CN101037690B - 具有新的单核苷酸多态性的brca1基因变体和其编码的蛋白质变体 - Google Patents
具有新的单核苷酸多态性的brca1基因变体和其编码的蛋白质变体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了含有新的单核苷酸多态性位点的核酸片段和相应的蛋白或片段，所述的多态性位点位于BRCA1基因全长CDS的位置3627。也提供了用于检测所述多态性位点的相关基因型的等位基因特异性寡核苷酸，以及用于检测所述多态性位点的相关基因型的等位基因特异性寡核苷酸的方法和试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及新的单核苷酸多态性。更具体地，本发明涉及BRCA1基因全长CDS的3627位的多态性位点，和含有所述的多态性位点的核酸片段，以及含有所述的多态性位点的蛋白或片段。也提供了用于鉴定所述多态性位点基因型的特异性寡核苷酸和方法。本发明的新的多态性位点与乳腺癌疾病的发生有关。
背景技术
传统上，分析基因变异的各种方法已经广泛应用于医药卫生领域，用来预防和诊断疾病的发生和/或倾向。已有的基本方法包括：利用核酸扩增的方法如聚合酶链式反应(PCR)和利用核苷酸测序，利用变性高压液相色谱(DHPLC)，单链构相多态性分析(SSCP)等。在实际应用中，有时需要将这些方法结合起来运用。
随着基因组研究的迅速、深入的发展，单核苷酸多态性(SNP)作为遗传分子标记亦日益受到研究人员的重视。越来越多的基因多态性与疾病的关系被揭示，如血管紧张素(angiotensin，AGT)、血管紧张素转换酶(ACE)两个基因的多态性与心血管疾病之间的关系已经得到研究界的公认。Pyrosequencing AB(Uppsala，SE)和Genomics Collaborative，Inc.(GCI)合作研究心血管疾病和药物反应，发现和确认了一些心血管疾病相关基因的多态性位点，并发明了评估心血管情况(包括心肌梗塞和中风)的方法，其发明涉及与心血管疾病相关的基因的SNPs，以及利用SNPs预测人体对抗高血压药物，如ACE抑制剂和血管紧张素受体激动剂等的反应(参见美国专利6,197,505)。
而且，目前，已有商品化诊断用基因多态性分析产品面世，如Affymetrix公司推出的p53基因突变诊断芯片、艾滋病病毒基因突变诊断芯片和细胞色素P450基因突变诊断芯片等。
BRCA基因，即乳腺癌易感基因，已知与乳腺癌(breast cancer)有关。BRCA基因为一种抑癌基因，可分为BRCA1和BRCA2。BRCA1基因位于人类第17号染色体上，BRCA2位于人类第13号染色体上。
遗传性乳腺癌患者中，90％会发生BRCA1或BRCA2突变，从而令女性患上乳腺癌的机会大大增加。此外，BRCA1和BRCA2的突变也和卵巢癌有关。不管是否有家族史也不论发病年龄，所有卵巢癌中2-6％有BRCA1的突变，3-4％有BRCA2的突变。
因此，筛选BRCA基因的突变的需求正在增加。
发明内容
本发明提供了含有新的单核苷酸多态性位点的、至少10个连续(contiguous)核苷酸的核酸片断和其互补序列。
本发明也提供了与含有新的单核苷酸多态性位点的基因片断或其互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸。
本发明提供了分析核酸的方法，包括分析含有新的多态性位点的核酸的核苷酸序列。
而且，本发明提供了人BRCA1多肽的变体或片断，其具有的氨基酸序列由10个或更多个氨基酸组成，其中包含对应于新的核酸突变的氨基酸突变。
本发明提供了分析蛋白质的方法，包括分析含有与新的核酸多态性位点相对应的氨基酸位点的蛋白的氨基酸序列。
本发明的核酸片段可以为诊断乳腺癌提供新的手段，例如，本发明的核酸片段可以被有效地用做乳腺癌诊断的探针或引物。
本发明的等位基因特异寡核苷酸可以被有效用做乳腺癌诊断的探针或引物。
本发明的人BRCA1多肽的变体或片段可以为诊断乳腺癌提供新的手段。
本发明的蛋白分析方法可以有效地用于乳腺癌的诊断。
附图说明
图1显示了具有包含本发明中的BRCA1突变核苷酸的部分，即，包含在3627位有胸腺嘧啶(T)的多态性位点的基因组测序图谱。
图2显示了检测本发明的SNP位点的基因型的一种实施方案，该实施方案利用了GAP-LCR方法，并且使用Luminex系统来进行检测。该图示意性地显示了相关的核苷酸序列。其中，长条形框表示目标核酸序列，例如BRCA1的一种等位基因的片段，并且其中示出了多态性位点。红色条状物分别表示与多态性位点上下游的序列互补的寡核苷酸序列。下游的互补寡核苷酸序列与多态性位点相距3个碱基，并且与之融合有下游通用序列。上游的互补寡核苷酸序列的3’末端对应于多态性位点，并且与之融合有报导标签序列和上游通用序列。特别地，如果上游的互补寡核苷酸序列3’端的核苷酸与多态性位点处的核苷酸相匹配，那么在GAP-LCR反应中，上下游的序列便可连接起来。接着，在Luminex系统中，连接的产物通过磁珠被分离，并且，利用通用序列而被扩增，扩增的序列中的报导标签序列可以用于与不同的荧光标记探针结合。因此，通过上述方法，可以实现核苷酸多态性位点的高通量和高灵敏性检测。
本发明的详细描述
本发明提供了核酸片断。在一个方面，本发明的核酸片段包含如在位置3627为胸腺嘧啶(T)的SEQ ID NO：1中所示的多态性位点，并且包含在SEQ ID NO：1或其互补序列中显示的至少大约10个连续核苷酸，例如，大约10至大约100个连续核苷酸、大约100至大约200个连续核苷酸、大约200至大约300个核苷酸、大约300至大约400个核苷酸、大约400至大约500个核苷酸、大约500至大约1000个核苷酸、大约1000至大约2000个核苷酸、大约2000至大约3000个核苷酸、大约3000至大约4000个核苷酸或大约4000至大约5000个核酸或者更长，甚至为SEQ ID NO：1中所示核酸序列的全长。在一种优选的实施方案中，本发明的核酸片断优选包含在SEQ ID NO：1或其互补序列中的大约10到大约100个连续核苷酸，更优选地大约10到大约50个连续核苷酸，以及最优选地大约10到大约20个连续核苷酸。在另一种实施方案中，本发明的核酸片断可以包含BRCA1基因本身。
