CN101027079A - 嵌合蛋白 - Google Patents
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Abstract
嵌合蛋白，融合蛋白包含的第一片段位于融合蛋白的氨基末端，并且特异性地结合以及中和一种细胞因子或生长因子的功能，融合蛋白包含的第二片段位于融合蛋白的羧基末端，并且特异结合另外一种细胞因子或生长因子的受体，该受体经常在某些疾病位点高表达，例如白细胞介素1受体高表达的炎症疾病位点。而且，所说的第二片段通常是受体拮抗剂，如白细胞介素1受体拮抗剂及其同功能类似分子。本发明同时包括编码该融合蛋白的核酸、载体、携带这些核酸分子的宿主细胞，以及相关的制剂组成和靶向治疗炎症疾病以及一些与炎症疾病共存的其它适应症的方法。
Description
发明技术领域
本发明嵌合蛋白药用制剂用于治疗如炎症、哮喘和肿瘤等不同疾病。
发明背景技术
相关申请：本专利申请于美国国家知识产权局，专利优先权申请号No.US 60/618,476，2004年10月12日备案，专利申请号US 60/628,994，2004年11月17日备案，专利标题《白细胞介素1受体拮抗剂融合蛋白抑制新生血管形成》，2005年2月1日备案，全部内容参考详细说明。
炎症是机体抵御损伤的一种免疫反应，这些损伤可以由机械损伤，感染或抗原刺激所致。病理性炎性反应是指自体抗原非正常刺激引起炎症，去除致炎因素后的过度或持续免疫反应也会引起炎症反应。哮喘和新生血管生成相关的病症往往伴随着炎症。已经开发了多种治疗性蛋白药物抑制炎症反应，用于治疗炎症反应相关的哮喘，缓解病理性新生血管生成。然而，大多数的蛋白制剂由于疗效差，有副作用或蛋白不稳定，治疗效果并不理想。
发明内容：
融合蛋白包含的第一片段位于氨基端，能够特异性结合、中和第一个细胞因子或生长因子；第二片段位于融合蛋白的羧基端并且能够特异性结合第二个细胞因子或生长因子的受体，例如在炎症部位高表达的白细胞介素1受体。这两个片段人为地连接在一起，所对应的第一或第二种细胞因子在炎症部位高表达。
上述的融合蛋白是糖基化蛋白。它还可以包含一个用于连接第一和第二片段的连接片段，该连接片段能够形成二聚体。例如：连接片段包含免疫球蛋白的Fc片段或同功能片段。优选如下免疫球蛋白：IgA，IgE，IgD，IgG，或IgM。最好是IgG或其Fc段，例如序列2片段。免疫球蛋白链包含序列9，11，12，14，23，或24；或来源于它们的同功能蛋白。
上述的融合蛋白中，第一片段结合且中和血管内皮生长因子，血管生成素、肿瘤坏死因子、白细胞介素18、白细胞介素4、白细胞介素6或其同功能的蛋白。例如：包含免疫球蛋白链序列的第一片段能够特异结合并中和血管内皮生长因子、血管生成素、肿瘤坏死因子、白细胞介素18、白细胞介素4、白细胞介素13、或IgE以及其它同功能蛋白。第一片段也可以包含血管内皮生长因子，新生血管形成因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素18、白细胞介素4、白细胞介素13或IgE的受体序列，例如序列3，6，15，或19。
上述融合蛋白中，第二片段可以特异地结合白细胞介素1的受体。第二片段可以是白细胞介素1的拮抗剂，例如包含白细胞介素1受体拮抗剂序列(序列1)的片段或其它同功能蛋白的片段。相应地，上述的融合蛋白可以包含序列5，8，10，13，17，18，21，22，24，或25。
本发明的另一方面描述的是，包含编码上述融合蛋白的序列的体外分离的核酸。该核酸片段可以包含从序列1至序列25中的某一序列。
本发明涉及范围中包括(1)上述融合蛋白或编码该蛋白的核酸序列(2)适合于药用的载体。另外本发明也涉及包含调节患者免疫反应的方法。此方法包括鉴定由于过度炎症反应、免疫应答、或新生血管形成造成机体损伤的患者，以及使用有效剂量的融合蛋白或编码该蛋白的核酸治疗上述疾病。该药物治疗患者可能已经或准备接受异基因或异种移植。实例病症包括炎症疾病、自身免疫疾病、过敏性疾病或是肿瘤疾病。在治疗依赖新生血管形成的肿瘤疾病时，融合蛋白包含序列24。
另外一方面，发明的特点还有提高重组蛋白在患者的体内半衰期的方法。该方法包括将重组蛋白与包含序列1片段或同功能的其它蛋白片段融合，形成融合蛋白嵌合体，该方法决定了融合蛋白在患者体内的半衰期。重组蛋白能够结合某一细胞因子或生长因子。
本发明的特点还包括提高重组蛋白于患者体内的功效的方法。该方法包括将重组蛋白与包含序列1的片段或同功能的其它蛋白片段连接，形成融合蛋白嵌合体。该方法决定了融合蛋白在患者体内的功效。具体讲，在患者体内炎症部位或高表达白细胞介素1受体的疾病部位，融合蛋白嵌合体能够同时结合且中和白细胞介素1受体和其他细胞因子或生长因子。另外一方面，在患者体内炎症部位或高表达白细胞介素1受体的疾病位点，融合蛋白嵌合体可以中和或拮抗白细胞介素1以及其他细胞因子或生长因子的生物活性。
本发明特征中的另外一方面包括治疗蛋白可以靶向性地投送到患者体内的药物靶点。该方法包括将治疗蛋白与包含序列1的片段或同功能的其它片段融合，形成融合蛋白嵌合体，以及将融合蛋白嵌合体注射给需要治疗的患者的方法。治疗蛋白的靶向位点是高表达白细胞介素1受体的炎症疾病位点。具体说，包含序列1或同功能蛋白的片段与白细胞介素1受体结合，重组蛋白是治疗蛋白，可以结合且中和某一细胞因子或生长因子。
分离的多肽指是指不含自然状态下与其结合的分子，它的纯度至少为75％，也就是在75％至100％(干重)之间。它的纯度可以通过合适的标准方法，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱进行测定。本发明所指分离的多肽可以从天然来源提取(野型多肽)，通过DNA重组技术表达，或是通过化学合成的方法获得。核酸可以指DNA分子(cDNA或基因组DNA)，RNA分子(mRNA)以及DNA或RNA的类似物，DNA或RNA的类似物可以利用核苷类似物合成。核酸分子可以是单链或双链，但一般首选双链DNA。分离的核酸是指其结构与任何一种天然核酸或天然的基因组核酸片段都不同。这一概念包括如下几个方面，例如：a)DNA包括天然基因组DNA分子的部分序列，但是不包含自然情况下生物基因组序列中该基因片段的旁侧序列。b)整合在载体或原核、真核生物基因组DNA内的核酸分子，与天然的载体或基因组DNA有所不同。c)体外分离的分子比如cDNA、基因组片段、PCR扩增片段，限制酶消化片段，d)重组核苷酸序列是杂合基因的部分序列，这部分基因可以编码融合蛋白。本发明的多肽蛋白就是用上述的核酸分子表达的。为此，研究人员可以通过将上述的核酸分子与合适的调控序列连接构建表达载体。
载体是指能够将与其相连接的其他核酸序列进行转移的核酸分子。该载体可以进行自我复制或整合于宿主DNA。载体可以包含质粒载体、柯斯载体或病毒载体。载体包含一段核酸片段，该核酸片段能够在宿主细胞表达。载体内包含一个或多个的调控序列，与要表达的核酸序列相连接。调控序列包括启动子、增强子、以及其它表达控制元件(例如多聚腺苷酸信号)。调控序列包扩引导某一核酸序列组成型表达、组织特异性表达和/或可诱导表达的调控元件序列。表达载体的设计取决于以下几个因素：待转化的宿主细胞，待表达的蛋白或RNA的表达水平或其他类似因素。表达载体可以被引入宿主细胞表达本发明介绍的多肽蛋白。发明还涉及含有上述核酸的宿主细胞。宿主细胞包含大肠杆菌、昆虫细胞(例如应用杆状病毒表达载体)、酵母、哺乳动物细胞，参见Goedd等在酶学方法丛书中的文章，基因表达技术(1990年，185页)。为表达本发明所述多肽蛋白，我们可以使用培养基在特定的条件下培养宿主细胞，让宿主细胞表达核酸编码的多肽蛋白，再从细胞或细胞培养液中纯化目标蛋白。或者将本发明提到的核酸利用T7启动子和T7聚合酶进行体外表达。
蛋白因子的同功能蛋白指来自于该蛋白的多肽，例如该蛋白具有一个或多个的点突变、插入突变、缺失突变、截短突变、融合蛋白、或以上突变的组合。同功能蛋白完全保留了该蛋白的活性，例如与细胞因子、生长因子、或其受体分子结合的能力。
本发明的详细具体说明内容在下面的说明中阐述。本发明的其它特征，目的以及优势将在下面的描述以及权利要求说明书详细说明。
说明书附图说明
图1：表达TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra融合蛋白的第一代CHO细胞克隆，细胞培养于含无血清培养基的24孔培养板中，直接考马斯亮蓝蛋白染色，所有重组蛋白的表达明显可见，表达量0.5-1.0ug蛋白，每孔上样量为10-15微升/孔。
图2：亲和层析纯化TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合蛋白，在还原和非还原条件下进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白用考马斯亮蓝染色。
图3：我们解决问题能力的一个例子：通过改变第一步纯化条件抑制了嵌合蛋白TNFRII-Fc-IL-1ra降解的问题。高效液相色谱分析纯化未降解和部分降解的TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合蛋白，以TNFRII-Fc作对照。
图4：亲和层析纯化IL-4R-Fc、IL-4R-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra。
