CN101058812A - 水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其应用 - Google Patents
水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其应用方法，属于基因工程领域。该基因的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码氨基酸序列SEQID NO.2。本发明基因OsNPSN11为水稻中首次报道，mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT－PCR验证后进行水稻的抗病性评价，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。因此，OsNPSN11可作为目的基因导入植物，提高植物的抗病性。
Description
技术领域
本发明公开了水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其应用，属于基因工程领域。
背景技术
在真核生物细胞内囊泡运输过程中的膜融合主要是由SNARE蛋白介导的，SNARE蛋白的结构高度保守。McNew等(2000McNew JA，Parlati F，Fukuda R，Johnston RJ，Paz K，Paumet F，SollnerTH，Rothman JE(2000)Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins.Nature，407(6801)：153-159)对人类、果蝇、酵母和拟南芥的全基因组序列进行SNARE蛋白基因的预测，发现它们所含SNARE蛋白家族成员的数目分别为35、20、21和68，拟南芥中SNARE蛋白数目明显高于其他物种，且组成复杂。目前许多真核生物全基因组测序已经完成，这为弄清SNARE蛋白家族在不同真核生物基因组范围内的分布和推测其功能提供了大量的信息，也有利于发现更多新的SNARE蛋白。
研究发现，植物中的SNARE蛋白促进植物细胞板形成，能与离子通道蛋白相互作用，有利于植物的正常生长发育，能提高植物的抗病性及参与植物的向重力性作用。植物SNARE蛋白不仅对植物生长发育起作用，在抵御生物与非生物胁迫过程中也起重要的作用(Pratelli et al.，2004 Pratelli R，Sutter JU，Blatt MR(2004)A new catch in the SNARE.Trends Plant Sci9(4)：187-195)。Collins等(2003 Collins NC，Thordahl-Christensen H，Lipka V，Bau S，Kombrink E，Qiu J，Hückelhoven R，Stein M，Freialdenhoven A，Somerville SC，Schulze-Lefert P(2003)SNARE-protein-mediated diseaseresistance at the plant cell wall.Nature 425：973-977)在研究与大麦非寄主抗性相关基因HvSyp121时，发现其突变体叶片被侵染部位聚集大量载着H2O2的囊泡，推测突变体细胞中囊泡未能与质膜融合，H2O2介导的抗病信号传导途径受阻，使得病原菌分泌的有毒物质进入植物体内致病(Dangl et al.，2001 Dangl JL，Jones JD(2001)Plant pathogens and integrated defence responses to infection.Nature 411：826-833；Tsanko et al.，2005 Tsanko SG，Jacques H(2005)Hydrogen peroxide as a signal controlling plantprogrammed cell death.J Cell Biol 168(1)：17-20)。表明植物中SNARE蛋白与植物的基本抗病性即非寄主抗性相关。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于公开水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其应用，该基因来自水稻，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，进行植物品种改良。
技术方案
水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的应用，包括：
1)总RNA的提取选 用水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”(太湖流域粳稻地方品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子(5×104ml-1)接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；
2)水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的克隆以 拟南芥基因AtNPSN11(Zheng et al.，2002 Zheng H，Bednarek SY，Sanderfoot AA，Alonso J，Ecker JR，Raikhel NV(2002)NPSN11 is a cell plate-associatedSNARE protein that interacts with the syntaxin KNOLLE.Plant Physiol 129：530-539)序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到880bp水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的全长序列，并设计两端引物：
P1：5-TGCTTTTGGTTGTTGTGATCC-3，
P2：5-CTGCTCTTGGTTGATTTGTTC-3。
将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min末端加A后克隆至pGEM-T载体，委托上海生工公司测序获得水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQ ID NO.1；
3)植物表达载体的构建 根据水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列(见SEQ ID NO.1)，在起始密码子ATG附近设计引物P3并引入限制性内切酶位点XbaI，引物序列为：
P3：5-AT
TCTAGATGGATTTGGAGTCGGTCA-3，
以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，用P3和P2引物经PCR扩增后，将OsNPSN11的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引物P3引入的XbaI酶切位点和pGEM-T载体上的SalI酶切位点进一步克隆至双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；
4)转基因植株的获得 将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
有益效果
1、本发明公开了水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其所编码的蛋白质。水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11为水稻中首次报道，mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。
2、本发明的OsNPSN11基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。
3、对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为2.5级，发病叶片平均病斑数目为4.25个及病斑平均长度为0.58mm，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为44个及病斑平均长度为5.00mm，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
4、利用本发明OsNPSN11基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括具有抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
具体实施方式
实施例1