进一步地，根据本发明的新的多态性位点可以位于核酸片断的任何部分，例如，位于靠近核酸片断的任一末端的位置，或者位于核酸片断的大约中间位置。
本发明的“核酸片断”可以是DNA或RNA，或者可以是PNA，或者天然的或合成的任何类似DNA的或类似RNA的物质。本发明的核酸片段可以是单链的或双链的，可以是代表正义链或反义链的，可以是基因组的或合成的。
本发明的核酸片段也可以包含天然核苷酸的已知类似物，例如包含碱基类似物，所述的碱基类似物例如但不限于：4-乙酰胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-甲氧基氨基-甲基-2-硫代尿嘧啶、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5′-甲氧基羰基-甲基尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧基-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、二氢尿嘧啶、假尿嘧啶、1-甲基假尿嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N6-异-戊烯基腺嘌呤、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2，2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、Q核苷、β-D-甘露糖Q核苷、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸和2，6-二氨基嘌呤以及类似物。
本发明的核酸片段也可以包括具有合成的骨架的核酸类似物。例如，本发明的核酸片段的骨架键可以不是磷酯键，例如是硫酯键，硫代磷酸键，类似肽键的键或者本领域技术人员已知的能够连接核苷生成合成的多聚物的其它任何化学键(参见，比如，Tam等，Nucl.Acids Res.22：977-986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13：351-360，1995)
在本发明中，术语“多态性”是指在被遗传检测的组中存在两种或更多种的可选择的基因组序列或等位基因。“多态性标记或位点”是变异发生的位置。优选地，在被选择的组中，标记含有至少两种等位基因，其发生频率为大于1％。多态性位点可以是单碱基对。本文在描述本发明的多态性位点时，是参照其在SEQ ID NO：1所示的序列中的位置来描述的，即，对应于SEQ ID NO：1的位置3627。在一些实施方案中，位于该多态性位点的等位基因核苷酸型为A。在另外的实施方案中，位于该多态性位点的等位基因核苷酸型为T。
此外，本发明提供了等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸包含如位置3627为T核苷酸的SEQ ID NO：1所示的多态性位点，并且能够特异性地鉴别不同的等位基因型，例如能够与SEQ ID NO：1的核苷酸序列或其互补序列特异地杂交。
在本发明中，术语“等位基因特异性”是指特异地与各等位基因杂交。例如，进行杂交使得特异地鉴定在位置3627为T核苷酸的SEQ ID NO：1的SNP。杂交是在严谨条件下进行的，例如1M或更低的盐浓度和25℃或更高的温度的条件。例如，5×SSPE(750mMNaCl，50mM磷酸钠(Naphosphate)，5mM EDTA，pH7.4)和25℃～30℃的温度条件适用于等位基因特异性寡核苷酸的杂交。
关于杂交技术，科学文献中已有过很多的详细描述。例如参见，Sambrook，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(2ND ED.)，vol.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory，(1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，Ausubel，ed.John Wiley&Sons，Inc.，New York(1997)；LABORATORYTECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY：HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES，Part I.Theory and Nucleic AcidPreparation，Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.(1993)。以上所有文献在此通过引用方式整体并入本文。因此，考虑到本发明的公开内容，本领域普通技术人员能够容易地确定具体的杂交条件。
特别地，本发明的等位基因特异性寡核苷酸可以用作探针。这里使用的术语“探针”意指杂交探针，它是能与核酸互补链序列特异性结合的寡核苷酸。这种探针包括Nielsen等在Science254，1497-1500(1991)中描述的肽核酸。本文的探针是等位基因特异性探针，其在一定条件下，与来自于一种组分(例如，一个等位基因)的DNA片断杂交，但不与来自不同组分的DNA片断杂交，这正是因为来自相同物种的两种组分的核酸片断具有多态性位点。在这种情形下，这些等位基因的杂交条件的杂交严谨性是明显不同的。这样，杂交条件应该严谨到足以允许仅与一个等位基因杂交。本发明的探针优选被设计成这样，即：使得其中心位点或大约中心位点——即15个核苷酸长的探针时在位点7，或16个核苷酸长的探针时在位点8或9——可以与序列的多态性位点匹配(align)，从而使得等位基因的杂交明显不同。这样的探针的示范性实例被描述于实施例3中。本发明的探针能够被用于检测等位基因的诊断方法中。诊断方法包括基于核酸杂交的检测方法，例如，southern印迹杂交，当DNA芯片用于检测特定核酸时，探针可以以固定在DNA芯片底物上的形式被提供。
