CN101061140B

CN101061140B - 单价结合cd40l的组合物和应用方法

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Publication number: CN101061140B
Application number: CN200580039317.5A
Authority: CN
Inventors: 史蒂芬·格兰特; 刘海群; 凯文·莫尔德
Original assignee: Domantis Ltd
Current assignee: Domantis Ltd
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2025-09-16
Also published as: CN101061140A; ZA200702427B; UA94213C2

Abstract

本发明涉及单价结合CD40L的抗体多肽。单价结合CD40L的抗体多肽可以抑制CD40L活性，同时避免使用能够二价或多价结合CD40L的抗体时可能发生的潜在的不理想的作用。一方面，单价抗-CD40L抗体多肽由单一免疫球蛋白可变结构域组成或者包括其，其特异性的结合并且拮抗CD40L的活性，优选地基本上不激动CD40和/或CD40L活性。另一方面，所述单价抗-CD40L抗体多肽是人抗体多肽。本发明还包括在个体中拮抗CD40/CD40L相互作用的方法和治疗包括CD40/CD40L相互作用的疾病或紊乱的方法，所述方法包括给所述个体施用单价抗-CD40L抗体多肽。

Description

单价结合CD40L的组合物和应用方法

发明背景

CD40是一种50kD的细胞表面糖蛋白分子，其在成熟和未成熟的B细胞、巨噬细胞、卵泡树突细胞、胸腺上皮细胞、正常的基底上皮细胞和一些肿瘤源性的细胞系的表面上表达。CD40分子是TNF受体家族的一员，并且具有重要的信号传导功能，其在许多细胞类型中引起各种下游作用。早期研究表明，在B细胞表面的CD40与抗体的交联导致B细胞的增殖和活化。在IL-4存在下与CD40交联的抗体诱导体外增殖和种类转换，通过LFA-1的B细胞聚集(Gordon等.，1988，J.Immunol.140：1425)，和许多细胞内物质的丝氨酸/苏氨酸以及酪氨酸磷酸化(Gordon等.，1988，同前所述；Uckun等.，1991，J.Biol.Chem.266：17478)。抗-CD40单克隆抗体还引发B细胞应答诸如PMA(Gordon等.，1987，Eur.J.Immunol.17：1535)和抗-CD20抗体(Clark&Ledbetter，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：4494)的试剂而增殖。

CD40的受体同源性和表明CD40在B细胞活化中的重要作用的抗体交联性研究促进了对天然配体的寻找。发现Jurkat T细胞系的突变体组成性地激活人B细胞分泌免疫球蛋白(Yellin等.，1991，J.Immunol.147：3389-3395)。产生了一种叫作5c8的单克隆抗体，其特异性地与所述突变体系反应，但是不与亲本Jurkat细胞系反应。5c8抗体免疫沉淀一种30kD(更准确地，29.3kD，261个氨基酸)细胞表面多肽，并且发现其特异性地抑制突变细胞系的B细胞辅助功能。(Lederman等.，1992，J.Exp.Med.，175：1091-1101；Lederman等.，1992，J.Immunol.149：3817-3826；Lederman等.，1993，Curr.Opin.Immunol.5：439.444；)。5c8抗体的30kD多肽配体叫作T-BAM，T-B-细胞活化分子。第二系的研究应用分子克隆技术鉴定特异性结合CD40分子的多肽。在CD40结合检测中鉴定了CD40特异配体的cDNA克隆，并且备选地叫作CD40配体(CD40L)、gp39、CD154或TRAP(Graf等.，1992，Eur.J.Immunol.22：3191-3194；Armitage等.，1992，Nature357：80-82；和Aruffo等.，1993，Cell 72：291-300)。后来，发现CD40L克隆具有同T-BAM相同的结构(Covey等.，1994，Mol.Immunol.31：471-484)。在核酸和氨基酸水平上，人CD40L蛋白分别表现出与从小鼠EL4胸腺瘤细胞分离的相似蛋白有82.8％和77.4％的相同性。这些蛋白都是在休眠B细胞上表达的CD40细胞表面抗原的配体。CD40L还被描述为IMD3，一种参与超-IgM免疫缺陷综合征的蛋白。

编码CD40L的人类基因定位在染色体Xq26.3-q27上。所述基因含有5个外显子。已经发现，集中在CD40L细胞外结构域有限区域的缺失、点突变和移码突变是一种罕见的X-连锁的免疫缺陷综合征(超-IgM免疫缺陷综合征，HIGMl)的基础，所述免疫缺陷综合征的特征在于周期性发生的细菌感染，非常低或不存在的IgG、IgA和IgE，和正常到增加的IgM和IgD血清水平。发现有因果关系的突变由成簇的缺失组成，所述缺失由具有外显子跳跃的剪接-供体突变、具有使用隐藏的剪接位点的剪接-受体突变、和产生新的剪接位点的缺失/插入事件而引起。

CD40L在活化的而不是休眠的CD4+T细胞上表达，并且发现其在体液免疫应答中起着特别重要的作用，其与B细胞增殖、抗体和细胞因子产生、和细胞生存能力有关。在体内，CD40L的缺失或突变在小鼠和在人体中引起严重的免疫缺陷，其特征在于细胞介导的免疫性中的血内丙种球蛋白过少和T细胞不足(Chess，C.，2001，在Therapeutic Immunology，第二畈，Austen，K.F.，Burakoff，S.，Rosen，F.和Strom，T.，eds.，BlackwellSciences，第441-456页)。感染了HIV1的人CD4+T细胞，不表达CD40L，所述HIV1引起严重的细胞免疫性功能紊乱，但是自相矛盾地导致B细胞的强烈的多克隆活化。已表明，通过活化的T细胞进行CD40L的基因和细胞表面表达在患有通常可变的免疫缺陷症(common variableimmunodeficiency，CVI)的患者亚群中受到了抑制。因此，通过CD40的低效率信号传导可以负责，至少部分地负责这些患者中B细胞分化的失败。

例如，CD40L结合CD40的功能性结果包括，a)从由Fas或IgM交联诱导的细胞程序性死亡挽救B细胞，b)诱导共-刺激因子分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)，其在活化的T细胞表面与CD28和CD152(CTLA-4)相互作用；c)增加其它细胞表面活化分子的表达，包括CD23、CD54、CD95和淋巴毒素-a；和d)诱导免疫球蛋白种类转换(参见，Chess，如前所述，和本文所引用的参考文献25，44和47-60)。与CD40结合的CD40L还增加了树突细胞的抗原递呈功能，诱导维持高水平的II类MHC抗原和附属分子包括CD58(LFA-3)的增量调控。在外周血单核细胞中，CD40L诱导细胞因子的产生和杀肿瘤活性。CD40L还共刺激活化的T细胞的增殖，并且所述共刺激伴随着IFN-γ、TNF-α和IL2的产生。CD40L在小鼠T辅助细胞和CD4+T细胞上的表达受到IFN-γ的抑制，并且在2型T辅助细胞上受到TGF-β的抑制。

CD40L通过培养的Hodgkin和Reed-Sternberg细胞而增量调控CD54的表达。增加的CD54表面表达伴随着表面结合的CD54的增加的脱落(shedding)。

还表明CD40L在诱导耐受性中是重要的——受到CD40L增量调控的CD80和CD86与CD28相互作用以提供T细胞的基本的共刺激，其与T细胞受体的活化相呼应，这导致T细胞的完全活化。在不存在CD28的CD80和CD86-引发的活化时，无反应力或耐受性作为抗原引发的结果而发生(Linsley&Ledbetter，1993，Ann.Rev.Immunol.11：191-212；Jenkins等.，1993，Curr Opin.Immunol.5：361-367；和Boussiotis等.，1996，Immunol.Rev.153：5-26)。

CD40L/CD40途径已经参与CD4+T细胞对CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTSs)的体内致敏(priming)。注意到，在活化的CD4+T细胞表面上表达的CD40L与在树突细胞上表达的CD40相互作用，诱导树突细胞表达更多的MHC，并且通过CD40的信号可以取代在引发CD8+CTL应答中对于CD4+T辅助细胞的需要。CD40L的阻断抑制CTL引发，这强调了CD40L/CD40相互作用在由辅助T细胞引发CTL中的重要作用(Ridge等.，1998，Nature 393：474-478；Schoenberger等.，1998，Nature 393：480-483；Bennett等.，1998，Nature 393：478-480)。

CD40L还调控CD4+T细胞与表达CD40的其它细胞诸如成纤维细胞、滑液细胞和内皮细胞之间的功能性相互作用(Yellin等.，1995，J.Leuko.Biol.58：209-216；Yellin等.，1995，J.Exp.Med.182：1857-1864)。CD40L通过成纤维细胞诱导CD54(ICAM-1)和CD106(VCAM-1)的表达，以及增加成纤维细胞IL-6、胶原酶和胶原蛋白的产生，并且诱导成纤维细胞增殖。因此，CD40L/CD40相互作用可能参与诱导与自体免疫性和免疫应答相关的纤维化。

CD40L与CD40的相互作用诱导内皮细胞表达CD62E(E-选择蛋白)、ICAM-1和VCAM-1。这些黏着分子的增量调控可以参与炎性细胞与血管内皮的结合，以及随后将炎性分子迁移到炎症位点。CD40L阻断妨碍了淋巴细胞通过内皮细胞屏障的迁移。在自体免疫的动物模型中，针对CD40L的抗体妨碍炎性细胞在炎症位点的累积。

CD40/CD40L相互作用已经包含在具有免疫或自体免疫联系的疾病中。例如，已证明CD40L/CD40途径在病理学中起作用的免疫相关疾病的动物模型包括下列各项的小鼠模型：系统性红斑狼疮(狼疮或SLE；参见，例如，Kalled等.，1998，J.Immunol.160：2158-2165)，关节炎(胶原蛋白-诱导的关节炎，参见，例如，Durie等.，1993，Science 261：1328-1330)，多发性硬化病(实验性自体免疫脑脊髓炎，EAE；参见，例如，Howard等.，1999，J.Clin.Invest.103：281-290)，自体免疫甲状腺炎(实验性自体免疫甲状腺炎，EAT；参见，例如，Caryanniotis等.，1997，Immunology 90：421-426)，结肠炎(半抗原-诱导的结肠炎；参见，例如，Stuber等.，1996，J.Exp.Med.183：693-698)，动脉硬化症和冠心病(参见，例如，Mach等.，1998，Nature 394：200-203)，和同种异体移植排斥(参见，例如，Parker等.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9560-9564；Kirk等.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：8789-8794；Larsen等.，1996，Nature 381：434-438和Blazar等.，1997，J.Immunol.158：29-39)。

用于治疗人类免疫相关疾病的CD40L抗体试验包括在患有狼疮的患者中的研究(参见，例如，Huang等.，2002，Arthritis Rheum.46：1554-1562)。I期试验证明，抗-CD40L人源化的单克隆抗体(IDEC-131)是安全的，并且得到患有狼疮的患者的很好地耐受(Davis等.，2001，J.Rheumatol.28：95-101)。关于IDEC-131抗体的II期研究表现出在临床症状上的改善，但是没有证明相对于安慰剂对照的药物功效(Kalunian等.，2002，ArthritisRheum.46：3251-3258)。在关于BG9588抗-CD40L抗体的II期研究中，证明了临床功效，但是由于血栓栓塞事件的发生而终止了所述研究(Boumpas等.，2003，Arthritis Rheum.48：719-727)。

美国专利号5,474,771(Lederman等.)和5,876,950(Siadak等.)公开了对于人gp39不同表位特异性的鼠单克隆抗体。WO95/06666(Noelle&Foy)公开了鼠抗-gp39抗体。

美国专利号6,328,964(Noelle和Claassen)公开了使用gp39-特异性抗体治疗多发性硬化病的方法。

美国专利号5,747,037(Noelle等.)，和EP0721469B1(Ledbetter等.)以及其副本美国5,869,049公开了对于gp39特异的抗-人单克隆(小鼠)抗体。美国专利号5,876,718(Noelle等.)公开了诱导对移植组织的T细胞不应答性的方法和用抗-gp39单克隆(小鼠)抗体治疗移植-对-宿主疾病的方法。EP0742721B1(Noelle等.)公开了抑制针对胸腺-依赖性抗原的体液免疫应答的方法，其使用抗-gp39单克隆(小鼠)抗体。美国专利号6,375,950描述了通过使用抗-gp39单克隆(小鼠)抗体在移植受体中诱导针对供体组织或器官的T细胞不应答性的方法。

EP1005372B1(De Boer等.)描述了使用抗-CD40L单克隆(小鼠)抗体-毒素融合蛋白而选择性地杀死自主反应性CD40L+T细胞的方法。

美国专利号6,340,459(Yellin等.)描述了鼠抗gp39单克隆抗体5c8用于治疗或预防重灌注损伤(reperfusion injury)的应用。

EP0831906B1(Claassen等.)描述了使用抗-gp39单克隆(小鼠)抗体而治疗自体免疫疾病诸如多发性硬化病中的T细胞介导的组织破坏的方法。现有技术中治疗途径中所用的抗体是鼠源二价抗体。

在蛋白酶消化后，已经鉴定了天然存在的抗体的许多更小的抗原结合片段。这些包括，例如，“Fab片段”(V_L-C_L-C_H1-V_H)，“Fab’片段”(具有重链铰链区的Fab)和“F(ab’)₂片段”(通过重链铰链区结合的Fab’片段二聚体)。已经应用重组方法产生甚至更小的抗原-结合片段，叫作“单链Fv”(可变片段)或“scFv”，其由通过合成的肽接头结合的V_L和V_H组成。

尽管通常已知天然存在抗体(例如，在人和大多数其它哺乳动物中)的抗原结合单位由一对V区域(V_L/V_H)组成，但是camelid物种表达大部分的全功能性、高度特异性的抗体，所述抗体完全没有轻链序列。发现camelid重链抗体作为单一重链的同型二聚体，通过它们的恒定区而二聚体化。这些camelid重链抗体的可变结构域叫作V_HH结构域，并且当作为V_H链片段分离时，保留高特异性结合抗原的能力(Hamers-Casterman等.，1993，Nature 363：446-448；Gahroudi等.，1997，FEBS Lett.414：521-526)。例如，还从鼠V_H基因文库中鉴定了抗原结合的单一V_H结构域，所述文库从来自免疫小鼠的脾的基因组DNA扩增并且在大肠杆菌(E.coli)中表达(Ward等.，1989，Nature 341：544-546)。Ward等将分离的单一V_H结构域命名为“dAbs”，为“结构域抗体”。本文中术语“dAb”是指特异性结合抗原的抗体单一可变结构域(V_H或V_L)多肽。“dAb”独立地结合其它V结构域的抗原；然而，当所述术语用于本文时，“dAb”可以与其它V_H或V_L结构域以同型-或异型多聚体存在，其中对于通过dAb的抗原结合不需要其它结构域，即，dAb独立地结合其它V_H或V_L结构域的抗原。

抗体单一的可变结构域，例如，V_HH，是已知的最小的抗原-结合抗体单位。对于在治疗中的应用，优选人抗体，主要是因为当施用给患者时，它们不那样可能激发免疫应答。如上文所述，分离的非-camelidV_H结构域倾向于相对不溶，并且通常是极少表达的。camelidV_HH与人抗体的V_H结构域的比较，揭示出与人V_H结构域V_H/V_L界面相对应的camelidV_HH结构域的构架区域中的一些主要的不同。已经操作了更加近似于V_HH序列的人V_H3的这些残基的突变(特别地，Gly 44→Glu，Leu 45→Arg和Trp47→Gly)，以产生“骆驼化的(camelized)”人V_H结构域，其保持抗原结合活性(Davies和Riechmann，1994，FEBS Lett.339：285-290)，还具有提高的表达和溶解性。(本文所用的可变结构域氨基酸编号与Kabat编号习惯一致(Kabat等.，1991，Sequences of Immunological Interest，第5版.U.S.Dept.Health&Human Services，Washington，D.C.))WO 03/035694(Muyldermans)报道了Trp 103→Arg突变提高了非camelidV_H结构域的溶解性。Davies和Riechmann(1995，Biotechnology N.Y.13：475-479)还报道了骆驼化的人V_H结构域噬菌体展示的所有组成成分的生产，和以100-400nM范围的亲和力结合半抗原的克隆的选择，但是对于结合蛋白抗原所选的克隆具有更弱的亲和力。

尽管许多抗体和它们的衍生物有效用于诊断和治疗，但是，对于具体的应用，通常不能获得理想的抗体药物代谢动力学。为了在抗体分子药物代谢动力学中提供改善，本发明提供单一结构域可变区多肽，其与提供增加的稳定性和半衰期的聚合物连接。聚合物分子(例如，聚乙二醇；PEG)与蛋白的附着得到很好地建立，并且已经表现出调节修饰的蛋白的药物代谢动力学特征。例如，已经表明，蛋白的PEG修饰改变蛋白的体内循环半衰期、抗原性、溶解性和对蛋白水解的抗性(Abuchowski等.，J.Biol.Chem.1977，252：3578；Nucci等.，Adv.Drug Delivery Reviews 1991，6：133；Francis等.，Pharmaceutical Biotechnology第3卷(Borchardt，R.T.ed.)；和Stability of Protein Pharmaceuticals：in vivo Pathways of Degradation andStrategies for Protein Stabilization 1991第235-263页，Plenum，NY)。

蛋白分子的位点-特异性和随机的PEG化在本领域内都是已知的(参见，例如，Zalipsky和Lee，Poly(ethylene glycol)Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications 1992，第347-370页，Plenum，NY；Goodson和Katre，1990，Bio/Technology，8：343；Hershfield等.，1991，PNAS 88：7185)。更具体地，已经在赖氨酸残基和硫醇化衍生物上描述了抗体分子的随机PEG化(Ling和Mattiasson，1983，Immunol.Methods 59：327；Wilkinson等.，1987，Immunol.Letters，15：17；Kitamura等.，1991，Cancer Res.51：4310；Delgado等.，1996 Br.J.Cancer，73：175；Pedley等.，1994，Br.J.Cancer，70：1126)。

发明概述

本发明涉及单价结合CD40L的抗体多肽。由于CD40L在抗体产生中明显的重要性，CD40/CD40L相互作用和途径是研发治疗包括不适当的或过量的抗体应答的疾病和紊乱诸如自体免疫疾病的治疗方法的重要靶点。单价结合CD40L的抗体多肽可以抑制CD40L活性，包括CD40在B细胞表面的结合和活化以及下游作用，同时避免使用能以二价或多价结合CD40L的抗体可能发生的潜在的不理想作用。单价抗-CD40L抗体多肽还可以用于其中还应用标准的二价抗体的许多应用中的任何一种，例如，体内成像和诊断。

一方面，所述抗体多肽由单一的免疫球蛋白可变结构域组成或者包括该可变结构域，所述可变结构域特异性地结合并且拮抗CD40L的活性，优选地基本上不激动CD40和/或Cd40L的活性。另一方面，由于当施用给人类受试者用于疾病治疗或预防时，人抗体将避免产生针对所述抗体的免疫应答，所以，所述抗体多肽是单价结合CD40L的人抗体多肽，优选地基本上不激动CD40和/或Cd40L的活性。

那么，概括说来，在一个实施方案中，本发明提供抗体多肽，优选地人抗体多肽，其单价结合CD40L(gp39)。

在一个实施方案中，当通过表面胞质基因共振测量时，人抗体多肽以50nM-20pM范围(包括端点)的K_d从人CD40L上解离。例如，人Cd40L的K_d可以是25nM-20pM，10nM-20pM，5nm-20pM，1nM-20pM，0.5nM-20pM，0.1nM-20pM，0.1nM-50nM，75pM-20pM，或者甚至是50pM-20pM。

除非另外说明，本文所述的所有范围都包括具体的端点。

在另一实施方案中，所述抗体多肽抑制CD40L与CD40的结合。

在另一实施方案中，抗体多肽与CD40L的结合基本上不激动CD40和/或CD40L活性。

在另一实施方案中，所述人抗体多肽抑制CD40与CD40L的结合，并且基本上不激动由CD40引起的信号传导。

在另一实施方案中，抗体多肽与CD40L的结合基本上不在Jurkat T细胞中诱导JNK磷酸化。

在另一实施方案中，抗体多肽与CD40L的结合基本上不诱导用抗-CD3抗体共刺激的Jurkat T细胞分泌IFN-γ。

在另一实施方案中，所述抗体多肽在标准血小板聚集检测中的存在没有导致比在没有加入抗体而进行的阴性对照检测中观察到的聚集多25％的聚集。

在另一实施方案中，所述人抗体多肽包括结合CD40L的单一免疫球蛋白可变结构域。在一个优选的上述方案中，所述单一免疫球蛋白可变结构域是V_H或V_L结构域。

在另一实施方案中，所述抗体多肽选自由dAb、Fab、scFv、Fv、或二硫键连接的Fv组成的组。

在另一实施方案中，人抗体多肽是PEG-连接的。在一个实施方案中，PEG与人抗体多肽共价结合。在一个优选的实施方案中，所述PEG-连接的人抗体多肽具有至少24kD的流体动力学大小。在另一个优选的实施方案中，PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基处连接到抗体多肽上。在另一个优选的实施方案中，全部PEG的大小从20-60kD，包括端点值。在另一个优选的实施方案中，所述PEG-连接的人抗体多肽具有至少200kD的流体动力学大小。

在一个实施方案中，相对于缺少聚乙二醇的相同的抗体多肽组合物，所述抗体多肽具有增加的体内半衰期。

在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tα-半衰期增加了10％或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tα-半衰期增加了50％或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tα-半衰期增加了2×或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tα-半衰期增加了5×或更多，例如，10×，15×，20×，25×，30×，40×或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tα-半衰期增加了50×或更多。

在另一个实施方案中，所述PEG-连接的抗体多肽具有0.25-6小时的tα半衰期，包括端点值。在另一个实施方案中，tα半衰期在30分钟-12小时的范围内，包括端点值。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tα-半衰期在1-6小时范围内。

在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tβ-半衰期增加10％或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tβ-半衰期增加50％或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tβ-半衰期增加2×或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tβ-半衰期增加了5×或更多，例如，10×，15×，20×，25×，30×，40×或更多。在另一个实施方案中，抗体多肽组合物的tβ-半衰期增加了50×或更多。

在另一个实施方案中，所述抗体多肽组合物具有1-170小时的tβ半衰期，包括端点值。在另一个实施方案中，tβ半衰期在12-48小时的范围内，包括端点值。在另一个实施方案中，tβ-半衰期在12-26小时范围内，包括端点值。

另外，或者作为上述标准的备选方案，本发明提供含有dAb的组合物，其包括按照本发明具有1mg.min/ml或更大范围内的AUC值(曲线下区域)的配体。在一个实施方案中，所述范围的下限是5，10，15，20，30，100，200或300mg.min/ml。另外，或者备选地，按照本发明的配体或组合物具有达到600mg.min/ml范围内的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上限是500，400，300，200，150，100，75或50mg.min/ml。有利地，按照本发明的配体应该具有选自由下列各项组成的组的范围内的AUC：15-150mg.min/ml，15-100mg.min/ml，15-75mg.min/ml和15-50mg.min/ml。

在另一实施方案中，本文所述的抗体多肽可以连接到人血清白蛋白(HSA)上，其还具有增加所述分子的体内半衰期的作用。使用衍生于可从GenBank登记号NM000477获得的cDNA序列的引物，可以通过PCR获得人血清白蛋白编码序列。这样的编码序列可以融合到本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽的编码序列上，并且所述融合体可以由本领域的技术人员进行表达。

在另一个实施方案中，HSA-连接的人抗体多肽组合物的tα-半衰期增加10％或更多。

在另一个实施方案中，HSA-连接的人抗体多肽组合物的tα-半衰期在0.25小时-6小时范围内。

在另一个实施方案中，HSA-连接的人抗体多肽组合物的tβ-半衰期增加10％或更多。

在另一个实施方案中，HSA-连接的人抗体多肽组合物的tβ-半衰期在12-48小时范围内。

在另一个实施方案中，所述人抗体多肽包括选自由SEQ ID NOs 7-82和246-360组成的组的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述人抗体多肽抑制CD40L与CD40的结合，IC₅₀在20pM-1.5μM范围内，包括端点值；在本文所述的任何实施方案中对于抑制CD40L与CD40结合的IC₅₀优选地按照本文实施例6中所述进行测定。IC₅₀可以优选地在20pM-1μM，20pM-900nM，20pM-800nM，20pM-700nM，20pM-600nM，20pM-500nM，20pM-400nM，20pM-300nM，20pM-200nM，20pM-100nM，或20pM-50nM范围内。其它可接受的或者优选的范围包括，例如，50pM-1μM，100pM-500nM，125pM-250nM，150pM-200nM，150pM-100nM和200pM-50nM。

在另一个实施方案中，将所述抗体多肽融合到与除CD40L外的配体结合的第二抗体多肽上。在一个优选的实施方案中，所述与除CD40L外的配体结合的抗体多肽结合选自由下列各项组成的组的配体：HSA，TNFα，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12，IL-18，IFN-γ，CD2，CD4，CD8，CTLA4，LFA1，LFA3，VLA4，CD80(B7-1)，CD28，CD86(B7-2)和CTLA-4。

在另一个实施方案中，所述人抗体多肽没有Fc结构域。Fc结构域的限制性在Kabat等.(1991，Sequences ofImmunological Interest，第5版.U.S.Dept.Health&Human Services，Washington，D.C.；通过参考结合于本文中)中列出。在备选方案中，Fc结构域由CH2-CH3区域组成，任选地包括与CH2连接的铰链区。在一个优选的实施方案中，在标准血小板聚集检测中，所述人抗体多肽不调控血小板聚集。

本发明还包括这样的人抗体多肽，其具有与选自由SEQ ID NOs 7-82和246-360组成的组的序列至少85％同一性的氨基酸序列，所述抗体多肽特异性地并且单价地结合CD40L。

本发明还包括一种抗原-结合多肽，所述多肽包括特异性并且单价地结合CD40L的单一免疫球蛋白可变结构域。换种方法阐述，本发明还包括包含特异性结合CD40L的部分多肽，所述部分由单一免疫球蛋白可变结构域组成。

在一个实施方案中，所述多肽由人单一免疫球蛋白可变结构域组成。

在另一个实施方案中，当通过表面胞质基因共振确定时，所述多肽具有对于人CD40L在50nM-20pM范围内的Kd，包括端点值。例如，对于人CD40L的Kd可以在25nM-20pM，10nM-20pM，5nm-20pM，1nM-20pM，0.5nM-20pM，0.1nM-20pM，75pM-20pM或者甚至50pM-20pM。

在另一个实施方案中，所述多肽抑制CD40L与CD40的结合。

在另一个实施方案中，所述多肽抑制CD40与CD40L的结合，并且具有20pM-1.5μM范围内的IC₅₀，包括端点值。例如，IC₅₀可以在20pM-1μM，20pM-900nM，20pM-800nM，20pM-700nM，20pM-600nM，20pM-500nM，20pM-400nM，20pM-300nM，20pM-200nM，20pM-100nM，或者20pM-50nM。其它可接受的或优选范围包括，例如，50pM-1μM，100pM-500nM，125pM-250nM，150pM-200nM，150pM-100nM和200pM-50nM。

在另一个实施方案中，多肽与CD40L的结合基本上不激动CD40和/或CD40L活性。

在另一个实施方案中，多肽与CD40L的结合基本上不在Jurkat T细胞中诱导JNK磷酸化。

在另一个实施方案中，多肽与CD40L的结合基本上不诱导用抗-CD3抗体共-刺激的Jurkat T细胞分泌IFN-γ。

在另一个实施方案中，所述抗体多肽在标准血小板聚集检测中的存在没有导致比缺少抗体多肽的阴性对照检测中观察到的聚集多25％的聚集。

在另一个实施方案中，所述单一免疫球蛋白可变结构域是人单一免疫球蛋白可变结构域。

在另一个实施方案中，所述单一免疫球蛋白可变结构域是V_H或V_L结构域。

在一个实施方案中，所述多肽是PEG-连接的。在一个实施方案中，PEG是共价连接的。在一个优选的实施方案中，所述PEG-连接的抗原-结合多肽具有至少24kD的流体动力学大小。在另一个优选的实施方案中，PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基处连接到抗原-结合多肽上。在另一个优选的实施方案中，全部PEG的大小从20-60kD，包括端点值。在另一个优选的实施方案中，所述PEG-连接的抗原-结合多肽具有至少200kD的流体动力学大小。

在另一个实施方案中，相对于缺少连接的聚乙二醇的相同的多肽组合物，所述PEG-连接的多肽具有增加的体内半衰期。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期增加了10％或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期增加了50％或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期增加了2×或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期增加了5×或更多，例如，10×，15×，20×，25×，30×，40×或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期增加了50×或更多。

在另一个实施方案中，所述PEG-连接的抗体多肽具有0.25-6小时的tα半衰期，包括端点值。在另一个实施方案中，tα半衰期在30分钟-12小时的范围内，包括端点值。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期在1-6小时范围内。

在另一个实施方案中，所述多肽组合物的tβ-半衰期增加10％或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tβ-半衰期增加50％或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tβ-半衰期增加2×或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tβ-半衰期增加了5×或更多，例如，10×，15×，20×，25×，30×，40×或更多。在另一个实施方案中，多肽组合物的tβ-半衰期增加了50×或更多。

在另一个实施方案中，所述组合物具有1mg.min/ml或更大范围内的AUC值(曲线下区域)。在一个实施方案中，所述范围的下限是5，10，15，20，30，100，200或300mg.min/ml。另外，或者备选地，按照本发明的配体或组合物具有达到600mg.min/ml范围内的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上限是500，400，300，200，150，100，75或50mg.min/ml。有利地，按照本发明的配体应该具有选自由下列各项组成的组的范围内的AUC：15-150mg.min/ml，15-100mg.min/ml，15-75mg.min/ml和15-50mg.min/ml。

在另一实施方案中，所述抗体多肽可以连接到人血清白蛋白(HSA)上。在另一个实施方案中，相对于缺少连接的HAS的相同的多肽组合物，所述抗体多肽在体内具有增加的半衰期。在另一个实施方案中，相对于缺少连接的HAS的分子，所述抗体多肽具有增加10％或更多的tα-半衰期。在另一个实施方案中，多肽组合物的tα-半衰期在0.25分钟-6小时范围内。在另一个实施方案中，多肽组合物的tβ-半衰期增加10％或更多。在另一个实施方案中，tβ-半衰期在12-48小时范围内。

在另一个实施方案中，所述抗原-结合多肽包括选自由SEQ ID NOs7-82和246-360组成的组的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述抗原-结合多肽没有Fc结构域。

在另一方面，本发明包括这样的免疫球蛋白可变结构域多肽，其具有与选自由SEQ ID NOs 7-82和246-360组成的组的序列至少85％同一性的氨基酸序列，所述多肽特异性地并且单价地结合CD40L。

在一个实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域多肽拮抗CD40L与CD40的结合。

在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域多肽抑制CD40与CD40L的结合，并且具有20pM-1.5μM范围的IC₅₀，包括端点值。例如，IC₅₀可以在20pM-1μM，20pM-900nM，20pM-800nM，20pM-700nM，20pM-600nM，20pM-500nM，20pM-400nM，20pM-300nM，20pM-200nM，20pM-100nM，或20pM-50nM范围内。其它可接受的或优选的范围包括，例如，50pM-1μM，100pM-500nM，125pM-250nM，150pM-200nM，150pM-100nM和200pM-50nM。

在另一个实施方案中，所述免疫球蛋白可变结构域多肽抑制CD40与CD40L的相互作用，但是基本上不激动由CD40引起的胞内信号传导。在一个优选的实施方案中，多肽与CD40L的结合基本上不在Jurkat T细胞中诱导JNK磷酸化。在另一个优选实施方案中，多肽与CD40L的结合基本上不诱导用抗-CD3抗体共-刺激的Jurkat T细胞分泌IFN-γ。在另一个优选实施方案中，所述抗体多肽与CD40L的结合在血小板聚集检测中基本上不诱导血小板聚集。

在另一个实施方案中，所述抗原-结合多肽还包括结合除CD40L外的配体的第二抗体多肽。在一个优选实施方案中，第二抗体多肽结合选自由下列各项组成的组的配体：HSA，TNFα，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12，IL-18，IFN-γ，CD2，CD4，CD8，CTLA4，LFA1，LFA3和VLA4。

在一个实施方案中，本发明涉及一种抗体多肽(例如，抗-CD40L dAb，FAb，scFv，Fv，或二硫键键合的Fv)，其包括特异性并且单价地结合CD40L的免疫球蛋白可变结构域，并且其包括一种或多种构架区域，所述构架区域包括与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者相对于由人生殖细胞抗体基因片段编码的所述相应构架区域的氨基酸序列，一种或多种所述构架区域的氨基酸序列总共包括高达5个氨基酸的差异。

在一个实施方案中，抗-CD40L可变结构域或dAb的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同，或者相对于由所述人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列，FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列总共包括高达10个氨基酸的差异。在另一个实施方案中，抗-CD40L可变结构域或dAb的FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同。

在上述另一个实施方案中，所述人生殖细胞抗体基因片段可以选自由DP47，DP45，DP48和DPK9组成的组。

本发明还包括在个体中拮抗CD40与CD40L的结合的方法，所述方法包括给个体施用本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽，其中所述多肽在个体中拮抗CD40与CD40L的结合。

本发明还包括在个体中拮抗CD40或CD40L活性的方法，所述方法包括给个体施用本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽，其中所述多肽拮抗CD40或CD40L或二者的活性。

本发明还包括一种包含延长释放的制剂的组合物，其包括单价抗-CD40L抗体多肽，优选地，但不限于，包括结合CD40L的单一免疫球蛋白可变结构域的多肽。在一个实施方案中，所述单一免疫球蛋白可变结构域是非人哺乳动物单一免疫球蛋白可变结构域。在另一个实施方案中，所述单一免疫球蛋白可变结构域是人单一免疫球蛋白可变结构域。

本发明还包括在需要这样的治疗的个体中治疗或预防由CD40L介导的疾病或紊乱的方法，所述方法包括给个体施用治疗有效量的包括单价抗-CD40L抗体多肽的组合物，优选地施用包括结合CD40L的单一人免疫球蛋白可变结构域的组合物。在一个实施方案中，所述疾病或紊乱是自体免疫疾病或紊乱。

本发明还包括在个体中治疗或预防系统性红斑狼疮(SLE)症状的方法，所述方法包括给所述个体以有效治疗或预防SLE症状的用量施用单价的抗-CD40L抗体多肽。本发明还包括减轻或缓和下列各项疾病的症状的方法，即，诸如系统性红斑狼疮、多发性硬化病、类风湿性关节炎、同种异体移植排斥、异种移植排斥、和糖尿病包括I型胰岛素依赖性糖尿病。