图5：TNFα细胞中和实验显示TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合体蛋白能够中和TNFα对L979细胞的杀伤活性。这一点与上市药物TNFRII-Fc(Enbrel)相似。
图6：白细胞介素1细胞中和实验显示，上市药物白细胞介素1受体拮抗剂(Kineret)和TNFRII-Fc-IL-1ra嵌合蛋白都能够中和白细胞介素1刺激D10细胞增殖的生物活性。
图7：人白细胞介素4中和实验测定IL-4R-Fc-IL-1ra和对照组的IL-4R-Fc的活性。
图8：人白细胞介素1中和实验测定IL-4R-Fc-IL-1ra的活性。
图9：白细胞介素18中和实验测定IL-18bp-Fc-IL-1ra.的生物活性。
图10：白细胞介素1中和实验测定IL-18bp-Fc-IL-1ra.的生物活性。
图11：利用D10细胞检测VEGFR1-Fc-IL-1ra融合蛋白中和白细胞介素1的活性。
图12：VEGFR1-Fc-IL-1ra蛋白在HUVE细胞中和血管内皮生长因子活性。
图13：白细胞介素1受体结合实验。
本发明详细内容描述
本发明的理论基础至少在一部分上在于发现白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能蛋白，与其他生物活性蛋白如抗炎症蛋白、抗哮喘蛋白、抗新生血管生成蛋白融合，能够延长这些细胞因子的生物半衰期及其生物学功效。这些功能蛋白包括肿瘤坏死因子(TNF)中和分子、白细胞介素18中和分子、白细胞介素4/白细胞介素13中和分子、血管内皮生长因子中和分子以及血管生成素中和分子。
蛋白(位于融合蛋白的氨基端)与其他活性蛋白融合往往导致活性缺失，尤其是在大分子蛋白融合上会更加的明显。例如，在酶原和激素前体分子中由于氨基端多肽的存在导致酶原和激素前体分子无活性。这些酶原和激素前体分子只有在这些氨基端多肽结构被切掉后才表现为活性分子。而且，大分子蛋白融合往往会导致低表达量。但是出乎意料的是，白细胞介素1受体拮抗剂融合蛋白可以通过哺乳动物细胞表达，可以达到产业化化生产的表达水平。与其他蛋白融合之后不会影响白细胞介素1受体拮抗剂结合白细胞介素1受体以及中和其活性的生物学功能，也不会影响与其融合的其它活性蛋白的结合、中和活性。同样出乎意料的是，白细胞介素1受体拮抗剂(哺乳动物表达的糖基化蛋白)以及其同功能蛋白不仅可以延长活性蛋白的半衰期，还可以引导融合蛋白定位于高表达白细胞介素1受体的炎症位点。
白介1受体拮抗剂
白细胞介素1是一种由巨噬/单核系细胞产生的细胞因子，它以两种形式存在：白细胞介素1α和白细胞介素1β。它通过结合细胞特异性白细胞介素1受体(IL-1R)而引发其生物学效应。白细胞介素1受体常常是表达在白细胞介素1敏感细胞的细胞膜表面。
白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)是人体内蛋白，白细胞介素1的天然抑制物。白细胞介素1受体拮抗剂已经用于抑制白细胞介素1的生物活性。它结合细胞膜结合型白细胞介素1受体从而抑制白细胞介素1结合同一白细胞介素1受体。白细胞介素1受体往往表达在炎症位点(Deleuran et al，1992；Laken VD et al，1997)和淋巴细胞(Dower SK et al，1990)。因此，白细胞介素1受体拮抗剂可以引导与其融合的治疗性蛋白(如下面将描述的肿瘤坏死因子中和分子)到高表达白细胞介素1受体的炎症部位。由于其具有靶向性效应，所以可以减少治疗蛋白所需的应用剂量，从而相应的减少副作用或增加药物疗效。此外，至少在一部分上，由于融合蛋白可以使白细胞介素1受体拮抗剂和与其相融合的蛋白同时到达某一位点，由于二者的协同作用，相对二者单独或联合应用，融合蛋白可以具有更好的治疗效果。
本发明可以通过白细胞介素1受体拮抗剂和其同功能蛋白来验证。白细胞介素1受体拮抗剂同功能蛋白是指来源于白细胞介素1受体拮抗剂(序列1)的多肽(如简介中所述)，它具有白细胞介素1受体拮抗剂的生物活性，即结合白细胞介素1受体并抑制白细胞介素1与该受体的结合。白细胞介素1受体拮抗剂及其同功能蛋白至少包含一个白细胞介素1的受体拮抗剂结构域，该结构域能够特异性结合白细胞介素1受体家族成员并且抑制白细胞介素及其家族成员诱导的这些受体的活化。白细胞介素1受体家族包含多个成员。相应地，也就有几种不同的白细胞介素家族的激动剂和拮抗剂。这些白细胞介素1拮抗剂不一定结合同一白细胞介素1受体家族成员。本发明所指的白细胞介素1受体拮抗剂用来代表所有能够结合白细胞介素1受体家族成员和/或中和白细胞介素1家族成员活性的白细胞介素1拮抗剂。
白细胞介素1受体拮抗剂同功能蛋白包含一个白细胞介素1受体拮抗剂结构域。该结构域是指能够特异性结合白细胞介素1受体家族成员，从而抑制白细胞介素1及其家族成员对细胞受体的活化。白细胞介素1受体拮抗剂可以包括IL-1ra(美国专利号6,096,728)、IL-1 HY1或白细胞介素家族成员5(美国专利号6,541,623)、IL-1Hy2或白细胞介素家族成员10(美国专利号6,365,726)、IL-1raβ(美国专利号6,399,573)、其它白细胞介素1拮抗剂成员或其同功能的蛋白，也就是来源于白细胞介素1受体拮抗剂的多肽蛋白，例如有一个或更多的点突变、插入、缺失、截短或以上几种突变的组合。它们充分保持了特异性结合白细胞介素1受体并抑制白细胞介素1活化其细胞膜表面受体的活性。这些蛋白包含序列1或序列1的某片段。白细胞介素1受体拮抗剂最好是来源于哺乳动物细胞的糖基化多肽。白细胞介素1受体拮抗剂的活性可以通过使用白细胞介素1依赖的D10细胞(见例3)进行白细胞介素1细胞中和实验以及其它白细胞介素1家族成员的中和实验来检测。
白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能蛋白最好是糖基化蛋白。天然的白细胞介素1受体拮抗剂具有两个N-link的糖基化位点(美国专利号6096728)。这两个N-link糖基化位点对于白细胞介素1受体拮抗剂的体内活性，尤其是生物学半衰期和它的血清蛋白结合特性有重要作用。大肠杆菌表达的白细胞介素1受体拮抗剂Kineret缺乏翻译后修饰。结果造成了它明显地与人血清蛋白结合，表现为较低的体内活性。
使用白细胞介素1依赖细胞D10细胞进行细胞中和实验，或其他标准白细胞介素1家族成员中和实验可以检测白细胞介素1受体拮抗剂和同功能蛋白的抑制活性(见例3)。白细胞介素1受体拮抗剂融合与任何蛋白融合可增加蛋白的分子量并提高体内的生物半衰期。白细胞介素1受体拮抗剂通过免疫球蛋白的Fc段(例如IgG1的Fc段)融合到其它蛋白上，能够进一步增加分子量，由于IgG1的Fc片段具有形成二聚体的能力，它的存在能够加倍提高蛋白在某一特定靶位的分布比例。
肿瘤坏死因子
肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β是哺乳动物细胞分泌的蛋白，对多种细胞进行具有广泛的作用。这两种细胞因子在功能和结构上具有很多的相似之处，所以他们都叫作TNF。
TNF通过结合TNF-敏感细胞的膜表面特异性TNF受体而发挥其生物功能。目前所知TNF受体有两种的形式，即分子量为55千道尔顿的I型受体(TNFRI)和分子量为75千道尔顿的II型受体(TNFRII)。TNFRI和TNFRII都能够结合TNFα和TNFβ。
目前TNF在炎症疾病的作用已很确定。TNFRII与人IgG1 Fc片段融合(商品名Enbrel)，已经用于治疗某些包括TNF依赖的疾病如类风湿性关节炎和牛皮癣。可溶性TNFRI(Onercept，Serono)已经进行临床实验用于治疗牛皮癣。
已经被确认了几种TNF拮抗剂。这些拮抗剂，如可溶性TNFRII可以结合TNF，并抑制TNF与TNF受体的结合。这些蛋白可以用来抑制由TNF所引发的生物学活性。TNF中和蛋白可以和白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能的蛋白融合。类似于白细胞介素1，TNF也是炎症反应中重要的介质。上述的TNF中和蛋白的靶蛋白包括TNF及其同功能蛋白。这些蛋白都包括一个或多个TNF中和结构域，该结构域能够中和TNF，也就是抑制TNF活性。TNF中和结构域包括人TNFRII的细胞外结构域、TNFRI的细胞外结构域、或是抗TNF抗体的可变区。这样的例子包括TNFRII的胞外结构域、TNF结合蛋白1(rhTBP-1)、TNFRI胞外结构域、人源化的抗TNF抗体和抗TNF的嵌合抗体。
TNFα和白细胞介素1是炎症疾病部位的两种主要的介质，TNF拮抗剂和白细胞介素1受体拮抗剂或它们同功能的蛋白的融合或嵌合分子既可以用来阻断TNFα也可以阻断白细胞介素1的通路，所以比二者单独使用更有效地治疗急、慢性炎症相关疾病。融合蛋白中TNF中和分子的活性可以使用TNF依赖细胞如L979 cell(ATTC)来检测。TNF依赖细胞可以被重组TNFα杀死。TNF中和蛋白可以中和这种TNF依赖活性，中和蛋白活性也可以应用TNF体外结合实验来检测。
同时使用白细胞介素1受体拮抗剂和TNF受体1(不是受体2)曾经用于治疗白细胞介素1和TNFα导致的疾病试验。然而，2003年Immunex Inc和Amgen Inc公司在进行临床实验242个病例，治疗24周后的结果显示，同时使用Enbrel和Kineret的正常剂量(Enbrel 25mg两周一次、Kineret 10mg每天一次，摩尔比大约为1∶12)治疗，结果显示联合使用并不会增加疗效，反而较Enbrel或Kineret单独使用增加了感染和中性粒细胞减少症发生的几率。
