CN101058809A - 人源化改造的鼠ing4基因及其腺病毒表达载体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及人源化改造的鼠ING4(肿瘤生长抑制因子4)基因，以及携带该基因的重组腺病毒(人腺病毒5型Ad－ING4－ΔGFP)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC－V200701)。本发明还涉及人源化改造的基因突变技术和去除GFP的腺病毒转移载体及去除GFP的同源重组腺病毒载体。本发明的ING4基因及其相关的重组腺病毒载体等可为治疗肿瘤疾病、发育性疾病、免疫性疾病或其它由于肿瘤生长抑制因子ING4表达异常所引起疾病提供新的免疫诊断和靶向治疗途径，特别是肺癌和白血病，具有巨大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及人源化改造的鼠ING4(肿瘤生长抑制因子4)基因和经去GFP载体改造后的ING4重组腺病毒载体，含有该基因的重组载体和宿主细胞。本发明还涉及本发明的基因、重组载体和宿主细胞的制备方法和用途。
背景技术
肿瘤是当今社会影响人类健康的主要疾病之一。近代细胞生物学研究表明，体内细胞在增殖、分化和凋亡的过程中，受到体内正性和负性两类调控信号的调节。正性信号(癌基因、生长因子)与负性信号(肿瘤抑制基因、生长抑制因子)之间平衡的破坏会导致肿瘤的发生。肿瘤的发生发展受体内多种基因的调控。肿瘤抑制基因正是参与这一调控的重要分子，很多肿瘤中都有某些肿瘤抑制基因失活。向缺失某种抑癌基因的细胞内导入正常的抑癌基因，则可逆转肿瘤细胞的表型、抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡，以达到治疗目的。
生长抑制基因家族(ING)成员，最早发现有ING1、ING2和ING3，其中ING1及ING2能以P53依赖的方式抑制细胞增殖，诱导细胞G1期阻滞及细胞凋亡(参见，如I.Garkavtsev等人，Nature 391(1998)295-298；C.C.Helbing等人，Cancer Res.57(1997)1255-1258；以及M.Nagashima等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)9671-9676)。ING3能增强P53下游基因表达，如P21及Bax等(参见M.Gunduz等人，Oncogene 21(2002)4462-4470)。
2004年又发现ING4(参见R.M.Hu，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)9543-9548)，ING4基因位于染色体12p13.31，至少有8个外显子。生物信息学分析显示ING4有一个PHD(plant homeodomain)锌指区和核定位信号(NLS)区。
ING4在多数肿瘤中有缺失突变，Mehmet Gunduz等根据ING4周围6个微卫星标志(D12S372，D12S77，D12S1697，D12S89，D12S825，D12S391)，发现在50例肿瘤样品中，66％肿瘤组织样品有D12S825标记的改变，它离ING4基因仅700bp(参见M Gunduz等人，Gene356(2005)109-117)。另外发现在一些细胞中有465位C，446位A单核苷酸的缺失，而导致了移码突变，并提前产生了终止密码，从而使表达的ING4缺失了一半的氨基酸，其中包括PHD锌指结构缺失(参见S Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)16251-16256)。有研究显示ING4稳定表达可使体外培养的肝癌细胞系(HepG2)G2/M期增加，同时细胞凋亡增加了20％，将过表达ING4的HepG2细胞接种到裸鼠体内，其生长速度明显减慢。此外，研究表明ING4还能增强了HepG2对化疗药物的敏感性，如阿霉素(DOX)和鬼臼乙叉甙(ETO)(参见Xin Zhang等人，FEBS Letters，570(2004)，7-12)。
Masaynki shiseki等发现ING4在体内能与p53结合，并能提高P53 382位赖氨酸的乙酰化程度，进而提高P53下游基因如P21、BAX等的表达，但P53本身的表达无明显改变(参见Masayuki S等人，Cancer research，63(2003)，2373-2378)。zhang xin等人通过表达了一系列GST-ING4不同区域的融合蛋白，进行了GST结合实验(pull down)，进一步证实ING4的核定位信号在与p53结合中起关键作用(参见Xin Zhang等人，Biochemical andBiophysical Research Communications 331(2005)1032-1038)。
ING4作为肿瘤生长抑制因子家族的新成员，不但能抑制神经胶质瘤细胞生长，还能抑制肿瘤组织中新生血管的生成。如Igor Garkavtsev等人将ING4基因及反义ING4基因利用真核表达质粒分别转入U87MG胶质瘤细胞，建立了ING4表达高低不同的U87MG细胞系，结果发现ING4过表达的肿瘤细胞生长明显减慢，其血管密度减少，而转入反义ING4基因的肿瘤血管密度增高，并比较容易出血(Garkavtsev，I.等人，Nature，428(2004)，328-332)。此外，研究还发现ING4能抑制HIF活性进而影响肿瘤对缺氧的耐受(参见Abdullah Ozer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)7481-7486)。因此，ING4基因作为一个新的肿瘤抑制基因，其抑制肿瘤的途径较多，具有良好的应用开发前景。
鼠ING4基因已经被成功地克隆(参见王金志等人，2005，28(4)：383-386)。通过氨基酸同源序列分析发现，人ING4基因和鼠ING4基因所编码的氨基酸组成有99％以上相同，仅有两个氨基酸不同，即66位与156位氨基酸在小鼠分别为R、A，而人为K、T。但是鼠的蛋白质应用到人体内有诱导免疫反应的可能，因免疫反应会导致疗效低，甚至会对机体产生不利影响。非人动物蛋白的人源化改造是作为人类疾病的治疗剂的一种有效途径。
在肿瘤的基因治疗中，腺病毒载体因其具有宿主范围广泛，既可感染分裂细胞也可感染非分裂细胞，转染效率高，表达时间长，没有致癌和致突变的的危险等优点，在基因治疗的研究中被广泛应用(参见Roy等人，Anticancer Res.22(2002)3185-3189；J.L.Bramson等人，Gene Ther.4(1997)1069-1076；Tong-Chuan He等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1998.95：2509-2514)。
目前，国内外尚未见人源化改造的鼠ING4基因，也无关于构建ING4基因的腺病毒载体及其用于抗肿瘤基因治疗应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源化改造的鼠ING4基因。