本发明还包括单价结合CD40L的抗体多肽，其中所述抗体多肽包括通用构架。

在一个实施方案中，所述通用构架包括选自由DP47、DP45和DP38组成的组的VH构架，和/或VL构架是DPK9。

在另一个实施方案中，所述抗体多肽包括通有的配体结合位点。在另一个实施方案中，所述通有的配体结合位点结合选自由蛋白A、蛋白L和蛋白G组成的组的通有配体。

在另一个实施方案中，所述抗体多肽包括具有一种或多种构架区域的可变结构域，所述构架区域包括与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者相对于由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列，一种或多种所述构架区域的氨基酸序列总共包括高达5个氨基酸的差异。

在另一个实施方案中，所述抗体多肽包括可变结构域，其中FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同，或者相对于由所述人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列，FW1、FW2、FW3和FW4的抗体序列总共包括高达10个氨基酸的差异。

在另一个实施方案中，所述抗体多肽包括抗体可变结构域，所述抗体可变结构域包括FW1、FW2和FW3区域，并且所述FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同。在另一个实施方案中，所述人生殖细胞抗体基因片段选自由DP47、DP45、DP48和DPK9组成的组。

本发明包括结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，其中所述多肽具有与DOM8-24的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者在不多于25个氨基酸位置与DOM8-24的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有同DOM8-24的序列至少80％同源性的序列。在一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域多肽，在25个或更少的氨基酸位置，20个或更少的氨基酸位置，15个或更少的氨基酸位置，10个或更少的氨基酸位置，5个或更少的氨基酸位置，2个或更少的氨基酸位置，或者只有1个氨基酸位置，不同于DOM8-24的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述抗体单一可变结构域多肽与DOM8-24的序列具有至少80％同源性，例如，至少85％同源性，至少90％同源性，至少95％同源性，并且达到和包括96％、97％、98％或99％同源性。

本发明包括结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，其中所述多肽具有与DOM8-24的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者在不多于25个氨基酸位置与DOM8-24的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有同DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，或者具有同DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列，或者具有同DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

本发明还包括结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，其中dAb具有与DOM8-24的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者在不多于25个氨基酸位置与DOM8-24的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有同DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，并且具有同DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列。

本发明还包括结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，其中dAb具有与DOM8-24的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者在不多于25个氨基酸位置与DOM8-24的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有同DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列，并且具有同DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

本发明还包括结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，其中dAb具有与DOM8-24的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者在不多于25个氨基酸位置与DOM8-24的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有同DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，并且具有同DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

本发明还包括结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，其中dAb具有与DOM8-24的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者在不多于25个氨基酸位置与DOM8-24的氨基酸序列不同的氨基酸序列，并且具有同DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，并且具有同DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列，并且具有同DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

在一个实施方案中，所述结合CD40L的抗体单一可变结构域多肽，如果不与DOM8-24的序列相同，那么就在25个或更少的氨基酸位置，20个或更少的氨基酸位置，15个或更少的氨基酸位置，10个或更少的氨基酸位置，5个或更少的氨基酸位置，2个或更少的氨基酸位置，或者只有1个氨基酸位置，不同于DOM8-24的氨基酸序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，和与DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列，和与DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，和与DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

本发明还包括一种CD40L拮抗物，其具有与DOM8-24的CDR1序列至少50％同源性的CDR1序列，和与DOM8-24的CDR2序列至少50％同源性的CDR2序列，和与DOM8-24的CDR3序列至少50％同源性的CDR3序列。

在一个实施方案中，所述CD40L拮抗物抑制CD40与CD40L的结合，和/或抑制CD40和/或CD40L的活性，和/或在血小板聚集检测中导致不多于25％的血小板聚集。在一个实施方案中，所述拮抗物导致25％或更少、20％或更少、15％或更少、10％或更少、5％或更少的血小板聚集，并且几乎没有血小板聚集。

本发明还包括一种双特异性的配体，其包括第一免疫球蛋白单一可变结构域和第二单一可变结构域，所述第一免疫球蛋白单一可变结构域具有与第一抗原的结合特异性，第二单一可变结构域具有与第二抗原的结合活性，其中所述第一抗原是CD40L，并且第二单一可变结构域与第二抗原的结合作用在体内增加所述配体的半衰期。在一个实施方案中，所述双特异性配体是4链IgG免疫球蛋白。

在一个实施方案中，所述4链IgG包括2个双特异性配体，所述双特异性配体在它们的可变结构域不同。

本发明还包括一种双特异性配体，其包括抗-人CD40L dAb和抗-SAdA。

在一个实施方案中，所述dAbs是camelidV_HH结构域。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，(i)第一和第二免疫球蛋白可变结构域是重链可变结构域；或者(ii)第一和第二免疫球蛋白可变结构域是轻链可变结构域。

在一个实施方案中，所述配体作为IgG免疫球蛋白而提供，其包括4个重链单一可变结构域或4个轻链单一可变结构域。重链可以包括camelidVHH结构域。

在所述双特异性配体的另一个实施方案中，所述第一和第二结构域独立地结合，以致双特异性配体可以同时结合第一和第二抗原。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，当通过表面胞质基因共振确定时，所述第一单一可变结构域对于人CD40L具有1×10^-8M或更小的解离常数(K_d)，和1×10^-3s^-1或更小的K_off速率常数。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，当通过表面胞质基因共振确定时，所述第二单一可变结构域对于血清白蛋白(SA)特异，并且对于SA具有1nM-500μm的解离常数(K_d)。

在另一个实施方案中，在标准配体结合检测中，所述第二结构域以1nM-500μM的IC50结合SA。第二单一可变结构域可以对于SA特异，并且包括MSA-16的氨基酸序列或者与其至少80％同源性的序列。备选地，第二单一可变结构域可以对于SA特异，并且包括MSA-26的氨基酸序列或者与其至少80％同源性的序列。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，抗-CD40L可变结构域或dAb包括通用构架。抗-CD40L可变结构域或dAb还可以包括选自由DP47、DP45和DP38组成的组的V_H构架；或者为DPK9的V_L构架。在另一实施方案中，所述双特异性配体或dAb可以包括用于通有配体的结合位点。

在一个实施方案中，所述通有配体结合位点选自由蛋白A、蛋白L和蛋白G结合位点组成的组。

在所述双特异性配体的一个实施方案中，抗-CD40L可变结构域或dAb包括一种或多种构架区域，所述构架区域包括与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列，或者相对于由人生殖细胞抗体基因片段编码的所述相应构架区域的氨基酸序列，一种或多种所述构架区域的氨基酸序列总共包括高达5个氨基酸的差异。

在一个实施方案中，抗-CD40L可变结构域或dAb的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同，或者相对于由所述人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列，FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列总共包含高达10个氨基酸的差异。

在一个实施方案中，抗-CD40L可变结构域或dAb的所述FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同。所述人生殖细胞抗体基因片段优选地选自由DP47、DP45、DP48和DPK9组成的组。

本发明还包括一种用于产生如本文所述的双特异性配体的方法，所述双特异性配体其包括第一免疫球蛋白单一可变结构域和第二单一免疫球蛋白单一可变结构域，所述第一免疫球蛋白单一可变结构域具有对于CD40L的结合特异性，第二单一免疫球蛋白单一可变结构域具有对于一种蛋白的结合特异性，双特异性配体在体内增加所述配体的半衰期，所述方法包括步骤：通过其结合CD40L的能力而选择第一可变结构域；通过其与所述蛋白结合的能力而选择第二可变结构域；将所述可变结构域组合；并且通过其与CD40L和所述蛋白结合的能力而选择所述配体。

在一个实施方案中，选择所述第一可变结构域用于在不存在互补可变结构域时结合CD40L。

本发明还包括编码本文所述的双特异性配体的核酸。所述核酸可以包括MSA-16的核酸序列或者与其至少80％同源性的序列，或者备选地可以包括，MSA-26的核酸序列或者与其至少70％同源性的序列。核酸可以结合在载体中，载体可以结合在宿主细胞中。

本发明还包括一种药物组合物，其包括本文所述的双特异性配体和药用赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还包括对CD40L特异的dAb单体，当通过表面胞质基因共振确定时，所述单体对于人CD40L具有1×10^-8M或更小的解离常数(K_d)，和1×10^-3s^-1或更小的K_off速率常数。

在一个实施方案中，当通过表面胞质基因共振确定时，所述对于CD40L特异的dAb单体具有1×10^-7M或更小的解离常数(K_d)。

在一个实施方案中，所述dAb单体具有对于CD40L的结合特异性，当通过表面胞质基因共振确定时，具有1×10^-8M或更小的解离常数(K_d)。

在一个实施方案中，dAb单体具有对CD40L的结合特异性，当通过表面胞质基因共振确定时，具有50nM-20pM的解离常数(K_d)。

在一个实施方案中，所述单体抑制CD40与CD40L的结合，具有50nM或更小的IC₅₀。

在另一实施方案中，dAb单体具有对于CD40L的结合特异性，当通过表面胞质基因共振确定时，具有1×10^-3s^-1或更小、1×10^-4s^-1或更小、1×10^-5s^-1或更小、或1×10^-6s^-1或更小的K_off速率常数。

在一个实施方案中，在标准检测中，dAb单体中和CD40L，具有50nM或更小的ND50。

发明中还包括一种双特异性配体，其包括第一和第二重链单一可变结构域，或者第一和第二轻链单一可变结构域，其中第一可变结构域是抗-CD40L dAb单体。

在一个实施方案中，第二可变结构域具有对于除CD40L外的抗原的结合特异性。

在另一实施方案中，第二可变结构域具有对于选自由下列各项组成的组的抗原的结合特异性：EPO受体，ApoE，Apo-SAA，BDNF，心肌营养蛋白-1，EGF，EGF受体，ENa-78，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-2，EpoR，FGF-酸性，FGF-碱性，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，CXXXC趋化因子(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-bl，胰岛素，IFN-g，IGF-I，IGF-II，IL-1a，Il-1b，IL-2，Il-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素a，抑制素b，IP-10，角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，Leptin，LIF，Lymphotactin，Mullerian抑制物质，单核细胞集落抑制因子，单核细胞引诱蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MIG，MIP-1a，MIP-1b，MIP-3a，MIP-3b，MIP-4，myeloid progenitor inhibitor factor-1(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，b-NGF，NT-3，NT-4，制癌蛋白M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1a，DFG1b SCF，SCGF，干细胞因子，(SCF)，TARC，TGF-a，TGF-b，TGF-b2，TGF-b3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-a，TNF-b，TNF受体I，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体-3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-b，GRO-g，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER 3，HER 4，TACE识别位点，TNF BP-1，TNF BP-II，以及在附件2或3中公开的抗原。

本发明还包括拮抗或抑制DOM8-24与CD40L结合的抗体多肽，或者与由DOM8-24结合的CD40L的相同表位而结合的抗体多肽。

本发明还包括一种双特异性配体，其包括第一免疫球蛋白单一可变结构域和第二单一可变结构域，所述第一免疫球蛋白单一可变结构域具有对第一抗原的结合特异性，第二单一可变结构域具有对第二抗原的结合活性，其中所述第一抗原是CD40L，和第二单一可变结构域是抗原呈递细胞表面抗原或者T细胞表面抗原。所述抗原呈递细胞表面抗原可以选自由下列各项组成的组的一种：树突细胞表面抗原、活化的巨噬细胞表面抗原、活化的B细胞表面抗原、共刺激性信号途径表面抗原、和MHC。

在一个实施方案中，MHC是II类，并且II类可以是α或β。

所述抗原呈递细胞表面抗原可以选自由下列各项组成的组：CD28、可诱导的共刺激性分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69、CD3、CD70、可诱导的共刺激性分子配体(ICOSL)、OX40L、CD80、CD86、HVEM(疱疹病毒进入调控因子，Herpes Virus Entry Mediator)和LIGHT，但是优选地为CD28、可诱导的共刺激性分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69或CD3的一种。

所述表面抗原优选地为B7基因表面抗原，诸如B7-2或B7-1。

定义：

当用于本文时，当用于抗体多肽或免疫球蛋白可变结构域时，术语“人”意指所述多肽具有衍生于人免疫球蛋白的序列。当所述序列是：a)从人类个体或者从人类个体的细胞或细胞系分离；b)从克隆的人抗体基因序列文库(或者人抗体V结构域序列文库)分离；或者c)当克隆的人抗体基因序列(或克隆的人V区域序列(包括，例如，生殖细胞V基因片段))用于产生一种或多种多样化的序列时，然后所述多样化序列被选择用于结合需要的靶点抗原，序列是“衍生于”人免疫球蛋白编码序列。当在本文用于抗体多肽或免疫球蛋白可变结构域时，术语“人”不包括来自其它物种的免疫球蛋白，例如，小鼠、骆驼等，其通过将人恒定区序列移植到抗体多肽上(即，用人恒定区取代非人恒定区)或者通过将人V区域构架序列移植到非人哺乳动物的免疫球蛋白可变结构域上(即，用人构架区域取代V结构域的非人构架区域)而被“人源化”。

最小程度上，人可变结构域与天然存在的人免疫球蛋白可变结构域序列具有至少85％的氨基酸相似性(包括，例如，87％，90％，93％，95％，97％，99％或更高的相似性)。

当用于本文时，术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其不依赖于其余的蛋白而保留其三级结构。一般地，结构域负责蛋白的分立的(discrete)功能特性，并且在许多情形中，可以被加到、移除或转移到其它蛋白上，而没有损失剩余的蛋白和/或结构域的功能。

“单一免疫球蛋白可变结构域”意指折叠的多肽结构域，其包括免疫球蛋白可变结构域特有的序列，并且其特异性地结合抗原(例如，500nM或更小的解离常数)。因此，“单一免疫球蛋白可变结构域”包括完整的抗体可变结构域以及修饰的可变结构域，例如，其中一个或多个环被非抗体可变结构域特有的序列取代，或者包括被剪截的或包括N-或C-端延长的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，其保持500nM或更小(例如，450nM或更小，400nM或更小，350nM或更小，300nM或更小，250nM或更小，200nM或更小，150nM或更小，100nM或更小)的解离常数和全长结构域的靶点抗原特异性。当需要时或者在任何有疑问的情形中，Kabat等.(1991，如前所述)提出的编号习惯和界线用于本文提及的免疫球蛋白可变和恒定结构域。

当用于本文时，抗体单一可变结构域多肽是指哺乳动物单一免疫球蛋白可变结构域多肽，优选地是人的，但是还包括啮齿动物的(例如，如在WO00/29004中公开的，其内容完全结合于此)或camelidV_HH dAbs。cameliddAbs是衍生于包括骆驼(camel)、美洲驼(llama)、羊驼(alpaca)、单峰驼(dromedary)和栗色羊驼(guanaco)物种的抗体单一可变结构域多肽，并且包括天然缺乏轻链的重链抗体：V_HH。V_HH分子比IgG分子小约10×，并且作为单一多肽，它们非常稳定，抵抗极端的pH和温度条件。并且，camelid抗体单一可变结构域多肽抵抗蛋白酶的作用。例如，camelid抗体在U.S.Pat.Nos.5,759,808；5,800,988；5,840,526；5,874,541；6,005,079；和6,015,695中描述，每一专利的内容完全结合于此。按照本发明有效的camelidV_HH抗体单一可变结构域多肽包括一类具有人样序列的camelid抗体单一可变结构域多肽，按照Kabat编号方式，其中该类特征在于V_HH结构域在位置45携带来自由下列各项组成的组的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，诸如例如L45，并且还在位置103包括色氨酸。例如，WO04/041862教导了人源化的camelidV_HH多肽，其教导内容完全结合于此。本领域的技术人员应该理解，天然存在的camelid抗体单一可变结构域多肽可以按照WO04/041862教导的内容进行修饰(例如，在位置45和103的氨基酸取代)，以产生人源化的camelidV_HH多肽。本发明还包括一种为nurse sharkV_HH的抗体单一可变结构域多肽。nurse sharkdAbs是衍生于nurse shark的抗体单一可变结构域多肽，其包括天然缺乏轻链的重链抗体：V_HH。例如，在Greenberg等.(Nature374第168-173页1995)和U.S.20050043519中描述了nurse sharkV_HHdAbs。

短语“单一免疫球蛋白可变结构域多肽”不仅包括分离的单一免疫球蛋白可变结构域多肽，而且包括更大的多肽，所述更大的多肽包括单一免疫球蛋白可变结构域多肽序列的单体。当所述术语用于本文时，“结构域抗体”或“dAb”等价于“单一免疫球蛋白可变结构域多肽”。关于单一免疫球蛋白可变结构域多肽，与抗原例如CD40L的结合受到单一免疫球蛋白V结构域的调控，不需要互补的V结构域。

按照本发明，术语“抗体单一可变结构域多肽”，“抗体单一可变结构域”，“单一抗体可变结构域”，和“单一免疫球蛋白可变结构域”理解成是等价的。

当用于本文时，短语“免疫球蛋白可变结构域特有的序列”是指与由免疫球蛋白可变结构域序列组成的序列同源性多于20个或更多、25个或更多、30个或更多、35个或更多、40个或更多、45个或更多或者甚至50个或更多个连续氨基酸的氨基酸序列。

与本文公开的序列的序列相似或同源(例如，至少约70％的序列相同性)也是本发明的一部分。在一些实施方案中，氨基酸水平的序列相同性可以为约80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。在核酸水平上，序列相同性可以为约70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。备选地，当在选择性杂交条件下(例如，非常高度严紧的杂交条件)，将核酸片段与所述链的互补链杂交时，存在基本的相同性。核酸可以存在于全细胞中、细胞裂解物中、或者在部分纯化或基本上纯的形式中。

当用于本文时，术语“同源性”或“相似性”是指两个核苷酸或氨基酸序列在结构上彼此相似的程度。当用于本文时，序列“相似性”是在序列比对中对氨基酸序列在相应位置共享相似的氨基酸残基的程度的测定。氨基酸彼此相似，其中它们的侧链也是相似的。具体地，“相似性”包括对于彼此是保守取代的氨基酸。“保守”取代是在blosum62 substitutionmatrix中具有正得分的任何取代(Hentikoff和Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。陈述“序列A与序列B是n％相似”意指序列A和B之间最优综合比对的n％的位置由相同的氨基酸或保守取代组成。在Needleman-Wunsch比对运算法则中，最优综合比对可以使用下述参量进行：

对于多肽：

取代矩阵：blosum62。

缺口得分函数：-A-B*LG，其中A＝11(缺口罚分)，B＝1(缺口长度罚分)和LG是缺口长度。

对于核苷酸序列：

取代矩阵：匹配为10，不匹配为0。

缺口得分函数：-A-B*LG，其中A＝50(缺口罚分)，B＝3(缺口长度罚分)和LG是缺口长度。

典型的保守取代在Met、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；残基Asp、Glu和Asn之间；残基Gln、Lys和Arg之间；或芳香残基Phe和Tyr之间。

当用于本文时，当使用Tatusova和Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174：247-250描述的Needleman-Wunsch运算法则或“BLAST 2 sequences”运算法则进行比对时，当它们彼此具有至少70％、80％或85％的序列相似性，包括，例如，90％、95％、97％、99％或者甚至100％序列相似性时，那么两个序列彼此是“同源的”或“相似的”。当使用“BLAST 2序列运算法则”进行氨基酸序列比对时，Blosum 62矩阵是默认的矩阵。

当用于本文时，术语“inhibit”、“inhibits”和“inhibited”(抑制)是指在给出的可测定活性(例如，结合活性)中相对于参照减少至少10％。在需要抑制的情形中，这样的抑制优选地至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多，达到并且包括100％，即，完全抑制或者不存在给定的活性。一种测定CD40L与CD40结合的抑制的方法在本文实施例6中得到描述。当用于本文时，术语“基本上抑制”是指在给出的可测定活性(例如，CD40L与CD40的结合)中相对于参照减少至少50％。例如，“基本上抑制”是指在给出的可测定活性中相对于参照减少至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％以及达到并且包括100％。当用于本文时，“抑制结合”，关于抗体多肽与CD40L结合，或者CD40与CD40L结合的结合，是指在结合中相对于参照减少至少10％。“抑制结合”优选地是指在结合中减少至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或更多，达到并且包括100％。

当用于本文时，术语“activate”、“activates”和“activated”(激活)是指在给出的可测定活性中相对于对照增加至少5％，例如，至少10％，25％，50％，75％或者甚至100％。

当用于本文时，术语“拮抗物”是指这样一种试剂，其抑制由CD40L调控的至少一种活性，抑制CD40与CD40L的结合，和/或在本文所述的血小板聚集检测或血小板活化检测中导致不多于25％的血小板活化和/或聚集，并且优选地导致25％或更少的血小板活化和/或聚集，20％或更少，15％或更少，10％或更少，5％或更少，和几乎没有血小板活化和/或聚集。如果相对于没有拮抗物，在存在拮抗物时，活性(即，CD40L介导的活性，CD40或CD40L的结合，或者血小板活化和/或聚集)减少至少10％，并且优选地至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％或者甚至100％(即，没有活性)，那么活性是被“拮抗的”。当所述术语用于本文时，拮抗物优选地包括单价结合CD40L的单一免疫球蛋白可变结构域。

当用于本文时，术语“激动剂”是指相对于参照，单独或者当与其它共刺激物组合时，激活至少一种由CD40L介导的活性的试剂。相对于没有激动剂，存在激动剂时，如果活性增加至少10％，例如50％，那么活性是被“激动的”。

当用于本文时，术语“表位”是指通常由免疫球蛋白V_H/V_L对结合的结构单位。表位定义用于抗体的最小结合位点，并且因此代表抗体特异性的靶点。在单一免疫球蛋白可变结构域的情形中，表位代表在分离物中由单一可变结构域结合的结构单位。即，结合位点由一种，单一免疫球代表可变结构域提供。

当用于本文时，术语“延长的释放”或等价术语“可控释放”或“缓慢释放”是指在施用给个体后在一段时间内释放活性药物，诸如多肽药物的药物制剂。多肽药物的延长释放，其可以在需要的时间范围内发生，例如，分钟、小时、天、周或更久，取决于所述药物制剂，是与标准制剂相反的，在标准制剂中，基本上全部剂量单位易于通过血流立即吸收或立即分布。优选的延长释放制剂从单一的施用导致循环药物水平，其持续，例如，8小时或者更久，12小时或者更久，24小时或者更久，36小时或者更久，48小时或者更久，60小时或者更久，72小时或者更久，84小时或者更久，96小时或者更久，或者甚至，例如，1周或2周或更久，例如，1个月或更久。

当用于本文时，“CD40L活性”是包括或由CD40L与CD40结合引起的活性，并且包括，但不限于与CD40结合(例如，按照实施例6中所述方法进行检测)，Jun-N-端激酶(JNK)活化，诱导T细胞产生并且分泌细胞因子包括，例如，IL-10、IFN-γ和TNF-α，以及血小板活化和/或聚集的调控。这些活性的检测在本文的下文中提供。

当用于本文时，术语“基本上不激动”意指，一种给出的试剂，例如，抗-CD40L抗体多肽，不激活一种或多种CD40L活性，包括在Jurkat T细胞中的Jun-N-端激酶活化(磷酸化)和在抗-CD3-刺激的Jurkat T细胞中诱导IFN-γ的产生或分泌，如同术语“活化”在本文中所定义的那样。当用于本文时，“基本上不激动”意指试剂激活不多于20％的由CD40结合CD40L而激活的活性，优选地，所述试剂激活不多于10％，8％，5％，3％，或者不多于2％或更少，包括零激活的由CD40结合CD40L而激活的活性。

当用于本文时，术语“抗体多肽”是指一种多肽，其为抗体或抗体的部分，修饰的或未修饰的，其保留特异性结合抗原的能力。因此，术语抗体多肽包括抗原-结合重链、轻链、重链-轻链二聚体、Fab片段、F(ab′)2片段、dAb、或Fv片段，包括单链Fv(scFv)。短语“抗体多肽”意欲包括重组融合多肽，其包括在融合的内容物中保持特异性结合抗原的能力的抗体多肽序列。

当用于本文时，术语“单价”意指一种给出的抗体多肽或单一免疫球蛋白可变结构域多肽只可以结合其靶点的单一分子。天然存在的抗体通常是二价的，由于它们具有两个功能性抗原-结合臂，每个臂包括VH和VL结构域。当位阻不是问题时，二价抗体可以结合两个独立分子的相同抗原。相反，“单价”抗体具有只结合一个这样的抗原分子的能力。当所述术语用于本文时，“单价”抗体还可以包括多于一个抗原结合位点，例如，两个抗原结合位点，但是所述结合位点必须是用于不同的抗原，以便所述抗体每次可以只结合一分子的CD40L。单价抗体的抗原-结合结构域可以包括V_H和V_L结构域，但是优选地只包括单一免疫球蛋白可变结构域，即，V_H或V_L结构域，其分别具有结合CD40L的能力，不需要相应的V_L或V_H结构域。单价抗体缺少交联单一抗原分子的能力。

当用于本文时，术语“标准血小板聚集检测”意指在本文下述部分描述的检测，题目为“血小板聚集检测”。

当用于本文时，术语“V_H结构域”和“V_L结构域”是指由Kabat等.(同前所述)定义的免疫球蛋白可变区，Kabat等.通过参考完全结合于此。

当用于本文时，“连接的”是指聚合物部分诸如PEG与抗体多肽的氨基酸残基的附着。PEG聚合物与抗体多肽例如抗-CD40L dAb的氨基酸残基的附着，叫作“PEG化”，并且可以使用一些PEG附着部分，包括，但不限于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、顺丁烯二酰亚胺(MAL)、乙烯砜(VS)或硫醇，而实现。PEG聚合物，或其它聚合物，可以在预先确定的位置连接到抗体多肽上，或者可以随机地连接到抗体多肽分子上。然而，优选将PEG聚合物在预先确定的位置连接到抗体多肽上。PEG聚合物可以连接到抗体多肽的任何残基上，然而，优选将所述聚合物连接到赖氨酸或半胱氨酸上，其是抗体多肽中天然存在的，或者其是被加工到所述抗体多体中的，例如，通过将抗体多肽中的天然存在的残基诱变成为半胱氨酸或赖氨酸。PEG-连接还可以通过附着到抗体多肽上的肽接头进行调控。即，PEG部分可以附着到融合到抗体多肽上的肽接头上，其中所述接头提供用于PEG附着的位点，例如，游离的半胱氨酸或赖氨酸。当用于本文时，“连接”还可以是指2个或多个抗体多肽例如dAb单体的缔合，以形成二聚体、三聚体、四聚体或其它的多聚体。抗体多肽单体可以通过本领域已知的一些方法而连接形成多聚体，所述方法包括但不限于，将抗体多肽单体作为融合蛋白表达，通过单体之间的肽接头连接2个或多个单体，或者在翻译后通过化学法连接单体，直接彼此连接，或通过二硫键的接头，或通过与二-、三-或多价连接部分的连接(例如，多臂PEG)。尽管在本文中，例如，在双-或多-特异性抗体多肽构建体的内容中，特别考虑了dAb多聚物，但是强调，对于任何给出的抗体多肽构建体，所述构建体应该只能结合一个CD40L分子，即，所述构建体可以具有唯一的CD40L-结合元件，并且不能交联CD40L。

当用于本文时，“聚合物”是指由重复的单体单位组成的大分子，并且可以指合成的或天然存在的聚合物，诸如任意取代的直链或支链聚亚烷基、聚亚链烯基(polyalkenylene)、或聚氧化烯聚合物(polyoxyalkylenepolymer)或者支化或未支化的多糖。当用于本文时，“聚合物”特别是指任意取代的或支链聚(乙二醇)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)及其衍生物。

当用于本文时，“PEG”或“PEG聚合物”是指聚乙二醇，并且更具体地可以指PEG的衍生形式，包括但不限于，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯诸如琥珀酰亚胺基丙酸酯，苯并三唑活性酯，与顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜或硫醇基团衍生的PEG。具体的PEG制剂可以包括PEG-O-CH₂CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-O-CH₂-NHS；PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS；PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS；PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS；和PEG-O-CH₂-CO₂-NHS；其中R是(CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)。用于本发明的PEG聚合物可以是线性分子，或者可以是支化的，其中多个PEG部分存在于单个聚合物中。一些用于本发明的特别优选的PEG构象包括但不限于下述：

当用于本文时，“巯基-选择试剂”是用于将PEG聚合物附着到含有硫醇的氨基酸上的试剂。氨基酸残基半胱氨酸上的硫醇基团特别用于与巯基-选择试剂相互作用。用于这样的附着的巯基-选择试剂包括，但不限于，顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜和硫醇。巯基-选择试剂用于偶联半胱氨酸残基的应用在本领域内是已知的，并且可以按照本发明如需要那样进行修改(参见，Eg.，Zalipsky，1995，Bioconjug.Chem.6：150；Greenwald等.，2000，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17：101；Herman等.，1994，Macromol.Chem.Phys.195：203)。

PEG或其它试剂例如HAS附着到本文所述的抗体多肽或单一免疫球蛋白可变结构域多肽上将优选地不应该消弱所述多肽特异性结合CD40L的能力。即，相对于非PEG-连接的副本，PEG-连接的抗体多肽或单一免疫球蛋白可变结构域多肽保持其结合活性。当用于本文时，“保持活性”是指这样的PEG-连接的抗体多肽的活性水平，其至少为非PEG-连接的抗体多肽的活性水平的10％，优选地至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％并且达到90％，优选地达到非PEG-连接的抗体多肽的活性水平的95％，98％，并且达到100％，所述非PEG-连接的抗体多肽包括一个或多个相同的抗原-结合结构域。更具体地，与非PEG连接的抗体可变结构域相比较，PEG-连接的抗体多肽的活性应该在抗体多肽摩尔基础上进行确定；即，在每次试验中，应该使用每个PEG-连接的和非PEG-连接的抗体多肽的等价摩尔数。在确定具体的PEG-连接的抗体多肽是否“保持活性”时，优选地应该将PEG-连接的抗体多肽的活性与没有PEG的相同的抗体多肽的活性进行比较。

当用于本文时，术语“体内半衰期”是指配体(例如，单一免疫球蛋白可变结构域)的血清浓度在体内减少50％所用的时间，例如，由于所述配体的降解和/或天然机制对配体的清除或螯合。本文所述的抗CD40L抗体多肽或单一免疫球蛋白可变结构域多肽可以通过与分子诸如PEG结合而在体内得以稳定并且其半衰期增加，所述分子抵抗降解和/或清除或螯合。如果它的功能活性在体内比没有连接PEG聚合物的相似的抗体多肽持续更长的时间阶段，那么抗体多肽的半衰期是增加的。典型地，相对于未PEG化的抗体多肽，PEG化的抗体多肽的半衰期增加10％，20％，30％，40％，50％或者更多。半衰期在2x，3x，4x，5x，10x，20x，30x，40x，50x或更大范围内的增加是可能的。备选地，或另外，半衰期在30x，40x，50x，60x，70x，80x，90x，100x，150x范围内的增加是可能的。按照本发明，PEG-连接的抗体单一可变结构域具有0.25-170小时的半衰期，优选地在1-100小时，更优选地30-100小时，并且更优选地50-100小时，并且达到170、180、190和200小时或更久。

当用于本文时，关于PEG或其它聚合物-连接的抗体多肽单体或多聚体的“抗降解性”或“抗降解”意指，当暴露于pH 2.0的胃蛋白酶30分钟时，PEG-或其它聚合物-连接的抗体多肽单体或多聚体降解不多于10％，并且优选地完全不降解。

当用于本文时，“流体动力学大小”是指，基于分子通过水性溶液扩散的分子(例如，蛋白分子)的表观大小。可以对蛋白通过溶液的扩散或移动进行处理以推理蛋白的表观大小，其中所述大小通过蛋白颗粒的″Stokes半径″或″流体动力学半径″而给出。蛋白的“流体动力学大小”取决于质量和形状(构象)，以致基于蛋白的综合构象，具有相同分子质量的两种蛋白可能具有不同的流体动力学大小。例如，流体动力学大小通过大小排阻层析进行测定。PEG-连接的抗体多肽例如单一免疫球蛋白可变结构域(包括本文所述的抗体可变结构域多聚体)的流体动力学大小，可以在24kDa-500kDa；30-500kDa；40-500kDa；50-500kDa；100-500kDa；150-500kDa；200-500kDa；250-500kDa；300-500kDa；350-500kDa；400-500kDa和450-500kDa范围内。优选地，本发明PEG化的抗体多肽的流体动力学大小为30-40kDa；70-80kDa或200-300kDa。在单一免疫球蛋白可变结构域多肽需要用于成像应用的情形中，所述多肽应该具有50-100kDa的流体动力学大小。备选地，在单一免疫球蛋白可变结构域多肽需要用于治疗应用时，所述多肽制剂应该具有大于200kDa的流体动力学大小。

当用于本文时，术语“IC₅₀”是指将给出的活性抑制50％所需的抑制剂的浓度。通过在不同量的抑制剂(例如，单价的抗-CD40L抗体多肽)的存在下，检测给出的活性，例如CD40L与CD40的结合，并且将抑制剂浓度相对目标确定的活性绘图，而确定IC₅₀。本文通过实施例6所述的方法测定CD40L与CD40的结合。备选地，可以使用SPR。

当用于本文时，术语“融合到抗体多肽上”意指，通过应用重组DNA技术而将多肽融合到给出的抗体上。因此，“融合到”另一多肽，例如，不同结合特异性的其它抗体，的抗体在自然界中不存在，并且通过重组方法产生。术语“融合到抗体多肽上”还包括通过，例如，二硫键或其它化学连接，将多肽连接到给出的抗体多肽上，其中所融合的多肽在天然中没有发现被融合到所述抗体多肽上。将多肽融合到另一种多肽上，例如抗体上的重组和化学方法在本领域内是公知的。

当用于本文时，术语“Fc结构域”是指恒定区抗体序列，其包括CH2和CH3恒定区，如按照Kabat等.，如前所述.所划定的那样。重链多肽的Fc部分具有自我-缔合的能力，一种促进二价抗体形成的功能。术语“缺少Fc结构域”意指，一种给出的抗体多肽缺少至少部分足以调控含有Fc抗体多肽的二聚体化的免疫球蛋白Fc结构域(由于这样的结构域按照Kabat等.，如前所述.而定义)。含有Fc抗体多肽的二聚体化，例如，通过层析方法或通过表面胞质基因共振而进行测定。缺少Fc结构域的抗体多肽避免了Fc-血小板相互作用，并且因此避免诱导血小板聚集。