如以上所述，本发明的等位基因特异性探针可以是任意长度，例如，本发明的探针包含至少10个连续核苷酸。可以选择地，本发明的探针可以是本发明的核酸序列的大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100个连续核苷酸。然而，本领域技术人员明显知道的是，探针的序列不必一定与靶序列完全互补，而是只要它能与靶序列特异性杂交即可。同样地，所述的多态性位点可以出现在探针序列的任意位置，只要获得的探针能够特异性地鉴别等位基因。
本发明的探针可以用于分析各种样品，例如，特别地，来自被怀疑患有乳腺癌或被认为具有患有乳腺癌的风险的个体或者来自健康个体的样品。本发明的探针可以被用来鉴定特定的靶序列(例如，等位基因)，例如，用来确定BRCA1基因的多态性位点的状态。在一种实施方案中，获得生物样品，并从其中分离出核酸，然后将这些核酸在允许探针与样品中可能存在的特异性靶序列杂交的条件下与探针接触。如果样品中含有所述的靶序列，那么探针的特异性杂交被检测到。可被检测的杂交可以通过使用由可检测的试剂标记过的探针来实现，例如，用放射性同位素、荧光染料或能催化形成可检测产物的酶来标记探针。使用标记探针来检测样品中特定核酸的存在的许多方法对本技术领域的普通技术人员是熟知的。因此，本发明的等位基因特异性核苷酸可以用作检测试剂。相应地，在另一种实施方案中，本发明也提供了包含本发明的等位基因特异性核苷酸作为探针的检测试剂或诊断试剂盒。
此外，在本发明中，等位基因特异性寡核苷酸可以是引物。这里使用的术语“引物”是指能在适当的条件(例如，在含有4种不同的核苷三磷酸和聚合酶如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶以及合适的缓冲液的条件下)和适当的温度下作为模板指导的DNA合成的起始点的单链寡核苷酸。引物的适当长度可以根据使用目的而改变，通常15到30个核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个核苷酸，但也可以是少于15个核苷酸，例如大约10、11、12、13、14个核苷酸，或者是多于30个核苷酸。一般地，短的引物分子需要较低的温度来与模板形成稳定的杂交。引物序列与模板不需要完全互补，但应该是足以与模板杂交的互补。优选地，设计引物，使得其3’末端安排有多态性位点，例如在位置3627为T核苷酸的SEQ ID NO：1的多态性位点。这样的引物的示范性实例被描述于实施例2中。引物与含有多态性位点的靶DNA杂交，并且起始等位基因的扩增。所述引物可以成对使用，其中的另一条引物杂交于相对的位点。扩增反应后，扩增产物从两个引物获得，这就意味着具有特定的等位基因形式。进一步地，特异性的扩增产物可以通过多种手段被检测。例如，通过在反应产物上进行凝胶电泳并用嵌入剂如溴化乙啶染色凝胶来检测。或者，可以用同位素标记一种或多种探针，放射性扩增产物的存在在凝胶电泳后通过放射自显影术来检测。作为选择，为了使由引物延伸而得到的产物易于检测，引物还可以与其它有助于检测的序列相融合，这样的融合的引物序列也被描述于例如实施例2中。这些以及其它的用于检测核酸产物的技术是本领域技术人员熟知的。因此，本发明的等位基因特异性核苷酸可以用作检测试剂。相应地，在另一种实施方案中，本发明也提供了包含本发明的等位基因特异性核苷酸作为引物的检测试剂或诊断试剂盒。
根据本发明的另一方面，提供了分析核酸的方法，包括测定在SEQ ID NO：1的位置3627处的多态性位点的核苷酸序列。该方法可以包括将核酸，例如基因组DNA或RNA从样品中分离，测定分离出的核酸的序列并且测定在SEQ ID NO：1的位置3627处的多态性位点的核苷酸序列。如果分析结果显示出在SEQ ID NO：1的位置3627处的多态性位点的核苷酸序列是不同于腺嘌呤(A)的核苷酸，这就确定有乳腺癌(breast cancer)增加的危险。这里，核苷酸序列可以通过普通的测序方法被测定，例如，双脱氧法或利用自动化设备，也可以使用本领域已知的任何其它测定序列的方法，例如利用等位基因特异性探针杂交和/或等位基因特异性引物延伸，例如本文中实施例所描述的GAP-LCR方法和DASH方法。
根据本发明的人BRCA1多肽的变体或片段含有多态性位点，该位点上，SEQID NO：2的1170位氨基酸是一个不同于异亮氨酸(Ile)的氨基酸，优选的是苯丙氨酸(Phe)，而且所述变体或片段含有源自SEQ ID NO：2氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。
本发明也提供了蛋白质的分析方法，包括测定SEQ ID NO：2的位置1170处的氨基酸序列。该氨基酸序列是用通常的方法测定，例如，N-或C-末端鉴定，或使用诸如MS/MS或MALTI-TOF的设备。进一步地，在一种实施方案中，如果对应于所述位置1170的氨基酸是苯丙氨酸，可确定患有乳腺癌的危险增加。
现在本发明将通过参考下面提到的实施例更详细地描述。但是，这些实施例仅被提供用于说明，并且本发明不局限于那些实施例。
实施例
实施例1：人BRCA1基因中新的多态性位点的鉴定
在本实施例中，从76例有乳腺癌或卵巢癌家族史、临床确诊为乳腺癌的女性患者，以及常规检查正常的105个女性的血液样品中分离基因组DNA，用PCR的方法对BRCA1基因的外显子部分进行扩增，通过变性高压液相色谱(DHPLC)对家族性乳腺癌患者的BRCA1基因突变进行筛选，经过碱基测序，BRCA1基因的新的突变位点被测定。
(1)人BRCA1基因外显子部分DNA的扩增
