隆抗体对载体蛋白也呈阳性反应，再从这些阳性杂交瘤中筛选出针对特异性的载体抗原也具有良好的特异性的单克隆抗体。这样就得到抗药物小分子的特异性的单克隆抗体，而同时这个特异性的单克隆抗体对免疫原中的载体蛋白成分即特异性的病原抗原也具有良好的抗原抗体反应能力，即所获得具有双功能特点的单克隆抗体！

2、依据权利要求1所述，用于与半抗原化学偶联的载体蛋白是特异性抗原，它们可以是肿瘤特异性抗原、细菌真菌的特异性蛋白抗原、病毒特异性蛋白抗原、寄生虫的特异性蛋白抗原。

3、依据权利要求1所述，双功能单克隆抗体所针对的药物小分子，是小分子药物或小分子有毒物质，并且小分子物质是具有一定化学结构的半抗原化合物，能与蛋白载体通过化学手段在不破坏小分子化合物的主要结构的前提下实现共价偶联。

4、依据权利要求1所述，双功能单克隆抗体与小分子药物以及特异性抗原结合都是非共价键的形式结合，在病灶处可以发生可逆性结合与脱落现象，小分子药物被这种方式运送到病灶处。

5、依据权利要求1所述，双功能抗体能特异性地识别病灶处特异性抗原蛋白质，而其他部分没有这种特异性的抗原成分，因而这种双功能抗体保持定向作用，将药物定向送到病灶处.