白细胞介素18和白细胞介素4
上述的白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能的蛋白可以与其它抗炎症、抗哮喘、抗血管生成的蛋白融合。实例包括：(i)白细胞介素18中和分子如白细胞介素18结合蛋白(IL-18bp)、白细胞介素18受体(IL-18R)胞外区、人源化抗白细胞介素18抗体。(ii)白细胞介素4中和分子如白细胞介素4受体(IL-4R)胞外区(商品名Nuvance，Immunex公司)、人源化抗白细胞介素4抗体(Protein Design Labs)。(iii)抗血管内皮细胞生长因子抗体和血管生成素中和分子(可溶性Tie2胞外区)。如那时讨论的那样，这些蛋白的碳端引入白细胞介素1受体拮抗剂：(1)增加它们的分子量(2)在哺乳动物宿主细胞表达蛋白时，增加两个糖基化位点(3)靶向性将这些蛋白投送到高表达白细胞介素1受体的炎症位点。(4)以分子比1∶1同时阻断白细胞介素18、白细胞介素4、血管内皮细胞生长因子或血管生成素以及白细胞介素1分子的生物学功能。
重组人白细胞介素18结合蛋白已经由Serono公司开展临床实验治疗皮肤炎症性的适应症牛皮癣。已经证明白细胞介素18结合蛋白的安全性。白细胞介素1受体拮抗剂融合在其碳端可以明显增加其生物活性持续时间。通过与白细胞介素1受体拮抗剂的融合能够增加其炎症位点的靶向性而显著增加疗效。用白细胞介素1受体拮抗剂融合蛋白同时阻断白细胞介素18和白细胞介素1具有协同效应，可以用于治疗炎症疾病如牛皮癣(Yudoh K等，2004年的研究结果)。最有趣的是，白细胞介素18和白细胞介素1的受体同属白细胞介素1受体家族，而且几乎是通过同样的信号转导通路发挥其生物学作用。双重阻断白细胞介素1和白细胞介素18几乎可以阻断整个白细胞介素1受体家族所引起的炎症进程。本发明所述嵌合蛋白双重阻断白细胞介素1和白细胞介素18表现为治疗炎症疾病的最有效的药用制剂。
白细胞介素18结合蛋白的同功能蛋白也可以用于本发明中。白细胞介素18结合蛋白或其同功能蛋白包含白细胞介素18中和结构域，该结构域可以中和白细胞介素18，也就是抑制白细胞介素18的生物活性。例如，白细胞介素18中和蛋白结构域可以包括人白细胞介素18受体胞外区(美国专利号6,589,764)，白细胞介素18结合蛋白、抗白细胞介素18抗体或白细胞介素18突变拮抗剂蛋白。
本发明所述的嵌合蛋白中的白细胞介素18中和蛋白活性，可以用白细胞介素18依赖细胞株KG-1细胞检测。例如，人白细胞介素18在TNFα存在的条件下以剂量依赖的方式诱导KG-1细胞分泌IFN-g。这种白细胞介素18依赖的IFN-g分泌可以被有效剂量的白细胞介素18中和蛋白所抑制。这些白细胞介素18中和蛋白的活性，也可以通过白细胞介素18/白细胞介素18受体结合实验来检测。
重组白细胞介素4受体正在进行临床实验治疗哮喘，已经证明其良好的安全性。然而，它的疗效还不是很让人满意。有趣的是，有研究报道白细胞介素1可以诱导Th2细胞的活化以及气道过敏反应(Iwakura Y等，2003年)。另外，哮喘和慢性炎症之间共存、相互依赖以及相互作用在临床上是很普遍的现象。至少在动物模型上，阻断白细胞介素1的功能以治疗哮喘的效果是明确的。完全有理由认为将IL-1ra和IL-4受体融合以1∶1的分子比同时阻断白细胞介素1和白细胞介素4，可以明显的提高治疗哮喘的疗效。IL-1ra靶向定位于炎症位点可以提高可溶性IL-4受体治疗复合炎症的严重哮喘的疗效。另外，白细胞介素1受体拮抗剂融合蛋白可以显著提高白细胞介素4受体的生物活性持续时间。
可溶性白细胞介素4受体或其同功能蛋白可以与白细胞介素1受体拮抗剂融合。白细胞介素4受体或其同功能蛋白包含白细胞介素4中和结构域，该结构域能够中和白细胞介素4，也就是抑制白细胞介素4活性。例如，白细胞介素4中和结构域包括白细胞介素4受体胞外区，抗白细胞介素4抗体，含有双突变R121D/Y124D序列(Schnarr等，1997年)的白细胞介素4突变蛋白拮抗剂。有趣的是，白细胞介素4受体亚单位不仅可以结合白细胞介素4，也能够结合白细胞介素13，这是因为白细胞介素4和白细胞介素13的受体具有共同亚单位的天然特点。
本发明所述融合蛋白的白细胞介素4中和活性的可以用白细胞介素4的依赖细胞TF-1检测。例如，加入有效剂量的IL-4中和蛋白可以抑制白细胞介素4依赖的TF-1细胞增殖。白细胞介素4中和蛋白的活性也可以通过白细胞介素4/白细胞介素4受体的结合实验来检测。
血管内皮生长因子和血管生成素
上述方法可以应用于血管内皮生长因子以及血管生成素和它们的同功能蛋白的拮抗剂。血管内皮生长因子对于新生血管生成有重要的作用。抗血管内皮生长因子抗体(商品名：Avastin，Genentech Inc)可以用于治疗肿瘤疾病。同样，血管内皮生长因子受体的胞外区与IgG1 Fc段融合，已经用于中和血管内皮生长因子来治疗新生血管生成相关适应症。血管内皮生长因子同功能蛋白包含血管内皮生长因子中和结构域，该结构域可以中和血管内皮生长因子，也就是抑制血管内皮生长因子的活性。例如，血管内皮生长因子中和蛋白结构域包括人血管内皮生长因子受体胞外区和抗血管内皮生长因子抗体的可变区。
本发明提到的嵌合蛋白中血管内皮生长因子中和蛋白的活性可以用血管内皮生长因子依赖的HUVEC细胞来检测。例如，人血管内皮生长因子可以诱导HUVEC细胞增殖。有效剂量的血管内皮生长因子中和蛋白可以抑制血管内皮生长因子依赖的HUVEC细胞增殖。血管内皮生长因子中和蛋白的活性，也可以通过血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体结合实验来检测。
有研究指出可溶性血管生成素受体Tie2可用作抗血管生成反应制剂治疗肿瘤或新生血管生成反应相关的类风湿性关节炎。临床观察很早就发现，新生血管生成和炎症是共存和相互依赖的。最普遍的例子就是在类风湿性关节炎，新生血管生成伴随着炎症发生。可溶性血管生成素受体Tie2或其同功能蛋白包含血管生成素中和结构域，该结构域能够中和血管生成素，也就是能够抑制血管生成素1的功能。例如，血管生成素中和结构域包括人Tie2胞外区和抗Tie2抗体或抗血管生成素抗体。
本发明提到的嵌合蛋白中Tie-2中和蛋白的活性可以用依赖细胞HUVEC来检测。例如，人血管生成素1能诱导HUVEC细胞的磷酸化。这种Tie-2依赖的磷酸化作用可以被有效剂量的Tie-2中和蛋白所抑制。Tie-2中和蛋白的活性也可以用Tie-2/血管生成素2结合实验检测。
已知白细胞介素1是病理性血管形成的重要刺激因素。在动物模型中，白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能蛋白中和白细胞介素1能够抑制新生血管形成和肿瘤生长，提示炎症可能促进新生血管形成。例如，恶性乳癌是炎症性乳癌。很有可能在治疗肿瘤或类风湿性关节炎方面，白细胞介素1受体拮抗剂和抑制新生血管形成蛋白(抗血管内皮生长因子抗体、可溶性VEGF受体胞外区、可溶性Tie2胞外区)融合蛋白的疗效要明显好于单独使用抗新生血管形成的制剂。
除了上述治疗制剂，其它适于与白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能蛋白相融合的治疗制剂在下面列出：
1.E25(olizumab).E25是人源化抗IgE抗体(Novartis)，用于治疗过敏性哮喘，季节性过敏性鼻炎。
2.H5G1.1.5G1.1是一种人源化抗C5抗体(Alexion Pharmaceuticals)，可以被应用于治疗牛皮癣和自身免疫性疾病。
3.TP10.TP10是一种可溶性的补体受体(sCR1)，用于治疗急性呼吸窘迫综合症和器官移植(AVANT Immunotherapeutics)。
4.ABX-IL8.ABX-IL8是一种抗白细胞介素18的单克隆抗体(Abgenix)，用于治疗牛皮癣。
5.CTLA4Ig.CTLA4Ig是一种重组的可溶性受体(Bristol-Myers Squibb)，用于免疫抑制。
在上述因子和白细胞介素1受体拮抗剂或其同功能蛋白形成的融合蛋白中，两种分子的功能具有协同或互补性。白细胞介素1受体拮抗剂结合白细胞介素1受体，引导融合蛋白定位于高表达白细胞介素1受体的炎症部位。它也可以中和白细胞介素1活性。白细胞介素1受体拮抗剂与以上任一种蛋白融合可以用于治疗炎症、哮喘、血管生成相关疾病或内皮细胞增殖相关的疾病。
新生血管生成相关疾病是指需要新生血管生成或表现为新生血管反应的病理症状。其中包括，但不仅限于癌症、实体瘤、肿瘤转移、良性肿瘤，包括血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿块、类风湿性关节炎，牛皮癣，眼部疾病如糖尿病性视网膜病，早产儿视网膜病，黄斑退化，眼角膜移植排斥、新生血管性青光眼、晶体纤维增生和发红，Osler-Webbe综合症、心肌新生血管生成、斑状血管形成、毛细血管扩张、血友病关节、血管纤维瘤和创伤性肉芽组织增生。在这里，内皮细胞增殖反应症状包括，但不仅限于粘连肠、动脉粥样硬化、硬皮病和肥厚性瘢痕。这里描述的融合蛋白也可以通过抑制胚胎着床所需的新生血管形成来治疗以上所述疾病。