本发明的目的是提供一种重组载体，其包含本发明的人源化改造的鼠ING4基因序列，该重组载体优选为去除GFP的腺病毒载体。
本发明的目的是提供一种组合物，其包含本发明的人源化改造的鼠ING4基因序列、或包含本发明的人源化改造的鼠ING4基因序列的重组载体。
本发明的目的是提供一种制备本发明的人源化改造的鼠ING4基因的方法。
本发明的目的是提供本发明的人源化改造的鼠ING4基因或含有该基因的重组腺病毒载体的应用。
本发明涉及提供一种人源化改造的鼠ING4基因。优选地，本发明的ING4基因所编码的氨基酸序列与GenBank报道的鼠ING4的氨基酸序列相比具有至少选自如下的突变之一：第66位氨基酸由Arg变成Lys，第156位氨基酸由Ala变成Thr。更优选地，本发明的ING4基因所编码的氨基酸序列与GenBank报道的鼠ING4的氨基酸序列相比具有如下突变：第66位氨基酸由Arg变成Lys，第156位氨基酸由Ala变成Thr。
优选地，本发明的ING4基因序列与GenBank报道的鼠ING4基因序列相比具有至少选自如下的突变之一：第197位的碱基G变成A、第231位的碱基A变成G、第476位的碱基G变成A或者第528位的碱基C变成A。更优选地，本发明的ING4基因与GenBank报道的鼠ING4序列相比具有如下突变：第197位的碱基G变成A、第231位的碱基A变成G、第476位的碱基G变成A和第528位的碱基C变成A。
本发明还涉及与上述的ING4基因序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码ING4多肽的多核苷酸。
本发明涉及提供一种制备本发明的人源化改造的鼠ING4基因的方法。本发明的ING4基因可以通过定点突变技术制备得到：其包括将鼠ING4基因的第66位氨基酸编码序列aga变aaa，和第156位氨基酸编码序列gct变act的步骤。具体地，制备本发明的ING4基因的方法包括以pcDNA3.0-mING4质粒为模板，以P1与P6，P2与P5分别进行第一轮PCR，胶回收后混合，随后以该混合PCR产物为模板，以引物P5与P6进行第二轮PCR，胶回收后再以此PCR产物为模板，以引物P3与P6，P4与P5分别进行第三轮PCR，胶回收后混合，再以此混合PCR产物为模板，以引物P5与P6进行第四轮PCR。其中：
P1：5’-gcc ctt ctc a
aa cag atc cag gag gcc tat-3’；
P2：5’-ctg gat ctg t
tt gag aag ggc cag ctt ctc-3’；
P3：5’-gcc ccc aag
act gcc cag aag aag tta aaa-3’；
P4：5’-ctt ctg ggc ag
t ctt ggg ggc ttc ttc atc-3’；
P5：5’-gc
g tcg aca tgg atg atg gga tgt att tgg aac-3’；
P6：5’-gc
a agc ttc tag tgg tgg tgg tgg tgg tgt ttc ttcttc cgt tct tgg gag-3’。
此外，还可用本领域技术人员知晓的人工合成方法来制备本发明的ING4基因(或其片段，或其衍生物)。通常，按照本发明公开的ING4基因序列，先合成多个小片段，然后再进行连接，可获得本发明公开的ING4基因序列。
本发明还涉及提供的重组载体含有去除GFP基因的腺病毒转移载体pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP、同源重组腺病毒载pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP或重组腺病毒Ad-ING4-ΔGFP。将本发明的ING4基因和带有GFP标记基因的pAdTrack-CMV质粒经Sal I、HindIII双酶切用后，胶回收试剂盒回收目的片段，再由T4DNA连接酶连接过夜，氯化钙法转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，测序鉴定；在此基础上，又通过酶切和PCR载体改造技术获得本发明的去GFP的重组质粒pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP。更优选地，本发明的重组载体为腺病毒载体。在肿瘤的基因治疗中，腺病毒载体因其具有宿主范围广泛，既可感染分裂细胞也可感染非分裂细胞，转染效率高，表达时间长，没有致癌和致突变的的危险等优点。优选地，本发明的重组腺病毒载体为Ad-ING4-ΔGFP(保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC-V200701，培养物名称：人腺病毒5型Ad-ING4-ΔGFP)。
本发明还涉及包含本发明的ING4基因的宿主细胞。包含本发明的ING4基因以及适当启动子或者控制序列的重组载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选地，本发明的宿主细胞为大肠杆菌DH5α，BJ5183和QBI-293A细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域是众所周知的。另一种方法是使用MgCl2如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的ING4基因或本发明的重组载体或者本发明的宿主细胞。该组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的ING4基因或本发明的重组载体或者本发明的宿主细胞施用给哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还涉及本发明的ING4基因、本发明的重组载体、本发明的宿主细胞和/或者本发明的药物组合物用于体内和/或体外杀死肿瘤细胞的用途。优选地，所述肿瘤细胞为肺癌细胞或者白血病细胞。更加优选地，所述肿瘤细胞为A549细胞或者K562细胞。
本发明还涉及本发明的ING4基因、本发明的重组载体、本发明的宿主细胞和/或者本发明的药物组合物在制备用于治疗肿瘤疾病、发育性疾病或免疫性疾病或其它由于肿瘤生长抑制因子ING4表达异常所引起疾病的药物的用途。优选地，所述肿瘤疾病是肺癌或者白血病。
在本发明的一个实例中，通过定点突变技术，对鼠ING4基因进行了人源化改造，使该ING4基因编码的氨基酸序列突变成人ING4氨基酸序列，同时构建了去GFP的pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP转移质粒，在国内外率先获得了携带该人源化改造的鼠ING基因的重组腺病毒载体Ad-ING4-ΔGFP。
在本发明的一个实例中，进行A549肺癌细胞体内、外抗肿瘤实验，结果发现经人源化改造的鼠ING4基因的表达在体外确能抑制A549肺癌细胞生长，诱导细胞G2期阻滞，还可促使细胞凋亡。用重组腺病毒Ad-ING4-ΔGFP感染后，结果发现P21表达有升高，而P53表达无明显改变。