选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管(TRIzol Reagents，购自Invitrogen，USA)，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。
以拟南芥基因AtNPSN11(Zheng et al.，2002 Zheng H，Bednarek SY，Sanderfoot AA，Alonso J，EckerJR，Raikhel NV(2002)NPSN11 is a cell plate-associated SNARE protein that interacts with the syntaxin KNOLLE.PlantPhysiol 129：530-539)序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到880bp水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的全长序列，并设计两端引物(P1：5-TGCTTTTGGTTGTFGTGATCC-3，P2：5-CTGCTCTTGGTTGATTTGTTC-3。)以总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板用高保真Pfu酶(购自Roche)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶(购自鼎国公司，北京)72℃保温10min末端加A后克隆至pGEM-T载体(购自Promega)，委托上海生工公司测序获得水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列。
分析上述获得的水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码蛋白SEQ ID NO.2，该基因编码的蛋白序列与拟南芥AtNPSN11蛋白序列的一致性为69％，在C端都存在保守结构域Qb-SNARE结构域和跨膜结构域。
实施例2
用实例1中设计的引物P1、P2进行半定量RT-PCR分析接种处理后水稻3-4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子2小时后OsNPSN11的表达增强，经灰度扫描分析，其mRNA表达量为对照的8倍，接种处理24h后表达有所减弱，表明OsNPSN11基因的表达与稻瘟病菌处理有关。
实验例3
根据根据实施例1得到的OsNPSN11的全长序列(见SEQ ID NO.1)，在起始密码子ATG附近设计引物P3并引入限制性内切酶位点XbaI(P3：5-AT
TCTAGATGGATTTGGAGTCGGTCA-3)，以实施例1中获得的扩增产物为模板，用P3和P2引物经PCR扩增后，将OsNPSN11的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引物P3引入的XbaI酶切位点和pGEM-T载体上的SalI酶切位点进一步克隆至双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，再将其转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”(太湖流域粳稻地方品种)，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为2.5级，发病叶片平均病斑数目为4.25个及病斑平均长度为0.58mm，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为44个及病斑平均长度为5.00mm，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。
综上所述，本发明人提供的OsOSNPSN11基因是首次在水稻中分离的新基因，为水稻中首次报道，其功能与水稻抗病性相关，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。可利用本发明OsNPSN11基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：880bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.1
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：261aa
(B)类型：氨基酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
序列表
<110>南京农业大学
<120>水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11及其应用
<130>说明书
<140>00
<141>2007-03-10
<160>5
<170>PatentIn version 3.1
<210>SEQ ID NO.1
<211>880
<212>DNA
<213>Oryza sativa(水稻)
<221>5’UTR
<222>(1)..(60)
<221>CDS
<222>(61)..(843)
<221>3’UTR
<222>(847)..(880)
<400>1
tgcttttggt tgttgtgatc cctgtggggc tcgggttccg gccggtgtag gggaggggag 60
atg gat ttg gag tcg gtc aac ccg gag ctc gcc gag atc gac ggc cag 108
Met Asp Leu Glu Ser Val Asn Pro Glu Leu Ala Glu Ile Asp Gly Gln
1 5 10 15
atc ggc gac atc ctc cgc gca ttg caa aat ggg ttc cag aag ctg gat 156
Ile Gly Asp Ile Leu Arg Ala Leu Gln Asn Gly Phe Gln Lys Leu Asp
20 25 30
aag atc aag gat gcc aat cga cgg agc agg caa ctc gaa gag ctc act 204
Lys Ile Lys Asp Ala Asn Arg Arg Ser Arg Gln Leu Glu Glu Leu Thr
35 40 45
gat aag atg cgg gat tgc aag agg ctt atc aag gac ttt gag cga gtt 252
Asp Lys Met Arg Asp Cys Lys Arg Leu Ile Lys Asp Phe Glu Arg Val
50 55 60
gtc aaa gat atg gca gga agt acc gat cct gag act gct agg atg ctt 300
Val Lys Asp Met Ala Gly Ser Thr Asp Pro Glu Thr Ala Arg Met Leu
65 70 75 80
cat gat agg aaa cag tca atg atc aaa gaa ttg aac tcc tat gtt gct 348
His Asp Arg Lys Gln Ser Met Ile Lys Glu Leu Asn Ser Tyr Val Ala
85 90 95
ttg aag aaa caa tat gca agt gaa aat aag cga gtt gat ctt ttt gat 396
Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ser Glu Asn Lys Arg Val Asp Leu Phe Asp
100 105 110
ggc cca agt gtt gaa gat ggc ttt ggt gaa gaa aat gtc ctg tta gca 444
Gly Pro Ser Val Glu Asp Gly Phe Gly Glu Glu Asn Val Leu Leu Ala
115 120 125
tca aat atg aca aac caa cag tta atg gat caa gga aac caa cta atg 492
Ser Asn Met Thr Asn Gln Gln Leu Met Asp Gln Gly Asn Gln Leu Met
130 135 140
gat gag act gat caa gct att gca aga tct aaa cag acc gtc caa gag 540
Asp Glu Thr Asp Gln Ala Ile Ala Arg Ser Lys Gln Thr Val Gln Glu
145 150 155 160
acc atc aat gta ggt aca gaa act gca gct gct ctc aaa tca cag aca 588
Thr Ile Asn Val Gly Thr Glu Thr Ala Ala Ala Leu Lys Ser Gln Thr