本发明提到的融合蛋白最好包含一个二聚化结构域。二聚化结构域指的是能够将两个多肽偶连在一起的结构域。例如，它包含IgG Fc段(也就是人的IgG重链恒定区)。这样的Fc段的例子包括序列2。IgG Fc段通过半胱氨酸残基形成链内二硫键(共价键)而形成二聚体。有时非共价键二聚化可以在没有二硫键参与的情况下形成。二聚化的IgG Fc段使融合蛋白嵌合体表现为，氮端为二个功能性TNFII型受体或可溶的白细胞介素4受体、白细胞介素18结合蛋白或可溶的Tie-2分子，碳末端为两个功能性白细胞介素1受体拮抗剂分子。这种排列能够在体内提高受体/配体结合的机会以更有效地中和TNF alpha、白细胞介素4、白细胞介素18或血管生成素和白细胞介素1受体。
通过二硫键形成的共价二聚化活性可以通过还原和非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测。二聚体蛋白分子量在还原条件下分子量会减少一半。非共价键的二聚化可以在非变性和变性的条件下电泳来检测，在这种情况下二聚体蛋白的分子量在变性条件下会减少一半。
本发明提到的多肽，TNF中和结构域，或白细胞介素4/白细胞介素13中和结构域，或白细胞介素18中和结构域，或血管内皮生长因子中和结构域，或血管生成素中和结构域和白细胞介素1受体拮抗剂结构域可以通过一定方法连接在一起。在这里，连接是指融合后多肽的各个结构域之间的构象不会相互影响，也就是保持各自的活性。例如白细胞介素4中和结构域保持其中和白细胞介素4的活性，白细胞介素1受体拮抗剂结构域保持其特异结合白细胞介素1受体，阻断白细胞介素1活化细胞受体的活性。二聚化结构域保持其促使两个本发明所述的融合蛋白聚合在一起，即两个白细胞介素4受体胞外区域在氮末端，两个白细胞介素1受体拮抗剂分子在碳末端。
白细胞介素1受体拮抗剂置于碳端与上述的TNF中和蛋白，白细胞介素18中和蛋白、白细胞介素4中和蛋白、血管内皮生长因子中和蛋白、血管生成素中和蛋白融合形成融合蛋白，具有以下特点：(1)提高分子量。(2)用哺乳动物作为宿主细胞表达时，白细胞介素1受体拮抗剂分子上额外增加了两个糖基化位点。(3)将与白细胞介素1受体拮抗剂融合的中和分子靶向投送到高表达白细胞介素1受体的炎症位点。(4)以分子比1∶1的比例同时封闭白细胞介素1和下列任一蛋白：TNF、白细胞介素18、白细胞介素4、白细胞介素13、IgE、血管内皮生长因子、血管生成素。这种双重阻断可以提高治疗炎症疾病的疗效，并且可以更加彻底地阻断炎症疾病的发展进程。对于某些疾病，炎症和哮喘或血管生成反应的共存或互相依赖在疾病发展起重要作用，所以同时双重阻断白细胞介素4/白细胞介素13/血管内皮生长因子/血管生成素和白介1可以更有效、更彻底地治疗这样的疾病。
本发明提及的多肽物质可以用合成或重组表达的方法来获得。为制备重组多肽，将编码该多肽的核酸序列与表达融合多肽的核酸序列相融合，例如谷胱甘肽巯基转移酶、6x-组氨酸表位标签或M13基因3蛋白的核酸序列连接在一起。得到的融合核酸序列在适当的宿主细胞中表达融合蛋白，进行纯化获得重组融合蛋白。许多宿主-表达载体系统可用于表达融合蛋白。其中包括但不仅限于，转化了重组噬菌体DNA、质粒DNA、粘粒DNA表达载体的细菌；转化了重组酵母表达载体的酵母菌；携带重组病毒或质粒表达载体的人源细胞系。利用传统的方法包括制备性色谱，单克隆或多克隆抗体等免疫学分离方法进行分离纯化重组多肽或其片段。所获得的重组多肽可以进一步处理，例如用酶消化来去除表达标签分子，获得本发明所指的重组多肽。
组成与治疗方法
本发明的领域还包括通过给患者注射有效剂量的本发明融合蛋白来治疗过度免疫反应疾病、血管生成反应相关疾病的方法。本发明所指融合蛋白制剂的适用人群包括已经或进行性的过度或异常免役反应所累的患者，例如自身免役、免役排斥、过敏性疾病、免疫细胞来源肿瘤疾病的患者。本方法可以单独使用或与其它药物或治疗方法联合使用。
治疗是指给患者注射药用制剂来治愈、减轻、缓和、预防、改善疾病的症状、疾病综合症、继发症或易感体质。治疗的有效剂量是指在用药的患者体内获得满意的疗效的剂量。满意的疗效可以是客观的(用某些检查或标志来判断)，也可以是主观的(患者的表现或感觉)。治疗疾病的范围包括急慢性炎症、糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、多发性硬化症、脑脊髓炎、重症肌无力症、全身性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括遗传性过敏性皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、Sjgren′s综合症、节段性肠炎、口腔溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、I型糖尿病、炎性肠疾病、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、药疹、麻风反复反应、麻风结节性红斑、自身免疫葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性脑出血、感觉神经性听力丧失、发育贫血症、纯红细胞性贫血、原发性血小板减少、多软骨炎、肉芽肿瘤、慢性肝炎、史-约综合征、口炎性腹泻、扁平苔癣、Graves’病、良性淋巴肉芽瘤、早期胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、肺间质纤维症、移植物抗宿主病；移植类包括异体或异基因组织移植如骨髓移植、肝移植或是其它器官或组织移植。变态反应疾病如异位性变态反应、艾滋病、淋巴细胞肿瘤如白血病、淋巴瘤、急性肝炎、新生血管生成相关疾病如类风湿性关节炎和肿瘤，心血管疾病。.
上述一种或几种症状的患者可以应用本发明药用制剂治疗。诊断这样的患者可以由患者的感觉或职业医护人员的判断来提供，可以是主观的(感觉)或客观的(测试或检验的结果)。
体内途径中，将含有本发明融合蛋白的制剂给患者使用。通常，蛋白溶于药用载体(如生理盐水)通过口服、静脉输注、皮下植入或注射、肌肉注射、鞘内注射、腹膜内注射、直肠内注射、鼻内注射、叶鞘内注射、子宫内注射、气管内注射、灌胃、肺内注射给药。
根据给药途径、制剂特性、患者症状及适应症、患者的体型大小、体重、体表面积、年龄和性别以及其他正在应用的药物来选择给药剂量，或者遵从医生的判断。适当的剂量范围在0.01-100.0mg/公斤体重。考虑到不同的剂型构成以及不同的给药方式造成的不同药物利用度，给药剂量根据实际情况进行调整。例如，口腔给药就要比静脉注射的给药量要高。用药剂量的改变可以根据标准的经验进行优化。尤其对于口服，利用合适的包封制剂载体(例如多聚微颗粒或可植入装置)，可能会提高药物投送的效率。
本发明也包括的药用制剂即可用的药用载体制剂以及有效剂量的本发明所提融合蛋白。此载体制剂可用于治疗上述疾病。药用载体可以包括溶剂、分散剂、包衣、抑菌剂、抗真菌剂、等渗缓冲剂、吸收缓释剂。本发明的药物根据不同给药途径通过经典的方法制作不同剂型的治疗制剂。例如，可以制成胶囊、凝胶剂、片剂用于口腔给药。胶囊制作材料包括标准药用的明胶或纤维素。片剂的制作材料包括标准常用的药用的固体填充、润滑剂，固体填充剂包含淀粉、糖、皂土。制剂也可以是以硬壳片剂或含乳糖、甘露醇、传统常用的填料及制片剂的胶囊。药物经非肠道途径给药。这类途径的例子包括水针、生理盐水输液、5％葡萄糖活性制剂，或其他常见药用赋形剂。环糊精、或是我们熟悉的其它溶液制剂，可用作赋形剂使药物成为治疗制剂。
本发明的药物制剂可以通过体内和体外两种方式检测。参见以下实例。简单的说，体外测活的原理是检测蛋白制剂能否体外抑制免疫应答。体内测活是通过将药物注射入动物体内(也就是动物模型)，检测治疗效果。以此结果为基础，确定适当的给药剂量范围和给药途径。
以下实例仅仅用于说明，而不限于以任何方式进行继续应用和开发。根据我们在此的描述，领域内的研究人员不需要进一步的详细解释就能够最大程度地应用本发明所述方法。所引用的文献仅限于参考。
我们的结果也表明利用哺乳动物宿主细胞表达的白细胞介素1受体拮抗剂融合分子，包含糖基化的白细胞介素1受体拮抗剂，它的分子量较非白细胞介素1受体拮抗剂融合分子有所增加。它们的生物活性持续时间也有所增加，而注射所需有效剂量及所需用药次数均有所减少。由于其能够靶向性作用于炎症发病位点以及低有效剂量和低用药频率的特点，白细胞介素1受体拮抗剂融合蛋白与非白细胞介素1融合蛋白或相应的治疗蛋白与白细胞介素1受体拮抗剂的联合使用相比，副作用较小。
本发明的具体实施方式：
实施例1：
我们构建了各种不同的表达载体，来表达编码下面的蛋白：
A)TNFRII-Fc-IL-1ra(序列5)，TNFRI-Fc-IL-1ra(序列8)和对照TNFRII-Fc(序列4)或TNFRI-Fc(序列7)；
B)Humira(D2E7)-IL-1ra(序列10和11)，Remicade(cA2)-IL-1ra(序列13和14)以及对照二聚化Humira(序列9和11)，和Remicade(cA2)(序列12和14)；
C)IL-18bp(序列15)，二聚化IL-18bp-Fc(序列16)，和二聚化IL-18bp-Fc-IL-1ra(序列17)；
D)可溶性IL-4R胞外区结构域(序列19)，IL-4R-Fc(序列19)，和IL-4R-Fc-IL-1ra(序列21)；
E)VEGFR1-Fc-IL-1ra和轻链(序列24、23)，以及抗VEGF重链-IL-1ra和轻链(序列25、23).