在本发明的一个实例中，通过Ad-ING4-ΔGFP对裸鼠A549肺癌移植瘤模型抗肿瘤实验，证明在体内，Ad-ING4-ΔGFP对A549肺癌移植瘤的生长也具有显著的抑制作用，同时通过免疫组化检测移植瘤中CD34表达，发现该基因表达也能抑制肿瘤组织中新生血管的生成。
在本发明的一个实例中，还检测了Ad-ING4-ΔGFP感染后A549肺癌细胞IL-6，IL-8及VEGF的分泌，结果发现，IL-6，IL-8的分泌大为减少，提示人源化改造的鼠ING4可能通过抑制IL-6、IL-8的表达而发挥抗肿瘤效应。
在本发明的一个实例中，检测了Ad-ING4-ΔGFP感染后，A549肺癌细胞体外转移浸润能力的变化，结果发现Ad-ING4-ΔGFP感染后，A549肺癌细胞体外转移浸润能力大为下降。
在本发明的一个实例中，在Ad-ING4-ΔGFP感染A549肺癌细胞48h后，其MMP2和MMP9的mRNA表达明显下降，表明Ad-ING4-ΔGFP可能是通过抑制MMP2和MMP9的表达来抑制A549肺癌细胞的转移浸润能力。
在本发明的一个实例中，检测了Ad-ING4-ΔGFP感染后A549肺癌细胞VEGF的分泌，结果发现，VEGF无明显改变。
在本发明的一个实例中，检测了Ad-ING4-ΔGFP对人脐静脉细胞系ECV304生长及分泌VEGF的影响，结果显示用Ad-ING4-ΔGFP感染ECV304脐静脉内皮细胞后，对ECV304细胞的生长及VEGF的分泌均有较强的抑制作用。
在本发明的一个实例中，通过腺病毒载体将人源化改造的鼠ING4基因导入K562细胞中，Ad-ING4-ΔGFP病毒感染的K562细胞生长受抑，凋亡率明显高于转染空腺病毒载体Ad感染的K562细胞，差异有统计学意义，提示该ING4基因对K562细胞有抑制生长和诱导凋亡的作用，因此ING4可作为白血病基因治疗的目的基因之一。
附图说明
图1A是人源化改造鼠ING4基因的点突变流程图。
图1B是pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP重组转移质粒改造流程图。
图2A是pAdTrack-CMV-ING4重组质粒PCR鉴定；图中1-ING4PCR产物；M-DNA marker。
图2B(1)～2B(4)是pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP转移载体的构建和鉴定，其中：
图2B(1)是poliA2+encapsidation signal PCR产物鉴定；
图中：1-poliA2+encapsidation signal PCR产物；M-DNA marker。
图2B(2)是pAdTrack-CMV-ING4质粒去GFP片段双酶切鉴定；
图中：1-poliA1+CMV2+GFP+poliA2+encapsidation signal；M-DNA marker。
图2B(3)是poliA2+encapsidation signal信号片段的PCR鉴定；
图中：1-poliA2+encapsidation signal PCR鉴定产物；M-DNA marker。
图2B(4)是pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP质粒双酶切鉴定；
图中：1-poliA2+encapsi-dation signal信号片段；M-DNA marker。
图3是pAdTrack-CMV-ING4的测序图谱。
图4是pAdeasy-1-pADTarck-CMV-ING4和pAdeasy-1-pADTarck-CMV-ING4-ΔGFP同源重组载体的PCR鉴定；
图中：1-pAd；2-pAd-ING4；3-pAd-ING4-ΔGFP；M-DNA marker。
图5A是ING4重组腺病毒感染QBI-293A细胞的QBI-293A对照。
图5B是ING4重组腺病毒感染QBI-293A细胞的QBI-293A-Ad-GFP对照。
图5C是Ad-ING4-GFP重组腺病毒感染QBI-293A细胞后的光镜形态学和荧光观察结果。
图5D是Ad-ING4-ΔGFP重组腺病毒感染QBI-293A细胞后光镜形态学和荧光观察结果。
图6是ING4重组腺病毒子的RT-PCR鉴定；
图中：1-QBI-293A；2-QBI-293A+Ad-GFP；3-QBI-293A+Ad-ING4-GFP；4-QBI-293A+Ad-ING4-ΔGFP；M-DNA marker。
图7是A549肺癌细胞感染Ad-ING4-ΔGFP病毒后的生长曲线。
图8表示流式细胞仪检测A549肺癌细胞周期和凋亡率。
图9表示Western blot检测ING4基因表达对A549肺癌细胞中p53、p21基因表达的影响；
图中：1-A549；2-A549+Ad；3-A549+Ad-ING4。
图10表示RT-PCR检测ING4基因在A549肺癌细胞中的转录；
图中：1-A549；2-A549+Ad；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图11是不同治疗组对A549肺癌细胞荷瘤裸鼠移植瘤生长抑制效应的对比图；
图中：1-PBS对照组；2-空载体Ad对照组；3-Ad-ING4基因治疗实验组。
图12是不同治疗组荷瘤裸鼠取出的肿瘤标本的对比照片；
图中：a-Ad-ING4实验组；b-空载体Ad对照组；c-PBS对照组。
图13表示移植瘤中CD34的表达；
图中：a-Ad-ING4实验组；b-空载体Ad对照组；c-PBS对照组。
图14表示Ad-ING4-ΔGFP感染后A549肺癌细胞VEGF的分泌。
图15表示Ad-ING4-ΔGFP感染后A549肺癌细胞IL-6的分泌。
图16表示Ad-ING4-ΔGFP感染后A549肺癌细胞IL-8的分泌。
图17是beta-actin基因定量PCR荧光检测。
图18是beta-actin基因定量PCR扩增溶解曲线。
图19是IL-6基因定量PCR荧光检测。
图20是IL-6基因定量PCR扩增溶解曲线。
图21是IL-8基因定量PCR荧光检测。
图22是IL-8基因定量PCR扩增溶解曲线。
图23是病毒感染后IL-6荧光定量PCR产物电泳图；
图中：1-A549+Ad；2-A549；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图24是病毒感染后IL-8荧光定量PCR产物电泳图；
图中：1-A549+Ad；2-A549；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图25是病毒感染后beta-actin荧光定量PCR产物电泳图；
图中：1-A549+Ad；2-A549；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图26表示Ad-ING4-ΔGFP对A549肺癌细胞体外转移浸润的影响；
图中：a-空白细胞组；b-空载体AD组；c-AD-ING4试验组
图27是beta-actin基因定量PCR荧光检测。
图28是beta-actin基因定量PCR扩增溶解曲线。
图29是MMP2基因定量PCR荧光检测。