当用于本文时，“治疗”、“减轻”、“预防”或“缓和”，当其与疾病症状相关时，是指基于临床可测量的参量症状减少至少10％，或者在疾病或症状严重度的临床用等级上减少至少1点。当用于本文时，术语“系统性红斑狼疮症状”是指本领域技术人员已知的任何SLE临床相关症状。非限制性的实例包括IgG自体抗体(例如，针对核抗原，诸如染色质、snRNPs (特别是U1、Sm、Ro/SSA和La/SSB)、磷脂和细胞表面分子)的累积、溶血性贫血、血小板减少症、白血球减少症、肾小球肾炎、血管炎、关节炎和浆膜炎。这样的症状的减轻是在临床可测量参量中至少10％的减少，或者在疾病严重度的临床用等级上减少至少1点。

当用于本文时，短语“特异性结合”是指抗原通过免疫球蛋白可变结构域的结合，当使用，例如，BIAcore^TM表面胞质基因共振系统和BIAcore^TM动力学评估软件(例如，版本2.1)进行表面胞质共振分析而测定时，具有1μM或更低的解离常数(K_d)。对于特异结合相互作用的亲和力或K_d优选地为约500nM或更低，更优选地约300nM或更低。

当用于本文时，“通有配体”是一种在给出的全体成分例如在噬菌体展示文库中结合基本比例的功能性成员的配体。因此，相同的通有配体可以结合全体成分中的许多成员，而不管它们的靶点配体特异性。一般地，功能性通有配体结合位点的存在表明，全部成员正确地表达和折叠。因此，所述通有配体与其结合位点的结合提供了一种用于从全体多肽中预先选择功能性多肽的方法。通有配体包括，例如，蛋白A、蛋白G和蛋白L。

当用于本文时，术语“通用构架”是指单一抗体构架序列，其与由Kabat(如前所述)定义的序列保守的抗体区域相对应，或者与由Chothia和Lesk，(1987)J.Mol.Biol.196：910-917定义的人生殖细胞免疫球蛋白全体或结构相对应。本发明提供单一构架、或者一套这样的构架的应用，虽然仅在超可变区变化，但是发现其允许本质上任何结合特异性的演变。

附图简述

图1显示本文所述的筛选方法中所用的生物素-标记的CD40L质量的凝胶分析。(a)1μg非生物素化-CD40L(泳道1)和0.3μg生物素-CD40L(泳道2)在SDS-PAGE上分析，并且通过Simply Blue Safe-Stain检测。(b)0.1μg生物素-CD40L(泳道1)和0.02μg生物素-CD40L(泳道2)通过用1∶5000链霉抗生物素-HRP探针进行蛋白质印迹检测。

图2显示剂量反应受体结合检测(RBA)读数的曲线描述，分析通过从1μM下降到10pM滴定的dAbs DOM-10，-20，-27，-30，-31，-62，-77对CD40L与CD40-Fc结合的抑制。dAbs DOM-20，-30和-31是最有效的，具有大约8nM的IC₅₀值。

图3显示剂量反应受体结合检测读数的曲线描述，分析通过从1μM下降到500pM滴定的dAbs DOM-4和DOM-5对CD40L与CD40-Fc结合的抑制。对于dAbs DOM-5和DOM-4的IC₅₀值分别为大约3nM和100nM。

图4显示剂量反应受体结合检测读数的曲线描述，分析通过从100nM下降到0.5pM滴定的dAbs DOM-24对CD40L与CD40-Fc结合的抑制。数据使用GraphPad Prism软件进行曲线-适配。

图5显示基于生殖细胞序列DP47-JH4b的V_H构架的序列(SEQ IDNO：1，氨基酸序列；SEQ ID NO：2，核苷酸序列-有义和反义链都显示-SEQ ID NO：2是上链(有义链)和SEQ ID NO：476是下链(反义链))。HCDRs 1-3用下划线标明。

图6显示基于生殖细胞序列DPK9-J_K1的V_κ构架的序列(SEQ ID NO：3，氨基酸序列；SEQ ID NO：4，核苷酸序列-有义和反义链都显示-SEQID NO：4是上链(有义链)和SEQ ID NO：477是下链(反义链))。LHCDRs1-3用下划线标明。

图7显示本文，例如在实施例6中所用的CD40L结合检测的图示。

图8显示各种GAS1分泌信号肽编码序列。

图9显示受体结合检测的结果，其用30K PEG MAL或40KPEG2-MAL证实PEG化的DOM8-24cys的亲和力。

图10显示评估双特异性二聚体与HSA和CD40L同时结合(阴影条形)的检测的结果。还显示了与对照BSA抗原的结合(实心条形)。

图11显示评估双特异性Fab与HSA和CD40L同时结合(阴影条形)的检测的结果。还显示了与对照脱脂乳粉末抗原的结合(实心条形)。

图12显示对单体DOM-24(灰色虚线)抑制作用进行FACS分析的结果。对照刺激的细胞显示为黑色实线，和对照dAb显示为灰色实线。

图13显示对Vk dAb DOM-116(虚线)抑制作用进行FACS分析的结果。对照刺激的细胞显示为黑色实线，和对照dAb显示为灰色实线。

详述

本发明提供单价结合CD40L的抗体多肽。CD40L结合的单价性排除了使用现有技术抗体存在的交联的可能性，并且所述交联在使用抗-CD40L单克隆抗体所观察到的不理想的副作用中起作用。此外，尽管不希望受到任何具体机制或理论的局限，但是，由于对于CD40L单价的抗体多肽不能交联CD40L，所以排除了这样的可能性，即，交联的CD40L可能又交联细胞表面的CD40，并且导致CD40信号传导活性的激动。因此，在优选的方面，本文所公开的抗-CD40L抗体不仅抑制或者拮抗CD40L与CD40的结合，它们基本上不激动CD40和/或CD40L的活性。

在一方面，对于CD40L结合单价的抗体是人抗体多肽。人抗体多肽可以施用给人患者，同时极大地避免通常由施用其它物种例如小鼠的抗体而激发的抗-抗体免疫应答。尽管可以通过将人恒定结构域移植到小鼠抗原-结合结构域上而将小鼠抗体“人源化”，但是，本文所公开的人抗体无需对小鼠抗体序列进行费力和费时的遗传基因操作而产生。

单价抗体多肽：

抗体的重链和轻链包括直接参与抗原相互作用的可变(V)区，和在与免疫效应器的非抗原特异性相互作用中提供结构支持和作用的恒定(C)区。常规抗体的抗原结合结构域由2个独立的结构域组成：重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L：其可以是V_κ或V_λ)。抗原结合位点本身由6个多肽环形成：3个来自V_H结构域(H1，H2和H3)和3个来自V_L结构域(L1，L2和L3)。在体内，编码V_H和V_L结构域的V基因的多样化主要全部成分通过基因片段的组合重组而产生。C区包括轻链C区(叫作C_L区)和重链C区(叫作C_H1，C_H2和C_H3区)。天然存在的抗体通常包括2个抗原结合结构域，并且因此是二价的。

在蛋白酶消化后，已经鉴定了天然存在的抗体的许多更小的抗原结合片段。这些包括，例如，“Fab片段”(V_L-C_L-C_H1-V_H)、“Fab’片段”(具有重链铰链区的Fab)、和“F(ab’)₂片段”(由重链铰链区连接的Fab’片段二聚体)。已经应用重组方法来产生这样的片段，并且产生甚至更小的抗原-结合片段，例如，叫作“单链Fv”(可变片段)或“scFv”的那些，其由通过合成的肽接头连接的V_L和V_H组成(V_L-接头-V_H)。Fab片段、Fab’片段和scFv片段对于抗原结合是单价的，由于它们每一个包括唯一的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括一个V_H/V_L二聚体。甚至更小的单价抗体片段是“结构域抗体”或“dAbs”，其只包括单一免疫球蛋白可变结构域，例如，V_H或V_L，其分别单独地特异性结合抗原，即，不需要互补的V_L或V_H结构域。

术语“dAb”在本文中是指特异性结合抗原的单一免疫球蛋白可变结构域(V_H或V_L)多肽。“dAb”独立地结合其它V结构域的抗原；然而，“dAb”可以与其它V_H或V_L结构域以同型-或异型多聚体存在，其中对于通过dAb结合抗原，不需要其它的结构域，即，其中dAb独立地结合其它V_H或V_L结构域的抗原。单一免疫球蛋白可变结构域的制备在本文下文中进行描述和举例说明。

单价抗体多肽可以用一些不同的方法产生。例如，可以对编码已知结合CD40L的抗体重链和轻链的核酸序列进行操作，以产生许多不同的对于CD40L结合是单价的抗体多肽。因此，假定给出编码组成抗体的重链和轻链多肽的序列以及标准分子克隆方法，人们可以产生单价抗原-结合多肽构建体，诸如Fab片段、scFv、dAbs或甚至是双特异性抗体(即，包括2个不同的抗原-结合部分并且因此可以结合2个独立的抗原，优选同时结合的抗体)，它们对于CD40L是单价的。

因此，一种产生对于CD40L特异的单价抗体多肽的方法是扩增并且表达重链和轻链基因序列的V_H和V_L区，例如，所述基因序列从表达抗-CD40L单克隆抗体的杂交瘤(例如，小鼠杂交瘤)分离。V_H和V_L结构域的分界线由Kabat等.(1991，如前所述)提出。关于重链和轻链基因的V_H和V_L结构域分界线的信息用来设计PCR引物，所述PCR引物从编码已知结合CD40L的抗体的重链或轻链编码序列扩增V结构域。将扩增的V结构域插入适当的表达载体中，例如pHEN-1(Hoogenboom等.，1991，Nucleic Acids Res.19：4133-4137)并且表达，例如，作为以scFv或其它适宜的单价形式的V_H和V_L融合体进行表达。然后，关于单价结合CD40L的高亲和力来筛选得到的多肽。对于本发明的所有方面，关于结合的筛选按照本领域已知的或者按照下文所述的进行。

备选地，文库筛选方法可以用来鉴定单价CD40L-特异性结合蛋白。噬菌体展示技术(参见，例如，Smith，1985，Science 228：1315；Scott&Smith，1990，Science 249：386；McCafferty等.，1990，Nature 348：552)提供了用于从抗体多肽的大量多样性全体组分中选择与需要的靶点结合的抗体多肽的方法。这些噬菌体-抗体文库可以分成2类：天然文库，其使用从人B细胞收集的重排V基因(Marks等.，1991，J.Mol.Biol.，222：581；Vaughan等.，1996，Nature Biotech.，14：309)，或合成文库，其中生殖细胞V基因片段或其它抗体多肽编码序列在体外‘重排’(Hoogenboom&Winter，1992，J.Mol.Biol.，227：381；Nissim等.，1994，EMBO J.，13：692；Griffiths等.，1994，EMBO J.，13：3245；De Kruif等.，1995，J.Mol.Biol.，248：97)，或者其中合成的CDRs结合到单一重排的V基因中(Barbas等.，1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。包括遗传展示包装(genetic display packages)(例如，噬菌体展示、多核糖体展示)的方法非常适用于选择单价CD40L-特异性抗体构建体，原因在于它们在所述展示包装上通常只表达单价片段，而不是完整的二价抗体。在附上的参考文献中描述了用于制备展示各种抗体片段的噬菌体展示文库的方法。例如，这样的方法还在美国专利号6,696,245中得到描述，其通过参考结合于此。在‘245专利中描述的方法通常包括所选的免疫球蛋白基因编码区，特别是V_H和V_L编码区的区域的随机化排列，而使其它区域非随机化排列(见下文)。‘245专利还描述了scFv构建体的产生，其包括个别随机化排列的V_H和V_L结构域。

V_H基因通过将3个基因片段，V_H、D和J_H重组而产生。在人中，取决于单倍型，存在大约51个功能性V_H片段(Cook和Tomlinson(1995)Immunol Today 16：237)，25个功能性D片段(Corbett等.(1997)J.Mol.Biol.268：69)和6个功能性J_H片段(Ravetch等.(1981)Cell 27：583)。V_H片段编码形成V_H结构域第一和第二抗原结合环(H1和H2)的多肽链区域，而V_H、D和J_H片段组合形成V_H结构域的第三抗原结合环(H3)。

V_L基因通过只有两个基因片段V_L和J_L的重组而产生。在人中，取决于单倍型，存在大约40个功能性V_κ片段(和Zachau(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 374：1001)，31个功能性Vλ片段(Williams等.(1996)J.Mol.Biol.264：220；Kawasaki等.(1997)Genome Res.7：250)，5个功能性J_κ片段(Hieter等.(1982)J.Biol.Chem.257：1516)和4个功能性J_λ片段(Vasicek和Leder(1990)J.Exp.Med.172：609)。V_L片段编码形成V_L结构域第一和第二抗原结合环(L1和L2)的多肽链区域，而V_L和J_L片段组合形成V_L结构域的第三抗原结合环(L3)。据信，选自这一主要所有组成成分的抗体充分地变化多样，以便以至少中等的亲和力结合几乎全部的抗原。高亲和力抗体在体内通过重排基因的“亲和力成熟”而产生，其中基于改善的结合，点突变由免疫系统产生并选择。

抗体结构和序列的分析表明，6个抗原结合环中有5个(H1，H2，L1，L2，L3)具有少数主链构象或规范的结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901；Chothia等.(1989)Nature 342：877)。主链构象由下述各项而确定：(i)抗原结合环的长度，和(ii)在抗原结合环和抗体构架中某些重要位置的特殊残基或残基的类型。环长度和重要残基的分析使得能够预测由大多数人抗体序列所编码的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等.(1992)J.Mol.Biol.227：799；Tomlinson等.(1995)EMBO J.14：4628；Williams等.(1996)J.Mol.Biol.264：220)。尽管在序列、长度和结构方面，H3区域是更加多样性的(由于D片段的应用)，但是，它还形成少数短环长度的主链构象，其取决于在环和抗体构架中重要位置的特殊残基的长度和存在或残基的类型(Martin等.(1996)J.Mol.Biol.263：800；Shirai等.(1996)FEBSLetters 399：1.)。

然而，在一种方法中，可以将多样性在不同抗原-结合环的CDRs中的任何位点添加到合成的所有成分上，这一方法形成更大比例的没有正确折叠的V结构域，并且因此组成更低比例的具有结合抗原潜能的分子。对组成抗原-结合环主链构象的残基的理解允许在合成的VH或VL结构域全体成分中鉴别特异的残基而多样化。即，多样性最好引入不是主要维持主链构象的残基中。作为一个实例，对于环L2的多样化，常规方法将使由Kabat等.(1991，如前所述)定义的相应的CDR(CDR2)中所有的残基、某7个残基多样化。然而，对于L2，已知位置50和53在天然存在的抗体中是多样的，并且观察到其与抗原接触。优选的方法仅将在这一环中的这两个残基多样化。关于产生一套抗原结合特异性所需要的功能多样性，这代表显著的改进。

基于预先确定的可变结构域主链构象，可以有利地设计免疫球蛋白多肽文库。这样的文库可以按照国际专利申请WO 99/20749中所述进行构建，其内容通过参考结合于此。因此，在一方面，抗体多肽包括给出的人生殖细胞V区基因片段的氨基酸序列，例如，V_H生殖细胞基因片段DP-47或V_κ生殖细胞基因片段DPK9。这样的可变区多肽可以用于产生scFvs或Fabs，例如，scFv或Fab，其包括(i)抗体重链可变结构域(V_H)，或其抗原结合片段，其包括生殖细胞V_H片段DP-47的氨基酸序列，和(ii)抗体轻链可变结构域(V_L)，或其抗原结合片段，其包括生殖细胞V_κ片段DPK9的氨基酸序列。在所选的重链和轻链生殖细胞基因片段如DP-47、DPK 9、DP45、DP38等的情形中，序列多样性可以产生多样性免疫球蛋白编码序列的所有成分。在产生多样化dAb或scFv序列文库的情形中，下文描述了一种多样性方法。这些可变区多肽还可以作为dAbs表达，并且对于结合CD40L的高亲和力进行筛选。可以将所有成分克隆到或者产生到适用于噬菌体展示的载体中，例如，λ或丝状噬菌体展示载体，并且然后，对于与给出的靶点抗原如CD40L的结合而进行筛选。

制备人单一免疫球蛋白可变结构域多肽：

单一免疫球蛋白可变结构域是一种折叠的多肽结构域，其包括免疫球蛋白可变结构域特有的序列，并且其特异性结合抗原(例如，500nM或更小的解离常数)，并且其作为单一可变结构域结合抗原；即，存在由单一免疫球蛋白可变结构域提供的一个结合位点，而没有任何互补可变结构域。因此，单一免疫球蛋白可变结构域包括完整的抗体可变结构域以及修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已经被不是抗体可变结构域特有的序列而取代，或者包括被剪截或包括N-或C-端延长的抗体可变结构域，以及可变结构域的折叠片段，其保留500nM或更小(例如，450nM或更小，400nM或更小，350nM或更小，300nM或更小，250nM或更小，200nM或更小，150nM或更小，100nM或更小)的解离常数和全长结构域的靶点抗原特异性。优选地，用于本发明的抗体单一可变结构域选自由V_H和V_L组成的组，其包括V_κ和V_λ。本文所用的单一免疫球蛋白可变结构域优选是“人的”，如所述术语在本文中定义的那样。

制备单一免疫球蛋白可变结构域：

以各种方法制备单一免疫球蛋白可变结构域。对于这些方法的每一种，公知的制备(例如，扩增、突变等)和操作核酸序列的方法是适用的。

制备单一免疫球蛋白可变结构域的一种方法是扩增并且表达克隆的抗体的重链或轻链基因的V_H或V_L区，已知所述克隆的抗体与需要的抗原结合。即，已知的抗-CD40L抗体编码区的V_H或V_L结构域可以作为单一结构域(或者作为单一结构域的融合体)进行扩增和表达，并且对与CD40L的结合进行评估。V_H和V_L结构域的边界由Kabat等.(1991，如前所述)提出。关于重链和轻链基因的V_H和V_L结构域边界的信息用于设计PCR引物，所述引物从编码已知与CD40L结合的抗体的克隆的重链或轻链编码序列扩增V结构域。将扩增的V结构域单独的或者作为与另一多肽序列的融合体插入适当的表达载体，例如，pHEN-1(Hoogenboom等.，1991，Nucleic Acids Res.19：4133-4137)，并且表达。

在一种优选方法中，V_H或V_L结构域的所有成分，优选地人V_H或V_L结构域的所有成分，例如通过针对需要的抗原的噬菌体展示而进行筛选。构建噬菌体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法是本领域公知的，并且，例如，由下列各项教导：McCafferty等.，1990，Nature 348：552；Kang等.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson等.，1991，Nature 352：624；Lowman等.，1991，Biochemistry 30：10832；Burton等.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：10134；Hoogenboom等.，1991，Nucleic Acids Res.19：4133；Chang等.，1991，J.Immunol.147：3610；Breitling等.，1991，Gene 104：147；Marks等.，1991，J.Mol.Biol.222：581；Barbas等.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Hawkins和Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks等.(1992)J.Biol.Chem.，267：16007；和Lerner等.(1992)Science，258：1313。Fab噬菌体展示文库通过如U.S.5,922,545教导。scFv噬菌体文库通过如Huston等.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.85：5879-5883；Chaudhary等.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.87：1066-1070；McCafferty等.，1990，如前所述；Clackson等.，1991，如前所述；Marks等.，1991，如前所述；Chiswell等.，1992，Trends Biotech.10：80；和Marks等.，1992，如前所述而教导。已经描述了在噬菌体包膜蛋白上展示的各种scFv文库的实施方案。噬菌体展示方法的改进也是已知的，例如在WO96/06213和WO92/01047(Medical Research Council等.)和WO97/08320(Morphosys，如前所述)中所述。

V_H或V_L结构域的所有成分可以是免疫球蛋白序列天然存在的所有成分或合成的所有成分。天然存在的所有成分是，例如，由从一个或多个个体收集的免疫球蛋白-表达细胞制备的所有成分。这样的所有成分可以是“首次用于实验的”，即，例如，从人胎儿或婴儿免疫球蛋白-表达细胞制备，或者是重新排列的，即，例如，从成人B细胞制备。例如，天然所有成分由Marks等.，1991，J.Mol.Biol.222：581和Vaughan等.，1996，Nature Biotech.14：309描述。在这方面，如果需要，然后将从与靶点抗原结合的天然所有成分或任何所有成分而鉴定的克隆进行诱变，并且进一步筛选，以产生并且选择具有提高的结合特性的变体。

单一免疫球蛋白可变结构域的合成的所有成分通过向克隆的V结构域人工引入多样性而制备。例如，合成的所有成分由Hoogenboom和Winter，1992，J.Mol.Biol.227：381；Barbas等.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：4457；Nissim等.，1994，EMBO J.13：692；Griffiths等.，1994，EMBO J.13：3245；DeKriuf等.，1995，J.Mol.Biol.248：97；和WO99/20749描述。

一方面，基于人工多样化的生殖细胞V_H或V_κ序列，合成的可变结构域所有成分在V_H或V_κ背景下制备。例如，V_H结构域的所有成分可以依据克隆的生殖细胞V_H基因片段V3-23/DP47(Tomlinson等.，1992，J.Mol.Biol.227：7768)和JH4b。例如，V_κ结构域的所有成分可以依据生殖细胞V_κ基因片段O2/O12/DPK9(Cox等.，1994，Eur.J.Immunol.24：827)和J_κ1。例如，通过PCR诱变将多样性引入这些或其它基因片段。多样性可以随机引入，例如，通过易错PCR(Hawkins，等.，1992，J.Mol.Biol.226：889)或化学诱变进行。然而，如上文所讨论的那样，优选地，多样性的引入靶向具体的残基。还优选地，通过使用编码所有氨基酸和TAG终止密码子的诱变引物引入密码子NNK(应用IUPAC命名法，其中N＝G，A，T或C，和K＝G或T)，而靶向需要的残基。实现相似目的的其它密码子也是有用的，包括NNN密码子(其引起其它终止密码子TGA和TAA的产生)、DVT密码子((A/G/T)(A/G/C)T)、DVC密码子((A/G/T)(A/G/C)C)和DVY密码子((A/G/T)(A/G/C)(C/T))。DVT密码子编码22％的丝氨酸和11％的酪氨酸、天冬酰胺(asgpargine)、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸，其最接近地模拟天然人抗体的抗原结合位点氨基酸残基的分布。使用在要被多样化的每个位点具有一种或多种选择的简并密码子的PCR引物，制备所有成分。PCR诱变是本领域公知的。

在一方面，使用如U.S.6,696,245中所用的编号方式，在位点H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97和H98，使用NNK密码子，向人生殖细胞V_H基因片段V3-23/DP47(Tomlinson等.，1992，J.Mol.Biol.227：7768)和JH4b的序列中引入多样性，这与CDRs 1，2和3的多样性对应。

在另一方面，使用如U.S.6,696,245中所用的编号方式，例如，在位点H30，H31，H33，H35，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H97，H98，H99，H100，H100a和H100b，使用NNK密码子，向人生殖细胞V_H基因片段V3-23/DP47和JH4b的序列中引入多样性，这与CDRs 1，2和3的多样性对应。

在另一方面，使用如U.S.6,696,245中所用的编号方式，例如，在位点L30，L31，L32，L34，L50，L53，L91，L92，L93，L94和L96，使用NNK密码子，向人生殖细胞V_κ基因片段O2/O12/DPK9和J_κ1的序列中引入多样性，这与CDRs 1，2和3的多样性对应。

将多样化的所有成分克隆到本领域已知的并且例如在WO 99/20749中描述的噬菌体展示载体中。一般地，实行本发明所需要的核酸分子和载体构建体在本领域内是可获得的，并且按照标准实验室手册诸如Sambrook等.(1989).Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，USA中所提出的那样进行构建和操作。

本发明中核酸的操作典型地在重组载体中进行。当用于本文时，“载体”是指离散的元件，其用于向细胞中引入异源DNA以进行其表达和/或复制。选择或构建并且随后应用这样的载体的方法对于本领域的技术人员是公知的。许多载体是公共可获得的，包括细菌质粒、噬菌体、人造染色体和游离载体。这样的载体可以用于简单克隆和诱变；备选地，当其是携带本发明的所有成分(或前所有成分)成员的典型载体时，应用基因表达载体。选择按照本发明应用的载体容纳需要大小的多肽编码序列，长度典型地从0.25千个碱基(kb)到40kb。在体外克隆操作后，用所述载体转化适当的宿主细胞。每种载体含有多种功能性成分，其一般包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少一种选择标记基因。如果给定的载体是一种表达载体，那么它另外具有下列一项或多项：增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每一项都位于克隆位点周围，以便它们与编码按照本发明的多肽所有成分成员的基因可操作性地连接。

克隆和表达载体一般都含有能够使得所述载体在一种或多种选择宿主细胞中复制的核酸序列。典型地，在克隆载体中，这一序列是能够使得所述载体不依赖于宿主染色体DNA进行复制的序列，并且包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母和病毒，这样的序列是公知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏阴性细菌，2微米质粒起点适用于酵母，和各种病毒起点(例如，SV40、腺病毒)用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般地，对于哺乳动物表达载体不需要复制起点，除非这些载体是用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞诸如COS细胞中。

有利地，克隆或表达载体还含有选择基因，其也叫作可选择标记。这一基因编码对于在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。因此，没有转化含有所述选择基因的载体的宿主细胞将不能在所述培养基中存活。典型的选择基因编码这样的蛋白，即，其赋予针对抗生素和其它毒素如氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤或四环素的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或者提供不能从生长培养基中获得的重要营养。

由于按照本发明的载体的复制最方便在在大肠杆菌中进行，所以，使用大肠杆菌选择标记，例如，赋予针对抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。这些可以从大肠杆菌质粒获得，诸如从pBR322或从pUC质粒如pUC18或pUC19获得。

表达载体通常含有被宿主生物体识别并且可操作性地连接到目的编码序列上的启动子。这样的启动子可以是可诱导的或组成型的。术语“可操作性地连接”是指并列，其中所述成分处于允许它们以其想要的方式起作用的关系。“可操作性地连接”到编码序列上的控制序列以这样的方式连接，以便在与控制序列相容的条件下获得所述编码序列的表达。

适用于原核宿主的启动子包括，例如，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统和杂合启动子诸如tac启动子。用于细菌系统的启动子通常也含有可操作性地与编码序列连接的SD(Shine-Dalgarno)序列。

在本文所述的文库或所有成分中，优选的载体是能够表达与多肽文库成员对应的核苷酸序列的表达载体。因此，通过表达多肽文库成员的单个克隆独立的增殖和表达，或者通过应用任意的选择展示系统，而进行选择。如上文所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体。优选的载体是噬菌粒载体，其具有大肠杆菌的复制起点(用于双链复制)，并且还具有噬菌体的复制起点(用于产生单链DNA)。这样的载体的操作和表达在本领域内是公知的(Hoogenboom和Winter(1992)如前所述；Nissim等.(1994)如前所述)。简要地，所述载体含有赋予噬菌粒选择性的β-内酰胺酶或者其它选择标记基因，和由pelB前导序列(其将表达的多肽导向壁膜间隙)组成的表达盒上游lac启动子，多克隆位点(用于克隆文库成员的核苷酸译本)，任选地，一种或多种肽标记(用于检测)，任选地，一种或多种TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。在一个实施方案中，所述载体编码真核GAS1前导序列而不是pelB前导序列，所述真核GAS1前导序列作用将融合多肽的分泌物导向大肠杆菌的壁膜间隙或导向真核细胞系统的培养基。使用大肠杆菌的各种抑制和非抑制菌株，并且加入葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体诸如VCSM13，所述载体能够作为质粒复制而不表达，只产生大量的多肽文库成员，或者产生噬菌体，它们中的一些在它们表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。

一种优选的载体的实例是pHEN1噬菌粒载体(Hoogenboom等.，1991，Nucl.Acids Res.19：4133-4137；序列是可以获得的，例如，WO 03/031611中的SEQ ID NO：7)，其中pIII融合蛋白的产生受到LacZ启动子的控制，所述LacZ启动子在存在葡萄糖时受到抑制，并且使用IPTG进行诱导。当在大肠杆菌的抑制菌株如TG1中生长时，基因III融合蛋白产生并且包装成噬菌体，而在非抑制菌株如HB2151中的生长允许可溶融合蛋白分泌到细菌周质中和分泌到培养基中。由于基因III的表达防止后来的辅助噬菌体感染，在感染VCSM13辅助噬菌体之前，将携带噬菌粒载体的细菌在葡萄糖的存在下增殖，以进行噬菌体挽救。

构建按照本发明的载体应用常规的连接技术。将分离的载体或DNA片段切割、剪截、并且以需要的形式重新连接，以产生需要的载体。如果需要，应用标准方法，进行序列分析以确定正确的序列存在于构建载体中。用于构建表达载体、制备体外转录物、向宿主细胞中引入DNA、并且进行评估表达和功能的分析的适宜的方法对于本领域的技术人员是已知的。检测基因序列在样品中的存在，或者其扩增和/或表达通过常规方法进行定量，诸如DNA或RNA印迹分析，蛋白质印迹，DNA、RNA或蛋白的斑点印迹，原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白分子的序列分析。如果需要，本领域的技术人员应该很容易地考虑到这些方法可以怎样进行改进。

筛选用于抗原结合的单一免疫球蛋白可变结构域：

在噬菌体表面表达单一免疫球蛋白可变结构域的所有成分后，通过将所述噬菌体所有成分与固定的靶点抗原(例如，通过DOM8-24结合的CD40L和/或表位)接触而进行选择，洗涤以移除不结合的噬菌体，并且增殖结合的噬菌体，这一完整的过程通常叫作“淘选(panning)”。这一过程适用于筛选单一免疫球蛋白可变结构域以及可以在展示文库上表达的其它抗体片段如scFv、Fab等。备选地，通过针对只由折叠的成员结合的固定的通有配体(例如，蛋白质A或蛋白质L)进行淘选，而预先选择表达正确折叠的成员变体的噬菌体。这具有减少非功能性成员比例，因而增加可能与靶点抗原结合的成员比例的优点。使用通有配体进行预先筛选在WO 99/20749中教导。例如，噬菌体抗体文库的筛选通常由Harrison等.，1996，Meth.Enzymol.267：83-109描述。

筛选通常使用固定在固体支持物如塑料管或孔，或者固定在层析基质如Sepharose^TM(Pharmacia)上的纯化的抗原而进行。筛选或选择还可以在复合抗原上进行，诸如在细胞表面上进行(Marks等.，1993，BioTechnology11：1145；de Kruif等.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：3938)。另一种备选方案包括通过结合溶液中生物素化的抗原然后通过在链霉抗生物素蛋白-包被的珠粒上捕获而进行的选择。

在一个优选的方面，淘选通过将抗原(通有的或特异性的)固定在管子上或平板的孔上如Nunc MAXISORP^TM免疫管8孔条带上而进行。将孔用150μl抗原(在PBS中100μg/ml)包被，并且温育过夜。然后，将所述孔用PBS洗涤3次，并且在37℃用400μl PBS-2％脱脂乳(2％MPBS)封闭2hr。将所述孔用PBS润洗3次，并且将噬菌体加入到2％MPBS中。将混合物在室温温育90分钟，并且移除含有未结合的噬菌体的液体。将孔用PBS-0.1％吐温20润洗10次，然后用PBS润洗10次以去除去污剂。通过加入200μl新鲜制备的100mM三乙胺，充分混合并且在室温温育10min，而洗脱结合的噬菌体。将洗脱的噬菌体转移到含有100μl 1MTris-HCl，pH 7.4的管中，并且振荡以中和三乙胺。将指数生长的大肠杆菌宿主细胞(例如，TG1)转染，例如，通过在37℃温育30min而转染150ml的洗脱的噬菌体。将感染的细胞离心，重悬在新鲜培养基中，并且接种在顶端琼脂糖上。洗脱噬菌体蚀斑或者挑取到新鲜的宿主细胞培养物中进行增殖，以用于分析或者用于更多轮的选择。如果需要保证选择的噬菌体的纯粹群体，那么进行一轮或多轮的蚀斑纯化。其它的筛选方法由Harrison等.，1996，如前所述.描述。

在鉴定了表达结合需要的靶点的单一免疫球蛋白可变结构域的噬菌体后，如果使用的是噬菌粒载体诸如pHEN1，那么，通过感染细菌的非抑制菌株，例如允许选择可溶的基因III融合蛋白的HB2151，容易地以可溶形式生产可变结构域融合蛋白。如果载体编码GAS1分泌信号肽，那么融合多肽可以由真核(例如，酵母或哺乳动物)或原核(例如，大肠杆菌)细胞分泌。备选地，按照本领域已知的方法，可以将V结构域序列亚克隆到适当的表达载体中，以产生可溶蛋白。

单一免疫球蛋白可变结构域的纯化和浓缩：

根据已知的方法(Harrison等.，1996，如前所述)，收集并且纯化分泌到壁膜间隙或分泌到细菌培养基中的单一免疫球蛋白可变结构域多肽或其它单价抗体多肽。Skerra和Pluckthun(1988，Science 240：1038)和Breitling等.(1991，Gene 104：147)描述了从周质中收集抗体多肽，和Better等.(1988，Science 240：1041)描述从培养物上层清液中收集。对于一些抗体多肽，纯化还可以通过与通有配体诸如蛋白质A或蛋白质L结合而实现。备选地，所述可变结构域可以与肽标记如Myc、HA或6X-His标记一起表达，所述肽标记通过亲和层析而促进纯化。

如果需要，通过本领域公知的几种方法中的任一种方法，包括例如，超滤、渗滤和切向流过滤，而浓缩单价抗-CD40L抗体多肽。超滤方法使用半透性膜和压力，以便基于大小和形状分离分子种类。压力由气压或由离心提供。商业超滤产品是广泛可获得的，例如，从Millipore(Bedford，MA；实例包括Centricon^TM和Microcon^TM浓缩器)和Vivascience(Hannover，Germany；实例包括Vivaspin^TM浓缩器)。通过选择小于目标多肽的截留分子量(尽管可以成功使用如10kD一样小的差别，但是通常为目标多肽分子量的1/3到1/6)，当溶剂和更小的溶质通过所述膜时，多肽便被截留。因此，大约5kD的截留分子量用于浓缩本文所述的抗-CD40L单一免疫球蛋白可变结构域多肽。