从76个患者和105个正常人收集血液，基因组DNA用蛋白酶K裂解和酚—氯仿抽提法分离。BRCA1基因中外显子部分用PCR反应溶液扩增。
PCR扩增总体系为25μl，含0.2—0.4μg模板DNA、0.4μmol/L上下游引物、200μmol/L dNTPs、1.0U Taq DNA聚合酶和相应的缓冲液。
扩增的条件是5分钟(94℃)用于最初的变性，35个循环为30秒(94℃)用于变性，根据表1选择各自引物优化的退火温度30秒用于退火以及30秒(72℃)用于延伸，10分钟(72℃)用于最后的延伸。
PCR扩增中用的引物列表列于表1中。
表1BRCA1基因引物序列及靶片段在全长基因上的分布
| 5’序列引物 | 3’序列引物 | |
| BRCA1基因外显子2 | SEQ ID NO：3 | SEQ ID NO：4 |
| BRCA1基因外显子5 | SEQ ID NO：5 | SEQ ID NO：6 |
| BRCA1基因外显子8 | SEQ ID NO：7 | SEQ ID NO：8 |
| BRCA1基因外显子9 | SEQ ID NO：9 | SEQ ID NO：10 |
| BRCA1基因外显子11片断(A) | SEQ ID NO：11 | SEQ ID NO：12 |
| BRCA1基因外显子11片断(B) | SEQ ID NO：13 | SEQ ID NO：14 |
| BRCA1基因外显子11片断(D) | SEQ ID NO：15 | SEQ ID NO：16 |
| BRCA1基因外显子11片断(E) | SEQ ID NO：17 | SEQ ID NO：18 |
| BRCA1基因外显子11片断(F) | SEQ ID NO：19 | SEQ ID NO：20 |
| BRCA1基因外显子11片断(G) | SEQ ID NO：21 | SEQ ID NO：22 |
| BRCA1基因外显子11片断(H) | SEQ ID NO：23 | SEQ ID NO：24 |
| BRCA1基因外显子11片断(I) | SEQ ID NO：25 | SEQ ID NO：26 |
| BRCA1基因外显子11片断(K) | SEQ ID NO：27 | SEQ ID NO：28 |
| BRCA1基因外显子11片断(L) | SEQ ID NO：29 | SEQ ID NO：30 |
| BRCA1基因外显子12 | SEQ ID NO：31 | SEQ ID NO：32 |
| BRCA1基因外显子13 | SEQ ID NO：33 | SEQ ID NO：34 |
| BRCA1基因外显子15 | SEQ ID NO：35 | SEQ ID NO：36 |
| BRCA1基因外显子16 | SEQ ID NO：37 | SEQ ID NO:38 |
| BRCA1基因外显子17 | SEQ ID NO：39 | SEQ ID NO：40 |
| BRCA1基因外显子18 | SEQ ID NO：41 | SEQ ID NO：42 |
| BRCA1基因外显子20 | SEQ ID NO：43 | SEQ ID NO：44 |
扩增产物用凝胶回收试剂盒回收。然后将回收产物和野生型正常对照等比例混合后，使用梯度PCR仪进行缓慢复性。
复性条件是：3分钟(95℃)变性，然后每秒降低0.01℃，直到65℃，自然冷却到室温。纯化产物用作变性高压液相色谱(DHPLC)序列分析的模板。
(2)PCR产物的鉴定
在不变性的温度条件下(50℃)下进行PCR产物，包括DNA片段大小，PCR产量及纯度的鉴定。
(3)变性高压液相色谱(DHPLC)分析
设定DHPLC柱温在接近DNA融解温度(Tm)上下2℃范围，启动变性高效液相色谱仪开始检测，用DHPLC自带软件计算的洗脱条件进行常规洗脱。
恒温自动取样器将5μl PCR产物注入WAVE DNA片段分析系统，PCR产物被流动相A液(0.1M TEAA，0.025％乙腈)和B液(0.1M TEAA，25％乙腈)带至分离柱洗脱分离。流动相流速为0.9ml/min。
将待分析样本的DHPLC谱型与野生型与当组实验已知的多态性对照进行比较，初步判定突变类型和多态性位点。
(4)DHPLC中峰形可疑样品的扩增
对所有DHPLC峰形可疑的样本，选用高保真Pyrobest DNA Polymerase(宝生物生物工程公司)进行PCR扩增。另外每对引物选取3个DHPLC峰型正常的样本，用高保真Pyrobest DNA Polymerase扩增。
(5)BRCA1基因的核苷酸序列分析
核苷酸测序PCR是通过ABI PRISM BigDye终止子循环测序预备反应试剂盒(Applied Biosystem，U.S.A)方法，用每种纯化的引物对样品核苷酸来进行的，并且用乙醇沉淀产物，接着产物在甲酰胺中悬浮，95℃煮沸5分钟，立即浸入4℃的冰中。最后，序列分析用ABI PRISM3700测序仪(Applied Biosystem，U.S.A)来进行。
(6)分析确定BRCA1基因突变
从序列分析得到的DNA序列利用DNAMAN软件与NCBI数据库原始数据进行比对和分析。
同时对照测序图(图1)最终确认突变类型和多态性位点。
经病理确诊为乳腺癌的76个患者的DNA样品和常规检查正常的105个女性的DNA样品经PCR，DHPLC和测序而被分析。
结果显示，一个新的突变在两个患者中被发现。也就是，发现两名患者的BRCA1基因全长CDS的3627位的A变成了T，该突变位于BRCA1基因第11号外显子上。此外，这可能提示BRCA1基因编码的氨基酸序列中1170位的导致异亮氨酸(Ile)变成了苯丙氨酸(Phe)。
实施例2：特异性地鉴定多态性位点的基因型：基于Gap-LCR和Luminex系
统的方法
在本实施例中，提供了用于特异性地鉴定在新的多态性位点处的核苷酸序列的方法和试剂，尤其是等位基因特异性寡核苷酸。其中，如下面所详细描述的，本发明的等位基因特异性寡核苷酸被用作连接酶链式反应(LCR)的引物。在此描述的方法和寡核苷酸仅是用于示范的目的，而不是用于限制本发明。本领域技术人员可以理解，本技术领域中还有可以用于检测SNP位点的其它方法，它们也适用于本发明。