图30是MMP2基因定量PCR扩增溶解曲线。
图31是MMP9基因定量PCR荧光检测。
图32是MMP9基因定量PCR扩增溶解曲线。
图33是病毒感染后MMP9荧光定量PCR产物电泳图；
图中：1-A549+Ad；2-A549；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图34是病毒感染后MMP2荧光定量PCR产物电泳图；
图中：1-A549+Ad；2-A549；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图35是病毒感染后beta-actin荧光定量PCR产物电泳图；
图中：1-A549+Ad；2-A549；3-A549+Ad-ING4；M-DNA marker。
图36是Ad-ING4-ΔGFP感染后ECV304细胞生长曲线。
图37是Ad-ING4-ΔGFP感染后ECV304细胞VEGF的表达。
图38表示RT-PCR鉴定ING4基因在K562细胞中的转录；
图中：1-K562+Ad；2-K562+Ad-ING4；M-DNA marker。
图39A表示Ad感染的K562细胞(100×)。
图39B表示Ad-ING4感染的K562细胞(100×)。
图39C表示正常的K562细胞(400×)。
图39D表示Ad-ING4感染的K562细胞(400×)。
图40A表示Ad感染的细胞的bcl-2蛋白表达的免疫细胞化学分析。
图40B表示Ad-ING4感染的细胞的bcl-2蛋白表达的免疫细胞化学分析。
图40C表示Ad感染的细胞的bax蛋白表达的免疫细胞化学分析。
图40D表示Ad-ING4感染的细胞的bax蛋白表达的免疫细胞化学分析。
图41A表示Ad感染的K562细胞。
图41B表示Ad-ING4感染的K562细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明所用材料：pcDNA3.0-mING4载体(由本研究室构建，构建方法后述)，细菌DH5α、BJ5183(上海晶美生物工程有限公司购买)，A549肺癌细胞(美国ATCC购买)，PmeI和Pac I(美国NEB公司购买)，pAdTrack-CMV转移载体、pAdEasy-1腺病毒载体和QBI-293A细胞为复旦大学钟江教授惠赠(无商品化产品上市)，Lipofectamine Reagent(美国Invitrogen生命技术公司购买)，P53、P21、CD34抗体(上海晶美生物工程有限公司购买)。SP试剂盒(福州迈新生物技术有限公司购买)，VEGF、IL-6、IL-8ELISA试剂盒(上海晶美生物工程有限公司购买)，侵袭小室(TranswellChanber孔径8μm)，人工基质胶(Matrige)(美国BD公司购买)，SYBR Green I(美国sigma公司购买)，4～6周龄雄性裸鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司购买)。
上述pcDNA3.0-mING4载体的构建方法为：从小鼠肝组织中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出ING4cDNA，先与pUCm-T载体进行体外连接，再与pcDNA3.0真核载体连接，构建出pcDNA3.0-mING4真核表达载体，并分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定。
实施例1 人源化改造鼠ING4基因的点突变法
根据人ING4氨基酸序列，将鼠ING4基因用点突变技术进行人源化改造(图1A)。设计将鼠ING4的第66位氨基酸编码序列aga变aaa，156位氨基酸编码序列gct变act的两对突变引物P1、P2和P3、P4及全长ING4上下游引物P5、P6；以pcDNA3.0-mING-4质粒为模板，以P1与P6，P2与P5分别进行第一轮PCR，胶回收后混合，随后以该混合PCR产物为模板，以引物P5与P6进行第二PCR，胶回收后再以此PCR产物为模板，以引物P3与P6，P4与P5分别进行第三轮PCR，胶回收后混合，再以此混合PCR产物为模板，以引物P5与P6进行第四轮PCR，获人源化改造的ING4基因。
表1.PCR扩增所用引物及其序列
| 引物 | 序列 |
| P1 | 5’-gcc ctt ctc a aa cag atc cag gag gcc tat-3’ |
| P2 | 5’-ctg gat ctg t tt gag aag ggc cag ctt ctc-3’ |
| P3 | 5’-gcc ccc aag act gcc cag aag aag tta aaa-3’ |
| P4 | 5’-ctt ctg ggc ag t ctt ggg ggc ttc ttc atc-3’ |
| P5 | 5’-gc g tcg aca tgg atg atg gga tgt att tgg aac-3’ |
| P6 | 5’-gc a agc ttc tag tgg tgg tgg tgg tgg tgt ttc ttcttc cgt tct tgg gag-3’ |
实施例2 重组腺病毒载体构建
(1)pAdTrack-CMV-ING4(有GFP标记)的构建
将纯化的第四轮PCR产物和带有GFP标记基因的pAdTrack-CMV质粒经SalI、HindIII双酶切用后，胶回收试剂盒回收目的片段，再由T4 DNA连接酶连接过夜，氯化钙法转化DH5α感受态细胞，筛选pAdTrack-CMV-ING4转移质粒的阳性克隆，测序鉴定。将测序正确的pAdTrack-CMV-ING4质粒和pAdTrack-CMV空质粒分别用PmeI单酶切线性化化后，胶回收与pAdEasy-1腺病毒载体氯化钙法分别共转化BJ5183感受态，挑选阳性克隆抽提质粒，酶切鉴定后，大量扩增转化子。
将获得的阳性克隆抽提质粒，经PCR鉴定(用引物P5和P6)在750bp附近有一条带(图2A)。目的条带的测序结果与GenBank报道的鼠ING4基因序列(BC009127)有四个不一致，即197位碱基由G(A
GA)变成A(A
AA)，231位由A(GA
A)变成G(GA
G)，476位由G(
GCT)变成A(
ACT)，528位由C(AC
C)变成A(AC
A)，因此鼠66位氨基酸由Arg变成Lys，156位氨基酸由Ala变成Thr，其余两个为由PCR引起的同义突变，结果此基因翻译后的氨基酸序列与人ING4氨基酸序列完全相同。表明人源化改造的pAdTrack-CMV-ING4重组质粒构建获得成功(图3)。
(2)pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP(无GFP标记)的腺病毒载体改造