当需要去除或者更换多肽制备液中的盐或缓冲液时，使用渗滤，其使用具有“洗涤”过程的超滤膜。多肽通过将溶剂和小的溶质通过所述膜而被浓缩，并且，当需要时，通过用新的缓冲液或盐溶液或水稀释截留的多肽而去除剩余的盐或缓冲液，这伴随着连续的超滤。在连续的超滤中，以与滤出液通过膜相同的速度加入新的缓冲液。渗滤体积是在渗滤开始之前的多肽溶液的体积——使用连续的渗滤，可以通过用6渗滤体积的新缓冲液洗涤而去除大于99.5％的完全透过性的溶质。备选地，所述方法可以以不连续的方式进行，其中将样品重复稀释，然后过滤回其初始体积，以去除或者更换盐或缓冲液，并且最终浓缩所述多肽。渗滤的设备及其应用的详细方法，例如，可从Pall Life Sciences(Ann Arbor，MI)和SartoriusAG/Vivascience(Hannover，Germany)获得。

切向流过滤(TFF)，也叫作“交叉流过滤”，也使用超滤膜。将含有目标多肽的流体沿着膜表面切向地泵入。压力引起一部分流体通过膜，而目标多肽在滤器上方截留。然而，与标准的超滤相反，截留的分子不在膜表面累积，而是由切向流运载。不通过滤器的溶液(含有目标多肽)可以重复地循环通过膜，以获得需要的浓缩程度。TFF的设备及其应用的详细方法，例如，可从Millipore(例如，ProFlux M12^TM Benchtop TFF系统和Pellicon^TM系统)，Pall Life Sciences(例如，Minim^TM切向流过滤系统)获得。

蛋白浓度通过本领域公知的许多方法测定。这些方法包括，例如，氨基酸分析、280nm处的吸收、“Bradford”和“Lowry”方法和SDS-PAGE。最准确的方法是完全水解后通过HPLC进行氨基酸分析，然后与单一免疫球蛋白可变结构域多肽的已知序列比较而确定浓度。尽管这种方法是最准确的，但是它花费大并且费时。通过测定280nm处的UV吸收进行蛋白确定更快并且花费少得多，却相对准确，并且优选地作为氨基酸分析的折衷办法。在280nm处的吸收用来确定在本文所述的实施例中报道的蛋白浓度。

“Bradford”和“Lowry”蛋白检测(Bradford，1976，Anal.Biochem.72：248-254；Lowry等.，1951，J.Biol.Chem.193：265-275)将样品蛋白浓度与最经常基于牛血清白蛋白(BSA)的标准曲线进行比较。这些方法不够准确，倾向于低估单一免疫球蛋白可变结构域的浓度。然而，它们的准确性可以通过使用V_H或V_κ单一结构域多肽作为标准物而提高。

另一种蛋白检测方法是二辛可宁酸检测，其在美国专利No.4,839,295(通过参考结合于此)中描述，并且由Pierce Biotechnology(Rockford，IL)作为“BCA蛋白检测”(例如，Pierce目录号23227)而市场化。

SDS-PAGE方法使用凝胶电泳和考马斯亮蓝染色，与已知浓度的标准物如已知量的单一免疫球蛋白可变结构域多肽进行比较。定量可以通过眼睛或者通过密度计量而进行。

本文所述的单一人免疫球蛋白可变结构域抗原-结合多肽保持高浓度的溶解性(例如，在水性溶液(例如，PBS)至少4.8mg(～400μM)，并且优选地至少5mg/ml(～417μM)，10mg/ml(～833μM)，20mg/ml(～1.7mM)，25mg/ml(～2.1mM)，30mg/ml(～2.5mM)，35mg/ml(～2.9mM)，40mg/ml(～3.3mM)，45mg/ml(～3.75mM)，50mg/ml(～4.2mM)，55mg/ml(～4.6mM)，60mg/ml(～5.0mM)，65mg/ml(～5.4mM)，70mg/ml(～5.8mM)，75mg/ml(～6.3mM)，100mg/ml(～8.33mM)，150mg/ml(～12.5mM)，200mg/ml(～16.7mM)，240mg/ml(～20mM)或更高)。促进高溶解性的一个结构特征是单一免疫球蛋白可变结构域多肽的相对较小的大小。一种全长常规的四链抗体，例如IgG，大小大约为150kD。相反，单一免疫球蛋白可变结构域，其全部具有包括4个构架(FW)区和3个CDRs的一般结构，具有12kD左右的大小，或者小于常规抗体大小的1/10。相似地，单一免疫球蛋白可变结构域为scFv分子(～26kD)大小的1/2左右，并且为Fab分子(～60kD)大小的1/5左右。优选地，本文公开的包含单一免疫球蛋白可变结构域的结构的大小是100kD或更小，包括，例如，大约90kD或更小、80kD或更小、70kD或更小、60kD或更小、50kD或更小、40kD或更小、30kD或更小、20kD或更小、减小到并且包括大约12kD的结构，或者分离的单一免疫球蛋白可变结构域。

多肽的溶解性主要通过氨基酸侧链与周围溶剂的相互作用而确定。疏水侧链倾向于位于内部，作为多肽折叠物，远离多肽的溶剂-相互作用表面。相反，亲水残基倾向于位于多肽的溶剂-相互作用表面。一般地，具有允许分子折叠而将更多的亲水残基暴露于水性环境的一级结构的多肽，比折叠而将更少的亲水残基暴露于表面的多肽更加可溶。因此，疏水和亲水残基的排列和数目是溶解性的重要决定因素。确定多肽溶解性的其它参量包括溶剂pH、温度、和离子强度。在常见应用中，可以通过向溶液中加入甘油(例如，～10％v/v)而维持或增强多肽的溶解性。

如上文所讨论的那样，已经在人V_H结构域的保守残基中鉴定了特异性的氨基酸残基，所述人V_H结构域与camelid物种的V_H结构域不同，camelid物种的V_H结构域通常比人V_H结构域更加可溶。这些残基包括，例如，Gly 44(在骆驼中为Glu)、Leu 45(在骆驼中为Arg)和Trp 47(在骆驼中为Gly)。V_H的第103个氨基酸残基也与溶解性有关，从Trp到Arg的突变倾向于赋予增加的V_H溶解性。

在本发明的优选方面，单一免疫球蛋白可变结构域多肽基于DP47生殖细胞V_H基因片段或DPK9生殖细胞V_κ基因片段。因此，特别当在本文所述的选择的结构位置多样化时，这些生殖细胞基因片段能够产生高度可溶的特异性的结合单一免疫球蛋白可变结构域多肽。特别地，优选不是多样化的4种构架区域，可以引起得到的蛋白的高溶解性。

预计与具有已知的高溶解性的单一人免疫球蛋白可变结构域高度同源的单一人免疫球蛋白可变结构域也应该倾向于是高度可溶。因此，作为预测或者识别给定的单一免疫球蛋白可变结构域将具有本文所述的高溶解性的一种方法，人们可以比较单一免疫球蛋白可变结构域多肽的序列与一种或多种具有已知溶解性的单一免疫球蛋白可变结构域多肽。因此，当鉴定单一免疫球蛋白可变结构域多肽具有高结合亲和力但是具有未知的溶解度时，将其氨基酸序列与已知具有高溶解性的一种或多种(优选多种)人单一免疫球蛋白可变结构域多肽(例如，本文公开的dAb序列)比较可以允许预测它的溶解性。尽管这不是一种绝对的预测，但是，在与已知高度可溶的序列存在高度相似性，例如90-95％或更高的相似性的情形中，并且特别是在关于亲水性氨基酸残基或者可能暴露在溶剂表面的残基存在高度的相似性的情形中，更可能地，最近鉴定的结合多肽应该具有与已知高度可溶序列的多肽相似的溶解性。

还可以应用分子建模软件相对于已知溶解性的多肽的溶解性而预测多肽序列的可溶性。例如，相对于更少的疏水性或者甚至是亲水性残基暴露于所述位置的已知溶解性的分子，预测在溶剂暴露面取代或加入疏水残基降低了所述多肽的相对溶解性。类似地，预测在这样的位置取代或加入更加亲水性的残基增加相对溶解性。即，相对于具有已知溶解性的单一免疫球蛋白可变结构域多肽结构，位于分子表面的亲水或疏水残基的净数目的变化(或者表面暴露残基的总体疏水或亲水性质)可以预测单一免疫球蛋白可变结构域多肽的相对溶解性。

备选地，或者与这样的预测结合，人们可以通过简单地浓缩所述多肽而确定单一免疫球蛋白可变结构域多肽溶解性的界限。

亲和力确定：

本文所述的分离的包含单一免疫球蛋白可变结构域和抗体多肽的多肽，优选地具有至少500nM或更小的亲和力(解离常数，K_d，＝K_off/K_on)，并且优选地至少400nM-50pM，300nM-50pM，200nM-50pM，并且更优选地至少100nM-50pM，75nM-50pM，50nM-50pM，25nM-50pM，10nM-50pM，5nM-50pM，1nM-50pM，950pM-50pM，900pM-50pM，850pM-50pM，800pM-50pM，750pM-50pM，700pM-50pM，650pM-50pM，600pM-50pM，550pM-50pM，500pM-50pM，450pM-50pM，400pM-50pM，350pM-50pM，300pM-50pM，250pM-50pM，200pM-50pM，150pM-50pM，100pM-50pM，90pM-50pM，80pM-50pM，70pM-50pM，60pM-50pM，或者甚至低至50pM。

抗体多肽如单一免疫球蛋白可变结构域多肽或其它单价抗体多肽的抗原-结合亲和力，可以使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor，Piscataway，N.J.)通过SPR便利地测定。在这种方法中，将抗原以已知浓度偶联到BIAcore芯片上，并且引入可变结构域多肽。可变结构域多肽和固定的抗原之间的特异结合在芯片基质上导致增加的蛋白浓度和SPR信号的改变。SPR信号的改变作为共振单位(RU)记录，并且关于沿着sensorgram Y轴的时间而展示。只用溶剂(例如，PBS)通过所述芯片而获得基线信号。基线信号和在完成抗体多肽注射后的信号之间的净差异代表给定样品的结合值。为了确定off速率(K_off)，on速率(K_on)和解离速率(K_d)常数，应用BIAcore动力学评估软件(例如，版本2.1)。

因此，SPR可以用来监测单价抗-CD40L抗体制备物对CD40L与CD40结合的拮抗作用，其通过测定由所述单价抗体制备物引起的CD40L与CD40结合的置换或抑制而进行监测。SPR还可以用来监测二聚体化，或者优选地，二聚体化的缺乏，其通过本文所述的抗体制备物的Fc区域发生。

高亲和力取决于抗原表面和抗体或抗体片段的CDRs之间的互补性。互补性由可能在靶点片段和CDR之间的分子相互作用的类型和强度决定，例如，潜在的离子相互作用，范德瓦尔斯引力，氢键或者其它可能发生的相互作用。CDR3倾向于比CDRs 1和2引起更多的抗原结合相互作用，这可能是由于它通常更大的大小，这为有利的表面相互作用提供了更多的机会。(参见，例如，Padlan等.，1994，Mol.Immunol.31：169-217；Chothia和Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：904-917；和Chothia等.，1985，J.Mol.Biol.186：651-663.)高亲和力表明具有高度互补性的抗体多肽/抗原配对，其与可变结构域和靶点的结构域直接相关。

一方面，将单价抗-CD40L抗体多肽如单一免疫球蛋白可变结构域多肽连接到另一抗体多肽上，以形成异源二聚体，其中每一单个抗体多肽能够结合不同的同源抗原。作为异源二聚体的融合抗体多肽，诸如单一免疫球蛋白可变结构域，其中每一单体结合不同的靶点抗原，可以产生双特异性配体，例如，能够桥接各自的靶点抗原的双特异性配体。这样的双特异性配体可以用来靶向在生物体的治疗位置协同合作的细胞因子和其它分子。因此，提供一种增效两种或多种细胞因子活性的方法，其包括施用能够与所述两种或多种细胞因子结合的双特异性抗体异源二聚体。

抗-CD40L双特异性抗体多肽的第二靶点的非限制性实例包括下列：TNF-α；IL-1；IL-2；IL-4；IL-6；IL-8；IL-12；IL-18；IFN-γ；CD2；CD4；CD8；CTLA4；LFA1；LFA3，VLA4，CD80，B7-1，CD28，CD86，B7-2和CTLA-4。特别地，按照本发明应用的第二靶点包括CD80，B7-1，CD28，CD86，B7-2和CTLA-4。认为这些靶点参与对T细胞激活关键的共同刺激途径(叫作，共刺激信号途径抗原)。这一途径包括T细胞表面上的分子CD28的激活。这种分子可以接受由B细胞或其它APCs上的配体递送的共刺激信号。CD28的配体包括B淋巴细胞活化抗原的B7家族的成员，诸如B7-1和/或B7-2(Freedman，A.S.等.(1987)J.Immunol.137，3260-3267；Freeman，G.J.等.(1989)J.Immunol.143，2714-2722；Freeman，G.J.等.(1991)J.Exp.Med.174，625-631；Freeman，G.J.等.(1993)Science 262，909-911；Azuma，M.等.(1993)Nature 366，76-79；Freeman，G.J.等.(1993)J.Exp.Med.178，2185-2192)。B7-1和B7-2还是存在于活化的T细胞表面的另一种分子CTLA4的配体。因此，本发明考虑到CD28信号传导途径的成员可以是对于双特异性形式的抗-CD40L抗体多肽有用的第二靶点。

同源序列：

本发明包括抗-CD40L抗体多肽，例如，结合CD40L的单一免疫球蛋白可变结构域克隆，和具有与它们相似或同源的基本序列的克隆，其也以高亲和力与靶点抗原结合。当用于本文时，“基本”序列相似或同源是指至少85％的相似性或同源性。

两种序列之间“同源性”或“序列同一性”(这两种术语在本文等同和可相互交换使用)的计算进行如下。出于最佳比较目的，将序列进行比对(例如，为了最佳比对，可以向第一和第二氨基酸或核酸序列之一或两者中引入缺口，并且出于比较目的，可以忽略非同源序列)。在一个优选实施方案中，用于比较目的比对的参考序列长度为所述参考序列长度的至少30％，优选地至少40％，更优选地至少50％，甚至更优选地至少60％，并且甚至更优选地至少70％，80％，90％，100％。然后比较在对应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当在第一序列的位置被与第二序列对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在这一位置是相同的(当用于本文时，氨基酸或核酸“同源性”等价于氨基酸或核酸“同一性”)。考虑到对于两种序列的最佳比对需要引入的缺口数目以及每个缺口的长度，两种序列之间的相同性百分数是所述序列共享的相同位置数目的函数。

当用于本文时，序列“相似性”是在序列比对中对氨基酸序列在相应位置共享相似的氨基酸残基的程度的测定。氨基酸彼此相似，其中它们的侧链也是相似的。具体地，“相似性”包括对于彼此是保守取代的氨基酸。“保守”取代是在blosum62 substitution matrix中具有正得分的任何取代(Hentikoff和Hentikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919)。陈述“序列A与序列B是n％相似的”意指序列A和B之间最优综合比对的n％的位置由相同的氨基酸或保守取代组成。在Needleman-Wunsch比对运算法则中，最优综合比对可以使用下述参量进行：

对于多肽：

取代矩阵：blosum62。

对于核苷酸序列：

取代矩阵：匹配为10，不匹配为0。

典型的保守取代在Met、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；残基Asp、Glu和Asn之间；残基Gln、Lys和Arg之间；或芳香残基Phe和Tyr之间。在计算两种多肽序列的相似性程度(最经常作为百分数)时，人们可以考虑在两种多肽序列中相应氨基酸残基之间观察到的同一性或相似性的位置数目与进行比较的两种分子的全长的关系。

备选地，应用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)运算法则进行序列比对，使用设定为默认值的参数。BLAST运算法则“BLAST 2序列”可从美国政府(“.gov”)全国卫生研究所(“nih”)的国家医学图书馆(“.nlm”)国家生物技术信息中心(“.ncbi”)的万维网(“www”)获得(www.ncbi.nlm.nih.gov)，在“/blast/”目录，“bl2seq/bl2.html”亚目录下。这种运算法则比对用于比较的两种序列，并且由Tatusova和Madden，1999，FEMS Microbiol Lett.174：247-250描述。

同源性或相似性的另一种测定是在高度严紧杂交条件下杂交的能力。因此，如果在高度严紧杂交条件下(诸如由Sambrook等.，MolecularCloning，Laboratory Manuel，Cold Spring，Harbor Laboratory press，NewYork描述的那些条件)，第一序列与第二序列(或其补体)杂交，那么编码单一免疫球蛋白可变结构域多肽的第一序列基本上与第二编码序列相似。“高度严紧的杂交条件”是指在6×SSC在45℃左右杂交，之后在65℃在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。“非常高度严紧的杂交条件”是指在65℃在0.5M磷酸钠，7％SDS中杂交，之后在65℃在0.2×SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。

CD40L活性检测：

优选地，本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽与CD40L结合，但是基本上不激动(agonize)CD40信号传导。CD40L/CD40途径的激活出现可以测定的许多不同结果，以便评估给出的单价抗-CD40L抗体多肽在所述途径活性上的作用。然而，对于本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽的拮抗性或激动性功能的评估，可以应用至少一种下述CD40L检测：

1.活化Jun-N-末端激酶(JNK)：

T淋巴细胞通过CD40L的刺激包括JUK的强激活。单价抗-CD40L抗体多肽激活这一信号传导途径的能力测定如下。按照Brenner等.，1997，FEBS Lett.417：301-306描述的那样(其通过参考结合于此)，将人白血病Jurkat细胞用阳性对照激动性抗-CD40L抗体(2μg/ml单克隆抗人或抗小鼠gp39/CD40L抗体(Pharmingen，San Diego，CA，USA)或与仓鼠或小鼠免疫球蛋白匹配的同种型(Dianova，Hamburg，Germany))、单价抗-CD40L抗体多肽或阴性对照不相关的抗体刺激。将所述细胞裂解，并且提取液通过比色测定(例如，Titerzyme^TM比色(EIA)磷代-JNK1/2免疫检测试剂盒，AssayDesigns Inc.，目录号#900-106)而检测磷酸化的JNK。相对于未刺激的细胞，抗-CD40L-刺激的细胞磷代-JNK的增加(例如，增加5％或更多)表明所述抗体多肽对CD40L活性的激动作用。

2.诱导细胞因子分泌：

已经证明，用抗-CD3Ab和CD40L共同刺激T细胞上调这些细胞IL-10、IFN-γ和TNF-α的生产。单价抗-CD40L抗体多肽激活这一信号传导途径的能力测定如下。将人白血病Jurkat T细胞(或新分离的CD4+T细胞)接种到含有固定的抗-CD3抗体的96孔平板中。然后，按照由Blair等.，2000，J.Exp.Med.191：651-660所描述的那样，在阳性对照激动性抗-CD40L抗体、CD40L、单价抗-CD40L抗体多肽或阴性对照不相关的抗体存在下，将所述细胞培养72小时。然后，使用IFN-g标准物产生标准曲线，所有其它未知的都可以从所述标准曲线计算，通过三明治ELISA，量化上清中的IFN-γ(或TNF-α的IL-10)。相对于未刺激的细胞，抗-CD40L-刺激的细胞IFN-g的增加(例如，增加5％或更多)表明所述抗体多肽的激动作用。

3.血小板聚集检测：

二价抗-CD40L抗体倾向于引起血小板聚集，其可能与现有技术中在二价抗-CD40L抗体临床试验中观察到的血栓栓塞事件相关。本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽优选地基本上不调控或者激动CD40L-介导的血小板聚集。关于这一方面，“标准血小板聚集检测”如下：

在2.5×10⁵/ml制备血小板，并且在500-Ca lumi-aggregometer(或其等价物，例如，血小板聚集靠模工具(BioData，Horsham，PA))中振荡。通过加入0.1-10μM ADP的连续稀释物(10μM ADP诱导聚集，并且用作阳性对照——更低的浓度活化血小板但是不诱导聚集)，将血小板部分活化。通过加入抗-CD40L单克隆抗体(即，二价单克隆抗体，例如，可从Pharmingen，San Diego，CA，USA获得)或可溶的CD40/Fc融合蛋白(可从R&D Systems获得)，而刺激CD40L介导的血小板聚集。允许反应进行3到5分钟。将超出只用ADP获得的最小(mininimal)聚集/活化的血小板聚集的刺激针对刺激性抗-CD40L或CD40/Fc浓度作图。血小板聚集的百分数通过加入要检测的抗体多肽或阳性对照肽之后透光率的变化而测定。将大于对于缺少抗体的阴性对照观察到的值并且相当于阳性对照(二价抗-CD40L或CD40/Fc融合体)值的25％或更多的值视作是诱导血小板聚集的指示。

评估血小板聚集和/或活化(包括在聚集之前的事件，或者是血小板聚集的下游事件)的其它方法，包括确定血小板活化的各种指示因子的检测，并且在本领域内是公知的。例如，可以通过检测血小板中CD62P的表达(例如，使用抗-CD26P抗体和流式细胞术)，检测单细胞-血小板-缀合物的形成，检测在高剪切力条件下的血小板终止时间(platelet closuretime)(如使用PFA-100，Dade Behring，Newark，DE)，以及检测血小板致密颗粒的释放，而确定血小板活化(并且，因此，CD40/CD40L活性)。实行这样的检测的方法在本领域内是已知的，并且，例如，可以从Langer等.，2005 Thromb.Haemost.93：1137-46中找到。

单价抗-CD40L抗体多肽的PEG化

本发明提供PEG化的单价抗-CD40L抗体多肽，其具有增加的半衰期，并且优选地相对于非PEG化的抗体多肽，其还抗降解而不失去活性(例如，结合亲和力)。

使用本领域已知的方法，可以将按照本方面的单价抗-CD40L抗体多肽偶联到聚合物分子(优选PEG)上，用于获得本发明包括的增加的半衰期和抗降解性特性。可以用于本发明的聚合物部分可以是合成的或天然存在的，并且包括，但不限于直链或有支链的聚亚烷基、聚亚链烯基或聚氧化烯聚合物，或者支链或无支链的多糖，诸如同多糖或杂多糖。可以用于本发明的合成聚合物的优选实例包括直链或支链聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)以及它们的衍生物或取代形式。用于本发明的特别优选的取代聚合物包括取代的PEG，其包括甲氧基(聚乙二醇)。除了或者代替PEG，按照本发明可以应用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖或肝糖原、及其可以由本领域技术人员识别的衍生物。本发明的聚合物分子的衍生形式包括，例如，这样的衍生物，即，其具有其它部分或者其中存在允许与本文所述的dAb多肽的氨基酸残基相互作用的活性基团。这样的衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯聚合物、和巯基-选择性活性剂诸如顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜和硫醇。特别优选的衍生聚合物包括，但不限于具有下式的PEG聚合物：PEG-O-CH₂CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-O-CH₂-NHS；PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS；PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS；PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS；PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS；和PEG-O-CH₂-CO₂-NHS；其中R是(CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)。用于本发明的PEG聚合物可以是线性分子，或者可以是有分枝的，其中多个PEG部分存在于单个聚合物中。用于本发明的一些特别优选地的PEG衍生物包括，但不限于下述：

活性基团(例如，MAL，NHS，SPA，VS，或硫醇)可以直接附着到PEG聚合物上，或者可以通过接头分子附着到PEG上。

用于本发明的聚合物的大小可以在500kDa-60kDa范围内，例如，在1000Da-60kDa之间，10kDa-60kDa，20kDa-60kDa，30kDa-60kDa，40kDa-60kDa，并且达到50kDa-60kDa。用于本发明的聚合物，特别是PEG，可以是直链聚合物，或者可以具有支链构象。取决于分子量和构象的组合，当附着到单价抗-CD40L抗体多肽上时，用于本发明的聚合物分子将产生具有24-500kDa平均流体动力学大小的分子。本文所用聚合物分子的流体动力学大小是指基于所述分子通过水性溶液扩散的分子(例如，蛋白分子)表观大小。可以处理蛋白通过溶液的扩散或运动，以得出蛋白的表观大小，其中所述大小由蛋白微粒的Stokes半径或流体力学半径给出。蛋白的“流体力学大小”取决于质量和形状(构象)，以致基于蛋白的总体构象，具有相同分子质量的两种蛋白可以具有不同的流体力学大小。PEG-连接的单价抗-CD40L抗体多肽如本文所述的抗-CD40L单一免疫球蛋白可变结构域的流体力学大小，可以在24kDa-500kDa；30-500kDa；40-500kDa；50-500kDa；100-500kDa；150-500kDa；200-500kDa；250-500kDa；300-500kDa；350-500kDa；400-500kDa和450-500kDa范围内。优选地，本文所述PEG化抗体多肽的流体动力学大小是30-40kDa；70-80kDa或200-300kDa。因此，附着到单价抗-CD40L抗体多肽上的聚合物分子的大小可以取决于需要的应用而不同。例如，在PEG化抗体多肽意欲留在循环中并且进入外周组织的情形中，有必要保持附着的聚合物大小低至促进从血流外渗。备选地，在有必要使得PEG化的抗体多肽保留在循环中持续更长的时间的情形中，可以使用更高分子量的聚合物(例如，30-60kDa的聚合物)。

应用本领域公知的方法，可以将用于本发明的聚合物(PEG)分子附着到抗体多肽上。将PEG或其它聚合物部分附着到抗体多肽上的第一步是用含有亲电子物质的官能团取代PEG聚合物的羟基末端基团。具体地，将PEG聚合物附着到抗体多肽中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基上。半胱氨酸和赖氨酸残基可以是天然存在的，或者可以是加工到抗体多肽分子中的。例如，半胱氨酸残基可以是在抗体多肽C端重组加工的，或者在抗体多肽中具体的溶剂可及位置的残基可以用半胱氨酸或赖氨酸取代。在一个优选的实施方案中，将PEG部分附着到存在于抗体多肽C端铰链区的半胱氨酸残基上。

在另一个优选的实施方案中，将PEG部分或其它聚合物附着到半胱氨酸或赖氨酸残基上，所述半胱氨酸或赖氨酸残基是天然存在于或者加工到本发明的抗体单一可变结构域多肽的N端的。在另一个实施方案中，将PEG部分或其它聚合物在半胱氨酸或赖氨酸残基(天然存在的或者是加工的)附着到按照本发明的抗体单一可变结构域上，所述半胱氨酸或赖氨酸残基距离(例如，在内部)所述抗体单一可变结构域多肽的C和/或N端至少2个残基。

在一个实施方案中，将PEG聚合物附着到在单一免疫球蛋白可变结构域的构架区域(FWs)和一个或多个异源CDRs中存在的一个或多个半胱氨酸或赖氨酸残基上。CDRs和构架区域(例如，CDR1-CDR3和FW1-FW4)是在目的免疫学蛋白序列Kabat数据库中(Kabat等.，1991，如前所述)定义的免疫球蛋白可变结构域的那些区域。在一个优选实施方案中，将PEG聚合物连接到V_H构架片段DP47、或V_k构架片段DPK9中的半胱氨酸或赖氨酸残基上。按照本发明可以连接到PEG上的DP47的半胱氨酸和/或赖氨酸残基包括在SEQ ID NO：1位置22或96的半胱氨酸，和在位置43，65，76或98的赖氨酸(图5)。按照本发明可以连接到PEG上的DPK9的半胱氨酸和/或赖氨酸残基包括在SEQ ID NO：3位置23或88的半胱氨酸残基，和在位置39，42，45，103或107的赖氨酸残基(图6)。另外，在V_H规范构架区域DP38或DP45中，特异的半胱氨酸或赖氨酸残基可以连接到PEG上。

另外，抗体分子中不是天然存在的半胱氨酸或赖氨酸残基的特异的溶剂可及位点可以突变成半胱氨酸或赖氨酸，以便PEG聚合物的附着。使用本领域已知的方法，诸如抗体多肽的晶体结构分析，可以确定在任何给出的抗体如dAb中的溶剂可及残基。例如，使用V_H dAb HEL4(SEQ ID NO：3；结合母鸡卵溶菌酶的dAb)的解析晶体结构，已经鉴定了残基Gln-13，Pro-14，Gly-15，Pro-41，Gly-42，Lys-43，Asp-62，Lys-65，Arg-87，Ala-88，Glu-89，Gln-112，Leu-115，Thr-117，Ser-119和Ser-120是溶剂可及的，并且按照本发明其是突变成用于PEG聚合物附着的半胱氨酸或赖氨酸残基的有吸引力的候选残基。另外，使用V_k模拟dAb(SEQ ID NO：4)的解析晶体结构，已经鉴定了残基Val-15，Pro-40，Gly-41，Ser-56，Gly-57，Ser-60，Pro-80，Glu-81，Gln-100，Lys-107和Arg-108是溶剂可及的，并且按照本发明其是突变成用于PEG聚合物附着的半胱氨酸或赖氨酸残基的有吸引力的候选残基。在本发明的一个实施方案中，将PEG聚合物连接到多个溶剂可及的半胱氨酸或赖氨酸残基上，或者连接到已经突变成半胱氨酸或赖氨酸残基的溶剂可及的残基上。备选地，只有一个溶剂可及残基连接到PEG上，其中具体的抗体多肽只具有一个溶剂可及的半胱氨酸或赖氨酸(或者修饰成半胱氨酸或赖氨酸的残基)，或者其中从一些用于PEG化的这样的残基中选择具体的溶剂可及残基。

HEL4的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：5)

V_k模拟物的一级氨基酸序列(SEQ ID NO：6)

用于本发明的一些PEG附着方案由Nektar公司(SanCarlos，CA)提供。例如，在需要将PEG或其它聚合物附着到赖氨酸残基上的情形中，可以使用与N-羟基琥珀酰亚胺衍生而来的PEG聚合物的活性酯，诸如琥珀酰亚胺基丙酸酯。在需要附着到半胱氨酸残基上的情形中，可以使用与巯基-选择性活性剂诸如顺丁烯二酰亚胺、乙烯砜或硫醇衍生而来的PEG聚合物。按照本发明可以用来产生PEG化抗体的PEG衍生物具体实施方案的其它实例可以在Nektar目录(可从万维网nektar.com上获得)中找到。另外，按照本发明可以使用PEG的一些衍生形式，以促进PEG聚合物与抗体多肽的附着。用于本发明的PEG衍生物包括，但不限于，PEG-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、氨基甲酸乙酯连接的PEG、PEG O-苯基碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯、PEG-羧甲基叠氮化合物、二甲基马来酸酐PEG、PEG二硫代碳酸酯衍生物、PEG-tresylates(2，2，2-trifluoroethanesolfonates)、mPEG亚氨酸酯、以及在Zalipsky和Lee，(1992)(“Use of functionalizedpoly(ethylene glycol)s for modification of peptides”in Poly(Ethylene Glycol) Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Press，NY)中所述的其它PEG衍生物。

在一个实施方案中，本发明提供一种抗-CD40L抗体单一可变结构域组合物，其包括抗体单一可变结构域和PEG聚合物，其中PEG聚合物与抗体单一可变结构域的比例为至少0.25∶1的摩尔比。在另一个实施方案中，PEG聚合物与抗体单一可变结构域的摩尔比例是0.33∶1或更大。在另一个实施方案中，PEG聚合物与抗体单一可变结构域的摩尔比例为0.5∶1或更大。

双特异性配体

本发明还提供双特异性配体，其包括每种具有不同特异性的免疫球蛋白单一可变结构域；即，由双特异性配体结合的第一和第二表位优选是不同的。当用于本文时，“双特异性配体”是指包括本文定义的第一免疫球蛋白单一可变结构域和第二免疫球蛋白单一可变结构域的配体，其中所述可变区能够结合2个不同抗原或同一抗原上的2个表位，其通常不被单特异性免疫球蛋白结合。例如，2个表位可以在同一半抗原上，但不是相同的表位，或者不是充分接近而被单特异性配体结合。按照本发明的双特异性配体由具有不同特异性的可变结构域组成，并且不包含具有相同特异性的突变的互补可变结构域对。双特异性配体可以是多肽、蛋白或核酸或者它们的片段，它们可以是天然存在的或合成的。在这方面，本发明的配体可以结合表位或抗原，并且作用为拮抗物或激动剂(例如，EPO受体拮抗物)。在一个实施方案中，配体的表位结合结构域具有相同的表位特异性，并且例如，当在同一抗原上存在表位的多个拷贝时，可以同时结合它们的表位。在另一实施方案中，这些表位在不同抗原上提供，以便所述配体可以结合所述表位并且桥接所述抗原。本领域的技术人员应该理解，表位和抗原的选择是广泛而多变的。例如，它们可以是人或动物蛋白、细胞因子、细胞因子受体、酶的酶辅因子或DNA结合蛋白。适宜的细胞因子和生长因子包括但不限于：ApoE，Apo-SAA，BDNF，心肌营养蛋白-1，EGF，EGF受体，ENA-78，Eotaxin，Eotaxin-2，Exodus-2，EpoR，酸性FGF，碱性FGF，成纤维细胞生长因子-10，FLT3配体，CXXXC趋化因子(CX3C)，GDNF，G-CSF，GM-CSF，GF-β1，胰岛素，IFN-γ，IGF-I，IGF-II，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8(72a.a.)，IL-8(77a.a.)，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18(IGIF)，抑制素α，抑制素β，IP-10，角质形成细胞生长因子-2(KGF-2)，KGF，瘦蛋白，LIF，Lymphotactin，Mullerian抑制物质，单核细胞集落抑制因子，单核细胞引诱剂蛋白，M-CSF，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MCP-1(MCAF)，MCP-2，MCP-3，MCP-4，MDC(67a.a.)，MDC(69a.a.)，MI G，MIP-1α，MIP-1β，MIP-3α，MIP-3β，MIP-4，髓细胞起源抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitorfactor-1)(MPIF-1)，NAP-2，Neurturin，神经生长因子，β-NGF，NT-3，NT-4，制癌蛋白M，PDGF-AA，PDGF-AB，PDGF-BB，PF-4，RANTES，SDF1α，SDF1β，SCF，SCGF，干细胞因子(SCF)，TARC，TGF-α，TGF-β，TGF-β2，TGF-β3，肿瘤坏死因子(TNF)，TNF-α，TNF-β，TNF受体I，TNF受体II，TNIL-1，TPO，VEGF，VEGF受体1，VEGF受体2，VEGF受体3，GCP-2，GRO/MGSA，GRO-β，GRO-γ，HCC1，1-309，HER 1，HER 2，HER 3，HER 4，TACE识别位点，TNF BP-I和TNF BP-II，以及在本文的附件2或附件3中公开的任何靶点，不管在附件中是以组合、不同的组合或单独提出。细胞因子受体包括前述细胞因子的受体，例如，IL-1 R1；IL-6R；IL-10R；IL-18R，以及在附件2或附件3中提出的细胞因子受体，还有在附件2和3中公开的受体。应该理解，这一列举并不是无遗漏的，当多特异性配体与两个表位(在同一个或不同抗原上)结合时，抗原可以从这一列举中选择。