大多数编码蛋白(序列号4-25)的重组子进行了DNA序列测定而且在哺乳动物细胞系进行表达。序列4-25利用天然或优化的密码子，以及人工合成的或天然分泌信号序列在驯化的能够悬浮培养的哺乳动物宿主细胞中表达。通过非加热SDS凝胶电泳和Westernblot免疫印记法检测到了含有抗体片段的二聚化重组表达产物。
应用无血清培养基，在24孔细胞培养板内TNFRII-Fc(序列4)和TNFRII-Fc-IL-1ra(序列5)的表达滴度可以分别达到50mg-100mg/L。用直接考马斯亮蓝染色法检测条件培养液中蛋白含量的方法显示在驯化的能够悬浮培养的CHO K1细胞中，TNFRII-Fc-IL-1ra表达量要高于TNFRII-Fc。这也表明通过哺乳动物细胞来表达含有白细胞介素1受体拮抗剂的嵌合蛋白可以达到高水平表达，足以达到商业生产要求。
实施例2：
我们进行了放大培养、纯化TNFRII-Fc-IL-1ra、IL-4R-ECD-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra重组表达产物。CHO细胞系用CHO-CD4培养基(Irvine Scientific)和常用的流加培养基进行无血清悬浮驯化，在3L细胞培养器中放大培养。融合蛋白TNFRII-Fc-IL-1ra(序列5)，IL-4R-ECD-Fc-IL-1ra(序列20)，IL-18bp-Fc-IL-1ra(序列17)的产量可达到商业生产的水平。这些蛋白可以应用protein-A亲和层析、离子交换、疏水层析进行纯化(图2、3、4)。纯化获得的蛋白加入制剂组分后，冻干，然后用SEC-HPLC液相分析。
实施例3：
利用生物活性实验测定TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL-1ra，IL-18bp-Fc-IL-1ra和VEGFR1-Fc-IL-1ra的活性。应用白细胞介素1依赖细胞D10进行白细胞介素1中和测定，D10细胞可用于检测以下几个蛋白的封闭活性：IL-1ra(Kineret)、TNFRII-Fc-IL-1ra、IL-4R-Fc-IL-1ra和IL-18bp-Fc-IL-1ra。它们都可以抑制重组人白细胞介素1的依赖细胞D10细胞的增殖。
简单说，人IL-1α能够以剂量依赖的方式诱导D10细胞增殖。白细胞介素1α诱导50％的细胞增殖，这个就是浓度就是EC50(半数有效剂量)。人IL-1α一般诱导D10细胞增殖的EC50范围在1-5pg/ml。细胞与有效剂量的白细胞介素1受体拮抗剂共孵育后，白细胞介素1受体拮抗剂通过封闭细胞表面白细胞介素1受体而抑制IL-1α诱导的细胞增殖。这种封闭效应同样是剂量依赖的。当受体拮抗剂的量较低时，它就不能封闭细胞表面的受体。那么，白细胞介素1诱导细胞增殖的活性得以恢复。受体拮抗剂使白细胞介素1的50％活性被抑制的浓度就是受体拮抗剂的半数有效剂量。
重组蛋白(TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL1ra，IL-18bp-Fc-IL-1ra，或VEGFR1-Fc-IL-1ra)的作用类似于可溶TNFRII、IL-18、IL-4或VEGF中和分子和白细胞介素1受体拮抗剂。细胞学测定确认了这些嵌合蛋白的生物活性(图6，8，10，11)。
在细胞学测定TNF中和分子活性方面，L929细胞(小鼠结缔组织细胞系，来源于ATCC)用于检测TNFRII阻断TNFα的活性。简单说，TNFα以剂量依赖的方式诱导快速细胞死亡，TNFα的半数有效浓度(诱导50％细胞死亡的TNFα浓度)低于50pg/ml。当TNFα分子与高浓度的可溶性TNF受体(sTNFR)共孵育后，可溶性受体与TNFα结合，从而抑制它与细胞表面受体结合。这样就阻断TNFα导致细胞死亡的活性。这种阻断效应也是剂量依赖的。sTNFR浓缩液稀释到一定浓度以下就不再阻断TNFα的活性，TNFα继续诱导细胞死亡。这样就可以确定是sTNFR的半数有效浓度(也就是阻断50％TNFα活性的浓度)。
96孔培养板中加入一定数量的L929细胞、10％的马血清、DMEM培养基(含谷氨酰胺)、1ug/ml放线菌D，每孔总体积150ul，再加入连续稀释的人TNFα样品(每浓度各两复孔)。对照孔只含细胞和培养基。培养板置于37℃温箱，5％CO2、饱和湿度条件下培养一天。每孔细胞用10％聚甲醛固定，用1％结晶紫染液染色。染色后加入30％的醋酸溶解。测定每孔光密度值(OD)，波长设在540纳米，光密度值与细胞总数成正比例。绘制细胞毒曲线，OD值设为Y轴，TNFα浓度作X轴。
连续稀释TNFRII-Fc(Enbrel)和TNFRII-Fc-IL-1ra样品(各作两复孔)，分别加入含固定浓度的人TNFα、10％的马血清、L-谷氨酰胺和1ug/ml的放线菌D的细胞板中。37℃共孵育1小时后转入另一块预先加有L929细胞的96孔板中。人TNF终浓度为500pg/毫升(总体积150ul/孔)。培养板置于37℃温箱，5％CO2饱和湿度条件下培养一天。细胞用10％多聚甲醛固定，1％结晶紫染液染色。染色后加入30％的醋酸溶解。测定每孔光密度值(OD)，波长设在540纳米。分别绘制中和曲线，OD值设为Y轴，TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra浓度作X轴。
结果表明人TNF alpha以剂量依赖的方式诱导L929细胞死亡。只含细胞和放线菌素D的本底O.D为0.5，人TNF-alpha剂量效应曲线从0.5降至0.1。人TNF-alpha剂量高于100pg/ml后O.D.值不再下降。结果显示人TNF-alpha已达饱和浓度。所有实验均作2复孔。每一样品浓度的CV％低于9％。此条件下人TNF-alpha的半数有效浓度为8pg/ml。
应用L929细胞，发现TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra能够以剂量依赖的方式抑制人TNF-alpha的活性。OD值的本底是0.1(细胞培养体系含TNF-alpha(500pg/ml)和放线菌素D)。加不同浓度的TNFRII-Fc-IL-1ra，OD值也从0.1增加到0.5，显示全部中和作用。50ng/ml的TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra能够完全中和人TNF-alpha活性。样品的每一稀释度均做两复孔，每一稀释度CV％低于10％，TNFRII-Fc和TNFRII-Fc-IL-1ra中和人TNF-alpha活性的半数有效浓度分别为3-4ng/ml，10ng/ml。
人白细胞介素4能够诱导TF-1细胞增殖，据此可用于白细胞介素4中和实验。稀释不同浓度人白细胞介素4加入含TF-1细胞的96孔细胞培养板，37℃，5％CO2条件下培养3天。培养基中加入MTS继续培养5小时。使用酶联仪测培养板各孔OD值，波长设在490纳米。可以绘出细胞增殖曲线，OD值作为Y轴，白细胞介素4浓度作为X轴。在中和实验中，将连续稀释的IL-4R-Fc和IL-4R-Fc-IL-1ra与含一定浓度的白细胞介素4(2ng/ml)培养基在96孔培养板中，37℃预孵育1小时。随后在每孔中加相同数量的TF-1细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养3天。加入MTS，继续培养5小时后，使用酶联仪测培养板各孔光密度值，波长490纳米。绘出细胞生长抑制曲线，OD值作为Y轴，IL-4R-Fc和IL-4R-Fc-IL-1ra浓度作为X轴。该实验结果(图表7)结合白细胞介素1中和实验的结果(图8)，显示了IL-4R-Fc-IL-1ra具有生物学功能，同时具有人IL-4受体和IL-1中和蛋白的活性。
人白细胞介素18可以剂量依赖的方式诱导KG-1细胞分泌IFN-g(培养体系含TNFa)，以此原理进行白细胞介素18中和实验。人白细胞介素18的半数有效剂量(就是指白细胞介素18诱导KG-1细胞分泌IFN-g达最高浓度的50％剂量)通常在20-40ng/ml。在加入细胞培养体系前，人白细胞介素18结合蛋白(IL-18bp)与人白细胞介素18预孵育，那么白细胞介素18结合蛋白可以结合、抑制白细胞介素18的活性。这种抑制效应是剂量依赖的。白细胞介素18结合蛋白完全封闭IFNg表达所需浓度的50％剂量，就是它的半数有效浓度。
细胞培养板中加入连续稀释的IL-18bp-Fc-IL-1ra和对照IL-18bp-Fc样品(各浓度设两个复孔)，与固定浓度(50ng/ml)的人白细胞介素18(R&D System)预孵育，37℃作用1小时。连续稀释的白细胞介素18(各浓度设两个复孔)加在培养板中设为阳性对照。各孔加入同样数量的KG-1细胞(ATCC，CCL246)，以及同样量的TNFa(BioSource Inc.)，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24小时。在细胞培养板中每孔取出50ul，转移到另外一个ELISA检测板中。按照人IFNg的ELISA检测试剂盒(BioSource Inc.)说明进行检测。光密度值测定初始波长为450纳米。绘出白细胞介素18诱导表达IFNg曲线，OD值为Y轴，人白细胞介素18浓度为X轴。白细胞介素18结合蛋白中和曲线以OD值为Y轴，IL-18bp-Fc-IL-1ra或对照组IL-18bp-Fc浓度为X轴。