在pAdTrack-CMV-ING4构建的基础上，进行去GFP的载体改造。pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP重组转移质粒改造流程如图1B，其基本思路为：以构建的pAdTrack-CMV-ING4转移质粒为起点，在GFP编码序列两端寻找2个单一酶切位点，切去GFP片段，若同时切去载体本身应具有的重要信号片段还需得还原。经综合分析选择多克隆位点(MCS)中的Xba I和包装信号(encasidation signal)下游SgrA I两个单一酶切位点进行双酶切，但双酶切后介导ING4的poliA信号(poliA1)和包装信号(encasidation signal)片段也同时被切去，故又通过PCR方法扩增和还原上述切去的包装信号片段和与poliA1等效的poliA2信号片段。方法大致如下：以pAdTrack-CMV-ING4质粒为模板，利用P1：5’-gcttctagataagatatcctgatcataa tcagccataccac atttg-3’(含Xba I酶切位点)和P2：5’-gtgcgccggtgtacacaggaagtgacaattttcgc-3’(含SgrA I酶切位点)引物进行PCR扩增poliA2和encapsidation signal信号片段。扩增的重要信号片段经Xba I和SgrA I双酶切后再亚克隆入经相同酶切pAdTrack-CMV-ING4后所获得的线性转移质粒大片段，构建去GFP的pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP重组转移质粒[其介导ING4的poliA信号，由原先的poliA1替换为原先介导GFP的poliA信号(poliA2)]。pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP重组转移质粒的构建和鉴定如图2B。
测序正确的pAdTrack-CMV-ING4、pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP质粒和空载体质粒经PmeI线性化后，与pAdEasy-1质粒共转化BJ5183大肠杆菌，将卡那霉素筛选的阳性克隆扩增后，抽提质粒进行PCR(用引物P5和P6)鉴定(图4)，PCR产物在750bp有一目的条带，结果表明pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4和pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP重组腺病毒载体已成功构建。
实施例3 重组病毒子Ad-ING4-GFP和Ad-ING4-ΔGFP的获得与鉴定
将上述构建的pAd-ING4、pAd-ING4-ΔGFP和pAd同源重组腺病毒质粒经Pac I线性化后，按Lipofectamine Reagent操作说明分别转染70％贴壁的QBI-293A细胞。在荧光显微镜下3-5d观察荧光，7-10d收集细胞悬液，2000r/min离心5min，细胞沉淀用无菌PBS悬浮后，将细胞悬液反复冻融3次，2000r/min离心5min，取上清，经多轮感染和扩增后获得高滴度的Ad-ING4-GFP、Ad-ING4-ΔGFP和Ad-GFP腺病毒子于-80℃保存。ING4重组腺病毒感染QBI-293A细胞后光镜形态学和荧光观察结果如图5A-5D。
将对数生长期的QBI-293A细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度为1×105个/ml，在96孔板上按每孔100μl接种细胞，培养24h后，将收获的Ad-ING4-GFP重组腺病毒子和空载体Ad-GFP腺病毒子作10-4、10-5、10-6、10-7稀释后，每个稀释度按每孔100μl接种3孔，37℃，5％CO2细胞培养箱里培养18h后，荧光显微镜下，进行荧光计数，按病毒效价(pfu/ml)＝(每孔荧光平均数×10)/稀释度公式计算病毒效价。Ad-ING4-ΔGFP由于不表达GFP，故根据CPE，利用常规TCID50法检测其病毒效价。
用10MOI的Ad-ING4-GFP、Ad-ING4-ΔGFP重组腺病毒子和空载体Ad-GFP腺病毒子分别感染QBI-293A细胞48h后，1500r/min离心5min收集细胞，PBS洗涤2～3次，按RNA抽提试剂盒说明书操作提取RNA，用上述引物P5和P6进行RT-PCR鉴定，PCR的条件为94℃2min；94℃50sec、58℃50sec、72℃55sec，35cycle；72℃10min。ING4重组腺病毒子RT-PCR鉴定结果如图6。
实施例4 MTT法检测Ad-ING4-ΔGFP重组病毒对A549肺癌细胞生长的影响
收取A549肺癌细胞作为靶细胞，用RPMI1640配成浓度为1×105个/ml的细胞悬液，100μl/孔接种于96孔培养板，37℃，5％CO2孵育过夜后，弃上清，于96孔培养板中分别加无血清RPMI164010μl为空白细胞对照，10μl(1×108pfu/ml)Ad-GFP为空病毒对照，10μl(1×108pfu/ml)Ad-ING4-ΔGFP重组腺病毒为实验组，每组设3个复孔，37℃，5％CO2孵育2h后，每孔补加90μl 10％FCS RPMI1640。分别培养0、24、48、72、96h时间段，每孔加MTT(5mg/ml)10μl，继续孵育4h后加入溶解剂[10％SDS+1％HCl(1mol/L)]100μl/孔，待甲臢颗粒完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测OD570值。
用获得的重组Ad-ING4-ΔGFP病毒感染A549肺癌细胞，结果(图7)表明A549肺癌细胞生长受到抑制，感染后第4天其抑制率可达55％；而空载体Ad-GFP感染细胞组与空白细胞组无明显差异(P＞0.05)。
实施例5 流式细胞仪检测Ad-ING4-ΔGFP重组病毒对A549肺癌细胞凋亡的影响
同上分3组处理A549肺癌细胞，感染病毒48h后，分别收集3组细胞，用PBS 1.0ml混匀，2000r/min离心5min，弃上清，重复上述步骤一次后，用70％冰乙醇固定细胞，最后用流式细胞仪对3组细胞进行细胞周期和凋亡率检测。
FCM检测结果(图8)表明，Ad-ING4-ΔGFP重组腺病毒感染A549肺癌细胞48h后，G2期(48.5％)出现明显阻滞，与Ad-GFP感染细胞组(0.8％)和空白细胞组(4.6％)存显著性差异(P＜0.01＝；并且能介导A549细胞凋亡，其凋亡率可达13.3％。
实施例6 Western blot检测Ad-ING4-ΔGFP感染后p53、p21基因在A549肺癌细胞中表达的变化
同上分3组处理A549肺癌细胞，感染病毒48h后，分别收集3组细胞，用PBS 1.0ml混匀，1000r/min离心5min，弃上清，重复上述步骤一次后，加细胞裂解液充分裂解(1×107/ml)，再与SDS-PAGE上样缓冲液混匀，煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，并将凝胶蛋白转印到NC膜上，经5％脱脂奶粉封闭1h后，分别加入兔抗P53、P21抗体(1∶1000)，37℃1h，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗，最后用特异性的底物DAB显色，每步反应结束均用TBST(10mmol/L Tris HCl PH7.5，100mmol/L NaCl，1g/L Tween 20)洗涤3次，每次5min。