在本发明第二构型的一个实施方案中，可变结构域来源于针对第一和/或第二抗原或表位的抗体。在一个优选实施方案中，可变结构域来源于单一可变抗体结构域的全体成分。在一个实例中，所述全体成分是并非在动物产生的全体成分或合成的全体成分。在另一个实例中，单一可变结构域不是通过动物免疫分离的(至少部分)。因此，单一结构域可以从首次用于实验的文库中分离。

在另一方面，本发明提供多特异性配体，其包括具有第一表位结合特异性的第一表位结合结构域，和具有第二表位结合特异性的非互补性第二表位结合结构域。所述第一和第二结合特异性可以是相同的或不同的。

在另一方面，本发明提供封闭构象的多特异性配体，其包括具有第一表位结合特异性的第一表位结合结构域，和具有第二表位结合特异性的非互补性第二表位结合结构域，其中第一和第二结合特异性能够竞争表位结合，以致所述封闭构象的多特异性配体不能同时结合两个表位。

在另一方面，本发明提供开放构象的配体，其包括非互补性结合结构域，其中所述结构域对于同一靶点上的不同表位是特异的。这样的配体以增加的亲和力与靶点结合。相似地，本发明提供包括非互补性结合结构域的多价配体，其对相同表位特异，并且针对包括所述表位的多个拷贝的靶点。

在一个类似的方面，按照本发明的配体可以设置成以低亲和力结合单个表位，以致与单个表位的结合没有治疗意义；但是由于与两个表位结合引起的增加的亲和力提供了治疗益处。在一个具体的实例中，可以靶向这样的表位，即，其单独在正常细胞类型上存在，但是只在异常的或患病的细胞诸如肿瘤细胞上一起存在。在这样的情形中，只有异常的或患病的细胞有效地被按照本发明的双特异性配体靶向。

对在同一靶点(叫作螯合dAbs)上的相同表位的多个拷贝或邻近的表位特异的配体，还可以是三聚体或多聚体(四聚体或更多聚体)配体，其包括3个、4个或更多个非互补性结合结构域。例如，可以构建包括3个或4个V_H结构域或V_L结构域的配体。

此外，本发明提供与多个亚单位靶点结合的配体，其中每个结合结构域对于所述靶点的亚单位是特异的。所述配体可以是二聚体、三聚体或多聚体。

本发明还包括双特异性配体，其包括具有针对第一抗原的结合特异性的第一免疫球蛋白单一可变结构域，和具有与第二抗原结合活性的第二单一可变结构域，其中所述第一抗原是CD40L，和所述第二单一可变结构域是抗原呈递细胞表面抗原或T细胞表面抗原。所述抗原呈递细胞(APC)表面抗原可以选自由下列各项组成的组之一：树突细胞表面抗原、活化的巨噬细胞表面抗原、活化的B细胞表面抗原、共刺激性信号途径表面抗原和MHC诸如MHC IIα或β。

(APC)表面抗原可以选自由下列各项组成的组：CD28、可诱导的共刺激性分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69、CD3、CD70、可诱导的共刺激性分子配体(ICOSL)、OX40L、CD80、CD86、HVEM(疱疹病毒侵入调控子，Herpes Virus Entry Mediator)和LIGHT，但是优选为CD28、可诱导的共刺激性分子(ICOS)、CD27、CD30、OX40、CD45、CD69或CD3中的一种。

表面抗原优选地是B7基因表面抗原，诸如B7-2或B7-1。

树突细胞表面抗原是本领域已知的，并且可以包括但不限于ICAM-1，ICAM-2，LFA-1，LFA-3，DEC205，I类MHC，II类MHC，B7-1和B7-2。活化的巨噬细胞表面抗原包括但不限于，TNF受体、CD40、I和II类MHC以及B7分子。活化的B细胞表面抗原是本领域已知的(例如，包括但不限于CD20和CD86)，并且在上文进一步描述(参见，例如，Janeway等.，1999，Immunobiology，Garland Publishing NY，NY)。

优选地，按照本发明上述方面的多特异性配体通过包括下列步骤的方法而获得：

a)通过其与第一表位结合的能力而选择第一表位结合结构域，

b)通过其与第二表位结合的能力而选择第二表位结合结构域，

c)结合所述表位结合结构域；和

d)通过其与所述第一表位和所述第二表位的结合能力而选择封闭构象的多特异性配体。

有利地，如本文所定义的那样，所述第一表位结合结构域和第二表位结合结构域是非互补性免疫球蛋白可变结构域。其为V_H-V_H或V_L-V_L可变结构域。

特别地，螯合dAbs可以按照本发明的一个优选的方面而制备，即锚定dAbs的应用，其中使用包括恒定的dAb上游或接头序列下游的载体，将全部第二、第三和更多的dAbs插入到所述接头的另一边，而构建二聚体、三聚体或多聚体dAbs文库。在备选方法中，可以避免使用接头，例如，通过应用结合结构域诸如V_H和V_κ之间的非共价键合或天然亲和力。因此，本发明提供用于制备多聚体配体的方法，其包括下列步骤：

(a)提供一种载体，其包括编码对靶点上第一表位特异的单一结合结构域的核酸序列；

(b)提供一种载体，其编码包括对所述靶点上第二表位特异的第二结合结构域的所有成分，其表位可以与第一表位相同或不同，所述第二表位邻近所述第一表位；和

(c)表达所述第一和第二结合结构域；和

(d)分离第一和第二结合结构域的那些组合，它们组合在一起产生结合靶点的二聚体。

所述第一和第二表位是邻近的，以致多聚体配体能够同时结合两个表位。如果结合，这为所述配体提供了增加了亲和力的益处。当所述表位相同时，通过在靶点上存在表位的多个拷贝而获得增加的亲和力，这允许至少两个拷贝同时结合，以便获得增加的亲和力作用。

在本发明第二构型上述方面的一个备选实施方案中，至少一个表位结合结构域包括本文定义的非免疫球蛋白‘蛋白支架’或‘蛋白骨架’。适宜的非免疫球蛋白蛋白支架包括但不限于选自由下列各项组成的组的那些蛋白支架中的任何一个：SpA，纤连蛋白，GroEL和其它蛋白伴侣，脂笼蛋白，CCTLA4和affibodies，如上文提出的那样。

按照本发明第二构型的上述方面，有利地，将所述表位结合结构域附着到‘蛋白骨架’上。有利地，按照本发明的蛋白骨架是免疫球蛋白骨架。

按照本发明，如本文所定义的那样，术语‘免疫球蛋白骨架’是指这样的蛋白，即，其包括至少一个免疫球蛋白折叠，并且其作用为一个或多个表位结合结构域的核。

本文定义的优选的免疫球蛋白骨架包括选自下列各项的那些中的任一种或多种：一种免疫球蛋白分子，其包括至少(i)抗体的CL(κ或λ亚类)结构域；或(ii)抗体重链的CH1结构域；包括抗体重链CH1和CH2结构域的免疫球蛋白分子；包括抗体重链CH1、CH2和CH3结构域的免疫球蛋白分子；或者亚类(ii)与抗体的CL(κ或λ亚类)结构域结合的任一种。也可以包括铰链区结构域。例如，结构域的这样的组合可以模拟天然抗体，诸如IgG或IgM，或其片段，诸如Fv、scFv、Fab或F(ab’)₂分子。本领域的技术人员应该理解，这一列举并不是无遗漏的。

如本文所定义的那样，将所述骨架与表位结合结构域连接可以在多肽水平上实现，即，在编码所述骨架和/或表位结合结构域的核酸表达之后进行。备选地，连接步骤可以在核酸水平上进行。将按照本发明的蛋白骨架连接到一个或多个表位结合结构域上的方法包括蛋白质化学和/或分子生物学技术的应用，这些是本领域的技术人员熟悉的，并且在本文中得到描述。

有利地，所述双特异性或多特异性配体可以包括能够结合靶点分子的第一结构域，和能够结合延长所述配体的半衰期的分子或基团的第二结构域。例如，所述分子或基团可以是大体积剂(bulky agent)，诸如HSA，或细胞基质蛋白。当用于本文时，短语“延长配体半衰期的分子或基团”是指这样的分子或化学基团，即，当与本文所述的双特异性配体结合时，相对于没有结合所述分子或基团的配体，在施用给动物时，其增加这样的双特异性配体在体内的半衰期。延长配体的半衰期的分子或基团的实例在下文中描述。在一个优选的实施方案中，封闭构象的多特异性配体可以能够只是取代增强半衰期的分子或基团而结合靶点分子。因此，例如，通过大体积分子诸如HSA，封闭构象的多特异性配体维持在受试者的血流循环中。当遇到靶点分子时，封闭构象多特异性配体结合结构域之间的竞争导致HSA的置换和靶点的结合。上文更详细地讨论的增加半衰期的分子。

按照本发明任一方面的配体，以及用于构建这样的配体的dAb单体，可以有利地从它们的同源靶点解离，K_d在300nM-5pM(即，3x10^-7-5x10^-12M)，优选地50nM-20pM，或5nM-200pM或1nM-100pM，1x10^-7M或更小，1x10^-8M或更小，1x10^-9M或更小，1x10^-10M或更小，1x10^-11M或更小；和/或K_off速率常数在5x10^-1-1x10^-7S^-1，优选地1x10^-2-1x10^-6S^-1，或5x10^-3-1x10^-5S^-1，或5x10^-1S^-1或更小，或1x10^-2S^-1或更小，或1x10^-3S^-1或更小，或1x10^-4S^-1或更小，或1x10^-5S^-1或更小，或1x10^-6S^-1或更小，这通过表面细胞质基因组共振确定。K_d速率常数定义为K_off/K_on。

此外，本发明提供dAb单体(或包括这样的dAb的双特异性配体)，其以1nM-500μM(即，x10^-9-5x10^-4)、优选地100nM-10μM的K_d结合血清白蛋白(SA)。优选地，对于包括第一抗-SA dAb和针对另一靶点的第二dAb的双特异性配体，第二dAb对其靶点的亲和力(例如通过表面细胞质基因组共振如使用BiaCore测定的K_d和/或K_off)，是第一dAb对SA的亲和力的1-100000倍(优选地100-100000，更优选地1000-100000，或10000-100000倍)。例如，第一dAb以大约10μM的亲和力结合SA，而第二dAb以100pM的亲和力与其靶点结合。优选地，所述血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。

在一个实施方案中，第一dAb(或dAb单体)以大约50，优选地70，和更优选地100，150或200nM的K_d结合SA(例如，HSA)。

此外，按照本发明的前述方面，本发明提供前述dAb单体的二聚体、三聚体和多聚体。

按照本发明的配体，包括dAb单体、二聚体和三聚体，可以连接到抗体Fc区，其包括C_H2和C_H3结构域之一或两者，和任选的铰链区。例如，编码作为单一核苷酸序列连接到Fc区的配体的载体可以用来制备这样的多肽。备选地，按照本发明的配体可以是没有Fc结构域的。

在另一方面，本发明提供编码本文定义的至少一个双特异性或多特异性配体的一种或多种核酸分子。在一个实施方案中，所述配体是封闭构象的配体。在另一实施方案中，它是开放构象的配体。所述多特异性配体可是在单一核酸分子上编码；备选地，每一表位结合结构域可以由独立的核酸分子编码。在配体由单一核酸分子编码的情形中，结构域可以作为融合多肽表达，或者可以独立地表达并且随后连接在一起，例如，使用化学连接剂。从独立的核酸表达的配体应该通过适当方法连接在一起。

所述核酸还可以编码信号序列，当表达时，用于将多肽从宿主细胞输出，并且当表达时，可以与丝状噬菌体颗粒的表面成分(或选择性展示系统的其它成分)融合。可以用于细菌表达和/或噬菌体或噬菌粒展示的前导序列包括pelB，stII，ompA，phoA，bla和pelA。

在本发明第二构型的另一方面，本发明提供包括按照本发明的核酸的载体。

在另一方面，本发明提供转染了按照本发明的载体的宿主细胞。

从这样的载体的表达可以设置成，例如，在噬菌体颗粒表面上，产生用于选择的表位结合结构域。使用本发明的方法，这允许展示结构域的选择，并且因此允许‘多特异性配体’的选择。

组合单一可变结构域

一旦使用上文示例的方法选定，用于本发明的结构域可以通过本领域已知的各种方法而组合，所述方法包括共价和非共价方法。

优选的方法包括使用多肽接头，如所述那样，例如，与scFv分子结合(Bird等.，(1988)Science 242：423-426)。适宜的接头的讨论在Bird等.Science 242，423-426；Hudson等，Journal Immunol Methods 231(1999)177-189；Hudson等，Proc Nat Acad Sci USA 85，5879-5883中提供。接头优选地是柔性的，允许两个单一结构域相互作用。一个接头实例是(Gly₄ Ser)_n接头，其中n＝1-8，例如，2，3，4，5或7。还可以应用用于双抗体的接头，其较不柔软(Holliger等.，(1993)PNAS(USA)90：6444-6448)。

在一个实施方案中，所用的接头不是免疫球蛋白铰链区。

可变结构域可以使用除接头以外的方法组合。例如，通过天然存在的或加工的半胱氨酸残基而提供的二硫桥键的应用，可以用来稳定V_H-V_H，V_L-V_L或V_H-V_L二聚体(Reiter等.，(1994)Protein Eng.7：697-704)，或者通过改变可变结构域之间的界面以提高“适合性”并且因此提高相互作用的稳定性(Ridgeway等.，(1996)Protein Eng.7：617-621；Zhu等.，(1997)Protein Science 6：781-788)。

适当地，可以应用其它技术，用来结合或稳定免疫球蛋白可变结构域，特别是抗体V_H结构域。

按照本发明，双特异性配体在溶液中可以是“封闭”构象。“封闭”构象是其中两个结构域(例如V_H和V_L)以缔合的形式存在，诸如形成抗体结合位点的缔合的V_H-V_L对形式。例如，scFv可以是封闭构象，这取决于用于连接V_H和V_L结构域的接头的排列。如果这充分柔软足以允许结构域缔合，或者严格地将它们控制在缔合位置，那么所述结构域采用封闭构象是可能的。

类似地，V_H结构域对和V_L结构域对可以存在于封闭构象中。一般地，这将是配体分子中诸如通过刚性接头紧密缔合所述结构域的功能。在封闭构象中，配体不能结合增加所述配体的半衰期的分子和第二靶点分子。因此，当从增加所述配体的半衰期的分子上解离时，所述配体典型地只结合第二靶点分子。

此外，不用接头构建V_H/V_H，V_L/V_L或V_H/V_L二聚体提供所述结构域之间的竞争。

此外，按照本发明的配体可以是开放构象的。在这样的构象中，所述配体能够同时结合增加配体半衰期的分子和第二靶点分子。典型地，开放构型的可变结构域(在V_H-V_L对情形中)保持足够远的距离，以使所述结构域不相互作用，并且形成抗体结合位点，并且不竞争与它们各自表位的结合。在V_H/V_H或V_L/V_L二聚体的情形中，所述结构域没有通过刚性接头连接在一起。自然地，这样的结构域对不竞争抗原结合或者形成抗体结合位点。

尽管应该理解，在不同环境下，开放的和封闭的双特异性配体可能以各种平衡存在，但是Fab片段和完整的抗体主要存在于封闭构象中。配体与靶点的结合可能使得所述平衡的均衡向开放构型转换。因此，在溶液中，按照本发明的某些配体可以存在于两种构象中，其中之一(开放形式)可以独立地结合两个抗原或表位，而备选构象(封闭形式)只可以结合一个抗原或表位；因此，在这种构象中，抗原或表位竞争与所述配体的结合。

尽管在溶液中双特异性配体的开放形式可以这样与封闭形式平衡存在，但是应该考虑到所述平衡倾向于封闭形式；此外，开放形式可以被结合到封闭构象的靶点而隐蔽(sequestered)。优选地，因此，本发明某些双特异性配体以两种(开放和封闭)构象的平衡存在。

按照本发明的双特异性配体可以进行修饰，以优选开放的或封闭的构象。例如，用二硫键稳定V_H-V_L相互作用来稳定封闭构象。并且，可以构建用于连接结构域，包括V_H结构域和V_L结构域对的接头，以便优选开放形式；例如，所述接头可以在空间上阻碍所述结构域的缔合，诸如通过在适当的位置结合大的氨基酸残基，或者设计适当的刚性结构而实现，所述刚性结构将使得所述结构域自然地在空间上隔离。

双特异性配体的特征性描述。

双特异性配体与其特异性抗原或表位(例如，CD40L和/或由DOM8-24结合的表位)的结合可以通过本领域技术人员熟悉的方法并且包括ELISA方法进行检测。在本发明的一个优选实施方案中，使用单克隆噬菌体ELISA检测结合。

噬菌体ELISA可以按照任何适当的方法进行：下文列出一种示例性的流程。

可以通过ELISA筛选在每一轮选择产生的噬菌体群体针对所选择的抗原或表位的结合，以鉴定“多克隆”噬菌体抗体。然后，这些群体中来自单一感染细菌克隆的噬菌体可以通过ELISA进行筛选，以鉴定“单克隆”噬菌体抗体。还有必要筛选与抗原或表位结合的可溶的抗体片段，并且这也可以通过ELISA进行，例如，使用针对C或N端标记的试剂进行(参见例如Winter等.(1994)Ann.Rev.Immunology 12，433-55以及本文所引用的参考文献)。

选择的噬菌体单克隆抗体的多样性还可以通过PCR产物的凝胶电泳(Marks等.1991，同前所述；Nissim等.1994同前所述)、探针探测(Tomlinson等.，1992 J.Mol.Biol.227，776)或者通过载体DNA测序而进行评估。

‘双特异性配体’的结构

如上文所述，抗体在本文中定义为包括至少一个重链和一个轻链可变结构域、至少2个重链可变结构域或至少2个轻链可变结构域的抗体(例如，IgG，IgM，IgA，IgA，IgE)和片段(Fab，Fv，二硫键连接的Fv，scFv，双抗体)。它可以至少部分来源于天然产生抗体的任何物种，或者通过重组DNA技术产生；不管是从血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌分离。

在本发明的一个优选实施方案中，所述双特异性配体包括抗体的至少一个单一重链可变结构域和抗体的一个单一轻链可变结构域，或者两个单一重链或轻链可变结构域。例如，所述配体可以包括V_H/V_L对、一对V_H结构域或一对V_L结构域。

这样的配体的第一和第二可变结构域可以在同一多肽链上。备选地，它们可以在分离的多肽链上。在它们在同一多肽链的情形中，它们可以由接头连接，如上文所述，接头优选是肽序列。

第一和第二可变结构域可以共价地和非共价地缔合。在它们共价缔合的情形中，共价键可以是二硫键。

在可变结构域选自V-基因所有成分(例如，其使用本文所述的噬菌体展示技术选择)的情形中，那么这些可变结构域包括通用构架区，以致它们可以被本文定义的特异性通有配体识别。通用构架、通有配体等的应用在WO99/20749中描述。

在使用V-基因所有成分的情形中，多肽序列中的变化优选地位于可变结构域结构环内。为了增强每一可变结构域与其互补对的相互作用，每一可变结构域的多肽序列可以通过DNA改组或通过突变而改变。DNA改组是本领域已知的，并且，例如，由Stemmer，1994，Nature 370：389-391和美国专利No.6,297,053教导，这两者通过参考结合于此。其它诱变方法是本领域的技术人员公知的。

在本发明的一个实施方案中，所述“双特异性配体”是单链Fv片段。在本发明的一个备选实施方案中，所述“双特异性配体”由Fab形式组成。

在另一方面，本发明提供编码至少本文定义的‘双特异性配体’的核酸。

本领域的技术人员应该理解，取决于本发明的方面，抗原或表位可以同时结合同一抗体分子。备选地，它们可以竞争与同一抗体分子的结合。例如，在两个表位同时结合的情形中，双特异性配体的两个可变结构域能够独立地结合它们的靶点表位。在结构域竞争情形中，一个可变结构域能够结合它的靶点，但不是与另一个可变结构域结合其同源靶点同时发生；或者第一可变结构域能够结合其靶点，但不是与第二可变结构域结合其同源靶点同时发生。

可变区可以来源于针对靶点抗原或表位的抗体。备选地，它们可以来源于单一抗体结构域的所有成分，诸如在丝状噬菌体表面上表达的那些。可以按照下文所述进行选择。

一般地，实行本发明所需要的核酸分子和载体构建体可以按照在标准实验室手册中列出的那样进行构建和操作，所述手册诸如Sambrook等.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，USA。

用于本发明的核酸的操作典型地在重组载体中进行。

因此，在另一方面，本发明提供一种载体，其包括编码至少本文所定义的‘双特异性配体’的核酸。

当用于本文时，载体是指用于将异源DNA引入细胞中进行其表达和/或复制的离散元件。选择或者构建并且随后使用这样的载体的方法是本领域的普通技术人员公知的。许多载体是公共可用的，包括细菌质粒、噬菌体、人造染色体和游离型载体。这样的载体可以用于简单克隆和诱变；备选地，应用基因表达载体。可以选择按照本发明应用的载体容纳需要大小的多肽编码序列，长度典型地从0.25千个碱基(kb)到40kb或更长。在体外克隆操作后，用所述载体转化适当的宿主细胞。每种载体含有多种功能性成分，其一般包括克隆(或“多接头”)位点、复制起点和至少一种选择标记基因。如果给定的载体是一种表达载体，那么它另外具有下列一项或多项：增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，每一项都位于克隆位点周围，以便它们可操作性地连接到编码按照本发明的配体的基因上。

有利地，克隆或表达载体可以含有选择基因，其也叫作可选择标记。这一基因编码对于在选择性培养基中生长的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白。因此，没有转化含有所述选择基因的载体的宿主细胞将不能在所述培养基中存活。典型的选择基因编码这样的蛋白，即，其赋予针对抗生素和其它毒素如氨苄青霉素、新霉素、甲氨喋呤或四环素的抗性，补充营养缺陷型缺陷，或者提供不能从生长培养基中获得的重要营养。

由于复制按照本发明的编码配体的载体最方便在大肠杆菌中进行，所以，使用大肠杆菌选择标记，例如，赋予针对抗生素氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。这些可以从大肠杆菌质粒获得，诸如从pBR322或从pUC质粒如pUC18或pUC19获得。

优选的载体是能够表达与多肽文库成员对应的核苷酸序列的表达载体。因此，可以通过表达多肽文库成员的单个克隆独立的增殖和表达，或者通过应用任意的选择展示系统，而进行第一和/或第二抗原或表位的选择。如上文所述，优选的选择展示系统是噬菌体展示。因此，可以使用噬菌体或噬菌粒载体，例如pIT1或pIT2。用于本发明的前导序列包括pelB、stII、ompA、phoA、bla和pelA。一个实例是噬菌粒载体，其具有大肠杆菌的复制起点(用于双链复制)，并且还具有噬菌体的复制起点(用于产生单链DNA)。这样的载体的操作和表达在本领域内是公知的(Hoogenboom和Winter(1992)如前所述；Nissim等.(1994)如前所述)。简要地，所述载体含有赋予噬菌粒选择性的β-内酰胺酶基因，和由pelB前导序列(其将表达的多肽导向壁膜间隙)组成的表达盒上游lac启动子，多克隆位点(用于克隆文库成员的核苷酸译本)，任选地，一种或多种肽标记(用于检测)，任选地，一种或多种TAG终止密码子和噬菌体蛋白pIII。因此，使用大肠杆菌的各种抑制或非抑制菌株，并且加入葡萄糖、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)或辅助噬菌体诸如VCS M13，所述载体能够作为质粒复制而不表达，只产生大量的多肽文库成员，或者产生噬菌体，它们中的一些在它们表面含有至少一个拷贝的多肽-pIII融合体。

构建按照本发明的编码配体的载体应用常规的连接技术。将分离的载体或DNA片段切割、剪截、并且以需要的形式重新连接，以产生需要的载体。如果需要，可以以已知的方式，进行分析以确定正确的序列存在于构建载体中。用于构建表达载体、制备体外转录物、向宿主细胞中引入DNA、并且进行评估表达和功能的分析的适宜的方法对于本领域的技术人员是已知的。检测基因序列在样品中的存在，或者其扩增和/或表达通过常规方法进行定量，诸如DNA或RNA印迹分析，蛋白质印迹，DNA、RNA或蛋白的斑点印迹，原位杂交、免疫细胞化学或者核酸或蛋白分子的序列分析。如果需要，本领域的技术人员应该很容易地考虑到这些方法可以怎样进行改进。

配体结构

按照本发明的一方面，连接2个或多个非互补性表位结合结构域，以致它们处于本文定义的封闭构象中。有利地，作为备选方案，或者当加成到本文所述的接头上时，它们可以进一步附着到骨架上，促进所述表位结合位点彼此间封闭构象的形成和/或维持。备选地，可以使用本文所讨论的支架或骨架框架而构建本发明的单体抗-CD40L抗体单一可变结构域多肽。

(I)骨架

如上文提出的那样，骨架可以基于免疫球蛋白分子或者可以是非免疫球蛋白源性的。如本文定义优选的免疫球蛋白骨架包括选自下列各项中的任何一种或多种中：一种免疫球蛋白分子，其包括至少(i)抗体的CL(κ或λ亚类)结构域；或(ii)抗体重链的CH1结构域；包括抗体重链CH1和CH2结构域的免疫球蛋白分子；包括抗体重链CH1、CH2和CH3结构域的免疫球蛋白分子；或者亚类(ii)与抗体的CL(κ或λ亚类)结构域结合的任一种。也可以包括铰链区结构域。例如，结构域的这样的组合可以模拟天然抗体，诸如IgG或IgM，或其片段，诸如Fv、scFv、Fab或F(ab’)₂分子。本领域的技术人员应该理解，这一列举并不是无遗漏的。

(II)蛋白支架

每一表位结合结构域包括蛋白支架和一个或多个CDRs，其参与所述结构域与一个或多个表位的特异性相互作用。有利地，按照本发明的表位结合结构域包括3个CDRs。除了基于免疫球蛋白结构域的那些，适当的蛋白支架还可以基于除免疫球蛋白结构域之外的蛋白支架或骨架。例如，天然细菌受体诸如SpA已经用作移植CDRs的支架，以产生与一个或多个表位特异性结合的配体。US 5,831,012中描述了这种方法的详情。其它适当的支架包括基于纤连蛋白和affibodies(Affibody，Bromma，Sweeden)的那些。WO 98/58965中描述了适当的方法的详情。其它适当的支架包括脂笼蛋白和CTLA4，如在van den Beuken等.，J.Mol.Biol.(2001)310，591-601中所述，以及诸如在WO0069907中所述的那些的支架(MedicalResearch Council)，例如，其基于细菌GroEL和其它分子伴侣多肽的环结构。按照本发明可以应用的其它基于非免疫球蛋白的支架包括基于A类LDL受体、EGF结构域单体和多聚体的那些，以及可从Biorexis(King ofPrussia，PA)或Avidia(Mountain View，CA)获得的支架。例如，在WO05/040229，WO04/044011和US20050089932中描述了其它可以使用的非免疫球蛋白支架。

用于构建配体的支架

i.主链构象的选择

对于它们的多肽链，免疫球蛋白超家族成员都有相似的折叠。例如，尽管按照它们的一级序列，抗体是高度变化的，但是序列和结晶结构的比较已经表明，与预测相反，抗体6个抗原结合环中的5个(H1，H2，L1，L2，L3)采用少数主链构象或规范的结构(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.，196：901；Chothia等.(1989)Nature，342：877)。因此，环长度和主要残基的分析使得可以预测在大多数人抗体中发现的H1、H2、L1、L2和L3的主链构象(Chothia等.(1992)J.Mol.Biol.，227：799；Tomlinson等.(1995)EMBO J.，14：4628；Williams等.(1996)J.Mol.Biol.，264：220)。尽管H3区域在序列、长度和结构上要多变得多(由于D片段的应用)，但是，它还形成少量的短环长度主链构象，其取决于在环和抗体构架中主要位置的具体残基的长度和存在或者残基的类型(Martin等.(1996)J.Mol.Biol.，263：800；Shirai等.(1996)FEBS Letters，399：1)。

本发明的配体有利地选自和/或组装自结构域文库，诸如V_H结构域文库和/或V_L结构域文库。此外，本发明的配体可以本身以文库形式提供。在本发明的一个方面，设计配体和/或结构域的文库，其中选择某些环长度和主要残基，以保证所述成员的主链构象是已知的。有利地，如上文所讨论的那样，存在天然发现的免疫球蛋白超家族分子的真实构象，以将它们是非功能性的机会减到最小。生殖细胞V基因片段作为用于构建抗体或T细胞受体文库的一种适当的基本构架；也应用其它序列。变化可以以低频率发生，以致少数功能性成员可以具有不会影响其功能的改变的主链构象。

还应用正则结构理论来估计由配体编码的不同主链构象的数目，以基于配体序列预测主链构象，并且选择不影响正则结构的多样化的残基。已知在人V_κ结构域中，L1环可以采用4种正则结构中的一种，L2环具有单一的正则结构，并且对于L3环，90％的人V_κ结构域采用4或5种正则结构种的一种(Tomlinson等.(1995)同前所述)；因此，在单独的V_κ结构域中，不同的正则结构可以组合，以产生一定范围的不同主链构象。假定V_λ结构域编码L1、L2和L3环的不同范围的正则结构域，并且V_κ和V_λ结构域可以与任何V_H结构域配对，所述V_H结构域可以编码H1和H2环的一些正则结构，那么，对于这5个环观察到的正则结构组合数目是非常大的。这意味着，对于产生广泛范围的结合特异性，在主链构象中产生多样性可能是重要的。然而，通过基于单一的已知的主链构象构建抗体文库，已经发现，与预测相反，产生足够的多样性以基本靶向所有抗原并不需要主链构象的多样性。甚至更令人惊讶地，单一主链构象不必是共有结构——单一的天然存在的构象可以用作整个文库的基础。因此，在一个优选的方面，本发明的配体具有单一的已知的主链构象。

在讨论的免疫球蛋白超家族分子类型中，所选择的单一的主链构象优选是普遍的。当观察到有显著数量的天然存在的分子采用其时，构象是普遍的。因此，在本发明的一个优选方面，分别考虑免疫球蛋白结构域每一结合环的不同主链构象的天然存在，然后选择一种天然存在的可变结构域，其具有不同环的主链构象的适宜组合。如果这些都不能得到，可以选择最接近的等价物。优选地，通过选择编码理想的主链构象的生殖细胞基因片段，产生不同环主链构象的适当的结合。更优选地，所选的生殖细胞基因片段被经常天然表达，并且最优选地，它们是所有天然生殖细胞基因片段最经常表达的。

在设计配体或其文库时，可以分别考虑每一抗原结合环的不同主链构象的发生率。对于H1、H2、L1、L2和L3，选择一种给定的构象，其由20％-100％天然存在分子的抗原结合环采用。典型地，它的观察到的发生率高于35％(即在35％-100％之间)，并且理想地，高于50％或者甚至高于65％。由于很大部分的H3环没有正则结构，优选地选择这样的主链结构，即，所述结构在不展现正则结构的那些环中是普遍的。对于每个环，因此，选择在天然所有成分中最经常观察到的构象。在人抗体中，每个环最常见的正则结构(CS)如下：H1-CS 1(表达的所有成分的79％)，H2-CS 3(46％)，V_κ的L1-CS 2(39％)，L2-CS 1(100％)，V_κ的L3-CS 1(36％)(计算假定κ∶λ比例为70∶30，Hood等.(1967)Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.，48：133)。对于具有正则结构的H3环，具有从残基94到残基101的盐桥的7个残基的CDR3长度(Kabat等.(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest，U.S.Department of Health and Human Services)似乎是最常见的。在EMBL数据文库中存在至少16种人抗体序列，其具有形成这种构象所需要的H3长度和主要残基，以及在蛋白数据库中存在至少2种结晶结构，其可以用作抗体模拟(2cgr和1tet)的基础。对于正则结构组合的最经常表达的生殖细胞基因片段为V_H片段3-23(DP-47)、J_H片段JH4b、V_κ片段O2/O12(DPK9)和J_κ片段J_κ1。V_H片段DP45和DP38也是适宜的。因此，这些片段可以结合用作构建具有理想的单一主链构象的文库的基础。

备选地，不是基于每一分离的结合环的不同主链构象的天然存在而选择单一主链构象，而将主链构象组合的天然存在用作选择单一主链构象的基础。在抗体情形中，例如，可以确定任意2个、3个、4个、5个或所有6个抗原结合环的正则结构组合的天然存在。这里，优选地，所选择的构象在天然存在的抗体中是普遍的，并且最优选地，它是在天然所有成分中最经常观察到的。因此，在人抗体中，例如，当考虑5个抗原结合环H1、H2、L1、L2和L3的天然组合时，确定最常见的正则结构组合，然后与H3环的最常见的构象组合，作为选择单一主链构象的基础。

ii.规范序列的多样性

选择了一些已知的主链构象或者优选地单一的已知的主链构象，可以通过改变分子的结合位点，而构建按照本发明的配体或者用于本发明的文库，以产生具有结构和/或功能多样性的所有成分。这意味着，产生变体，以致它们在其结构和/或其功能中具有充分的多样性，以便它们能够提供一定范围的活性。

典型地通过在一个或多个位置改变所选择的分子而产生理想的多样性。要被改变的位置可以随机选择或者优选地选择。然后，变化可以通过下列方式实现：通过随机选择，在这一过程中，常驻(resident)氨基酸被天然的或合成的任何氨基酸或其类似物而取代，产生大量的变体；或者通过用一个或多个确定的氨基酸子集取代常驻氨基酸，产生更少的变体。

对于引入这样的多样性，已经报道了许多方法。易错PCR(Hawkins等，(1992)J.Mol.Biol.，226：889)、化学诱变(Deng等.(1994)J.Biol.Chem.，269：9533)或细菌突变菌株(Low等.(1996)J.Mol.Biol.，260：359)可以用来向编码所述分子的基因中引入随机的突变。用于突变所选位置的方法也是本领域公知的，并且包括应用错配寡核苷酸或简并寡核苷酸，应用或者不应用PCR。例如，通过将突变靶向抗原结合环，产生了一些合成的抗体文库。已经将人破伤风毒素结合Fab的H3区域随机化处理，以产生一定范围的新的结合特异性(Barbas等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457)。随机的或半随机的H3和L3区域已经附加在生殖细胞V基因片段上，产生具有未突变构架区的大文库(Hoogenboom和Winter(1992)J.Mol.Biol.，227：381；Barbas等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4457；Nissim等.(1994)EMBO J.，13：692；Griffiths等.(1994)EMBO J.，13：3245；De Kruif等.(1995)J.Mol.Biol.，248：97)。已经将这样的多样化作用扩大到包括一些或所有的其它抗原结合环(Crameri等.(1996)Nature Med.，2：100；Riechmann等.(1995)Bio/Technology，13：475；Morphosys，WO97/08320，同前所述)。