细胞中和实验结果在图9中显示。结合白细胞介素1中和实验的结果(图10)，证明了IL-18bp-Fc-IL-1ra融合蛋白成功的表达是成功的。它保持了同时中和白细胞介素18和白细胞介素1的活性。
人VEGF(血管内皮细胞生长因子)以剂量依赖的方式诱导HUVE(人内皮脐静脉细胞增殖)，半数有效浓度，就是它诱导HUVE细胞增殖最高所需浓度的50％，一般为2-6ng/ml。将可溶性人VEGF受体1与血管内皮细胞生长因子预孵育后加入到细胞板中，可溶性人VEGF受体-1结合人VEGF并封闭其诱导细胞增殖的活性，这种封闭效应同样是剂量依赖的。完全封闭所需受体浓度的50％剂量，就是它的半数有效浓度。重组蛋白VEGFR1-Fc-IL-1ra由可溶性VEGF受体1和白细胞介素1受体拮抗剂两部分组成。它能够发挥可溶性VEGFR1和白细胞介素1受体拮抗剂的双重作用。
连续稀释VEGFR1-Fc-IL-1ra样品(各做两复孔)，分别与10ng/ml的VEGF(BioSource)于96孔细胞培养板中37℃预孵育1小时。连续稀释的人VEGF设为对照组。然后向96孔板中每孔加入相同数量的HUVE细胞(Cambrex)进行培养。在37℃，5％CO2培养箱中继续培养96小时。在最后的4小时内向每孔加入MTS(Promega)。测定光密度(OD值)的波长为490纳米。绘出不同浓度的VEGF使细胞增殖的OD值曲线。VEGF-R的中和曲线用OD值做Y轴，VEGFR1-Fc-IL-1ra浓度作X轴。
人VEGF以剂量依赖的方式刺激HUVE细胞增殖。半数有效浓度3ng/ml。浓度为10ng/ml的VEGF与连续稀释的VEGFR1-Fc-IL-1ra共孵育后，加入细胞培养体系中，VEGF依赖细胞的增殖以剂量依赖的方式受到抑制。VEGFR1-Fc-IL-1ra的半数有效浓度是15ng/ml(图12)。结合白细胞介素1中和实验的结果(图11)，证明了VEGFR1-Fc-IL-1ra融合蛋白的表达是成功的。它具有中和VEGF和IL-1的双重活性。
实施例4：
使用小鼠哮喘模型检测IL-4R-Fc-IL-1ra疗效。使用雌性BALB/c小鼠(6-8周龄)制备模型。简单讲，这些小鼠在第0天和第14天腹膜内注射40ug OVA(以2.25mg氢氧化铝乳化制成乳剂，总体积100ul)。
将小鼠分成8小时和48小时两组，8小时组包含生理盐水对照8小时组、OVA8小时组、IL-4R-Fc/OVA8小时组、IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA8小时组，48小时组分成理盐水对照48小时组、OVA48小时组、IL-4R-Fc/OVA48小时组、IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA48小时组。
第28天，所有组均给药100ug OVA，溶于0.05ml生理盐水通过鼻内给药，生理盐水组除外。生理盐水组第0天和第14天腹膜内给正常量的生理盐水(含氢氧化铝)，在28天通过鼻内给0.05ml生理盐水。
在29天，48小时组每组均再次给100ug OVA，溶于0.05ml生理盐水通过鼻内给药，生理盐水组除外。生理盐水组同样在第29天通过鼻内再次给0.05ml生理盐水。
IL-4R-Fc和IL-4R-Fc-IL-1ra的给药治疗
在第28天，IL-4R-Fc/OVA-8小时组，IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-8小时组，IL-4R-Fc/OVA-48小时组和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-48小时组，以200ug/只/天剂量分别给药。OVA激发前60分钟腹膜内注射给药。IL-4R-Fc/OVA-48小时组和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-48小时组在第29天以200ug/只/天的剂量再次给药。测定支气管肺泡灌洗液中的细胞数。
8小时组动物在第28天，鼻内一次OVA激发8小时后，处死小鼠取支气管肺泡灌洗液进行组织学研究。48小时组动物在28天和29天鼻内OVA激发48小时后处死。小鼠左肺主支气管处结扎，用1ml正常浓度的生理盐水通过气管插管灌洗右肺。用血球计数板计算总(淋巴)细胞数。制备甩片，用leukostat(fisher Diagnostics，Pittsburgh，PA)染色后分别计算各种分化细胞数。利用标准血细胞计算方法，分别计巨噬细胞、嗜酸性细胞、中性粒细胞、淋巴细胞数，400倍放大的视野中应至少有200个细胞。
肺组织学
取出气管和左肺上、下叶部分组织在20摄氏度条件下用Carnoy’s固定液固定15小时。用石蜡包埋，切片(5um)。每只小鼠左肺随机取10个气道组织切片，评估细胞浸润及黏液阻塞程度。在肺部血管和气道的周围的细胞浸润强度依据半定量评分。
结果
1.IL-4R-Fc-IL-1ra嵌合蛋白治疗早期阶段的肺炎。
表1 8小时组的小鼠经过鼻内OVA一次激发后，支气管肺泡灌洗液内的分化细胞数量。8小时组的小鼠生理盐水对照组、OVA、IL-4R-Fc/OVA-8hr和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA组(每组5只)的分化细胞计数如下(Mean±SEM).
| 所有细胞数量x10-3 | 中性粒细胞x10-3 | |
| 生理盐水对照组8小时组 | 51±8 | 30±5 |
| OVA-8小时组 | 220±16 | 172±17 |
| IL-4R-Fc/OVA-8小时组 | 200±11 | 165±10 |
| IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-8小时组 | 86±7 | 60±8 |
2.使用IL-4R-Fc-IL-1ra阻断晚期肺炎。
表格2 48小时组经过鼻内OVA的两次激发后，支气管肺泡灌洗液内的分化细胞数。48小时组的小鼠生理盐水组、OVA、IL-4R-Fc/OVA、IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA组(每组5只)的分化细胞数(Mean±SEM)。
| 所有细胞数量x10-3 | 嗜酸性细胞x10-3 | |
| 生理盐水对照组8小时组 | 44±8 | 3±2 |
| OVA-8小时组 | 180±12 | 52±7 |
| IL-4R-Fc/OVA-8小时组 | 102±10 | 20±5 |
| IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-8小时组 | 68±7 | 10±5 |
肺组织学研究：
结果显示在OVA-8小时组和OVA-48组实验中肺部血管和气道组织周围观察到严重细胞浸润。与IL-4R-Fc/OVA-48hr组和IL-4R-Fc/OVA-8hr组比较，IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-8小时治疗组和IL-4R-Fc-IL-1ra/OVA-48小时治疗组能够明显减少肺部血管和气道组织的细胞浸润。结果显示，在该哮喘动物模型中，IL-4R-Fc-IL1ra治疗效果最佳。
实施例5
小鼠关节炎动物模型(CIA)考察IL-18bp-IgG1Fc-IL-1ra融合蛋白的治疗效果。依据最近发表的标准方法修改方案(Banada等，2002)诱导CIA动物模型，8-10周龄的DBA/1J小鼠皮内注射牛II型胶原蛋白。在0天和21天，每只小鼠皮内注射100ul含有200ug牛II型胶原蛋白和含200ug灭活结核分支杆菌的不完全弗氏佐剂。小鼠(每组5只)在21到36天之间每3天注射治疗一次，分成3组，分别腹膜内注射PBS缓冲液对照、3mg/kg IL-18bp-Fc、3mg/kg IL-18bp-Fc-IL-1ra。小鼠36天脱颈处死。正常的三只DBA/1J对照小鼠同时被处死。
在21到36天每两天应用双盲法评测CIA的疾病临床活动性评分，用三等级评分法评测每只小鼠爪的发病程度，打分标准：0＝正常关节，1＝轻微炎症和发红，2＝严重红斑和肿胀影响整个爪子，活动受限，3＝畸形关节、关节强硬、关节强直、功能缺失。关节炎发病程度由四个爪子的总分计算，每只动物的最高分为12分。
在第36天取所有小鼠的双前肢和右后肢，10％福尔马林固定，按照前述方法(Bendele等，2000年)制作组织样本进行组织学分析。由有经验的人员以双盲法对爪、踝关节、膝等部位的组织学改变进行评分。按照前述方法(Bendele等，2000年)，按0-5评分，每只小鼠取5个部位的数据，统计数据显示的是炎症、血管翳、软骨和骨损伤的平均分以及整体评分.