A549肺癌细胞感染病毒48h后，分别收集3组细胞做Western blot分析，结果(图9)显示，ING4基因表达对A549肺癌细胞的p53抑癌基因表达无明显改变，而p21抑癌基因表达有所升高。
实施例7 RT-PCR检测ING4基因在A549肺癌细胞中的转录
用100MOI的Ad-ING4-ΔGFP病毒感染A549肺癌细胞48h后，1000r/min，离心5min收集细胞，PBS洗涤2-3次，按RNA抽提试剂盒说明书提取RNA，用引物P5和P6进行RT-PCR鉴定，并设Ad-GFP感染对照组和A549细胞对照组。PCR的条件为94℃2min；94℃50sec、58℃50sec、72℃55sec，35cycle；72℃10min。
获得的Ad-ING4-ΔGFP重组腺病毒子感染A549细胞48h后，收集细胞抽提总RNA，利用RT-PCR法检测目的基因的转录情况。结果(图10)显示Ad-ING4病毒在感染A549肺癌细胞中目的基因能进行有效转录，RT-PCR产物经电泳后可出现750bp的条带；而感染空载体Ad-GFP病毒及空白对照的A549肺癌细胞中均未出现上述阳性条带。
实施例8 裸鼠A549肺癌细胞皮下移植瘤模型的建立及治疗
取0.2ml 2×107/ml A549肺癌细胞皮下接种于小鼠右前肢腋下，建立裸鼠A549肺癌细胞皮下移植瘤模型。第10d成瘤后将15只小鼠按每组肿瘤大小大致相等原则分为3组(每组5只)进行治疗实验，即PBS对照组，Ad-GFP空病毒对照组，Ad-ING4-ΔGFP基因治疗实验组，对照组瘤体内注射PBS 60μl，空病毒组瘤体内注射Ad-GFP空病毒60μl(2×109pfu/ml)，实验组瘤体内注射Ad-ING4-ΔGFP 60μl(2×109pfu/ml)，均为隔天1次，共5次，终止治疗后第三天处死小鼠，取肿瘤称重。
用A549肺癌细胞所建立的荷瘤裸鼠接受Ad-ING4治疗后，肿瘤生长明显减慢。经连续5次治疗，于最后一次治疗后第3天处死小鼠，取肿瘤称重。结果(图11、12)显示PBS对照组瘤重为1.42±0.24g，空载体Ad-GFP对照组瘤重为1.12±0.22g，而Ad-ING4-ΔGFP基因治疗实验组瘤重为0.54±0.16g，与PBS对照组相比，Ad-ING4-ΔGFP基因治疗实验组肿瘤显著减小(P＜0.01)，其抑瘤率可达到60％。，Ad-ING4-ΔGFP基因治疗取得了明显效果。
实施例9 免疫组化法检测移植瘤中肿瘤内微血管密度的变化
将裸鼠处死后取出的肿瘤组织用福尔马林固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，采用免疫组化SP法染色，CD34抗体检测，DAB显色，苏木素复染，肿瘤内微血管内皮细胞在光镜下呈棕褐色反应者为阳性表达。微血管判断标准按照Weidne等的评判标准[14]，CD34阳性标记的单个细胞或内皮细胞簇为1个血管标记(MDV)，先在低倍镜下全面观察切片，以确定肿瘤血管密度最明显区域，然后在高倍镜下选择微血管数量最多的5个视野计数MVD，求其平均数作为该例的MVD值。
荷瘤裸鼠的移植瘤取出用福尔马林固定后，石蜡包埋和切片，用CD34标记移植瘤中肿瘤血管内皮细胞，计算其微血管密度(MVD)，结果(图13)发现经Ad-ING4-ΔGFP基因治疗后，其MVD值为50.4±14.3，而PBS对照组和空载体Ad-GFP对照组分别为89.2±18.3和81.6±13.6，与PBS和空载体Ad-GFP对照组相比，Ad-ING4-ΔGFP基因治疗实验组肿瘤微血管密度明显降低(P＜0.01)。
实施例10 ELISA检测Ad-ING4-ΔGFP对A549肺癌细胞分泌VEGF和IL-6、IL-8的影响
收取A549肺癌细胞，用RPMI1640配成浓度为1×105个/ml的细胞悬液，于96孔培养板每孔加100μl，37℃，5％CO2孵育过夜后，弃上清，于96孔培养板中分别加无血清RPMI164010μl为空白细胞对照，10μl(1×108pfu/ml)空载体Ad-GFP腺病毒为空病毒对照，10μl(1×108pfu/ml)Ad-ING4-ΔGFP重组腺病毒子为实验组，每组设3个复孔，感染2h后每孔补加含10％小牛血清的RPMI1640 90μl，分别于24、48、72h时间段，收取上清，按ELISA试剂盒说明书检测VEGF、IL-6和IL-8的表达。
Ad-ING4-ΔGFP感染A549肺癌细胞后，分别与24，48，72h收取上清，ELISA法检测结果(表2-4，图14-16)，Ad-ING4-ΔGFP感染组A549肺癌细胞24，48，72h各时间段VEGF分泌分别为298.0±68.3，821.1±53.2，1211.0±123.0pg/ml，而空白细胞对照组和Ad-GFP病毒对照组依次分别为224.3±62.4，783.2±75.8，1194.0±130.0pg/ml；231.5±52.3，708.0±81.3，1018.9±116.7pg/ml，与对照组相比无明显差别(P＞0.05)；48h时，IL-6及IL-8的分泌Ad-ING4-ΔGFP感染组分别为94.8±10.2，512.3±50.6pg/ml，而空白细胞对照组和Ad-GFP病毒对照组依次分别分别为180.0±35.8，712.5±116.5pg/ml；178.3±11.4，805.4±125.8pg/ml，与对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)。
表2 Ad-ING4感染A549肺癌细胞后ELISA检测VEGF结果
| 空白细胞对照 | Ad空病毒对照 | Ad-ING4实验组 | |
| 24h | 224.3±62.4 | 231.5±52.3 | 298±68.3 |
| 48h | 783.2±75.8 | 708±81.3 | 821.1±53.2 |
| 72h | 1194±130 | 1018.9±116.7 | 1211±123 |
表3 Ad-ING4感染A549肺癌细胞后ELISA检测IL-6结果
| 空白细胞对照 | Ad空病毒对照 | Ad-ING4实验组 | |
| 48h | 180±35.8 | 178.3±11.4 | 94.8±10.2* |
*P＜0.05
表4 Ad-ING4感染A549肺癌细胞后ELISA检测IL-8结果
| 空白细胞对照 | Ad空病毒对照 | Ad-ING4实验组 | |
| 48h | 712.5±116.5 | 805.4±125.8 | 512.3±50.6* |
*P＜0.05
实施例11 荧光定量RT-PCR检测IL-6、IL-8mRNA的表达
IL-6、IL-8mRNA表达荧光定量PCR检测所用引物如下：
IL-6上游：5’-cag aca gcc act cac ctc ttc ag-3’
IL-6下游：5’-ctc atc tgc aca gct ctg gct tg-3’
IL-6PCR产物大小：308bp
IL-8上游：5’-atg act tcc aag ctg gcc gtg g-3’
IL-8下游：5’-tta tga att ctc agc cct ctt caa aa-3