由于环随机化作用具有为单独的H3产生大约大于10¹⁵个结构和为其余5个环产生相似大量的变体的潜力，所以，不可能使用现有的转化技术，或者甚至通过使用没有细胞的系统(cell free system)，而产生代表所有可能组合的文库。例如，在目前构建的一个最大文库中，产生了6×10¹⁰个不同的抗体，这只是这种设计的文库的潜在多样性的一部分(Griffiths等.(1994)同前所述)。

在一个优选的实施方案中，只有直接参与产生或者修饰分子的适当功能的那些残基被多样化。对于许多分子，所述功能是与靶点结合，并且因此，多样性应该集中在靶点结合位点，同时避免改变对于分子的全面包装或者对于保持所选的主链构象是至关重要的残基。

当用于抗体结构域时规范序列的多样化

在本发明的配体的情形中，靶点的结合位点最经常是抗原结合位点。因此，在一个高度优选的方面，本发明提供抗体配体的文库或者用于抗体配体组装的文库，其中只有在抗原结合位点的那些残基被改变。在人抗体所有成分中，这些残基是极端多样的，并且已知在高分辨抗体/抗原复合体中接触。例如，在L2中，已知在天然存在的抗体中位置50和53是多样的，并且观察到与所述抗原接触。相反，常规方法使得在相应的互补决定区(CDR1)的所有残基都多样化，如由Kabat等.(1991，同前所述)所定义的那样，与这两个相比，在按照本发明应用的文库中有某7个残基多样化。这代表了关于产生一定范围的抗原结合特异性所需要的功能多样性的显著提高。

实际上，抗体多样性是两种方法的结果：生殖细胞V、D和J基因片段的体细胞重组，以产生首次用于实验的一级所有成分(叫作生殖细胞和连接多样性)以及得到的重组V基因的体细胞高变。人抗体序列的分析已经表明，一级所有成分的多样性集中在抗原结合位点中心，而体细胞高变将多样性扩大到抗原结合位点的外围区域，所述外围区域在一级所有成分中是高度保守的(参见Tomlinson等.(1996)J.Mol.Biol.，256：813)。这种互补性可能成为搜索序列间隔的有效的策略，并且，尽管明显地只有抗体才有，它可以容易地用于其它多肽所有成分。变化的残基是形成靶点结合位点的那些残基的子集。如果需要，在选择过程的不同阶段，将在靶点结合位点的不同(包括重叠)子集的残基多样化。

在抗体所有成分的情形中，产生初始‘首次用于实验的’所有成分，其中抗原结合位点的一些残基而不是所有残基被多样化。当在上下文中用于本文时，术语‘首次用于实验的’是指没有预定的靶点的抗体分子。这些分子类似于由没有经历免疫多样化作用的个体的免疫球蛋白基因编码的那些分子，正如在胎儿和婴儿个体的情形中，其免疫系统还没有受到广泛种类的抗原性刺激物的激活。然后，将该所有成分针对一定范围的抗原或表位进行选择。如果需要，然后，可以进一步将多样性引入初始所有成分多样化区域之外的区域。可以针对改进的功能、特异性或亲和性对这种成熟的所有成分进行选择。

本发明提供用于构架配体的2种不同的初次用于实验的结合结构域的所有成分，或者配体的初次用于实验的文库，其中抗原结合位点的一些或所有残基被改变。“一级”文库模拟天然的一级所有成分，多样性局限于在抗原结合位点中心的残基上，所述残基在生殖细胞V基因片段中是多样的(生殖细胞多样性)或者在重组过程中是多样的(连接多样性)。多样化的那些残基包括但不限于，H50，H52，H52a，H53，H55，H56，H58，H95，H96，H97，H98，L50，L53，L91，L92，L93，L94和L96。在“体细胞”文库中，多样性局限于在重组过程中多样化(连接多样性)的或是高度体细胞突变的残基上。多样化的那些残基包括但不限于：H31，H33，H35，H95，H96，H97，H98，L30，L31，L32，L34和L96。已知上文列出的适用于这些文库的多样性的所有残基在一个或多个抗体-抗原复合体中接触。由于在这两个文库中，没有改变抗原结合位点的所有残基，所以，通过改变其余的残基，在选择过程中结合其它的多样性，如果需要这样做的话。本领域的技术人员应该明白，任何这些残基(或包括抗原结合位点的其它残基)的任何子集可以用于将所述抗原结合位点初始和/或随后多样化。

在构建用于本发明的文库时，所选位置的多样化典型地在核酸水平上实现，其通过改变标明多肽序列的编码序列，以致许多可能的氨基酸(全部20种或其子集)可以结合到所述位置。使用IUPAC命名法，最通用的密码子是NNK，其编码所有的氨基酸以及TAG终止密码子。为了引入需要的多样性，优选使用NNK密码子。也应用实现相同目的的其它密码子，包括NNN密码子，其导致其它终止密码子TGA和TAA的产生。

人抗体抗原结合位点的侧链多样性特征是一种显然的偏好，其优选某些氨基酸残基。如果总结在每一个V_H、V_κ和V_λ区10个最多变位置的氨基酸组成，那么，大于76％的侧链多样性仅仅来自于7个不同的残基，这些残基为，丝氨酸(24％)、酪氨酸(14％)、天冬酰胺(11％)、甘氨酸(9％)、丙氨酸(7％)、天冬氨酸(6％)和苏氨酸(6％)。这种可以提供主链机动性的对于亲水残基和小的残基的偏好可能反映了表面的演变，其先倾向于结合宽范围的抗原或表位，并且可以帮助解释抗体在一级所有成分中需要的混杂性(promiscuity)。

由于优选地模拟氨基酸的这种分布，在要被改变位置的氨基酸分布优选地模拟在抗体的抗原结合位点见到的分布。允许针对一定范围的靶点抗原选择某些多肽(不只是抗体多肽)的氨基酸置换的这样的偏好，易于用于任何多肽所有成分。存在许多方法用来偏选在要改变的位置的氨基酸分布(包括应用三核苷酸诱变，参见WO97/08320)，由于合成的便利性，其中优选的方法是使用常规简并密码子。通过将由简并密码子的所有组合(在每个位置具有等比例的单个、两个、三个和四个简并性)编码的氨基酸分布与天然氨基酸应用相比较，可以计算出最有代表性的密码子。密码子(AGT)(AGC)T，(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)——即，分别为DVT，DVC和DVY，使用IUPAC命名法——是最接近理想的氨基酸分布的密码子：它们编码22％丝氨酸和11％酪氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。因此，优选地，在每个多样性位置使用DVT、DVC或DVY密码子构建文库。

增加的半衰期

在体内，由于PEG化的抗体分子将具有极大延长的体内半衰期，所以，本文所述的PEG化的单价抗-CD40L抗体与未PEG化的抗体多肽相比，赋予显著的有利性。不受某种具体的理论的束缚，据信本文所述的增加的分子半衰期是由PEG聚合物附着引起的增加的抗体多肽流体动力学大小而赋予的。更具体地，据信，两种参量在确定PEG化抗体多肽的血清半衰期中起重要作用。第一标准是PEG附着物的性质和大小，即，如果所用的聚合物只是线性链或者有分枝的/支链，其中有分枝的/支链引起更长的半衰期。第二是最终形式中一个或多个PEG部分在抗体多肽上的位置，以及所述分子具有多少“游离的”未修饰的PEG臂。例如，当通过大小排阻层析估计时，得到的PEG化抗体多肽的流体动力学大小反映分子的血清半衰期。因此，PEG化分子的流体动力学大小越大，血清半衰期越大。

增加的半衰期在体内用于免疫球蛋白，特别是抗体，并且最特别地是用于小的抗体片段。这样的片段(Fvs，Fabs，scFvs，dAbs)受到机体的快速分解；因此，尽管它们能够快速到达机体的大部分，并且很快产生和更容易处理，但是，它们的体内应用受到它们在体内短暂的持续的限制。

在一方面，本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽通过与增加所述抗体多肽的流体动力学大小的部分诸如PEG融合而在体内得到稳定。用于药物代谢动力学分析和半衰期确定的方法是本领域的技术人员所熟悉的。详情可以在Kenneth等：Chemical Stability of Pharmaceuticals：A Handbook forPharmacists和在Peters等，Pharmacokinetc analysis：A Practical Approach(1996)中找到。还可以参考“Pharmacokinetics”，M Gibaldi和D Perron，由Marcel Dekker出版，2^nd Rev.ex edition(1982)，其描述了药物代谢动力学参数，诸如tα和tβ半衰期以及在曲线下的区域(AUC)。

典型地，相对于未PEG化的dAb，本文所述的PEG化抗体多肽(其中PEG化抗体多肽和未PEG化抗体多肽的抗体多肽是相同的)的半衰期增加了10％，20％，30％，40％，50％或更多。半衰期在2x，3x，4x，5x，7x，10x，20x，30x，40x以及多达50x或更多范围内的增加是可能的。备选地，或者另外，半衰期在多达30x，40x，50x，60x，70x，80x，90x，100x，150x范围内的增加是可能的。

半衰期(t1/2α和t1/2β)和AUC可以从配体血清浓度针对时间的曲线上确定。可以使用WinNonlin分析包装(可从Pharsight Corp.，Mountain View，CA 94040，USA获得)，例如，来模拟所述曲线。在第一期(α期)，配体主要分布在患者中，但是有一些例外。第二期(β期)是末期，此时配体已经分布，并且当所述配体从患者清除时，血清浓度下降。tα半衰期是第一相的半衰期，和tβ半衰期是第二相的半衰期。当用于本文时，除非另外注明，□半衰期□是指通过非间隔模拟(例如，与两阶段模拟相反)而确定的本发明的抗体单一可变结构域的综合半衰期。β半衰期是一定量的dAb单体或多聚体从施用其的哺乳动物清除所用的时间的测定。因此，有利地，本发明提供含有dAb的组合物，例如，dAb-效应物基团组合物，其具有0.25小时到6小时或更长范围内的半衰期。在一个实施方案中，所述范围的下限是30分钟，45分钟，1小时，1.3小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，10小时，11小时或12小时。另外或者备选地，含有dAb的组合物具有达到并且包括12小时范围内的tα半衰期。在一个实施方案中，所述范围的上限是11，10，9，8，7，6或5小时。适当的范围的实例是1.3-6小时，2-5小时或3-4小时。

有利地，本发明提供含有dAb的组合物，其包括按照本发明的配体，所述配体具有1-170小时或更长范围内的tβ半衰期。在一个实施方案中，所述范围的下限是2.5小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时或12小时。另外，或备选地，含有dAb的组合物，例如，dAb-效应物基团组合物具有多达并且包括21天范围内的tβ半衰期。在一个实施方案中，所述范围的上限是12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。有利地，按照本发明的含有dAb的组合物具有2-100小时、4-48小时和10-40小时范围内的tβ半衰期。在另一个实施方案中，它将在12-48小时范围内。在另一个实施方案中，它将在12-26小时范围内。本发明提供含有dAb的组合物，其包括具有1-170小时或更长范围内的半衰期的按照本发明的配体。在一个实施方案中，所述范围的下限是1.3小时，2.5小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时，9小时，10小时，11小时或12小时。另外，或者备选地，含有dAb的组合物，例如，dAb-效应物基团组合物具有多达并且包括21天范围内的半衰期。在一个实施方案中，所述范围的上限是12小时，24小时，2天，3天，5天，10天，15天或20天。

除了上述标准之外或者上述标准的备选方案，本发明提供含有dAb的组合物，其包括具有1mg.min/ml或更大的AUC值(曲线下区域)的按照本发明的配体。在一个实施方案中，所述范围的下限是5，10，15，20，30，100，200或300mg.min/ml。另外，或者备选地，按照本发明的配体或组合物具有达到600mg.min/ml范围内的AUC。在一个实施方案中，所述范围的上限是500，400，300，200，150，100，75或50mg.min/ml。有利地，按照本发明的配体具有选自由下列各项组成的组范围内的AUC：15-150mg.min/ml.15-100mg.min/ml，15-75mg.min/ml和15-50mg.min/ml。

按照本发明的配体，包括单-，双-和多-特异性配体，在其一种构型中，能够与可以在体内增加所述配体的半衰期的一种或多种分子结合。典型地，这样的分子是体内天然存在的多肽，并且其抵抗从生物体移除不需要的物质的内源机制的降解或移除。例如，增加生物体的半衰期的分子可以选自下列各项：

胞外基质的蛋白；例如胶原蛋白、层粘连蛋白、整联蛋白和纤连蛋白。胶原蛋白是主要的胞外基质蛋白。目前已知大约15种类型的胶原蛋白分子，它们在机体的不同部位发现，例如，在骨、皮肤、腱、韧带、角膜、内脏器官中发现的I型胶原蛋白(占机体胶原蛋白的90％)，或者在软骨、无脊椎动物椎间盘、脊索、眼的玻璃体中发现的II型胶原蛋白。

在血液中发现的蛋白，其包括：

血浆蛋白，诸如血纤蛋白、α-2巨球蛋白、血清白蛋白、凝血因子A、凝血因子B、血清淀粉样蛋白A、庚球蛋白(heptaglobin)、肌动蛋白抑制蛋白、泛蛋白、子宫珠蛋白和β-2-微球蛋白；

酶和抑制剂，诸如纤维蛋白溶酶原、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、α-1-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂。纤维蛋白溶酶原是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶纤维蛋白溶酶的无活性前体。发现它通常在血流中循环。当纤维蛋白溶酶原激活并且转化成纤维蛋白溶酶时，它露出溶解凝血因子I纤维的潜在的酶促结构域，所述凝血因子I纤维将血细胞网织在血液凝块中。这叫作纤维蛋白溶解。

免疫系统蛋白，诸如IgE，IgG，IgM。

转运蛋白，诸如视黄醇结合蛋白、α-1微球蛋白。

防卫素，诸如β-防卫素1、嗜中性防卫素1，2和3。

在血脑屏障或在神经组织中发现的蛋白，诸如黑皮质素受体、髓磷脂、抗坏血酸转运蛋白。

运铁蛋白受体特异性配体-神经药剂融合蛋白(参见US5977307)；脑毛细管内皮细胞受体、运铁蛋白、运铁蛋白受体、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF 1)受体、胰岛素样生长因子2(IGF 2)受体、胰岛素受体。

位于肾脏的蛋白，诸如多囊蛋白、IV型胶原蛋白、有机阴离子转运蛋白K1、Heymann’s抗原。

位于肝脏的蛋白，例如乙醇脱氢酶、G250。

凝血因子X

α1抗胰蛋白酶

HNF 1α

位于肺的蛋白，诸如分泌成分(结合IgA)。

位于心脏的蛋白，例如HSP 27。这与扩大性心肌病有关。

位于皮肤的蛋白，例如角蛋白。

骨特异性蛋白，诸如骨形态发生蛋白(BMPs)，其是证实生骨活性的转化生长因子β超家族的子集。实例包括BMP-2，-4，-5，-6，-7(也叫作生骨蛋白(OP-1))和-8(OP-2)。

肿瘤特异性蛋白，包括人滋养层抗原、herceptin受体、刺激素受体、组织蛋白酶如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)。

疾病特异性蛋白，诸如只在活化的T细胞上表达的抗原：其包括

LAG-3(淋巴细胞活化基因)，护骨蛋白配体(OPGL)参见Nature 402，304-309；1999，OX40(TNF受体家族的一员，表达在活化的T细胞和人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)-生产细胞中已知受到特异性上调的唯一的共刺激性T细胞分子。)参见J Immunol.2000 Jul 1；165(1)：263-70；金属蛋白酶(与关节炎/癌症有关)，包括CG6512 Drosophila，人截瘫蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠ftsH；血管发生生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血管内皮生长因子/血管渗透因子(VEGF/VPF)，转化生长因子-a(TGF a)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(PlGF)，中期因子血小板衍生生长因子-BB(PDGF)，CXXXC趋化因子。

应激蛋白(热休克蛋白)

HSPs通常在细胞内发现。当它们在胞外发现时，它是细胞已经死亡并且释放出其成分的指示。这种非程序化细胞死亡(坏死)只作为外伤、疾病和损伤的结果发生，并且因此，在体内，胞外HSPs引发免疫系统抵抗感染和疾病的反应。结合胞外HSP的双特异性蛋白可以位于疾病位点。

参与Fc转运的蛋白

Brambell受体(也叫作FcRB)：

这种Fc受体具有两种功能，这两种功能都潜在地用于递送

所述功能为

(1)将IgG从母亲通过胎盘转运到孩子

(2)保护IgG免受降解，因而延长IgG的血清半衰期。据认为，所述受体从内体再循环利用IgG。参见Holliger等，Nat Biotechnol 1997Jul；15(7)：632-6。

参与Fc转运的其它蛋白包括在Gastinel等.，1992，PNAS 89：638；和Roopenian等.，2003 J.Immunol.170：3528中所述的新生儿Fc受体(FcRn)。

按照本发明的配体可以设计成对上述靶点特异，而不需要体内半衰期的任何增加或者增加的体内半衰期。例如，按照本发明的配体可以是对选自上述的组织特异性靶点特异的，因而，不管半衰期的任何增加，尽管这可能发生，能够进行结合组织特异性的治疗相关的靶点的双特异性配体或dAb单体的组织特异性靶向。并且，在所述配体或dAb单体靶向肾脏或肝脏的情形中，这可以将所述配体或dAb单体重新导向体内备选的清除途径(例如，所述配体可以被从肝脏清除途径导出到肾脏清除途径)。

用于增加半衰期的多肽包括但不限于附件I中所示的那些。

增加的蛋白酶稳定性

本发明的另一优点是本文所述的PEG化的dAbs和dAb多聚体具有针对蛋白酶作用的增加的稳定性。取决于检测条件，dAbs通常本来就对于蛋白酶作用是稳定的。然而，在胃蛋白酶存在时，由于蛋白在酸性条件下是解开的，因而使得蛋白更容易受蛋白酶影响，所以许多dAbs在pH 2完全降解。本发明提供PEG化的dAb分子，包括dAb多聚体，其中据信，由于PEG聚合物对骨架的物理覆盖，由此防止蛋白酶得以接近多肽骨架并分解它，所以，PEG聚合物提供对多肽骨架的保护。在一个优选的实施方案中，由于更大的流体力学大小将比具有更小的流体力学大小的PEG化的dAb证实更高水平的免受蛋白酶降解的保护，所以，按照本发明产生具有更高流体力学大小的(例如，200-500kDa)PEG化的dAb。在一个实施方案中，当暴露于一种或多种胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶时，PEG-或其它聚合物-连接的抗体单一可变结构域单体或多聚体降解不超过10％，其中如果所述蛋白酶是胃蛋白酶，那么暴露在pH 2.0进行30分钟，并且如果所述蛋白酶是一种或多种胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶，那么暴露在pH 8.0进行30分钟。在一个优选的实施方案中，当在pH 2.0暴露于胃蛋白酶30分钟时，PEG-或其它聚合物-连接的dAb单体或多聚体降解不超过10％，优选地不超过5％，并且优选地完全不降解。在另一优选的实施方案中，在pH 2.0在胃蛋白酶存在下30分钟时，本发明的PEG-或其它聚合物-连接的dAb多聚体(例如，异源或同源二聚体、三聚体、四聚体、八聚体等)降解少于5％，并且优选地完全不降解。在一个优选的实施方案中，当在pH 8.0暴露于胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶30分钟时，PEG-或其它聚合物-连接的dAb单体或多聚体降解不超过10％，优选地不超过5％，并且优选地完全不降解。在另一个优选的实施方案中，在pH 8.0在胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶存在下30分钟时，本发明的PEG-或其它聚合物-连接的dAb多聚体(例如，异源或同源二聚体、三聚体、四聚体、八聚体等)降解少于5％，并且优选地完全不降解。

蛋白酶：抗体单一可变结构域多肽的相对比例可以按照本发明改变，以获得上述理想的降解水平。例如，蛋白酶比抗体单一可变结构域的比例可以从约1∶30，到约10∶40，到约20∶50，到约30∶50，约40∶50，约50∶50，约50∶40，约50∶30，约50∶20，约50∶10，约50∶1，约40∶1，以及约30∶1。

因此，本发明提供用于减少抗体单一可变结构域的降解的方法，其包括按照本文所述的任一实施方案，将抗体单一可变结构域单体或多聚体连接到PEG聚合物上。按照本发明的这一方面，在pH2.0在胃蛋白酶存在下30分钟时，所述抗体单一可变结构域降解不超过10％。特别地，在pH2.0在胃蛋白酶存在下30分钟时，PEG-连接的dAb多聚体降解不超过5％，并且优选地完全不降解。在一个备选实施方案中，当在pH 8.0暴露于胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶30分钟时，所述抗体单一可变结构域降解不超过10％，优选地不超过5％，并且优选地完全不降解。

按照本发明的PEG-连接的dAb单体和多聚体的降解可以使用本领域技术人员公知的方法进行测定。例如，在将PEG-连接的dAb与胃蛋白酶在pH 2.0温育30分钟后，或者与胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或羧肽酶在pH 8.0温育30分钟后，可以通过凝胶过滤分析所述dAb样品，其中dAb单体或多聚体的降解通过比未降解的(即，没有用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶或羧肽酶处理的对照dAb)dAb更小分子量的凝胶条带得到证实。凝胶上dAb条带的分子量可以通过比较所述条带的移动与分子量梯度的移动而确定(参见图5)。测定蛋白降解的其它方法是本领域已知的，并且可以改编以评估本发明的PEG-连接的dAb单体和多聚体。

药物组合物、剂量和施用

本发明的抗体多肽可以结合到适于施用给受试者的药物组合物中。典型地，所述药物组合物包括单价抗-CD40L抗体多肽和药用载体。当用于本文时，“药用载体”包括任意和所有的生理相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。术语“药用载体”排除组织培养基，包括牛或马血清。药用载体的实例包括一种或多种下列各项：水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等、以及它们的组合。在许多情形中，在组合物中将优选包括等渗剂，例如，糖，多醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。药用物质包括较少量的辅助物质，诸如湿润或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加所述抗体多肽的保存期限或效力。

本文所述的组合物可以是各种形式的。这些形式包括，例如，液体、半固体和固体剂型，诸如液体溶液(例如，可注射的和可灌注溶液)、分散液或混悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于需要的施用方式和治疗应用模式。典型的优选组合物是可注射或可灌注溶液的形式，诸如类似于用来用其它抗体被动免疫人的那些的组合物。优选的施用模式是肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。

典型地，在制备和储存条件下，治疗组合物必需是无菌的和稳定的。所述组合物可以配制成溶液、微乳剂、分散液、脂质体或其它适合高药物浓度的规则的结构。无菌注射溶液可以通过将需要用量的活性化合物结合到适当的溶剂中而制备，当需要时，与上述列举的成分的一种或组合一起结合，之后进行过滤除菌。一般地，分散液通过将活性化合物结合到无菌赋形剂中而制备，所述赋形剂包含碱性分散介质和上文列举的那些中需要的其它成分。在无菌粉剂用来制备无菌注射溶液的情形中，优选的制备方法是产生活性成分的粉末的真空干燥和冷冻干燥，加上来自其先前过滤除菌的溶液的任何其它需要的成分。可以保持溶液的适当的流动性，例如，通过使用涂层，诸如卵脂酰胆碱，在分散液的情形中通过保持需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂。

尽管对于许多治疗应用，优选的施用途径/模式是静脉内注射或灌注，但是，本文所述的抗体多肽可以通过本领域已知的各种方法施用。多肽还可以通过肌内或皮下注射而施用。

熟练的技术人员应该理解，施用途径/模式将取决于需要的结果而不同。在某些实施方案中，所述活性化合物可以与保护所述化合物不进行快速释放的载体一起制备，诸如可控释放的制剂，其包括移植物、透皮贴片和微胶囊化的递送系统。部分是由于它们的小的尺寸——例如，每剂量摩尔数可以比完整大小的抗体的剂量显著更高，所以，单一免疫球蛋白可变结构域和其它相对小的单价抗体多肽很适合配制成延长释放的制剂。可以使用可生物降解的、生物适合的聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以通过在组合物中包括延缓吸收的试剂如单硬脂酸盐和明胶而导致可注射组合物延长的吸收。制备这样的制剂的许多方法获得了专利权，或者通常是本领域的技术人员已知的。参见，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。本文公开的适用于多肽药剂诸如单价抗体多肽的可控或者延长释放的其它方法，例如，在美国专利Nos.6,306,406和6,346,274中，以及例如在美国专利申请Nos.US20020182254和US20020051808中描述，所有这些通过参考结合于此。

在某些实施方案中，单价抗-CD40L抗体多肽可以口服施用，例如，与惰性稀释剂或可吸收的食用载体一起。化合物(和其它成分，如果需要)还可以封装在硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或者直接结合到个体的日常饮食中。对于口服治疗施用，所述化合物可以与赋形剂结合，并且以可吸收的片剂、口腔含片、药片、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂等形式应用。为了通过除肠胃外施用的方法施用本发明的化合物，可以必要地将所述化合物用防止其失活的物质包被或者与防止其失活的物质共同施用。

其它活性化合物还可以结合在组合物中。在某些实施方案中，单价抗-CD40L抗体多肽与一种或多种其它治疗剂共同配制和/或共同施用。例如，单价抗-CD40L抗体多肽可以与一种或多种结合其它靶点的其它抗体(例如，结合其它细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)，或者，例如，结合一种或多种细胞因子的其它抗体共同配制和/或共同施用。这样的组合治疗可以应用所施用的治疗剂的更低剂量，因而避免可能的毒性或与各种单一治疗有关的并发症。

本发明的治疗组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的单价抗-CD40L抗体多肽。“治疗有效量”是指在剂量上和在需要的时间阶段获得理想的治疗结果的有效用量。抗体多肽的治疗有效量可以依据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述单价抗-CD40L抗体多肽在个体内激发需要的应答的能力因素而不同。治疗有效量还是这样一种用量，即，其中治疗有益作用胜过抗体或抗体片段的任何毒性或有害作用。“预防有效量”是指在剂量上和在需要的时间阶段获得理想的预防结果的有效用量。典型地，由于预防剂量在基本早期阶段之前或之时用于受试者，所以，所述预防有效量应该低于治疗有效量。

可以调整剂量方案，以提供最理想的反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以施用单一的大丸剂，可以随着时间施用一些分成几部分的剂量，或者所述剂量可以按照治疗情况的紧急性需要而成比例地减少或增加。有利地，为了施用的便利和剂量的均一性，以单位剂型配制肠胃外组合物。用于本文的单位剂型是指适用于要治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上不连续的单位；每一单位含有计算产生理想的治疗作用的预定量的活性成分，其与需要的药物载体缔合。

单价抗-CD40L抗体多肽治疗或预防有效量的非限制性范围是0.1-20mg/kg，更优选地是1-10mg/kg。应该意识到，所述剂量值可以随着要被减轻的病况的类型和严重性而不同。还应该理解，对于任何具体的受试者，具体的给药方案应该按照个体需要和给药临床医生的专业判断而随时调整。

使用本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽的治疗功效由熟练的临床医生根据被治疗的疾病状况或紊乱的一种或多种症状或指症的改善而进行判断。尽管优选更大的改善，诸如20％，30％，40％，50％，75％，90％，或者甚至100％，或者取决于要测定的指症，大于100％(例如，2倍、3倍、10倍等，直到并且包括无病状态的获得)，但考虑在一种或多种临床指症中至少10％改善认为是“有效治疗”。指示可以是物理测定，例如，酶、细胞因子、生长因子或代谢物水平，细胞生长或细胞死亡率，或者异常细胞的存在或量。例如，人们还可以测定疾病或紊乱的症状的发作次数的不同(例如，对于减轻/复发型疾病，诸如多发性硬化病)。备选地，治疗有效性的标准依赖于非物理测定，诸如报告的疼痛或不适或其它疾病状况指示的减少。在进行非物理测定的情形中，可以应用各种临床可接受的尺度或指数，例如，局限性回肠炎活性指数(Crohn’s Disease Activity Index)或CDAI(Best等.，1976，Gastroenterology 70：439)，其将物理指示，其中诸如血细胞比容和液体或非常稀的粪便(very soft stools)数量，与患者报告的因素诸如腹痛或痉挛的严重性和全面的舒适结合来赋予疾病得分。

当术语用于本文时，如果相对于在没有用所述组合物治疗的相似个体(人或动物模型)中这样的症状，一种或多种症状的发作或严重性被延缓或减少至少10％，或者被消除了，那么使用本文所述的组合物进行的“预防”是“有效的”。

然而，本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽必须结合人CD40L，在人们评估其在动物模型系统中的作用的情形中，所述多肽必须与动物模型系统中的一种或多种抗原交叉反应，优选地以高亲和力交叉反应。如果对于给定的动物模型系统和给定的单价抗-CD40L抗体多肽，那么本领域的技术人员可以很容易地确定这种情况是否得到满足。如果这种情况得到满足，那么，单价抗-CD40L抗体多肽的功效可以通过将其在模拟疾病状态的条件下施用给动物模型并且监测所述疾病状况的一种或多种指示至少10％的改善而进行检验。

动物模型：

本文所述的单价抗-CD40L抗体多肽有效用于治疗其中CD40/CD40L信号传导不恰当地作用的自体免疫疾病。存在一些动物模型，其中可以评估给定的单价抗-CD40L抗体多肽的治疗功效，如下文所讨论的那样。

系统性红斑狼疮(SLE)：

在NZB/NZW和SNF1 SLE小鼠中，抗-CD40L抗体治疗防止狼疮样肾炎的发展。用抗-CD40L抗体治疗SNF1小鼠逆转了已建立的肾炎并且保护了肾功能。参见，例如，Mohan等.，1995，J.Immunol.154：1470-1480；Early等.，1996，J.Immunol.157：3159-3164；Kalled等.，1998，J.Immunol.160：2158-2165，和Chess，2001，“Blockade of the CD40L/CD40 Pathway，”在Therapeutic Immunology第二版中，Austen，Burakof，Rosen和Strom，Eds.，Blackwell Sciences(Pubs.)，第441-456页。

多发性硬化病：

在用髓鞘碱性蛋白或PLP髓鞘抗原诱导的B10P1L和(PLJ x SJL)F1小鼠中，在免疫时对CD40L的特异性封闭显著地抑制了实验性自体免疫脑脊髓炎(EAE)的发生率、死亡率、发作天数和临床得分。参见，例如，Gerritse，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：2494；Grewal等.，1996，Science 273：186；Laman等.，1998，Mult.Scler.4：14；和Chess，2001，同前所述。

类风湿性关节炎：

抗-CD40L阻滞关节炎症的发展、针对胶原蛋白的血清抗体滴度、炎症细胞向滑膜组织的渗透、以及在胶原蛋白诱导的关节炎中软骨和骨骼的腐蚀。参见，例如，Durie等.，1993，Science 261：132；和Chess，2001，同前所述。

胰岛素依赖性I型糖尿病模型：

非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠自发的发展T细胞依赖性自体免疫型糖尿病。抗-CD40L单克隆抗体治疗3-4周龄的NOD雌鼠(胰岛炎典型地开始的时间)完全防止了胰岛炎和糖尿病。细胞因子分析揭示在IFN-g和IL-2释放中的显著减少，而没有伴随由抗-CD40L-治疗的小鼠的T细胞产生的IL-4的增加。

同种异体移植物和异种移植物移植排斥的抑制：

在小鼠中，抗-CD40L防止对完全的同种异基因移植物的肾排斥的发展。并且，通过单独的抗-CD40L治疗，典型地延长了移植到进行肾切除手术的rehsus猴中的肾同种异体移植物的存活。类似地，在啮齿动物中，抗CD40L治疗防止了皮肤、胰岛细胞和心脏移植以及GVHD的移植排斥。参见，例如，Kirk等.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94：8789-8794；Parker等.，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：9560；Larsen等.，1996，Transplantation 61：4；和Chess，2001，同前所述。

单价抗-CD40L抗体多肽的应用

本文所述的抗-CD40L抗体多肽有效用于治疗或者预防CD40L/CD40-介导的途径的不适当激活参与的疾病或紊乱。特别地，自体免疫疾病通常包括CD40L/CD40途径的不适当的调控或激活。将本文所述的抗-CD40L抗体多肽施用给患有这样的疾病的个体，可以减轻所述疾病的一种或多种症状。本文所述的抗体多肽可以治疗性应用的疾病的非限制性实例包括系统性红斑狼疮(SLE)、Idiotypic Thrombocytopenic Purpura(ITP)、移植排斥、局限性回肠炎、炎性肠病(IBD)、大肠炎、哮喘/过敏症、动脉粥样硬化、重症肌无力、对重组药物产物如血友病中因子VII的免疫应答、多发性硬化病、银屑病、类风湿性关节炎、强直性脊椎炎、冠心病、以及包括1型和/或2型糖尿病的糖尿病。

本文所述抗-CD40L抗体多肽另外有效用于通常使用任何抗体制剂的方法中，例如，用于体内成像或诊断应用、体外诊断应用等。对于这些以及其它应用，可以必要地将抗-CD40L抗体多肽标记，例如，用荧光、比色的、酶促反应的或放射性标记。标记抗体多肽的方法是本领域公知的。

实施例

实施例1.重组CD40L的生物素化

将重组人可溶的CD40L(PeproTech)生物素化，并且用于噬菌体选择过程中。试剂、装置以及它们可获得的来源在表1中提供。

按照产品用法说明，通过将CD40L(0.5mg/ml)与EZ-Link^TM磺基-NHS-LC-生物素[磺基琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基)己酸酯](Pierce)以5∶1的摩尔比例在冰上温育2小时，而进行CD40L的生物素化。然后，将生物素化反应混合物在4℃在透析盒中针对3次更换的PBS(1000×样品体积)进行透析，以去除未结合的生物素化试剂。

通过与CD40/Fc结合的受体结合检测，检测生物素化-CD40L，以确定其生物活性。还通过在NuPaGE 4-12％Bis-Tris凝胶上分析而监测生物素-CD40L的质量，并且通过Simply Blue Safe-染色(Invitrogen)(图1a)，通过用链霉抗生物素蛋白-HRP探针探测的蛋白质印迹(图1b)而检测。生物素化-CD40L进一步通过使用大部分含有1或2个生物素部分的CD40L亚单位的质谱进行分析(数据未显示)。