165 170 175
gag caa atg agc aga att gtt aat gaa ctg gat tcc att cat ttc tcc 636
Glu Gln Met Ser Arg Ile Val Asn Glu Leu Asp Ser Ile His Phe Ser
180 185 190
att aaa aag gca tca caa atg gtg aaa gaa att ggt agg cag gtt gca 684
Ile Lys Lys Ala Ser Gln Met Val Lys Glu Ile Gly Arg Gln Val Ala
195 200 205
act gat cgc tgc atc atg gcc ttg ctt ttt ctc att gtt gct gga gtc 732
Thr Asp Arg Cys Ile Met Ala Leu Leu Phe Leu Ile Val Ala Gly Val
210 215 220
ata gca ata ata gtc gtt aag att gta aac cca cag aac aag act atc 780
Ile Ala Ile Ile Val Val Lys Ile Val Asn Pro Gln Asn Lys Thr Ile
225 230 235 240
cga gac att cct ggt ctc gct cca cca gtt agc aga agg cta ttg agt 828
Arg Asp Ile Pro Gly Leu Ala Pro Pro Val Ser Arg Arg Leu Leu Ser
245 250 255
att gta gaa gac atc tgaacttcat acatgtgaac aaatcaacca agagcag 880
Ile Val Glu Asp Ile
260
<210>SEQ ID NO.2
<211>261
<212>PRT
<213>Oryza sativa(水稻)
<400>2
Met Asp Leu Glu Ser Val Asn Pro Glu Leu Ala Glu Ile Asp Gly Gln
1 5 10 15
Ile Gly Asp Ile Leu Arg Ala Leu Gln Asn Gly Phe Gln Lys Leu Asp
20 25 30
Lys Ile Lys Asp Ala Asn Arg Arg Ser Arg Gln Leu Glu Glu Leu Thr
35 40 45
Asp Lys Met Arg Asp Cys Lys Arg Leu Ile Lys Asp Phe Glu Arg Val
50 55 60
Val Lys Asp Met Ala Gly Ser Thr Asp Pro Glu Thr Ala Arg Met Leu
65 70 75 80
His Asp Arg Lys Gln Ser Met Ile Lys Glu Leu Asn Ser Tyr Val Ala
85 90 95
Leu Lys Lys Gln Tyr Ala Ser Glu Asn Lys Arg Val Asp Leu Phe Asp
100 105 110
Gly Pro Ser Val Glu Asp Gly Phe Gly Glu Glu Asn Val Leu Leu Ala
115 120 125
Ser Asn Met Thr Asn Gln Gln Leu Met Asp Gln Gly Asn Gln Leu Met
130 135 140
Asp Glu Thr Asp Gln Ala Ile Ala Arg Ser Lys Gln Thr Val Gln Glu
145 150 155 160
Thr Ile Asn Val Gly Thr Glu Thr Ala Ala Ala Leu Lys Ser Gln Thr
165 170 175
Glu Gln Met Ser Arg Ile Val Asn Glu Leu Asp Ser Ile His Phe Ser
180 185 190
Ile Lys Lys Ala Ser Gln Met Val Lys Glu Ile Gly Arg Gln Val Ala
195 200 205
Thr Asp Arg Cys Ile Met Ala Leu Leu Phe Leu Ile Val Ala Gly Val
210 215 220
Ile Ala Ile Ile Val Val Lys Ile Val Asn Pro Gln Asn Lys Thr Ile
225 230 235 240
Arg Asp Ile Pro Gly Leu Ala Pro Pro Val Ser Arg Arg Leu Leu Ser
245 250 255
Ile Val Glu Asp Ile
260
<210>SEQ ID NO.3
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<221>引物P1
<222>(1)..(21)
<400>3
tgcttttggt tgttgtgatc c 21
<210>SEQ ID NO.4
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<221>引物P2
<222>(1)..(21)
<400>4
ctgctcttgg ttgatttgtt c 21
<210>SEQ ID NO.5
<211>26
<212>DNA
<213>人工合成
<221>引物P3
<222>(1)..(26)
<400>5
attctagatg gatttggagt cggtca 26
Claims (3)
1、水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11，该基因的cDNA序列为SEQ ID NO.1。
2、权利要求1所述水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11所编码氨基酸序列为SEQ IDNO.2。
3、权利要求1所述水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的应用，包括：
1)总RNA的提取
选用水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子5×104ml-1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；
2)水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的克隆
以拟南芥基因AtNPSN11序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到880bp水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的全长序列，并设计两端引物：
P1：5-TGCTTTTGGTTGTTGTGATCC-3，P2：5-CTGCTCTTGGTTGATTTGTTC-3。
将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min末端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQID NO.1；
3)植物表达载体的构建
根据水稻SNARE蛋白基因OsNPSN11的cDNA序列SEQ ID NO.1，在起始密码子ATG附近设计引物P3并引入限制性内切酶位点XbaI，引物序列为：
P3：5-AT
TCTAGATGGATTTGGAGTCGGTCA-3，
以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，用P3和P2引物经PCR扩增后，将OsNPSN11的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引物P3引入的XbaI酶切位点和pGEM-T载体上的SalI酶切位点进一步克隆至双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；
4)转基因植株的获得
将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T1代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。
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-
2007
- 2007-04-10 CN CN200710021375A patent/CN101058812B/zh not_active Expired - Fee Related
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