IL-8PCR产物大小：299bp
beta-actin上游：5’-tgc gtg aca tta agg aga ag-3’
beta-actin下游：5’-ctg cat cct gtc ggc aat g-3’
beta-actin PCR产物大小：317bp
实时定量PCR检测IL-6、IL-8mRNA表达及其计算方法大致如下：在MJ ResearchOpticonTM2荧光定量PCR仪上同时检测IL-6、IL-8及β-actin的表达，以SYBR Green I为荧光染料，实时定量PCR的体系为：5×PCR buffer 5μl，250mM MgCl2 0.5μl，10mMdNTP 0.75μl，20×SYBR Green I 1μl，10μM引物各0.5μl，5u/μl HS Taq DNA聚合酶0.25μl，cDNA 2.0μl，反应总体积为25.0μl。反应程序为：95℃，5min，95℃，15s，58℃，20s，72℃，30s读板，78℃，2s读板，80℃，2s读板，49循环，溶解曲线从68℃到96℃，每0.3s读一次，时间为1s，最后72℃，5min。各标本每个基因检测复孔，取平均值为基因表达量。计算基因表达水平的改变参考文献[2]，简叙如下：以看家基因β-actin表达作为内参照，基因表达水平的改变＝2-ΔΔCT。目的基因表达水平ΔCT＝目的基因CT-β-actinCT。ΔCT＝实验组ΔCT-对照组ΔCT值。CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。实验重复3次。
ING4重组腺病毒感染A549肺癌细胞48h后收取细胞，荧光定量RT-PCR检测IL-6、IL-8的表达，结果(图17-25)显示，ING4重组腺病毒实验组IL-6mRNA表达水平是空白对照组细胞的0.41±0.05倍(P＜0.01)，空载体Ad-GFP组与空白对照组细胞IL-6 mRNA表达水平无显著差异(P＞0.05)；IL-8 mRNA表达水平在ING4重组腺病毒实验组是空白对照组细胞的0.52±0.12倍(P＜0.01)，空载体Ad-GFP组与空白对照组细胞IL-8mRNA表达水平也无显著差异(P＞0.05)。产物经溶解曲线分析及凝胶电泳验证无非特异性条带及引物二聚体。
实施例12 Ad-ING4-ΔGFP感染后A549肺癌细胞体外转移浸润
将Matrigel 40ul均匀的铺在TranswellChanber膜上，37℃，30min成胶。取对照组和实验组细胞各2×105个/ml，0.3ml分别接种到成胶的TranswellChanber，并将TranswellChanber置于24孔板内，板内加入0.6ml含10％小牛血清的RPMI1640培养液，24h后取出TranswellChanber；用棉签头擦掉Matrige胶及胶上细胞，PBS液洗3次，瑞氏染色，结果判定：200倍光镜下随机计数5个视野的穿膜细胞数，取均值。
由图26可见，Ad-ING4-ΔGFP感染后，A549肺癌细胞体外转移浸润能力大为下降，染色显示，实验组穿膜细胞为6±3；而空白细胞对照组穿膜细胞和Ad-GFP感染对照组穿膜细胞分别为134±14，118±18，与对照组相比，实验组穿膜细胞大为减少，结果有显著性差异(P＜0.01)。
实施例13 荧光定量PCR检测MMP2、MMP9 mRNA的表达
参照实施例11，荧光定量PCR检测MMP2、MMP9mRNA的表达。
MMP2、MMP9mRNA表达荧光定量PCR检测所用引物如下：
MMP2上游：5’-gctatggaccttgggagaa-3’
MMP2下游：5’-tggaagcggaatggaaac-3’
MMP9上游：5’-tggaagcggaatggaaac-3’
MMP9下游：5’-tggaagcggaatggaaac-3’
ING4重组腺病毒感染A549肺癌细胞48h后收取细胞，荧光定量RT-PCR检测MMP2、MMP9的表达，结果(图27-35)显示，ING4重组腺病毒实验组MMP2mRNA表达水平是空白对照组细胞的0.62±0.13倍(P＜0.01)，空载体Ad-GFP组与空白对照组细胞MMP2mRNA表达水平无显著差异(P＞0.05)；MMP9 mRNA表达水平在ING4重组腺病毒实验组是空白对照组细胞的0.50±0.04倍(P＜0.01)，空载体Ad-GFP组与空白对照组细胞MMP9mRNA表达水平也无显著差异(P＞0.05)。产物经溶解曲线分析及凝胶电泳验证无非特异性条带及引物二聚体。
实施例14 MTT法检测Ad-ING4-ΔGFP重组病毒对ECV304细胞生长的影响及ELISA检测Ad-ING4-ΔGFP对ECV304细胞分泌VEGF的影响
参照实施例4和实施例10，MTT法检测Ad-ING4-ΔGFP重组病毒对ECV304细胞生长的影响及ELISA检测Ad-ING4-ΔGFP对ECV304细胞分泌VEGF的影响。
用获得的重组Ad-ING4-ΔGFP病毒感染ECV304细胞，结果(图36)表明被感染的ECV304细胞48h后生长受到抑制，感染后第4天其抑制率达到63％，而空载体Ad-GFP感染细胞组与空白细胞组无明显差异。
Ad-ING4-ΔGFP感染ECV304细胞后，ELISA法检测24，48，72h上清VEGF分泌情况，结果(表5，图37)显示，Ad-ING4感染后，ECV304细胞24，48，72h各时间段VEGF分泌分别为365.8±125.6，481.5±92.1，702.3±88.5pg/ml，而空白细胞对照组和Ad-GFP病毒对照组依次分别分别为282.3±94.4，708.2±95.6，1209.6±226.8pg/ml；362.5±115.6，811.0±141.8，1215±188.9pg/ml，实验组48，72h VEGF的表达水平与对照组相比均呈现明显下降，均有明显差别(P＜0.01)。
表5 ELISA检测Ad-ING4感染后ECV304细胞VEGF的表达
| 空白细胞对照 | Ad空病毒对照 | Ad-ING4实验组 | |
| 24h | 282.3±94.4 | 362.5±115.6 | 365.8±125.6 |
| 48h | 708.2±95.6 | 811±141.8 | 481.5±92.1* |
| 72h | 1209.6±226.8 | 1215±188.9 | 702.3±88.5* |
*P＜0.05
实施例15 腺病毒载体介导的ING4基因对K562白血病细胞凋亡的影响K562细胞中IN64基因转录水平表达的检测
Ad-ING4-ΔGFP及空载体Ad-GFP转染的K562细胞培养72h后，收集细胞提取总RNA，以此为模板合成cDNA第一链，然后用上述引物常规PCR扩增ING4编码区cDNA。具体反应条件为94℃4min；94℃45sec，58℃45sec，72℃50sec，35cycle；72℃10min。产物通过1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
人ING4基因编码序列约为750bp，经RT-PCR检测证实感染Ad-ING4-ΔGFP的K562细胞内有ING4mRNA表达，而感染空腺病毒载体Ad-GFP的细胞内无ING4mRNA表达(图38)。