表1

实施例2.使用生物素化的抗原选择噬菌体

结构域抗体(dAb)文库基于V_H(DP47和JH4b)和VK(DPK9和JK1)的单一人构架，其侧链多样性结合在与已知分子结构的抗原接触并且反映人抗体所有成分中多样化的残基的抗原结合位点位置。使用噬菌体载体pDOM4(Fd-Tet)，其编码Fd-噬菌体基因组，dAb表达受控于基因III启动子，所述抗体展示为共价连接到Fd-噬菌体蛋白pIII N端的融合蛋白。dAb盒由下列各项组成(5′到3’)：真核前导序列、dAb、myc标记、gIII。所述载体包含M13和colE1复制起点，并且可使用四环素选择。V_H和V_κ文库每一个具有大于1×10¹⁰个分子的计算大小。试剂、装置以及它们可获得的来源在表2中提供。

将每个结构域dAb文库的大约1×10¹¹个噬菌体在室温下在含有2％Marvel^TM的终体积1ml的PBS中温育1h。将生物素化的抗原添加到封闭的噬菌体中，以致噬菌体抗原混合物在PBS中具有2％的Marvel^TM终浓度。用于第一轮选择的抗原浓度是60nM；对第2轮，抗原浓度减少到6nM，并且对第3轮，减少到0.6nM。在～40rpm旋转下，将抗原/噬菌体混合物在室温下温育1h。

对于每次选择，通过在含有0.1％吐温-20的1ml PBS中洗涤1次，之后再在1ml PBS中洗涤1次，而制备100μl链霉抗生物素蛋白-包被的顺磁性珠粒(Dynal Biotech)。然后，在室温下，在转轮上，将所述珠粒在2ml eppendorf管中在含有2％Marvel^TM的1ml PBS中封闭1h。

将含有封闭的链霉抗生物素蛋白-包被的磁珠的管子置于磁性容器中，使得能够捕获磁珠。去除上层清液，并且将珠子重悬在抗原/噬菌体混合物中。将这一混合物旋转10min，以允许噬菌体/抗原复合物的珠粒捕获。

将所述珠粒使用磁性容器捕获，并且使用含有0.1％吐温-20的1mlPBS重复洗涤19次，然后用1ml PBS最后洗涤。在第3，9，15和19次洗涤步骤后更换eppendorf管，以将携带的背景噬菌体减少到最少。

然后，重新捕获洗涤的珠粒，并去除所有的洗涤溶液。通过重悬在500μl胰蛋白酶溶液(将50μl 10mg/ml胰蛋白酶储液添加到450μl PBS中，现用现稀释)中并且在室温下旋转10min，而洗脱噬菌体。通过使用磁性容器捕获所述珠粒和回收含有洗脱的噬菌体的液体而回收洗脱的噬菌体。将洗脱的噬菌体用来感染E.coli TG1，以制备用于下一轮选择的噬菌体。

将洗脱的噬菌体(250μl)与1.75ml对数期的E.coli TG1(OD₆₀₀在0.3-0.6)混合，并且在37℃不摇动允许感染发生30min。将感染的E.coli TG1培养物在室温下在微量离心机中以11,600g离心1min。将沉淀的细菌重悬在100μl 2×TY中，并且接种在含有补充了15μg/ml四环素的TYE的规则的9cm直径平板上。平板在37℃生长过夜。

过夜生长后，将含有15％甘油的2ml 2×TY添加到培养平板中，并且用涂布器将细胞松动，以确保细胞彻底混合。通过吸入到冷藏瓶中而回收2毫升的培养物，其中50μl用来接种50ml补充了15μg/ml四环素的2×TY。冷藏瓶中剩余的细胞保存在-80℃。

在250rpm摇动下，将50ml培养物在37℃生长16-24小时。

过夜生长后，将培养物以3,300g离心15min，以沉淀细菌。然后，向40ml澄清的上层清液中加入10ml PEG/NaCl，而将噬菌体从上层清液中沉淀下来。将噬菌体/PEG溶液混合并且在冰上温育至少1h。为了沉淀噬菌体，将溶液在4℃以3,300g离心30min。轻轻倒出上层清液，并且吸取而去除任何残余的上层清液。

将获得的噬菌体沉淀重悬在2ml PBS中，并且在微量离心机中以11,600g离心10min，以去除任何残余的细菌碎片。将上层清液通过0.45μm滤器(Sartorius，Minisart)过滤。重悬的噬菌体溶液用于下一轮选择。

表2

实施例3.将富集的噬菌体选择成果克隆到可溶dAb表达载体pDOM5中

在第二和第三轮选择后，获得感染了富集的展示dAb的fd-噬菌体群体的大肠杆菌细胞。将一份等分的这些细胞用来制备噬菌体DNA，并且将富集的V-基因通过使用限制性核酸内切酶SalI和NotI消化而切除。将纯化的V-基因连接到pDOM5(衍生于pUC119的表达载体，具有LacZ启动子、真核前导序列、dAb克隆位点、myc标记)相应的位点，并且将连接的DNA用来电转化在含有抗生素羧苄青霉素的琼脂平板上过夜生长的大肠杆菌HB2151细胞。以200μl微量培养物或50ml培养物，诱导得到的克隆以表达dAb蛋白。使用CD40L受体结合检测，分析得到的dAb的抑制活性。

在噬菌体选择后，使用Qiagen的QIAfilter Plasmid Midi DNA纯化试剂盒，按照制造者的用法说明，从50ml过夜大肠杆菌培养物中获得的细胞沉淀纯化pDOM4 DNA。通过混合下列各项而将dAb基因从pDOM4载体上切除：10μl 10×SalI缓冲液；1μl 100×BSA；20μg纯化的DNA片段；2.5μl SalI酶(10U/μl)；2.5μl NotI酶(10U/μl)；将消化混合物用无菌水补足到终体积100μl。将消化混合物在37℃温育5小时。

将消化的DNA样品在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，并且将与dAb V-基因(～324bp to 372bp)相应的条带从凝胶上切下。使用Qiagen的QIAquick凝胶提取试剂盒，按照制造者的用法说明，将dAb基因DNA从凝胶切片上纯化出来。

将表达载体pDOM5用SalI和NotI消化，如下述：10μl 10x SalI缓冲液；1μl 100x BSA；20μg质粒pDOM5；1.5μl SalI酶(10U/μl)；1.5μl NotI酶(10U/μl)；将消化混合物用无菌水补足到终体积100μl。将消化混合物在37℃温育2小时。消化的载体片段用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。

通过混合下列各项而连接消化的pDOM5和消化的dAb基因：2μl 10xT4DNA连接酶缓冲液；400ng消化的pDOM5载体；100ng消化的dAb基因；1μl T4DNA连接酶(400U/μl)；将连接混合物用无菌水补足到20μl。将连接混合物在25℃温育2小时。

将2微升连接混合物转移到预冷(在冰上)的0.2cm电穿孔杯的底部，电穿孔杯中加入100μl电转感受态大肠杆菌HB2151细胞。将DNA/细胞混合物在冰上温育1-2min，然后在2.5kV(25μF，200Ω)进行电穿孔。向杯中立即加入1毫升2xTY，并且将细胞轻轻地重悬。将重悬的细胞转移到14ml一次性培养管中，并且在37℃250rpm摇动下温育1小时。将从10^-0到10^-3的细胞稀释液接种到含有补充了5％葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素的TYE的规则9cm直径平板上。将细胞在37℃倒置培养过夜。试剂、装置以及它们可获得的来源在表3中提供。

表3

实施例4.可溶dAbs的微孔表达

在将选择的噬菌体dAb成果克隆到pDOM5中之后，将单个细菌克隆接种为微孔培养物，并且用IPTG诱导以表达dAb蛋白，使用CD40L受体结合检测分析dAb蛋白的抑制活性。试剂、装置以及它们可获得的来源在表4中提供。

仔细挑取单个细菌克隆，以确保避免相邻克隆的污染。将挑取的克隆用来接种96孔细胞培养平板，每孔含有100μl 2xTY，补充5％葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素。将盖子置于细胞培养平板上，将平板在湿润的氛围下在37℃在HiGro轨道摇床(GeneMachines，935 Washington St，San Carlos，CA 94070，USA)中以450rpm(4mm摇动轨道直径)过夜培养，气体(30％O₂+70％N₂)以5SLPM(每分钟标准升数)的流速每5分钟脉冲10秒。

[这些平板叫作原版平板(Master Plates)]。

过夜生长后，使用96孔转移装置将1-5μl细菌培养物转移到新的96孔培养板中，每孔含有100μl补充了0.1％葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素的2xTY。

将新接种的平板在37℃培养3-4h(450rpm摇动，气体(30％O₂+70％N₂)以5SLPM的流速每5分钟脉冲10秒)，直到培养物的OD₆₀₀达到1.0左右。然后，通过每孔加入100μl含有50μg/ml羧苄青霉素和2mM IPTG的2xTY中(终IPTG浓度为1mM)，而诱导所述培养物，在30℃过夜培养，并且在450rpm摇动，气体(30％O₂+70％N₂)以5SLPM的流速每5分钟脉冲10秒。[这些平板叫作诱导平板]。

通过向每孔加入100μl含有50％无菌甘油的2xTY，而制备初始原版平板的甘油储液。将这些平板保存在-80℃。

将诱导平板过夜培养后，通过在4℃以1,800g离心10min而将细菌细胞沉淀下来。然后分析上层清液(含有表达的dAb)，以确定dAbs在受体结合检测中是否能够抑制CD40L与CD40-Fc融合体的结合。

表4

实施例5.在50ml大肠杆菌中表达dAb

为了产生更多量的dAb蛋白用于分析，将50ml的培养物用来诱导。将在TYE平板上生长的需要的dAb的单克隆(例如DOM-24)接种到30ml通用管中10ml补充了5％葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素的2xTY中，并且在37℃250rpm摇动生长过夜。将500微升过夜培养物添加到50ml补充了0.1％葡萄糖和50μg/ml羧苄青霉素的2xTY中，并且在37℃250rpm摇动生长。与无菌2xTY比较，规律地监测培养物的OD₆₀₀，并且在OD₆₀₀为0.9时，通过加入1M IPTG至终浓度1mM而诱导所述培养物。将接种的培养物在30℃250rpm摇动培养过夜。第二天，将培养物在4℃以6000g离心15min，并且将澄清的上层清液与100μl蛋白质A层流或蛋白质L琼脂糖(预先用5mM MgSO₄洗涤)在4℃混合过夜。然后，将上层清液/珠粒混合物在4℃以180g离心2分钟。将上层清液轻轻倒出，并且将留下的珠粒用含有0.5M NaCl的10ml PBS洗涤。将珠粒溶液转移到96孔Whatman过滤平板中，并且将珠粒用含有0.5M NaCl的400μl PBS洗涤1次，然后用400μl PBS洗涤1次，在每次洗涤步骤后以180g离心2分钟。用70μl 0.1M甘氨酸(pH 2.0)洗脱dAb蛋白，并且通过加入40μl1M Tris-HCl(pH 8.0)而中和所述溶液。通过OD₂₈₀确定纯化的dAb浓度。

试剂、装置以及它们可获得的来源在表5中提供。

表5

实施例6.CD40L受体结合检测

CD40L检测用来测定CD40L与CD40的结合以及结合体(例如，单价抗体片段诸如dAbs)阻滞这一相互作用的能力，如下文所述以及在图7中示意性所示的那样。(来自R&D Systems的可溶蛋白为CD40/Fc＝同型二聚体和CD40L＝同型三聚体)。

在4℃，将96孔Nunc Maxisorp检测平板每孔用100μl在碳酸缓冲液中的0.5μg/ml重组人CD40/Fc(R&D Systems)包被过夜。使用Tecan平板洗涤器，将平板用300μl 0.05％吐温/PBS洗涤3次，并且用300μl PBS洗涤3次。将孔用含有2％(w/v)BSA的200μl PBS封闭，并且在室温下温育最少1h。按上述洗涤孔，然后向每个孔中加入50μl纯化的dAb蛋白(或者含有来自微量表达培养物的dAb的未纯化的上层清液)。还向每个孔中加入50μl在稀释剂中以6ng/ml的CD40L(终浓度为3ng/ml)，并且将平板在室温下温育1hr。

将平板按前文所述洗涤，并且加入100μl在稀释剂中以0.5μg/ml的生物素化的抗-CD40L抗体，并且在室温下温育1hr。按上文所述洗涤平板，然后向每个孔中加入100μl HRP缀合的抗生物素抗体(在稀释剂中1∶5000稀释)，并且将平板在室温下温育1hr。使用Tecan平板洗涤器，按上文所述再次洗涤平板，并且使用100μl SureBlue 1-Component TMBMicroWell过氧化物酶溶液将检测显色(将平板置于室温下达20min)。通过加入100μl 1M盐酸而终止反应。在加入酸30分钟之内检测平板的OD_450nm。OD_450nm与结合的链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物的量成比例，因此，dAb抑制的程度越大，得到的信号的OD_450nm越低。试剂、装置以及它们可获得的来源在表6中提供。

对照

包含下列对照：

●0ng/ml CD40L(只有稀释剂)

●3ng/ml CD40L

●3ng/ml CD40L与1μg/ml抗-CD40L抗体

表6

实施例7.结果

对于最有潜力的抑制剂的受体结合数据总结在下文图2，3和4以及在表7中。下文的表8提供在受体结合检测中鉴定为抑制CD40L与CD40结合的的独特的dAbs的DNA和翻译的氨基酸序列。

图2显示剂量反应受体结合检测(RBA)读数，其分析从1μM滴定到10pM的dAbs DOM-10，-20，-27，-30，-31，-62，-77对CD40L结合CD40-Fc的抑制。dAbs DOM-20，-30和-31是最有潜力的，IC₅₀值为8nM左右。

图3显示剂量反应受体结合检测读数，其分析从1μM滴定到500pM的dAbs DOM-4和DOM-5对CD40L结合CD40-Fc的抑制。dAbs DOM-5和DOM-4的IC₅₀值分别大约为3nM和100nM。

图4显示剂量反应受体结合检测读数，其分析从100nM滴定到0.5pM的dAb DOM-24对CD40L结合CD40-Fc的抑制。使用GraphPad Prism软件将数据进行曲线-适化处理。

表7

表8：使用CD40L/CD40-Fc受体抑制检测确定的展现出一定范围CD40L 抑制性IC ₅₀ 值的dAbs的总结。

在受体结合检测中鉴定为抑制CD40L与CD40结合的的独特的dAbs的DNA和翻译的氨基酸序列详细如下：

在所述DOM克隆中，已经进行了关于克隆之间的同源性的许多观察，并且在抗-CD40L dAbs的具体位点预测了氨基酸特性。这些在下述表9和10中显示：

表9.抗-VH CD40L克隆的预测：(使用标准的单字母氨基酸密码)

^*如果在位置99的氨基酸(模拟物)是P，那么G或D通常在位置100发现。

表10.抗-VK CD40L克隆的预测：

^*如果在位置28的氨基酸(模拟物)是D，那么E通常在位置34发现。

^**通过在位置34的氨基酸(模拟物)是E，那么Y通常在位置91发现，并且H或D通常在位置92发现。

实施例8：DOM8-24的PEG化

在这一实例中，DOM8-24的位置特异性顺丁烯二酰亚胺-PEG化需要在C端蛋白表面提供溶剂可及的半胱氨酸。一旦被还原给出游离的硫羟基(thiol)，那么半胱氨酸残基可以用来通过宽范围的给出二硫化物的化学试剂诸如顺丁烯二酰亚胺或其它的硫醇而特异性地将蛋白偶联到PEG上。宽范围的不同大小和分枝形式的化学修饰的PEGs可从Nektar(正式叫作Shearwater Corp)获得。这允许碱性dAb-cys可以通过各种方法配制，例如作为PEG化的单体、二聚体、三聚体、四聚体等。PEGs的大小以kDa给出，但是还可以称作K(即“40K PEG”＝40kDa PEG)。

DOM8-24cys的PCR构建

用于PEG附着的位点可以位于dAb表面的任何地方，只要靶点氨基酸是溶剂可及的，并且得到的PEG化蛋白仍保持抗原结合。因此，还可能将cys加工到dAb构架1-4的任一个中，用于PEG化作用，并且仍保持某些抗原结合。下列寡核苷酸用来特异性地PCR DOM8-24，使其具有用于克隆的SalI和BamHI位点，并且还引入C端半胱氨酸残基。

用于扩增加工的dAb的PCR引物的DNA序列显示如下。

正向引物

5’-AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3’(SEQ ID NO：86)

反向引物

5’-AAAGGATCCTTATTAGCACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3’(SEQ ID NO：87)

PCR反应(50μL体积)设置如下：200μM dNTP’s，0.4μM每种引物，5μL10x PfuTurbo缓冲液(Stratagene)，100ng模板质粒(DOM8-24)，1μLPfuTurbo酶(Stratagene)，并且用无菌水将体积调整到50μL。应用下述PCR条件：初始变性步骤94℃2mins，然后是25个循环的94℃30secs，64℃30sec和72℃30sec。还包括最后的延伸步骤72℃5mins。纯化PCR产物，并且将其用SalI和BamHI消化，并且连接到也已经用相同的限制性酶剪切的载体(pDOM5)中。正确的克隆通过DNA测序进行检验。

DOM8-24的表达和纯化

将DOM8-24载体转化到HB2151电感受态细胞中。使用100μg/mL羧苄青霉素选择携带dAb质粒的细胞。培养在2L带挡板的烧瓶中进行，其中含有500mL terrific肉汤(Sigma-Aldrich)和100μg/mL羧苄青霉素。将培养物在30℃ 200rpm生长至O.D.600为1-1.5，然后用1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，来自Melford Laboratories)诱导。允许dAb的表达在30℃持续12-16hrs。发现大部分dAb存在培养基中。因此，通过离心(8,000xg，30mins)将细胞与培养基分离，并且将上层清液用来纯化dAb。向每升上清中，加入10mL层流蛋白质A(Amersham Biosciences)，并且在室温下搅拌3小时或者在4℃过夜，允许dAb批量地结合。然后，在移除上清之前，允许树脂在重力下沉积1小时。然后，将琼脂糖装柱到XK 16柱(Amersham Pharmacia)中，并且用10个柱体积的2xPBS洗涤。将结合的dAb用100mM甘氨酸pH 3.0洗脱下来，然后通过加入1/5体积的1M Tris pH 8.0而中和含有蛋白质的级分。

使用MAL活化的PEG将DOM8-24cys PEG化

单体PEG化

将加工到VH dAb表面的半胱氨酸残基用单个线性的或分枝的PEG-MAL特异性地修饰，以给出单体修饰的蛋白。可以用于将单体VH或Vk dAb PEG化的mPEG-MAL形式如下。在大小上，PEGs可以是500-60,000的MW(例如，2,000-40,000)。

将2.5ml 500μM DOM8-24cys用5mM二硫苏糖醇还原，并且置于室温下20分钟。然后使用PD-10柱(Amersham Pharmacia)，将样品更换缓冲液。柱子用5mM EDTA，20mM磷酸钠pH 6.5，10％甘油预平衡，并且按照制造商指导上样和洗脱。将洗脱的样品(3.5ml～360μM dAb)置于冰上直到需要时。称重4倍摩尔过量的30K PEG-MAL或40K PEG2-MAL(Nektar)，并且直接加入到还原的dAb溶液中，轻轻搅拌直到聚合物溶解。将反应置于室温下进行3小时。

30K和40K PEG化DOM8-24cys单体的纯化

由于蛋白的等电点(pI)是～8，所以使用阳离子交换层析纯化PEG化的dAb。向每mL 30K或40K PEG DOM8-24cys反应液中加入40μL 40％冰醋酸，将pH减少到～4。然后，将样品上样到已经用50mM醋酸钠pH 4.0预平衡的1mL Resource S阳离子交换柱(Amersham Pharmacia)上。通过流过20多个柱体积的从0到500mM的线性氯化钠梯度，而将PEG化的物质与未修饰的dAb分离。用SDS-PAGE鉴定只含有PEG化dAb的级分，然后合并到一起，并且通过加入1/5体积的1M Tris pH 8.0而将pH增加到8。

体外功能性结合检测：CD40配体受体检测(CD40L RBA)

CD40L检测用来测定CD40L与CD40的结合和结合部分(包括单价抗体片段诸如dAbs)阻滞这一相互作用的能力，如图7所示。

将96孔Nunc Maxisorp检测平板在4℃每孔用100μl在碳酸盐缓冲液中的0.5μg/ml的重组人CD40/Fc(R&D Systems)包被过夜。使用Tecan平板洗涤器，将平板用300μl 0.05％吐温/PBS洗涤3次，并用300μl PBS洗涤3次。将孔用含有2％(w/v)BSA的200μl PBS封闭，并且在室温下温育最少1h。按上述洗涤孔，然后向每个孔中加入50μl纯化的dAb蛋白。还向每个孔中加入50μl在稀释剂中的6ng/ml的CD40L(终浓度为3ng/ml)，并且将平板在室温下温育1hr。将平板按前文所述洗涤，并且加入100μl在稀释剂中的0.5μg/ml的生物素化的抗-CD40L抗体，并且在室温下温育1hr。按上文所述洗涤平板，然后向每个孔中加入100μl HRP缀合的抗生物素抗体(在稀释剂中1∶5000稀释)，并且将平板在室温下温育1hr。使用Tecan平板洗涤器，按上文所述再次洗涤平板，并且使用100μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell过氧化物酶溶液进行检测(将平板置于室温下达20min)。通过加入100μl 1M盐酸而终止反应。在加入酸30分钟之内检测平板的OD_450nm。OD_450nm与结合的链霉抗生物素蛋白-HRP缀合物的量成比例，因此，dAb抑制的程度越大，得到的信号的OD_450nm越低。包含下列对照；0ng/ml CD40L(只有稀释剂)，3ng/ml CD40L和3ng/ml CD40L与1μg/ml抗-CD40L抗体。

CD40L RBA的结果在图9中显示。可以看出，PEG化的DOM8-24cys对于CD40L具有同未修饰的蛋白相似的亲和性。附着的聚合物的大小(30或40K)似乎没有显著地影响～1nM的IC50。

实施例9：双特异性dAb二聚体(DOM7h-26-DOM-24)的产生和表达

基本上按照WO2004/003019以及下文所述构建双特异性dAb二聚体。

使用引物VH-5’-NotI(5’-GTATGTCTGGCGGCCGCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTG-3’；SEQ ID NO：90)和VH-NO-XhoI(5’-TAGAATTCTTATTAGCTGGAGACGGTGACCAGGGT-3’；SEQ ID NO：91)，产生向DOM-24DNA序列中引入5’NotI和3’EcoRI限制性位点的PCR片段。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，并且切下适当的条带，并用Qiagen凝胶提取试剂盒清除凝胶。将纯化的DNA用NotI和EcoRI在37℃消化1小时，然后使用Qiagen PCR清除试剂盒纯化消化的DNA片段。用T4DNA连接酶将消化的PCR产物连接到衍生于pPICz-α(Invitrogen Ltd，Paisley，UK)的载体pCH3中，所述载体已经先用NotI的EcoRI消化，因而使得DOM-24DNA 3’序列相对于抗-人血清白蛋白dAbDNA序列(DOM7h-26)连接在一起。使用具有脉冲控制模式的BioradGenepulser II，将1微升的连接混合物用来电穿孔50μl大肠杆菌TOP10F’(0.2mm直径杯；25μFD；200Ω；2.500kV)。将电穿孔的细胞立即重悬在1ml低盐LB培养基(10g/l胰蛋白胨；5g/l酵母提取物；5g/l NaCl；用4MNaOH调整到pH 7.5；然后在121℃高压灭菌15min)中，并且将100μl细胞混悬液涂布到补充了25μg/ml zeocin(Invitrogen Ltd，Paisley，UK)的低盐LB琼脂平板上(10g/l胰蛋白胨；5g/l酵母提取物；5g/l NaCl；用4MNaOH调整到pH 7.5；15g/l琼脂；然后在121℃高压灭菌15min)，并且在37℃过夜生长。

使用α-因子测序引物(5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’；SEQ IDNO：92)和反向3’AOX1引物(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’；SEQID NO：93)，通过DNA测序分析来自过夜生长平板的一些单个克隆。通过接种100ml补充了25μg/ml zeocin的低盐LB培养基，并且在37℃250rpm摇动生长过夜，之后用Qiagen质粒小量制备试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA，而制备来源于含有需要的DNA序列的单个克隆的质粒制备物。

DNA的浓度和纯度通过测定在280nm和260nm处的吸收而确定。将10-50μg DNA用PmeI，SacI或BstXI限制性酶消化，并且通过在0.8％琼脂糖凝胶上分析而证实DNA的消化。使用Qiagen Qiaex II试剂盒(Qiagen)纯化消化的DNA，并且每20μl Qiaex II树脂将DNA洗脱在10μl纯化的水中。

通过将野生型毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X33划线到YPD琼脂平板(对于1升培养基：将20g来自1型肉类的蛋白胨；10g酵母提取物；20g琼脂溶解在900ml水中，并且通过在121℃高压灭菌15分钟而进行灭菌；之后当培养基冷却到50℃以下时，无菌加入100ml 20％destrose和需要量的zeocin)上，并且在30℃生长36-48h直到出现克隆，而制备感受态酵母细胞。将单个克隆接种到5ml YPD培养基(关于YPD琼脂，不加入20g琼脂)，并且在50ml带挡板的烧瓶中在30℃250rpm摇动下生长过夜。将0.1-0.5ml过夜培养物接种到在21带挡板的烧瓶中的500毫升YPD培养基中，并且在30℃250rpm摇动下生长过夜至OD600约为1.3-1.5。将培养物在冰上冷却，然后通过在4℃以1500g离心5min而收集毕赤酵母。弃掉上清，并且将沉淀重悬在500ml冰冷的超纯水中。通过在4℃以1500g离心5min而再次回收毕赤酵母。将沉淀再重悬和离心三次，第一次在250ml冰冷的超纯水中，然后两次在20ml冰冷的1M山梨醇中。在使用前将感受态毕赤酵母保存在冰上达6小时。

为了通过电穿孔而转化毕赤酵母，在预冷的微量离心管中，将在10μl水中的10-20μg线性载体与80μl感受态毕赤酵母混合，并且在冰上温育5min。然后，将毕赤酵母混合物转移到预冷的0.2cm缝隙的电穿孔杯中，并且进行电穿孔：在带有脉冲控制模板的Biorad Genepulser II中，25μF，电阻设置为无穷大，0.54kV。立即向电穿孔杯中加入1ml冰冷的1M山梨醇，并且将电穿孔的毕赤酵母转移到15ml聚丙烯管中。将这一培养物在30℃温育2小时，不摇动，以允许细胞复苏。然后，将细胞涂布到YPDS琼脂平板(补充了1M山梨醇的YPD琼脂)上，并且加入zeocin至终浓度100μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml和2000μg/ml。将平板在30℃黑暗中温育2-10天，直到出现克隆。从每个平板上挑取一些克隆，并且重新划线到补充了同它们最初选择所用的相同量的zeocin的YPD平板上。对于少量和中量摇瓶表达，没有确定每个X33克隆的Mut状况。

单个重新划线的克隆用来接种在250ml烧瓶中的50ml BMGY培养基(对于1升培养基：将20g来自1型肉类的蛋白胨；10g酵母提取物溶解在700ml水中，并且通过在121℃高压灭菌15分钟而进行灭菌；之后无菌加入100ml 1M KPO4 pH 6.0；100ml 10％甘油；和100ml 10xYNB(酵母氮基，Yeast Nitrogen Base)；2ml 500x生物素)，并且在30℃250rpm摇动下生长至达得2-6的OD600。通过在室温下以1500g离心5min而回收毕赤酵母。将得到的沉淀重悬在20ml BMMH培养基(除了用100ml of 5％甲醇取代100ml 10％甘油外，如同BMGY培养基)中，并且倒回新的250ml带挡板的烧瓶中，并在诱导后在30℃ 250rpm摇动下温育多达5天。在24h的时间间隔，回收0.5ml样品，并且通过SDS-PAGE分析上层清液而进行评估。

使用层流(Streamline)蛋白质-A基质(Amersham Biosciences)，从培养物上清中纯化二聚体dAb。在结合二聚体dAb后，将基质转移到含有玻璃料的空20ml层析柱上，并且允许上清流过柱子，留下基质。将所述基质用10倍基质体积的高盐缓冲液(10mM磷酸盐缓冲液，2.7mM KCl，487mM NaCl，pH 7.4)洗涤。将结合的蛋白用补充了0.15M NaCl的0.1M甘氨酸pH 3进行洗脱，并且收集0.8ml级分，将所述级分立即加入0.2ml1M Tris-HCl pH 8.0而中和。

双特异性dAb二聚体的同时抗原结合

为了证明所述双特异性二聚体dAb是功能性的，并且能够同时结合两个抗原，进行了抗原结合ELISA。在4℃将每孔50微升在PBS中的100μg/ml人血清白蛋白过夜包被到Maxisorb ELISA平板(Nunc)上。将平板用补充了0.1％(v/v)吐温20(Sigma)的PBS 250μl/孔洗涤3次。然后将平板在室温下每孔用200μl PBSM(补充了2％(w/v)低脂奶粉的PBS)封闭1h。如前洗涤平板，然后每孔加入50μl在PBSM中两倍稀释的二聚体dAb，并且在室温下温育1小时。如前洗涤平板，然后每孔加入50μl在PBSM中5nM生物素化的CD40L溶液，并且在室温下温育1小时。如前洗涤平板，然后每孔加入50μl在PBSM中1∶4000稀释的链霉抗生物素蛋白-HRP(Amersham Biosciences)，并且在室温下温育1小时。将平板用补充了0.1％(v/v)吐温20的PBS 250μl/孔洗涤4次，然后用PBS 250μl/孔洗涤2次。通过每孔加入50μl SureBlue 1-Component TMB MicroWell过氧化物酶溶液(KPL，Gaithersberg，MD)显色ELISA，并且在室温下温育几分钟直到获得理想的色彩强度。通过加入100μl 1M盐酸而终止反应，并且在450nm处读取(图10)。

双特异性Fab(DOM7h-2：CK DOM-24：CH)的产生和表达

除了将DOM7h-2和DOM-24 dAbs的DNA分别克隆到基于pPICz-α的独立的载体(分别含有人CK或人CH1结构域)中之外，用来产生双特异性Fab的方法基本上与用于双特异性dAb二聚体(DOM7h-26-DOM-24)所述的方法相同。这两种载体的每一种都设计成能够表达由符合阅读框地融合到适当的dAb 3’末端的CH1或CK结构域组成的单一多肽。为了获得完整的Fab片段的表达，将感受态毕赤酵母菌株X33同时用两种线性的载体转化。纯化同于用于二聚体Fab所述。

双特异性Fab的同时抗原结合

使用与用于上述双特异性dAb二聚体所述的相同的检测，进行双特异性Fab的同时抗原结合。结果在图11中显示。

L3055胞中对CD40/CD40L相互作用的CD40介导的CD54上调破坏(disruption)的抑制

检测单体dAb分子破坏细胞缔合的CD40L与CD40的结合的能力。这通过FACS测定在第一组Burkitt淋巴瘤细胞系L3055上CD40介导的CD54上调的抑制水平而确定。展示在L3055细胞上的CD40受到在转染了CD40L基因的成纤维细胞(典型地为小鼠L细胞)表面表达的CD40L的刺激，如早先有Garrone等.，1995(Garrone P.，Neidhardt E.V.，Garcia E.，Galibert L.，van Kooten C.，Banchereau J.(1995)J Exp Med 182，1265-1273)所述那样。

在加入L3055细胞之前，将含有dAbs的样品预先与L-细胞细胞一起温育1小时。将两种细胞系共同培养22小时，之后，将L-细胞染色用于FACS分析，如Baker等.，1998(Baker，M.P.，Eliopoulos，A.G.，Young，L.S.，Armitage，R.J.，Gregory，C.D.，Gordon，J.(1998)Blood，92(8)，2830-2843)和由Challa等.，2002(Challa，A.，Eliopoulos，A.G.，Holder，M.J.，Burguete，A.S.，Pound，J.D.，Chamba，A.，Grafton，G.，Armitage，R.J.，Gregory，C.D.，Martinez-Valdez，H.，Young，L.和Gordon，J.(2002)Blood，99(9)，3411-3418)所述的那样。

浓度为12μm的DOM-24(单体形式)的FACS分析表现出抑制。

与对照空白dAb和刺激的细胞踪迹相比，浓度为9μM的Vk DOM-116的FACS分析表现出抑制(图13)。

抗-CD40L治疗对针对KLH免疫的初级免疫应答的作用。

为了显示抗-CD40L治疗对针对KLH免疫的初级免疫应答的作用，可以进行由Gobburu，J.V.S.等.，1998所述的相似的研究(Gobburu，J.V.S.，Tenhoor，C.，Rogge，M.C.，Frazier，D.E.，Thomas，D.，Benjamin，C.，Hess，D.M.，和Jusko，W.J.(1998)JPE T，286，925-930)。

研究样品可以如下：在时间第0h，168h和336h，以10mg/kg的剂量给猕猴注射抗-CD40L抗体或dAb形式。在24h，动物接受100μg高度纯化的匙孔血蓝蛋白(KLH)的单次皮内注射。在开始之前和在完成所述研究之后检测血清的KLH应答。允许动物复苏适当的时间，以确保dAb分子已经从循环中清除，然后注射KLH(无dAb)，以确定动物是否可以出现针对KLH的免疫应答。如果在研究开始之前检测到针对KLH的更早的应答，那么可以使用备选的抗原。

针对KLH的免疫应答通过适当的ELISA、RIA或抗体滴度检测而测定。预计结果将表明PEG化的单体DOM-24抑制动物针对KLH的免疫应答。这将在与阳性对照相比抗体滴度的减少中表现出来。将所述结果标准化，以便将阳性对照认为是100，并且在施用dAbs后免疫应答的减少将在10-90％即90-10个单位范围内。

DOM7h-26-DOM-24的序列

LEKREVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDEYNMSWVRQAPGKGLEWVSTILPH

GDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQDPLYRFDYWGQG

TLVTVSSAAAEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYQMAWVRQAPGKGLEW

VSSITSEGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGKNFDY

WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：88)

DOM7h-26的序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQKIATYLNWYQQKPGKAPKLLIYRSSSLQSAVPS

RFSGSGSGTVFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYAVPPTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：89)

本文引用的所有专利、专利申请和发表的参考文献都通过参考完全结合于此。尽管本发明参考其优选的实施方案已经得到具体的显示和描述，但是本领域的技术人员应该理解，在不背离由附上的权利要求所包括的本发明的范围情形下，可以从中进行形式和详情中的各种改变。