(1)包含3627位的多态性位点的人BRCA1 DNA片断的扩增
从经测序确认，BRCA1基因全长CDS的3627位的A变成了T的病理确诊为乳腺癌的患者，和BRCA1基因全长CDS的3627位为A的正常人提取血液。按照实施例1(1)中的方法，对人BRCA1基因外显子包含3627位的部分(BRCA1基因外显子11片断K)进行扩增。使用的引物序列为：SEQ ID NO：27和SEQ IDNO：28。
(2)等位基因特异性寡核苷酸序列的设计
依据SEQ ID NO：1核酸片段的3627位5’侧的序列设计一段长度为20bp的寡核苷酸序列SEQ ID NO：45，该序列与本发明描述的3627位的单核苷酸多态性位点相距3bp，并且与SEQ ID NO：1互补，具体地说，与SEQ ID NO：1的3604—3623位的序列互补。
依据SEQ ID NO：1核酸片段的3627位3’侧的序列设计长度均为15bp的两种寡核苷酸序列SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。上述寡核苷酸序列的3’末端为本发明描述的3627位的单核苷酸多态性位点。SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47核酸片段仅仅在本发明描述的单核苷酸多态性位点处存在一个碱基的差别，分别与不同的多态性位点核苷酸配对；而两种寡核苷酸的其余序列则均与SEQ ID NO：1互补。SEQ ID NO：46用于检测3627位为腺嘌呤(A)的野生型样本，SEQ ID NO：47用于检测3627位为胸腺嘧啶(T)的突变型样本。
同样地，依据SEQ ID NO：1核酸片段的3627位3’侧的序列设计长度均为20bp的两种寡核苷酸序列SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49。上述寡核苷酸序列的3’末端为本发明描述的3627位的单核苷酸多态性位点。SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49核酸片段仅仅在本发明描述的单核苷酸多态性位点处存在一个碱基的差别，分别与不同的多态性位点核苷酸配对；而两种寡核苷酸的其余序列则均与SEQ ID NO：1互补。SEQ ID NO：48用于检测3627位为腺嘌呤(A)的野生型样本，SEQ ID NO：49用于检测3627位为胸腺嘧啶(T)的突变型样本。
同样地，依据SEQ ID NO：1核酸片段的3627位3’侧的序列设计长度为30bp的两种寡核苷酸序列SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51。上述寡核苷酸序列的3’末端为本发明描述的3627位的单核苷酸多态性位点。SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：51核酸片段仅仅在本发明描述的单核苷酸多态性位点处存在一个碱基的差别，分别与不同的多态性位点核苷酸配对；而两种寡核苷酸的其余序列则均与SEQ ID NO：1互补。SEQ ID NO：50用于检测3627位为腺嘌呤(A)的野生型样本，SEQ ID NO：51用于检测3627位为胸腺嘧啶(T)的突变型样本。
利用上面所述设计出的寡核苷酸，便能够在Gap-LCR中获得特异性的连接产物。也就是说，在Gap-LCR方法中，当模板核酸片段来自野生型样本时，下游的寡核苷酸SEQ ID NO：45与上游的寡核苷酸SEQ ID NO：46、48、50中的任何一个都能够在连接酶作用下，连接形成更长的特异性产物。当模板核酸片段来自突变型样本时，下游的寡核苷酸SEQ ID NO：45与上游的寡核苷酸SEQ ID NO：47、49、51中的任何一个都能够在连接酶作用下，连接形成更长的特异性产物。
进一步地，为了开发出具有大规模检测应用前景的分析手段，将Gap-LCR方法与Luminex公司的荧光微球体技术组合起来。因此，利用设计出的下游寡核苷酸序列和另外设计出的通用序列(在本文中称为下游通用序列)，获得融合的等位基因特异性寡核苷酸序列。同时，利用上面设计出的每一种上游寡核苷酸序列和Luminex公司提供的报导标签序列以及另外设计出的通用序列(在本文中称为上游通用序列)，分别获得融合的等位基因特异性寡核苷酸序列。其中，对于用于检测3627位为腺嘌呤(A)的寡核苷酸，与之融合的报导标签序列为SEQ ID NO：59；对于用于检测3627位为胸腺嘧啶(T)的寡核苷酸，与之融合的报导标签序列为SEQ ID NO：60。报导标签序列可以用于与不同的荧光标记探针结合。下游通用序列为SEQ ID NO：61，上游通用序列为SEQ ID NO：62，用来扩增由Gap-LCR方法连接得到的序列。
上述各种序列的设计被总结于表2中。
表2等位基因特异性寡核苷酸序列设计
*所述的SNP位点基因型是指通过示出的上游序列而特异性鉴别的多态性位点处的核苷酸序列(即，A或者T)；
**所述的融合的等位基因特异性寡核苷酸序列顺次包含下游寡核苷酸序列和下游通用序列(对于下游)；或者上游通用序列、报导标签序列和上游寡核苷酸序列(对于下游)。这样的融合的等位基因特异性寡核苷酸将在下面的方法中被应用。
(3)Gap-LCR连接反应
这里，利用单碱基变化造成的碱基互补性对延伸反应的影响，来实现针对SNP的特异性的连接。
利用如上所述的融合的等位基因特异性寡核苷酸，通过在本领域内惯例地使用的Gap-LCR方法(参见Abravaya，K.，Carrino，J.J.，Muldoon，S.，and Lee，H.H.1995.Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction(Gap-LCR).NucleicAcids Res.23：675-682，该文献通过引用方式整体并入本文)进行延伸连接，产生100bp左右的产物。