Ad-ING4-ΔGFP感染K562细胞形态学和凋亡检测
取对数生长期的K562细胞，1000r/min离心10min，弃培养液，细胞沉淀用无血清1640培养液打匀，约500μl，铺满小方瓶底部，分别加Ad-ING4-ΔGFP和空载体Ad-GFP各200μl，37℃5％CO2条件下孵育30min，再各加入含10％小牛血清的1640 3ml，37℃5％CO2条件下培养，于72h后观察荧光及细胞形态，同时收集细胞。
K562细胞在正常情况下大多呈圆形，细胞形态完整，透亮度均匀，增生活跃，具有原始白血病细胞的典型特征，感染空病毒Ad-GFP和Ad-ING4-ΔGFP 72h后，可见部分细胞堆集成葡萄状，其中Ad-ING4-ΔGFP组可见细胞数减少，细胞形态不规则，大小不一，透亮度差，出现细胞碎片，部分细胞可观察到凋亡改变，胞核出现许多小的颗粒(凋亡小体)，有核固缩，核破碎现象，说明Ad-ING4-ΔGFP对K562细胞有生长抑制和诱导细胞凋亡的作用，而空病毒对照组无此现象发生(图39A-D)。
免疫细胞化学分析感染Ad-ING4-ΔGFP对凋亡因子的影响
分别将Ad-ING4-ΔGFP及空载体Ad-GFP转染72h后的K562细胞1000r/min离心10min，弃培养液，细胞沉淀用PBS洗二遍，然后作细胞涂片，吹干，用丙酮固定，分别用bcl-2，bax的免疫组化试剂盒，按说明书进行操作，高倍镜下随机计数100个细胞，计算阳性细胞的百分率，阳性细胞表现为胞浆及胞膜上有棕黄色颗粒。实验重复5次。观察感染前后bcl-2、bax蛋白表达的变化
经免疫组化试剂盒检测，空载体Ad-GFP感染72h后的K562细胞对照组bcl-2和bax阳性细胞百分率为81.4±5.5％和23.6±3.4％，感染Ad-ING4-ΔGFP 72h的实验组bcl-2和bax阳性细胞百分率分别为71.2±7.6％和31.0±5.2％，与对照组相比，P＜0.05(图40A-D)，表明Ad-ING4-ΔGFP既能通过下调bcl-2的表达，又能通过上调bax的表达，使bcl-2/bax的比值下降，进而促进细胞的凋亡。
激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察K562细胞凋亡
将ING4基因重组载体及空载体感染72h后的K562细胞收集离心，用PBS洗两次，然后调整浓度为105/ml，吸取30μl细胞悬液加1.5μl丫啶橙(AO，终浓度为5μg/ml)和1.5μl溴乙锭(终浓度为5μg/ml)，室温避光作用30min，涂片，在LSCM下观察，计数凋亡细胞，计算凋亡率(每20个细胞中凋亡细胞数为一个样本，不同视野重复计数10次)。统计学处理采用SPSS10.0统计软件包进行分析，t检验。
正常K562细胞核较大，呈弥散均匀的荧光，核膜清晰，可见到数个核仁，胞膜完整，偶见有瘤状突起。凋亡细胞胞膜不完整，核皱缩呈致密浓染或碎裂成块状，核膜模糊或消失，有的呈现明显的凋亡小体(图41A、B)。Ad-ING4-ΔGFP感染K562细胞72h后，凋亡率为20.3±4.9％，明显高于转染空载体的K562细胞的凋亡率5.9±2.6％(P＜0.05)。
Claims (13)
1、一种人源化改造的鼠ING4基因，其编码的氨基酸序列与GenBank报道的鼠ING4的氨基酸序列相比具有至少选自如下的突变之一：第66位氨基酸由Arg变成Lys，第156位氨基酸由Ala变成Thr。
2、权利要求1的基因，其编码的氨基酸序列与GenBank报道的鼠ING4的氨基酸序列相比具有如下突变：第66位氨基酸由Arg变成Lys，第156位氨基酸由Ala变成Thr。
3、权利要求1的基因，其与GenBank报道的鼠ING4基因序列相比具有至少选自如下的突变之一：第197位的碱基G变成A、第231位的碱基A变成G、第476位的碱基G变成A或者第528位的碱基C变成A。
4、权利要求1的基因，其与GenBank报道的鼠ING4序列相比具有如下突变：第197位的碱基G变成A、第231位的碱基A变成G、第476位的碱基G变成A和第528位的碱基C变成A。
5、包含权利要求1-4的任何一项的基因的重组载体，包含去除GFP基因的腺病毒转移载体pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP、同源重组腺病毒载体pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-ΔGFP或重组腺病毒Ad-ING4-ΔGFP。
6.包含权利要求1-4的任何一项的基因或权利要求5的任何一种重组载体的宿主细胞，选自大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BJ5183或QBI-293A细胞。
7.一种药物组合物，其含有权利要求1-4的任何一项的基因、权利要求5中的任何一种的重组载体或权利要求6中的任何一种的宿主细胞，含有药学上可接受的药物载体或者赋形剂。
8.制备人源化改造的鼠ING4基因的方法，其包括将鼠ING4基因的第66位氨基酸编码序列aga变aaa和第156位氨基酸编码序列gct变act，其步骤包括以pcDNA3.0-mING4质粒为模板，以P1与P6，P2与P5分别进行第一轮PCR，胶回收后混合，随后以该混合PCR产物为模板，以引物P5与P6进行第二轮PCR，胶回收后再以此PCR产物为模板，以引物P3与P6，P4与P5分别进行第三轮PCR，胶回收后混合，再以此混合PCR产物为模板，以引物P5与P6进行第四轮PCR；其中：
P1：5’-gcc ctt ctc a
aa cag atc cag gag gcc tat-3’；
P2：5’-ctg gat ctg t
tt gag aag ggc cag ctt ctc-3’；
P3：5’-gcc ccc aag
act gcc cag aag aag tta aaa-3’；
P4：5’-ctt ctg ggc ag
t ctt ggg ggc ttc ttc atc-3’；
P5：5’-gc
g tcg aca tgg atg atg gga tgt att tgg aac-3’；
P6：5’-gc
a agc ttc tag tgg tgg tgg tgg tgg tgt ttc ttcttc cgt tct tgg gag-3’。
9.权利要求1-4的任何一项的基因、权利要求5的任何一种的重组载体、权利要求6的任何一项的宿主细胞和/或权利要求7的组合物用于抑制肿瘤细胞的用途。
10.权利要求9的用途，所述肿瘤细胞为肺癌细胞或者白血病细胞。
11.权利要求9的用途，所述肿瘤细胞为A549细胞或者K562细胞。
12.权利要求1-4的任何一项的基因、权利要求5的任何一项的重组载体、权利要求6的任何一项的宿主细胞和/或权利要求7的药物组合物用于制备肿瘤疾病、发育性疾病或免疫性疾病或其它由于肿瘤生长抑制因子ING4表达异常所引起疾病的药物中的用途。
13.权利要求12的用途，所述肿瘤疾病为肺癌或者白血病。
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