附件1；在体内增加半衰期的多肽。

α-1糖蛋白(血清类黏蛋白)(AAG)

α-1抗胰凝乳蛋白酶(Antichyromotrypsin)(ACT)

α-1抗胰蛋白酶(AAT)

α-1微球蛋白(蛋白HC)(AIM)

α-2巨球蛋白(A2M)

抗凝血酶III(AT III)

脱脂载脂蛋白A-1(Apo A-1)

脱脂载脂蛋白B(Apo B)

β-2-微球蛋白(B2M)

血浆铜蓝蛋白(Cp)

补体成分(C3)

补体成分(C4)

C1酯酶抑制剂(C1 INH)

C-反应蛋白(CRP)

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)

铁蛋白(FER)

凝血因子I(FIB)

纤连蛋白(FN)

触珠蛋白(Hp)

血红素结合蛋白(HPX)

免疫球蛋白A(IgA)

免疫球蛋白D(IgD)

免疫球蛋白E(IgE)

免疫球蛋白G(IgG)

免疫球蛋白M(IgM)

免疫球蛋白轻链(κ/λ)

脂蛋白(a)[Lp(a)]

甘露糖-结合蛋白(MBP)

肌红蛋白(Myo)

新生儿Fc(FcRn)

纤维蛋白溶酶原(PSM)

前白蛋白(运甲状腺素蛋白)(PAL)

视黄醇结合蛋白(RBP)

Rheomatoid因子(RF)

血清淀粉样A成分(SAA)

可溶运铁蛋白受体(sTfR)

运铁蛋白(Tf)

附件2

附件3：肿瘤学联系

序列表

<110>S·格兰特等

<120>单价结合CD40L的组合物和应用方法

<130>8039/2138

<140>Not yet assigned

<141>2005-09-17

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<151>2004-09-17

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<151>2005-04-08

<160>477

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>1

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Artificial

<220>

<223>Primary amino acid sequence of Vk dummy

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>PRT

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<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>23

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<210>25

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>116

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<213>Homo sapiens

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>29

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>29

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Leu Tyr

20 25 30

Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Asp Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>30

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>30

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr

20 25 30

Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Asn Gly Asn Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Gly Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>31

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>31

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr

20 25 30

Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Arg Tyr

20 25 30

Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Asp Asp Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr

20 25 30

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r Thr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Val Tyr

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

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<211>108

212>PRT

213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Asp Ser

20 25 30

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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20 25 30

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50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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115

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

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115

<210>46

<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>47

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20 25 30

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<210>48

<211>122

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>48

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Leu Tyr

20 25 30

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<210>49

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>49

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser

20 25 30

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>50

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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<210>51

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>51

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser

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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>52

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>52

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gln

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>53

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Val Asp Glu

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u Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>54

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ala

20 25 30

Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr Leu Gly Ser Asp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>55

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>55

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Tyr Gly Gly

20 25 30

Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>56

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>56

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ala Tyr

20 25 30

Arg Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

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50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210>57

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>57

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Arg Tyr

20 25 30

Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Thr Ala Gln Gly Leu Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

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<210>58

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>58

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

Ala Lys Ala Leu Ala Asp Arg Ser Gly Gly Val Val Glu Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>59

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>59

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr

20 25 30

Asp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Asp Thr Asp Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>60

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>60

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1 5 10 15

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115

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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85 90 95

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<210>62

211>120

212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>62

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1 5 10 15

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20 25 30

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115 120

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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20 25 30

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100 105 110

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115

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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100 105 110

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>66

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>66

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

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20 25 30

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Thr Val Ser Ser

115

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<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>68

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Asp Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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65 70 75 80

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<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

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<210>70

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>70

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Gly Tyr

20 25 30

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<210>71

<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>71

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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85 90 95

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<210>72

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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100 105 110

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<210>73

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>73

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20 25 30

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>74

<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>74

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Gln Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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<210>75

<211>122

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>75

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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50 55 60

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85 90 95

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100 105 110

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115 120

<210>76

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>76

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr

20 25 30

Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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65 70 75 80

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85 90 95

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115

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<211>116

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<213>Homo sapiens

<400>77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr

20 25 30

Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr A la Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>78

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>78

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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<210>79

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>79

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Ala Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120

<210>80

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Leu Tyr

20 25 30

Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Asp Ser Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

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115

<210>81

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>81

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Gln Tyr

20 25 30

Gln Met Ala Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>82

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>82

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1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctgcgtctct cctgtgcagc ctccggattc acctttagta attatcagat ggcgtgggtc 120

cgccaggctc cagggaaggg tctagagtgg gtctcaagta ttactagtga gggtggttcg 180

acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct cccgcgacaa ttccaagaac 240

acactgtatc tgcaaatgaa cagcctgcgt gccgaggaca ccgcggtata ttactgtgcg 300

aaaccgggta agaattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgtgctaa 360

taaggatcc 369

<210>84

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>84

cgcagctgcc tccacgtcga caacctcaga ccccctccga accatgtcgg accccccagg 60

gacgcagaga ggacacgtcg gaggcctaag tggaaatcat taatagtcta ccgcacccag 120

gcggtccgag gtcccttccc agatctcacc cagagttcat aatgatcact cccaccaagc 180

tgtatgatgc gtctgaggca cttcccggcc aagtggtaga gggcgctgtt aaggttcttg 240

tgtgacatag acgtttactt gtcggacgca cggctcctgt ggcgccatat aatgacacgc 300

tttggcccat tcttaaaact gatgacccca gtcccttggg accagtggca gagcacgatt 360

attcctagg 369

<210>85

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(120)..(121)

<223>X corresponds to stop codon in coding sequence

<400>85

Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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<210>86

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

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<400>86

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<212>DNA

<213>Artificial

<220>

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<400>87

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<210>88

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>88

Leu Glu Lys Arg Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

1 5 10 15

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr

20 25 30

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35 40 45

Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Leu Pro His Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr

50 55 60

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65 70 75 80

Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala

85 90 95

Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Asp Pro Leu Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln

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Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gln Met Ala

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile

165 170 175

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180 185 190

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro

210 215 220

Gly Lys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210>89

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>89

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro

85 90 95

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<211>51

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

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<210>91

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

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<400>91

tagaattctt attagctgga gacggtgacc agggt 35

<210>92

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>Alpha factor seguencing primer

<400>92

tactattgcc agcattgctg c 21

<210>93

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>AOX1reverse primer

<400>93

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210>94

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>94

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttct gattatgaga tgatgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attacttcgg atggtatttc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ttccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaagtggg 300

aggttttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>95

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>95

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ctaatactct actacaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taatgaagcc taccataaag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag aaggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg cttttcaccc 300

tccaaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>96

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>96

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat aattatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attacgagtg atggtacttc gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctaat 300

ccgccgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>97

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>97

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacta ttaatactct actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgctcac taccatgaag ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggatta 300

ggcggcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>98

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>98

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gggtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attacgagtg atggtacgag tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300

ctgcgttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>99

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>99

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacta cccatactct accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgctcac taccatgctc atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300

gacgcaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>100

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>100

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat ttgtatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attactagtg atggtgtttc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctggg 300

gtgatttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>101

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>101

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta aacatactct actgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgatcac taccacaaag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgaccc 300

cactaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>102

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>102

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gtttattgat acgtcgttag agtggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gggtcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagatttag ctacgtacta ctgtcaacag tattgggttc ttcctctgac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

<210>103

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>103

ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt caaataacta tgcagcaatc tcaccatagt cgtctttggt 120

ccctttcggg gattcgagga ctagatacta cccagggtaa acgtttcacc ccagggtagt 180

gtaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240

cttctaaatc gatgcatgat gacagttgtc ataacccaag aaggagactg caagccggtt 300

ccctggttcc acctttagtt tgcc 324

<210>104

<211>351

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>104

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttagtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttatt gcttatgata tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatgg attgatgagt ggggtctgca gacatactac 180agactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagacg 300

cctgaggagt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351

<210>105

<211>351

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>105

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aatcatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaataa cgaatactat actcaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagtacc taactactca ccccagacgt ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttttctgc 300

ggactcctca aactgatgac cccagtccct tgggaccagt ggcagagctc g 351

<210>106

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>106

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt gattatgaga tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attgatggtg agggttctga tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300

aggagttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>107

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>107

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca ctaatactct actcaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtccc taactaccac tcccaagact atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300

tcctcaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>108

<211>354

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>108

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg ttgtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attgatattt tgggttcgag gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagatctg 300

tcgtggcagg gttttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354

<210>109

<211>354

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>109

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatcc aacatactct accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtccc taactataaa acccaagctc ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttctagac 300

agcaccgtcc caaaactgat gaccccagtc ccttgggacc agtggcagag ctcg 354

<210>110

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>110

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttct tattattcga tgtattgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg atttcgcctt ttggttgggg tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagga cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300

gagacgagtg gtccgatttc tgagaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>111

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>111

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ataataagct acataaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taaagcggaa aaccaacccc atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttcct gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttataccc 300

ctctgctcac caggctaaag actcttaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>112

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>112

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg tcttatgata tgacgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attatggctt cgggtgatga tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatgggat 300

cgggattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>113

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>113

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaacc agaatactat actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taataccgaa gcccactact atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttacccta 300

gccctaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>114

<211>360

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>114

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gagtatgtta tgtcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact atttctccta ttggtctgac tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaatttcct 300

ttgattattc ttcctgattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360

<210>115

<211>360

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>115

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctcatacaat acagcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taaagaggat aaccagactg atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ccttaaagga 300

aactaataag aaggactaaa actgatgacc ccagtccctt gggaccagtg gcagagctcg 360

<210>116

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>116

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gagtatgcga tgatttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatt atttctccgc ttggtttgtc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatcag 300

gattcgtctg atagtcagta tacgaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtct cgagc 369

<210>117

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>117

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg gaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatac ctcatacgct actaaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttaa taaagaggcg aaccaaacag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttatagtc 300

ctaagcagac tatcagtcat atgcttaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>118

<211>363

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>118

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gattatggga tggggtgggc ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attggtcctc tgggtctttg gacatactac 180

gcagactccg cgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatctccg 300

cttgagggtt tgattacgaa ttttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360

agc 363

<210>119

<211>363

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>119

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctaataccct accccacccg ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taaccaggag acccagaaac ctgtatgatg 180

cgtctgaggc gcttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttagaggc 300

gaactcccaa actaatgctt aaaactgatg accccagtcc cttgggacca gtggcagagc 360

tcg 363

<210>120

<211>357

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>120

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttcct gagtatgata tgacgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatat attagttctg atggttattc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgcat 300

gggagtccgc gggagtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357

<210>121

<211>357

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>121

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagga ctcatactat actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagtata taatcaagac taccaataag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcgta 300

ccctcaggcg ccctcaaact gatgacccca gtcccttggg accagtggca gagctcg 357

<210>122

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>122

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cccctttccg cagtatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg attacttctg atggtcttga tacatattac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctgag 300

cctctttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>123

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>123

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa ggggaaaggc gtcatagtct accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttac taatgaagac taccagaact atgtataatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggactc 300

ggagaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>124

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>124

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg ggttatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggt attagttcgg agggtcttac tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaattgggg 300

cgtaggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>125

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>125

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaagc ccaatagtct accgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcca taatcaagcc tcccagaatg atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttaacccc 300

gcatccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>126

<211>360

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>126

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg aattatgaga tggggtgggc ccgccaggct 120 agggaagg gtctagagtg ggtctcagtt atttctgagt ggggttattc tacatactac 180

gcagactccg cgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacttgtg 300

ggtgggactc agtatgagtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360

<210>127

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>127

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc ttaatactct accccacccg ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcaa taaagactca ccccaataag atgtatgatg 180

cgtctgaggc gcttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgaacac 300

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>128

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttcat aattatgaga tgtcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt atttcttcgg gtggttcttc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300

gttaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>129

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagta ttaatactct acagcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taaagaagcc caccaagaag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300

caattcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>130

gaggtgcagc tgttggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg ctgtatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attacgggtg atggtatttc gacatactac 180

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aggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctccacgtcg acaacctcag gccccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaccc gacatactct actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taatgcccac taccataaag ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggtcctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgaccc 300

tccttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt aattatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attactagtg agggtggttc gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300

aagaattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>133

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatca ttaatagtct accgcaccca ggcggtccga 120

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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aagacgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>138

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagggacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

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gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

<210>161

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>161

ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt cctataacca ttattaaatc tcaccatggt cgtctttggt 120

ccctttcggg gatccgagga ctagatagta cccaggacca acgtttcacc ccagggtagc 180

gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagaat ggtagtcgtc agacgttgga 240tctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atactaaaat taggatgatg caagccggtt 300

ccctggttcc acctttagtt tgcc 324

<210>162

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>162

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ctgtgtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gaatattgat ggtctgttat ggtggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg gggtccgggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aaggcttttg agccttttac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

<210>163

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>163

ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct gacacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt cttataacta ccagacaata ccaccatagt cgtctttggt 120

ccctttcggg gattcgagga ctagatacgc cccaggccca acgtttcacc ccagggtagt 180

gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240

cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc ttccgaaaac tcggaaaatg caagccggtt 300

ccctggttcc acctttagtt tgcc 324

<210>164

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>164

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcgtatgata tgggttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgggaggg atggttcttt tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctcgt 300

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<210>165

<211>357

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>165

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaattc cgcatactat acccaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtgtc taaccctccc taccaagaaa atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggagca 300

gccatacgat aaaaatgaaa actagcccca gtcccttggg accagtggca gagctcg 357

<210>166

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>166

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt gagtatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgcgaatg atggttcgac tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300

cggcagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>167

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>167

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaaa ctcatactct actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taacgcttac taccaagctg atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacta 300

gccgtcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>168

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>168

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt ccgtatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgttggtg atggtctgga tacatactac 180

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ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggat 300

cgggtttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>169

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>169

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca ggcatactct actgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taacaaccac taccagacct atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccta 300

gcccaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>170

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct tcttatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120

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ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac tccgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300

agggcttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacga agaatactct accgcaccca ggcggtccga 120

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatgc agaatactct accccaccca ggcggtccga 120

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<210>174

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<210>176

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<211>366

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<210>178

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>188

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggtga ccgtgtcacc 60

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<400>189

ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatccact ggcacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt cctataaccc agacgcaatt ccaccatagt cgtctttggt 120

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<210>191

<211>324

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<213>Homo sapiens

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ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt ccgctaaata ccccccaatg ccaccatggt cgtctttggt 120

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gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg cttttgaaac 300

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tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg cggtatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attactgctc agggtcttgg gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca actccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatctt 300

actgatttta gtagtgggca tcaggagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>195

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>195

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc gccatactct accccaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtgcc taatgacgag tcccagaacc ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt tgaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttatagaa 300

tgactaaaat catcacccgt agtcctcaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>196

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>196

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat gattatacta tgggttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attcatggga ctggtggtca gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctttg 300

gctgatagga gtgggggggt tgttgagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>197

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>197

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta ctaatatgat acccaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtacc taagtaccct gaccaccagt ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgaaac 300

cgactatcct caccccccca acaactcaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>198

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>198

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60ctgtgcag cctccggatt caccttttct gagtatgata tgtattgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgatactg atggtgggga tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300

ctgaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>199

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>199

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60gacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ctcatactat acataaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtacc taactatgac taccacccct atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacca 300

gacttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>200

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>200

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gtttatacta tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaacg attgatgagt ctggtcgtga tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300

gtttggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>201

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>201

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc caaatatgat accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagttgc taactactca gaccagcact atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacca 300

caaaccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>202

<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>202

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttctg gattatgcga tgggttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact atttctccga tgggtatggg tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatcgagt 300

gctatttcgt ttacttctga tatttctaat tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360

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<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>203

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagac ctaatacgct acccaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taaagaggct acccataccc atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttagctca 300

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tggcagagct cg 372

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<211>360

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>204

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct gcttatgcta tgacgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatat attagtccga atggtacggc gacatactac 180agactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaatatgtg 300

gggatgcgtt ggaattcttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>205

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacga cgaatacgat actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtata taatcaggct taccatgccg ctgtatgatg 180tctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

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<210>206

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>206

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg agttatgaga tggcttgggt ccgccaggct 120

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>207

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaagc tcaatactct accgaaccca ggcggtccga 120

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<210>208

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>208

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat gagtatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120

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gcagactccg taaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>209

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta ctcatactct actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taatgatcac tcccatcacc ctgtatgatg 180

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gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggatta 300

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<210>210

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact attactagtg agggtcattc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300

acttcgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ctaatactct acaacaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taatgatcac tcccagtaag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggaccc 300

tgaagcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>212

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt gattatgaga tgagttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgattctg atggtagttt tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300

gtgaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>213

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>213

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatca ctaatactct actcaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taactaagac taccatcaaa atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccca 300

cacttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>214

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>214

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gattatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct atttcttcta ctggtcagtc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300

aataagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>215

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>215

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaattc ctaatactct actgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taaagaagat gaccagtcag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccca 300

ttattcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>216

<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>216

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttctt gattatggta tggcttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct atttcgcctc ttggtcttag tacatactac 180

gcagactccg tgaagagccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagaggtg 300

agggtgggta ggggtgttca tcctccgaag tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gc 372

<210>217

<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>217

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60gacacgtc ggaggcctaa gtggaaagaa ctaataccat accgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcga taaagcggag aaccagaatc atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttctcggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttctccac 300

tcccacccat ccccacaagt aggaggcttc aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360

tggcagagct cg 372

<210>218

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>218ggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aattatgcta tgtcgtgggt ccgccaggct 120

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ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaaagaag 300

gttggggcgt ggctgcagtc gcggagtttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>219

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>219

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ttaatacgat acagcaccca ggcggtccga 120

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gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttttcttc 300

caaccccgca ccgacgtcag cgcctcaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>220

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>220

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag ggttatccta tgtcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attagtcctt tgggtcctga tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaactgttg 300

atgggggagt atttgaattc taggacgttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>221

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>221

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ccaataggat acagcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taatcaggaa acccaggact atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttgacaac 300

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cagagctcg 369

<210>222

<211>362

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>222

tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag 60

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gc 362

<210>223

<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>223

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc cgcataggat acagcaccca ggcggtccga 120

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cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgaatca 300

cgaccccgcc tctgagtaca aatagccgaa aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360

tggcagagct cg 372

<210>224

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>224

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttct aagtatgata tgtcttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attctggagg atggtctgac tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300

cgtttgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>225

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>225

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ttcatactat acagaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taagacctcc taccagactg atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300

gcaaacaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>226

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>226 ggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg gattatccta tgacgtgggt ccgccaggct 120

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gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctgag 300

aaggattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

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<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>227ccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaagc ctaataggat actgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taagacagag gcccatgcct ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgactc 300

ttcctaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>228

<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>228

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctcgggatt cacctttttg cagtatccga tgggttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact atttctcctg ttggtttgac tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaattgttt 300

gaggggtcga ggattcagcg tgatgtgggt tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360

accgtctcga gc 372

<210>229

<211>372

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>229cacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggagccctaa gtggaaaaac gtcataggct acccaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taaagaggac aaccaaactg atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttaacaaa 300

ctccccagct cctaagtcgc actacaccca aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360

tggcagagct cg 372

<210>230

<211>366

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>230

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gagtatggta tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact atttctccgc tgggtatttc gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacatgct 300

acgtctcagg agtctttgcg gtcttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360

tcgagc 366

<210>231

<211>366

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>231

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctcataccat accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taaagaggcg acccataaag ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgtacga 300

tgcagagtcc tcagaaacgc cagaaaactg atgaccccag tcccttggga ccagtggcag 360

agctcg 366

<210>232

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>232aggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aggtatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccggggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attagttctg atggtggggg gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300

catcggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>233

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>233 ccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc tccatagtct accgcaccca ggcggtccga 120

ggccccttcc cagatctcac ccagagttgc taatcaagac taccaccccc ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacca 300

gtagccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>234

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>234

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt cgttatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct atttcttctg atggtggggg gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgtct 300

cgtcggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>235

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>235

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca gcaatagtct accgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taaagaagac taccaccccc ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcaga 300

gcagccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>236

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>236

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtt cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag ttgtatccga tggcgtgggt ccgccaggct 120agggaagg gtctggagtg ggtctcatcg atttctccgg ttggttttct gacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagggcat 300

gaggggtcgt atactccgcg gtcggctttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>237

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>237

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccaa ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc aacataggct accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagtagc taaagaggcc aaccaaaaga ctgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttcccgta 300

ctccccagca tatgaggcgc cagccgaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>238

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>238

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtg gcgtatccta tggcgtgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact attgcgcctc tgggtggtaa tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggccg 300

gaggggctgc agattgattc tcagaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360

gtctcgagc 369

<210>239

<211>369

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>239

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60ggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacac cgcataggat accgcaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taacgcggag acccaccatt atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgccggc 300

ctccccgacg tctaactaag agtcttaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360

cagagctcg 369

<210>240

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>240

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ttgtatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgattctt ctggtagtga tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgag 300

cgtgattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>241

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>241

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc aacatagtct accgaaccca ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taactaagaa gaccatcact atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggactc 300

gcactaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>242

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>242

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg cagtaccaga tggcttgggc ccgccaggct 120agggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgcgtcgg atggtgtttc tacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagttggt 300

cgtgattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348

<210>243

<211>348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>243

ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60

aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatcc gtcatggtct accgaacccg ggcggtccga 120

ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taacgcagcc taccacaaag atgtatgatg 180

cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240

gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcaacca 300

gcactaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348

<210>244

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>244

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gcctattggt cctgatttac tgtggtacca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattgggctt ttcctgtgac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

<210>245

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>245

ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt cggataacca ggactaaatg acaccatggt cgtctttggt 120

ccctttcggg gattcgagga ctagatagtc tgcaggtaaa acgtttcacc ccagggtagt 180

gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240

gttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc ataacccgaa aaggacactg caagccggtt 300

ccctggttcc acctttagtt tgcc 324

<210>246

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>246

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Gln Tyr

20 25 30

Asp Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Asp Glu Ala Gly His Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Met Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>247

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>247

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asp Ala

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg His Ser Thr Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>248

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>248

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Glu Ser

20 25 30

Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

er Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Trp Lys Ala Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>249

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>249

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Val Glu Asp

20 25 30

Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ala Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Arg Arg Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>250

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>250

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Pro Met

20 25 30

Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Leu Val Thr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>251

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>251

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Ala

20 25 30

Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Gly Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe Gln Glu Pro Val

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>252

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>252

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gln Ile Ser Asp Glu

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Val Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Phe Pro Ser

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>253

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>253

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Asp Tyr

20 25 30

Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Phe Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala Arg Tyr Tyr Tyr Leu Ser Gln Ile Lys Asn Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>254

<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>254

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Ile Tyr

20 25 30

Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Pro Leu Gly Leu Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Lys Glu His Gly Asp Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>255

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>255

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Leu Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Pro Thr Gly Leu Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Lys Arg Ser Gly Lys Thr Asp Asp Thr Asn Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>256

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>256

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Glu Tyr

20 25 30

Asp Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Val Gly Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gln Asp Arg Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>257

<211>118

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>257

Glu Val Gln Pro Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Lys Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Arg Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Leu Phe Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210>258

<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>258

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Ser Pro Ile Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asn Ala Tyr Asp Arg Lys Ser Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>259

<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>259

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Tyr

20 25 30

Val Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Glu Trp Val

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Ser Gly Ile Thr Pro Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Leu Gly Arg His Phe Asp Pro Leu Leu Pro Ser Phe Asp

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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Thr Ile Thr Pro Gly Gly Phe Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Thr Ser Ser Gly Glu Leu Gln Leu Val Glu Asp Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Lys His Ser

20 25 30

Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Arg Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg

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Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Ser Asn Tyr

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Lys

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<212>PRT

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

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<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>278

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Glu Tyr

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<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>280

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Arg Tyr

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<210>281

<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<210>282

<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>282

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr

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<210>283

<211>124

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>283

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Ser Tyr

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<210>284

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>284

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>285

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

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20 25 30

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115

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>286

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>287

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Glu Tyr

20 25 30

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115

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<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>288

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115

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<211>123

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>289

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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20 25 30

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100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>290

<211>116

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>290

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr

20 25 30

Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Ser Val Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>291

<211>121

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>291

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr

20 25 30

Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Trp Ile Glu Ala Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Leu Thr Asp Gln His Val Ile Glu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210>292

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>292

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Tyr

20 25 30

Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ala Pro Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Trp Gly Met Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

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<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>293

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ser Tyr

20 25 30

Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Gly Pro Ile Gly Phe Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<211>120

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>294

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Ala Tyr

20 25 30

Trp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Thr His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

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Ser Val Ile Ser Glu Val Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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20 25 30

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<210>310

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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<210>311

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ala Asp

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>312

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>312

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Ser Asp

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu Ile

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<210>313

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>313

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Asp

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Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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<210>314

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>314

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100 105

<210>315

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>315

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Asp

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Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>316

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>316

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1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asp

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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65 70 75 80

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>317

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>317

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Thr Thr Ser

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>318

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>318

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile His Thr Asn

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

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65 70 75 80

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys Arg

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<210>319

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>319

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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile His Thr Asp

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>320

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>320

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Asn

20 25 30

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35 40 45

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210>321

<211>108

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>321

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Thr Asn

20 25 30

Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Arg Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

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<211>108

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<212>PRT

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<213>Homo sapiens

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<211>119

<212>PRT

<213>Homo sapiens

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50 55 60

Cys Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala

65 70 75 80

Gly Cys Ala Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr

85 90 95

Thr Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys

100 105 110

Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys

115 120 125

Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys

130 135 140

Thr Ala Thr Cys Ala Thr Ala Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Thr

145 150 155 160

Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys

165 170 175

Ala Thr Cys Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys

180 185 190

Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly

195 200 205

Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr

210 215 220

Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr

225 230 235 240

Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala Cys Gly Thr

245 250 255

Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly

260 265 270

ly Gly Ala Thr Ala Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Thr Ala Thr

275 280 285

Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala

290 295 300

Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala

305 310 315 320

Ala Cys Gly Gly

<210>379

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gacatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gtgcgggctg tgccttatac gtttggccaa 300

gggaccaagg tggaaattaa acgg 324

<210>380

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttcgttttt ctccttatac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

<210>381

<211>324

<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tcttatgcta ggcctgtgac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60

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gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

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gaggattttg ctacgtacta ctgtcaacag tataaggtta ggcctaatac gttcggccaa 300

gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatttatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240

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gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180ttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctacaacct 240

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gggaccaaag tggaaatcaa acgg 324

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<212>DNA

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<211>369

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<212>DNA

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<211>348

<212>DNA

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<211>348

<212>DNA

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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<212>DNA

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

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tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct tcgtatccga tgggttgggt ccgccaggct 120

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60

tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg gcttattgga tggtttgggt ccgccaggct 120

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<212>DNA

<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

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<213>Homo sapiens

<400>477

ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60

tagtgaacgg cccgttcagt ctcgtaatcg tcgataaatt taaccatggt cgtctttggt 120

ccctttcggg gattcgagga ctagatacga cgtaggtcaa acgtttcacc ccagggtagt 180

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cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc tcaatgtcat ggggattatg caagccggtt 300

ccctggttcc acctttagtt tgcc 324

Claims

1.包括抗体单一可变结构域多肽的、单价与CD40L结合的抗体多肽在制备用于治疗或者预防自体免疫疾病症状的药物中的应用，其中所述单一可变结构域多肽拮抗CD40或CD40L或者两者的活性，并且其中所述抗体多肽抑制包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的抗体单一可变结构域与CD40L的结合，其中所述抗体多肽以200pM-50nM的IC50抑制CD40L与CD40的结合，其中所述抗体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:75相同。

2.按照权利要求1的应用，其中所述自体免疫疾病是选自由下列各项组成的组的疾病：系统性红斑狼疮、多发性硬化病、类风湿性关节炎、糖尿病、同种异体移植排斥、异种移植排斥和移植物抗宿主疾病。

3.按照权利要求1的应用，其中所述抗体多肽由单一可变结构域多肽组成。

4.按照权利要求1的应用，其中所述单一可变结构域多肽是人抗体单一可变结构域多肽。

5.按照权利要求1的应用，其中所述单一可变结构域多肽是V_H或V_L结构域。

6.按照权利要求1的应用，其中所述抗体多肽的氨基酸序列与SEQID NO:26相同。

7.按照权利要求1的应用，其中所述抗体多肽与CD40L的结合基本上不激动CD40和/或CD40L活性。

8.按照权利要求1的应用，其中所述抗体多肽在标准血小板聚集检测中的存在没有引起比在阴性对照检测中观察到的聚集高出25％的聚集。

9.按照权利要求1的应用，其中所述的单一可变结构域多肽作为与另外的V_H或V_L结构域的均或异多聚体形式存在，其中所述单一可变结构域多肽独立于所述另外的V_H或V_L结构域而结合于CD40L。

10.一种特异性且单价结合CD40L的包含抗体单一可变结构域或由抗体单一可变结构域组成的抗体多肽，其中所述多肽基本上抑制CD40L与CD40的结合，其中所述抗体多肽与CD40L的结合基本上不激动CD40和/或CD40L活性，并且其中所述抗体多肽抑制包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的抗体单一可变结构域与CD40L的结合，其中所述抗体多肽以200pM-50nM的IC₅₀抑制CD40L与CD40的结合，其中所述抗体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:75相同。

11.权利要求10的抗体多肽，其中所述抗体多肽与CD40L的结合基本上不诱导Jurkat T-细胞中的JNK磷酸化。

12.权利要求10的抗体多肽，其中所述抗体多肽与CD40L的结合基本上不诱导用抗-CD3抗体共同刺激的Jurkat T-细胞分泌IFN-γ。

13.权利要求10的抗体多肽，其中所述抗体多肽在标准血小板聚集检测中的存在没有引起比在阴性对照检测中观察到的聚集高出25％的聚集。

14.权利要求10的的抗体多肽，其中所述多肽是PEG-连接的。

15.权利要求14的PEG-连接的抗体多肽，其具有至少24kD的流体动力学大小。

16.权利要求14的PEG-连接的抗体多肽，其中所述PEG在半胱氨酸或赖氨酸残基处与所述抗体连接。

17.权利要求14的PEG-连接的抗体多肽，其中整个PEG大小是20-60kD，包括端点。

18.权利要求14的PEG-连接的抗体多肽，其具有至少200kD的流体动力学大小。

19.权利要求14的PEG-连接的抗体多肽，其相对于缺少连接的聚乙二醇的相同的多肽组合物而言具有增加的体内半衰期。

20.权利要求19的PEG-连接的抗体多肽，其中所述多肽组合物的tα-半衰期增加10％或更多。

21.权利要求19的PEG-连接的抗体多肽，其中所述多肽组合物的tα-半衰期在0.25分钟-12小时范围内。

22.权利要求19的PEG-连接的抗体多肽，其中所述多肽组合物的tβ-半衰期增加10％或更多。

23.权利要求19的PEG-连接的抗体多肽，其中所述tβ-半衰期在12-48小时范围内。

24.权利要求10的抗体多肽，其没有Fc结构域。

25.权利要求24的抗体多肽，其中所述抗体多肽在标准血小板聚集检测中的存在没有引起比在阴性对照检测中观察到的聚集高出25％的聚集。

26.按照权利要求10的多肽，其中所述抗体多肽包括一种或多种构架区域，所述构架区域包括与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

27.按照权利要求10的多肽，其中所述抗体多肽的FW1、FW2、FW3和FW4的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同。

28.按照权利要求27的多肽，其中所述抗体多肽的所述FW1、FW2和FW3的氨基酸序列与由人生殖细胞抗体基因片段编码的相应构架区域的氨基酸序列相同。

29.按照权利要求27的多肽，其中所述人生殖细胞抗体基因片段选自由DP47,DP45,DP48和DPK9组成的组。

30.权利要求10的抗体多肽，其拮抗CD40L的结合。

31.权利要求10的抗体多肽，其中所述与CD40L结合的单一可变结构域多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示。

32.权利要求10的多肽，其中所述单一可变结构域多肽作为与另外的V_H或V_L结构域的均或异多聚体形式存在，其中所述单一可变结构域多肽独立于所述另外的V_H或V_L结构域而结合于CD40L。

33.权利要求10的抗体多肽在制备用于在个体中治疗或预防自体免疫疾病的症状的药物中的应用。

34.一种组合物，其包括权利要求10的抗体多肽和结合除CD40L之外的配体的第二抗体多肽，其中所述结合除CD40L之外的配体的第二抗体多肽结合选自由下列各项组成的组的配体：HSA,TNFα,IL-1,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8,IL-12,IL-18,IFN-γ,CD2,CD4,CD8,LFA1,LFA3,VLA4,CD80,B7-1,CD28,CD86,B7-2,CTLA-4CD28,可诱导的共刺激性分子,CD27,CD30,OX40,CD45,CD69,CD3,CD70,可诱导的共刺激性分子配体,OX40L,HVEM,LIGHT。

35.一种延长释放的药物制剂，其包括权利要求10的单价的抗-CD40L抗体多肽，其中所述抗体多肽包括或者由抗体单一可变结构域多肽组成。

36.权利要求35的制剂，其中所述单价的抗-CD40L抗体多肽包括结合CD40L的单一抗体可变结构域。

37.一种双特异性配体，其包括权利要求10的抗体多肽和具有与第二抗原结合活性的第二单一可变结构域，其中所述第二单一可变结构域是抗原呈递细胞表面抗原或T细胞表面抗原。

38.按照权利要求37的配体，其中所述抗原呈递细胞表面抗原是选自由下列各项组成的组：活化的巨噬细胞表面抗原、活化的B细胞表面抗原、共刺激性信号途径表面抗原和MHC。

39.按照权利要求38的配体，其中所述MHC是II类。

40.按照权利要求38的配体，其中所述II类MHC是α。

41.按照权利要求38的配体，其中所述II类MHC是β。

42.按照权利要求38的配体，其中所述抗原呈递细胞表面抗原选自由下列各项组成的组：CD28,可诱导的共刺激性分子,CD27,CD30,OX40,CD45,CD69,CD3,CD70,可诱导的共刺激性分子配体,OX40L,CD80,CD86,HVEM和LIGHT。

43.按照权利要求38的配体，其中所述抗原呈递细胞表面抗原选自由下列各项组成的组：CD28,可诱导的共刺激性分子,CD27,CD30,OX40,CD45,CD69和CD3。

44.按照权利要求38的配体，其中所述表面抗原是B7基因表面抗原。

45.按照权利要求44的配体，其中所述B7基因表面抗原是B7-2或B7-1。