Gap-LCR连接总体系为30μl，含1μmol/L模板DNA、0.2μmol/L上下游各自融合的等位基因特异性寡核苷酸、100μmol/L dNTPs、1.0U DNA连接酶和相应的缓冲液。
Gap-LCR的条件是5分钟(95℃)用于最初的变性，然后，30秒(95℃)用于变性，30秒(53℃)用于退火以及30秒(60℃)用于连接，以上进行10个循环，5分钟(60℃)用于最后的连接。
(4)SNP位点的基因型的Luminex检测
相应的SNP位点的基因型的检测通过使用本领域技术人员已知的Luminex技术(参见，Fei Ye，May-Sung Li，J.David Taylor，Quan Nguyen，Heidi M.Colton，Warren M.Casey，Michael Wagner，Michael P.Weiner，and Jingwen Chen.FluorescentMicrosphere-Based Readout Technology for Multiplexed Human Single NucleotidePolymorphism Analysis and Bacterial Identification，Human Mutation17：305-316，2001；和Marie A.Iannone，J.David Taylor，Jingwen Chen，May-Sung Li，Philip Rivers，Kimberly A.Slentz-Kesler，and Michael P.Weiner，Multiplexed Single NucleotidePolymorphism Genotyping by Oligonucleotide Ligation and Flow Cytometry，Cytometry，39：131-140，2000，以上文献通过引用方式整体并入本文)，在对上面程序(3)中的反应产物进行扩增之后通过Luminex100多功能液相芯片分析平台来进行。
结果显示，对于代表不同基因型的两种样品，当如上所述地使用设计出来的寡核苷酸片段进行Gap-LCR连接、扩增和检测时，所获得的检测结果与测序结果相一致。这表明，本发明的等位基因特异性寡核苷酸能够特异地检测出本发明所述的多态性位点的基因型。
实施例3：特异性地鉴定多态性位点的基因型：基于动态等位基因特异性杂交
(dynamic allele specific hybridization，DASH)的方法
本实施例提供了用于分析和检测本发明的新的多态性位点的基因型的另外的方法以及相关的特异性寡核苷酸。本实施例是基于DASH方法来进行的，DASH方法是本领域已知的，参见例如Jonathan A.Prince，Lars Feuk，W.Mathias Howell，Magnus Jobs，Tesfai Emahazion，Kaj Blennow，and Anthony J.Brookesl，Robust andAccurate Single Nucleotide Polymorphism Genotyping by Dynamic Allele-SpecificHybridization(DASH)：Design Criteria and Assay Validation，Genome Research.Vol.11，Issue1，152-162，2001，此文献通过引用方式整体并入本文。
简单地说，用生物素标记的一条引物进行DNA样品的扩增，所得到的PCR产物被结合于链亲和素包被的微孔板上，用碱对板进行洗涤以除去未带有生物素标记的链。加入本发明设计的探针和荧光染料SYBR Green I(该荧光染料可以特异性地插入DNA双链中，并在激发光的作用下发出荧光，而在单链DNA中则不能)，探针和PCR产物单链杂交后，在DASH仪中将微孔板持续地缓慢升温，同时实时地检测孔中荧光强度，温度以及对应的荧光强度被记录到计算机中。SNP基因型与探针完全匹配的样品(即，目标链中SNP位点的核苷酸与探针中对应位置的核苷酸互补)在较高温度才解链，因此在较高温度才出现荧光强度的陡变，表现为d(荧光)/dt峰，而与探针不匹配的样品则在较低温度时就出现d(荧光)/dt峰，杂合子则得到两个峰。
依据SEQ ID NO：1核酸片段3627位附近的序列设计长度均为17bp的两种探针SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64。这两个序列与BRCA1基因的核酸片段互补，其第9位和本发明描述的3627位的单核苷酸多态性位点对齐。SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64核酸片段仅仅在本发明描述的单核苷酸多态性位点处存在一个碱基的差别，它们分别与不同的多态性位点基因型结合。其中，SEQ ID NO：63用于检测3627位为腺嘌呤(A)的野生型样本，SEQ ID NO：64用于检测3627位为胸腺嘧啶(T)的突变型样本。
相应的SNP位点的基因型的检测使用动态等位基因特异性杂交法来进行。在实施例2中使用的核酸样品被用于本方法，实验按照Jonathan A.Prince etc.，supra等所述的方法进行。用设计出来的探针片段检测，可以较好地区分不同的多态性位点基因型。
虽然本发明参照示范性的实施方案来特别说明或描述，那些本领域的普通技术人员将明白其中形式和细节上的可作的不同变化而不脱离像权利要求定义的本发明的精神和范围。
序列表
<110>国家人口计生委科学技术研究所
<120>具有新的单核苷酸多态性的BRCA1基因变体和其编码的蛋白质变体
<130>
<160>64
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>5711
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(120)..(5711)
<223>BRCA1变体序列
<400>1
<210>2
<211>1863
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
<210>3
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>3
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>5
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>6
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>7
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>8
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>9
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>10
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>11
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>12
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>13
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>14
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>15
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>16
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>17
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>18
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>19
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>20
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>21
<210>22
<211>20
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
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<210>23
<211>23
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
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<210>25
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>25
<210>26
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>26
<210>27
<211>22
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
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<210>28
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>28
<210>29
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>29
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>30
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>31
<210>32
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>扩增引物
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<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>33
<210>34
<211>23
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>34
<210>35
<211>20
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<213>人工序列
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<223>扩增引物
<400>35
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>36
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>37
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>38
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>39
<210>40
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>40
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>41
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>42
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>43
<210>44
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>扩增引物
<400>44
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游杂交寡核苷酸
<400>45
<210>46
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游杂交寡核苷酸
<400>46
<210>47
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游杂交寡核苷酸
<400>47
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游杂交寡核苷酸
<400>48
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游杂交寡核苷酸
<400>49
<210>50
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游杂交寡核苷酸
<400>50
<210>51
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游杂交寡核苷酸
<400>51
<210>52
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>52
<210>53
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>53
<210>54
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>54
<210>55
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>55
<210>56
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>56
<210>57
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>57
<210>58
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>融合的寡核苷酸
<400>58
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>检测A的标签序列
<400>59
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>检测T的标签序列
<400>60
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>下游通用序列
<400>61
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>上游通用序列
<400>62
<210>63
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>检测A的DASH探针
<400>63
<210>64
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>检测T的DASH探针
<400>64
Claims (10)
1.核酸片段，其包含对应于SEQ ID NO：1的位置3627的多态性位点，并且为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列，其中位置3627的核苷酸是T。
2.权利要求1的核酸片段，其长度为10到150个连续的核苷酸。
3.权利要求2的核酸片段，其长度为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150个核苷酸。
4.等位基因特异性寡核苷酸，其与包含对应于SEQ ID NO：1的位置3627的多态性位点的等位基因片段特异性杂交，其中位置3627的核苷酸是T，所述等位基因片段为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的至少10个连续核苷酸或其互补序列，其中所述等位基因特异性寡核苷酸为SEQ ID NO：47、49、51、54、56、58或64中所述的序列。
5.权利要求4的等位基因特异性寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是探针或引物。
6.权利要求4的等位基因特异性寡核苷酸，其中所述的引物的3’末端安排有核酸片段多态性位点。
7.权利要求4-6中任何一项所述的等位基因特异性寡核苷酸，其长度为10到150个核苷酸。
8.用于鉴定单核苷酸多态性位点的基因型的的试剂盒，其中包括权利要求1-3中任何一项所述的核酸片段，或权利要求4-7中任何一项所述的等位基因特异性寡核苷酸。
9.权利要求1-3中任何一项所述的核酸片段或权利要求4-7中任何一项所述的等位基因特异性寡核苷酸在制备用于诊断乳腺癌或确定患有乳腺癌的危险的药物中的用途。
10.人BRCA1多肽的变体或其片断，其含有对应于SEQ ID NO：2的位置1170的氨基酸多态性位点，并且为SEQ ID NO：2的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸，其中位置1170的氨基酸是苯丙氨酸。
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