结果
IL-18bp-Fc-IL-1ra临床治疗关节组织疾病及关节组织学研究。
各实验组关节炎发病率接近100％。与PBS空白对照相比，21到36天注射3mg/kgIL-18bp-Fc、3mg/kg IL-18bp-Fc-IL-1ra的蛋白治疗组小鼠的疾病临床活动性评分结果降低。关节组织学分析显示，与PBS组比较3mg/kg IL-18bp-Fc和3mg/kgIL-18bp-Fc-IL-1ra能够防止关节损伤。对比3mg/kg IL-18bp-Fc和3mg/kgIL-18bp-Fc-IL-1ra治疗组，疾病临床活动性评分以及组织学评分之间都具有显著性差异。IL-18bp-Fc-IL-1ra的疗效明显优于IL-18bp-Fc。
表3：IL-18bp-Fc-IL-1ra治疗CIA模型鼠的疾病临床活动性评分
在0天和21天DBA/1J小鼠注射200ug牛II型胶原蛋白、弗氏不完全佐剂、200ug结核杆菌。各组小鼠在21到36天之间每3天分别腹膜内注射PBS缓冲液对照、3mg/kg体重的IL-18bp-Fe和3mg/kg体重的IL-18bp-Fc-IL-1ra。由两位有经验的研究人员每两天以双盲法分别鉴定CIA小鼠每只爪子的病理改变程度，三级评分法进行打分。下列结果为最初注射牛II型胶原蛋白后，各实验组小鼠的疾病临床活动性评分数据。((mean±SEM))
| 36天时临床疾病症况 | |
| PBS缓冲液对照组 | 8.8±0.7 |
| IL-18bp-Fc | 6.5±0.6 |
| IL-18bp-Fc-IL-1ra | 3.8±0.5 |
实施例6：
小鼠接触性过敏试验模型(CHS)体内测试IL-18bp-Fc-IL-1ra活性。
CHS模型的制作及白细胞介素18嵌合蛋白的药效实验。
实验动物采用C57BL/6mice(8周和14周龄)。所用试剂：二硝基氟苯、丙酮、伊文思蓝、甲酰胺、牛血清白蛋白、乙酸盐、伊屋诺霉素、布雷菲德菌素A、脂多糖(Escherichiacoli026：B6)均购自Sigma-Aldrich公司。DNFB(二硝基氟苯)使用前丙酮/橄榄油(4/1)现用现稀释，刮去小鼠背部皮肤，涂抹25μl的0.5％DNFB溶液于小鼠背部致敏动物，同时设置未处理的对照组。5天后，在小鼠右耳两侧使用10μl的0.2％DNFB(非刺激性剂量)溶液涂抹，左耳使用同剂量溶剂(无DNFB)涂抹。在激发疾病模型的5天前，每天使用卡尺测量耳部的厚度。耳部肿胀程度((Tn-T5)右耳)-(Tn-T5)左耳))，Tn和T5分别代表第n天测量各只小鼠耳部厚度数值以及激发5天前小鼠耳部厚度数值。为确保试验中小鼠耳部肿胀由DNFB导致炎症而不是非特异性所致，每次实验都设立一个非致敏但激发动物对照组。每只小鼠从第5天激发前60分钟开始每天给药，分别腹膜内注射250μg的IL-18bp-Fc或IL-18bp-Fc-IL-1ra来中和白细胞介素18或/和白细胞介素1。对照组动物只注射生理盐水。再次激发期间的初次治疗7天为一个疗程。
结果
IL-18bp-Fc-IL-1ra治疗接触过敏。
制作接触过敏动物模型，在小鼠背部刮毛，涂抹半抗原DNFB(二硝基氟苯)致敏动物。5天后耳部涂抹DNFB激发小鼠的接触过敏。对比DNFB和溶剂空白处理对照组动物的耳朵肿胀增加程度进行打分确定炎症的激发。在模型激发阶段即5-7天给药IL-18BP-Fc和IL-18bp-Fc-IL-1ra，能够明显在这期间减少耳部肿胀。IL-18bp-Fc和IL-18bp-Fc-IL-1ra的疗效具有显著性差异(结果见表)，该结果显示IL-18bp-Fc-IL-1ra具有在同一或富含IL1受体的靶向性的特点，保证双重阻断IL-1和IL-18，其靶向性能够直接保证其高效性。IL-18bp-Fc-IL-1ra的疗效明显优于IL-18bp-Fc。
表格4：在接触性过敏性模型诱发过程中测试IL-18BP的药效试验
第0天DNFB致敏C57BL/6小鼠，5天后涂于耳部激发。每天测量耳部肿胀程度，用DNFB激发组较空白对照组肿胀程度的增加来表示。每天使用IL-18bp嵌合蛋白或空白试剂处理小鼠。以下为每组5只小鼠数据的平均值。
| 天数 | 5 | 6 | 7 |
| 空白组 | 0±0 | 110±12 | 160±10 |
| IL-18bp-Fc | 0±0 | 80±9 | 105±8 |
| II-18BP-Fc-IL-1ra | 0±0 | 50±5 | 70±5 |
实施例7
白细胞介素1受体结合实验。
简单说，重组人白细胞介素1受体胞外区使用CHO细胞表达后，进行纯化。TNFRII-Fc-IL-1ra、阴性对照TNFRII-Fc、阳性对照IL-1ra(Kineret)，包被于96孔板中，浓度1ug/孔，每孔加100ul包被缓冲液(Sigma)。纯化的白细胞介素1受体(浓度0.1ug/孔)在PBS缓冲液中37℃作用45分钟。用兔抗人白细胞介素1受体胞外区抗体(R&DSystems)检测配体/受体结合反应。随后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Pierce)，PBS-T缓冲液洗板，加入TMB(Sigma，T8665)显色，EL800酶标仪测光密度值，波长为650纳米。检测结果作图，OD值为纵坐标，稀释倍数为横坐标。图13显示了TNFRII-Fc-IL-1ra和IL-1ra(Kineret)都能够结合白细胞介素1受体，而TNFRII-Fc(Enbrel)不能。有趣的是哺乳动物表达的白细胞介素1受体拮抗剂和大肠杆菌表达的白细胞介素1受体拮抗剂(Kineret)相比，与白细胞介素1受体结合得更好。而且哺乳动物表达的白细胞介素1受体拮抗剂包含2个糖基化的N-link糖基化位点，所以与大肠杆菌表达的白细胞介素1受体拮抗剂(Kineret)相比，结合血清蛋白较少，在体外的结合特性也有所不同。
实施例8
125-I标记TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL-1ra，和IL-18bp-Fc-IL-1ra检测实验动物体内分布情况，以非白细胞介素1受体拮抗剂融合的蛋白作为对照。
用Iodogen方法以125-I标记TNFRII-Fc-IL-1ra，IL-4R-Fc-IL-1ra和IL-18bp-Fc-IL-1ra，然后通过分子筛色谱层析法纯化(M Hui等.，1989)，IL-1受体结合实验是一种常用的方法，用自己制备的哺乳动物表达重组白细胞介素1受体细胞外结构域融合蛋白进行检测。白细胞介素1受体与125-I标记的TNFRI-Fc-IL-1ra结合的与非标记的TNFRII-Fc-IL-1ra结合进行平行比较。结果显示125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra具有结合白细胞介素1受体的功能。
使用6nmol TPA溶于200ul丙酮涂抹于小鼠耳部，2-3天诱导了皮肤炎症的发生。在皮肤炎症小鼠动物模型注射125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra和125-I标记的TNFRII-Fc(Enbrel)。令人惊讶的是，结果显示125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra在炎症位点的分布要多于TNFRII-Fc。这很有可能与白细胞介素1受体的结合有关。
将125-I标记的IL-4R-Fc-IL-1ra、IL-18bp-Fc-IL-1ra以及125-I标记的IL-4R-Fc、IL-18bp-Fc注射小鼠皮肤炎症模型动物。获得了相似的结果。
表格5：125-I标记的TNFRII-Fc-IL-1ra和TNFRII-Fc注射4小时后，在炎症和非炎症皮肤组织位点的分布。该分布情况以每克组织含注射剂量的百分比表示(六只动物)。
| 治疗 | 组织 | 每克组织中的注射剂量百分比(n＝6) |
| 125-I标记TNFRII-Fc-IL-1ra | 炎症皮肤 | 3.8±0.2 |
| 125-I标记TNFRII-Fc-IL-1ra | 正常皮肤 | 1.5±0.1 |
| 125-I标记TNFRII-Fc(Enbrel) | 炎症皮肤 | 2.8±0.2 |
| 125-I标记TNFRII-Fc(Enbrel) | 正常皮肤 | 1.4±0.2 |
表格6：125-I标记的IL-4R-Fc-IL-1ra和IL-4R-Fc注射4小时后，在炎症和非炎症皮肤组织的分布。以每克组织中的注射剂量百分比表示(六只动物)。
| 治疗 | 组织 | 每克组织中的注射剂量百分比(n＝6) |
| 125-I标记IL-4R-Fc-IL-1ra | 炎症皮肤 | 4.0±0.2 |
| 125-I标记 | 正常皮肤 | 1.6±0.1 |
| IL-4R-Fc-IL-1ra | ||
| 125-I标记IL-4R-Fc | 炎症皮肤 | 1.4±0.3 |
| 125-I标记IL-4R-Fc | 正常皮肤 | 1.4±0.2 |
表格7：125-I标记的IL-18bp-Fc-IL-1ra和IL-18bp-Fc注射4小时后，在炎症和非炎症组织的分布。以每克组织中的注射剂量百分比表示(六只动物)。
| 治疗 | 组织 | 每克组织中的注射剂量百分比(n＝6) |
| 125-I标记IL-18bp-Fc-IL-1ra | 炎症皮肤 | 3.9±0.3 |
| 125-I标记IL-18bp-Fc-IL-1ra | 正常皮肤 | 1.4±0.5 |
| 125-I标记IL-18bp-Fc | 炎症皮肤 | 1.5±0.3 |
| 125-I标记IL-18bp-Fc | 正常皮肤 | 1.4±0.3 |
实施例9
使用2只猕猴测定IL-4R-Fc-IL-1ra的免疫原性。每周皮下注射10mgIL-4R-Fc-IL-1ra，共注射8周。注射前，后(第1和56天)收集血清样本。应用中和实验检测血清样品中是否存在能够中和IL-4和IL-1生物活性的针对嵌合蛋白的中和性抗体。为了更好的检测低浓度的中和抗体，血清进一步用蛋白A和抗IgM抗体进行亲和层析。在药物注射猕猴的未稀释的血清样本以及纯化的IgG和IgM中都未检出能够中和IL-4和IL-1生物活性的针对嵌合蛋白的抗体。结果提示，嵌合蛋白IL-4R-Fc-IL-1ra对猴和人没有免疫原性。
序列表
嵌合蛋白序列
<110>美国蛋白质公司，哈药集团生物工程有限公司
<120>嵌合蛋白
<130>2006010
<140>200580011525.4
<141>2004-04-08
<150>PCT/US2005/012194
<151>2004-10-12
<160>25
<210>1
<211>152
<212>PRT
<213>人工序列
<310>WO2006/043972 A1
<311>2006-04-27
<400>1
Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile
1 5 10 15
Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr leu Arg Asn Asn Gln leu
20 25 30
Val Ala Gly Tyr leu Gln Gly Pro Asn Val Asn leu Lys Glu Lys
35 40 45
Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala leu Phe leu Gly Ile
50 55 60
His Gly Gly Lys Met Cys leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu
65 70 75
Thr Arg leu Gln leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp leu Ser Glu
80 85 90
Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser
95 100 105
Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe
110 115 120
leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser leu Thr Asn
125 130 135
Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu
140 145 150
Asp Glu
<210>2
<211>232
<212>PRT
<213>人工序列
<310>WO2006/043972 A1
<311>2006-04-27
<400>2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
5 10 15
Ala Pro Glu Lue Lue Gly Gly Pro Ser Val Phe Lue Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Lue Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
65 70 75
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
80 85 90
Lue Thr Val Lue His Gln Asp Trp Lue Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
95 100 105
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Lue Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
110 115 120
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
125 130 135
Lue Pro Pro Ser Arg Asp Glu Lue Thr Lys Asn Gln Val Ser Lue
140 145 150
Thr Cys Lue Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
155 160 165
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
170 175 180
Pro Val Lue Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Lue Tyr Ser Lys Lue
185 190 195
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
200 205 210
Ser Val Met His Glu Ala Lue His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
215 220 225
Lue Ser Lue Ser Pro Gly
230
<210>3
<211>235
<212>PRT
<213>人工序列
<310>WO2006/043972 A1
<311>2006-04-27
<400>3
Lue Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly
5 10 15
Ser Thr Cys Arg Lue Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met
20 25 30
Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys
35 40 45
Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Thr Gln Lue Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Lue Ser Cys Gly
65 70 75
Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
80 85 90
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala
95 100 105
Lue Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Lue Cys Ala Pro Lue Arg Lys
110 115 120
Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser
125 130 135
Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr
140 145 150
Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val
155 160 165
Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser
170 175 180
Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Lue Pro
185 190 195
Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu
200 205 210
Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Lue Lue Pro Met Gly Pro
215 220 225
Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp
230 235
<210>4
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<310>WO2006/043972 A1
<311>2006-04-27
<400>4
Lue Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly
5 10 15
Ser Thr Cys Arg Lue Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met
20 25 30
Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys
35 40 45
Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Thr Gln Lue Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Lue Ser Cys Gly
65 70 75
Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
80 85 90
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala
95 100 105
Lue Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Lue Cys Ala Pro Lue Arg Lys
110 115 120
Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser
125 130 135
Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr
140 145 150
Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val
155 160 165
Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser
170 175 180
Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Lue Pro
185 190 195
Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu
200 205 210
Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Lue Lue Pro Met Gly Pro
215 220 225
Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys
230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Lue Lue
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Lue Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Lue Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Lue Thr Val Lue His
320 325 330
Gln Asp Trp Lue Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
335 340 345
Lys Ala Lue Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
350 355 360
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lue Pro Pro Ser Arg
365 370 375
Asp Glu Lue Thr Lys Asn Gln Val Ser Lue Thr Cys Lue Val Lys
380 385 390
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
395 400 405
Gln Pro Glu Asn Ash Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Lue Asp Ser
410 415 420
Asp Gly Ser Phe Phe Lue Tyr Ser Lys Lue Thr Val Asp Lys Ser
425 430 435
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
440 445 450
Ala Lue His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Lue Ser Lue Ser Pro
455 460 465
Gly Lys
<210>5
<211>619
<212>PRT
<213>人工序列
<310>WO2006/043972 A1
<311>2006-04-27
<400>5
Lue Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly
5 10 15
Ser Thr Cys Arg Lue Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met
20 25 30
Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys
35 40 45
Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Thr Gln Lue Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Lue Ser Cys Gly
65 70 75
Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
80 85 90
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala
95 100 105
Lue Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Lue Cys Ala Pro Lue Arg Lys
110 115 120
Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser
125 130 135
Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr
140 145 150
Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val
155 160 165
Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser
170 175 180
Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Lue Pro
185 190 195
Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu
200 205 210
Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Lue Lue Pro Met Gly Pro
215 220 225
Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys
230 235 240
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Lue Lue
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Lue Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Lue Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
290 295 300
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Lue Thr Val Lue His
320 325 330
Gln Asp Trp Lue Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
335 340 345
Lys Ala Lue Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
350 355 360
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Lue Pro Pro Ser Arg
365 370 375
Asp Glu Lue Thr Lys Asn Gln Val Ser Lue Thr Cys Lue Val Lys
380 385 390
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
395 400 405
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Lue Asp Ser
410 415 420
Asp Gly Ser Phe Phe Lue Tyr Ser Lys Lue Thr Val Asp Lys Ser
425 430 435
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
440 445 450
Ala Lue His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Lue Ser Lue Ser Pro
455 460 465
Gly Lys Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe
470 475 480
Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Lue Arg Asn Asn
485 490 495
Gln Lue Val Ala Gly Tyr Lue Gln Gly Pro Asn Val Asn Lue Lys
500 505 510
Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Lue Phe Lue
515 520 525
Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Lue Ser Cys Val Lys Ser Gly
530 535 540
Asp Glu Thr Arg Lue Gln Lue Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Lue
545 550 555
Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser
560 565 570
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575 580 585
Trp Phe Lue Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Lue
590 595 600
Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe
605 610 615
Gln Glu Asp Glu
<210>6
<211>249
<212>PRT
<213>人工序列
<310>WO2006/043972 A1
<311>2006-04-27
<400>6
Met Gly Lue Ser Thr Val Pro Asp Lue Lue Lue Pro Lue Val Lue
5 10 15
Lue Glu Lue Lue Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Lue
20 25 30
Val Pro His Lue Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro
35 40 45
Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr
50 55 60
Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Lue Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro
65 70 75
Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr
80 85 90
Ala Ser Glu Asn His Lue Arg His Cys Lue Ser Cys Ser Lys Cys
95 100 105
Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp
110 115 120
Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr
125 130 135
Trp Ser Glu Asn Lue Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Lue Cys Lue
140 145 150
Asn Gly Thr Val His Lue Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val
155 160 165
Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Lue Arg Glu Asn Glu Cys Val
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Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Lue Glu Cys Thr Lys Lue Cys
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50 55 60
Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Lue Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro
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Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr
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Trp Ser Glu Asn Lue Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Lue Cys Lue
140 145 150
Asn Gly Thr Val His Lue Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val
155 160 165
Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Lue Arg Glu Asn Glu Cys Val
170 175 180
Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Lue Glu Cys Thr Lys Lue Cys
185 190 195
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200 205 210
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215 220 225
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260 265 270
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Trp Ser Glu Asn Lue Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Lue Cys Lue
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275 280 285
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290 295 300
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Lue Pro
305 310 315
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320 325 330
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335 340 345
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350 355 360
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365 370 375
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Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp
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Gly Ser Met Lys Lue Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser
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Asn His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Lue
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Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ser Ile Ash Ser Ala Thr
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Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser
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Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Lue Thr Val Ser Ala
110 115 120
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Lue Ala Pro Ser Ser Lys
125 130 135
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140 145 150
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Lue
155 160 165
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Lue Gln Ser Ser Gly
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230 235 240
Ser Val Phe Lue Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Lue Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
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Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Lue Thr Val Lue His Gln Asp Trp
305 310 315
Lue Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Lue
320 325 330
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335 340 345
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350 355 360
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380 385 390
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395 400 405
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Gly Ser Met Lys Lue Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser
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Asn His Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Lue
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Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Lue Thr Val Ser Ala
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Ser Val Phe Lue Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Lue Met Ile
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Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
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305 310 315
Lue Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys ALa Lue
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Lue Asp Ser Asp Gly Ser
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Lue His
425 430 435
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Lue Ser Lue Ser Pro Gly Lys Arg
440 445 450
Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp
455 460 465
Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Lue Arg Asn Asn Gln Lue Val
470 475 480
Ala Gly Tyr Lue Gln Gly Pro Asn Val Asn Lue Lys Glu Lys Ile
485 490 495
Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Lue Phe Lue Gly Ile His
500 505 510
Gly Gly Lys Met Cys Lue Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr
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545 550 555
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650 655 660
Phe Phe Lue Tyr Ser Lys Lue Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Phe Gln Glu Asp Glu
605
Claims (32)
1.一种融合蛋白，其特征是第一片段位于融合蛋白的氨基末端，并且特异性地结合，以及中和一个细胞因子或生长因子的功能，第二片段位于融合蛋白的羧基末端，并且特异结合一种生长因子或一种细胞因子的受体，这两个片段是人为连接的，第二个细胞因子的受体在炎症或疾病位点高表达。
2.根据权利要求1中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白质含有连接片段，该连接片段将连接第一片段和第二片段连在一起，其中连接片段具有二聚体化的功能。
3.根据权利要求2中所述融合蛋白，其特征是：所述的蛋白的连接片段，包含免疫球蛋白的Fc片段或其同功能片段。
4.权利要求3中所述的融合蛋白，其特征是：所述的免疫球蛋白，是指IgA、IgE、IgD、IgG或IgM。
5.根据权利要求3中所述的融合蛋白，其特征是：所述的免疫球蛋白，是指IgG。
6.根据权利要求5中所述的融合蛋白，其特征是：所述的Fc片段包含序列2。
7.根据权利要求1中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，它的第一片段可以结合及中和血管内皮细胞生长因子，血管生成素、肿瘤坏死因子、白细胞介素18、白细胞介素4或者白细胞介素13或它们的同功能蛋白。
8.根据权利要求7中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，其中第一片段包含一条免疫球蛋白链序列，能够特异地结合且中和血管内皮细胞生长因子，新生血管生成素，白细胞介素18、白细胞介素4、白细胞介素13或IgE或其同功能蛋白。
9.根据权利要求8中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，它的免疫球蛋白链，包含序列9，11，12，14，23，或24或同功能蛋白。
10.根据权利要求7中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，它的第一片段包含血管内皮生长因子、血管生成素、肿瘤坏死因子、白细胞介素18、白细胞介素4和白细胞介素13的受体或结合蛋白序列。
11.根据权利要求10中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，第一片段包含序列3，6，15，或19。
12.根据权利要求1中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白是糖基化蛋白。
13.根据权利要求1中所述的融合蛋白，其特征是：所述的第二个细胞因子是指白细胞介素1。
14.根据权利要求13中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，第二片段是白细胞介素1的拮抗剂。
15.根据权利要求14中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白，第二片段包含白细胞介素1受体拮抗剂的序列(序列1)或其同功能蛋白序列。
16.根据权利要求14中所述的融合蛋白，其特征是：所述的蛋白包含序列5，8，10，13，17，18，21，22，24，或25。
17.一种体外分离的核酸，其特征是：其中包含编码权利要求1中所述的融合蛋白的序列。
18.根据权利要求17中所述的核酸序列，包含编码序列1至25的某一序列。
19.一种载体，其特征是：其中包含权利要求17中所述的核酸序列。
20.一种宿主细胞，其特征是：其中包含权利要求17中所述的核酸。
21.一种生产多肽的方法，包括利用细胞培养基培养权利要求20中所述的细胞，使核酸序列编码的多肽在细胞中表达，然后从培养的细胞或细胞培养液中纯化这些多肽。
22.一种药物制剂组分，其特征是：其中包含权利要求1提到的融合蛋白，或是编码该融合蛋白的核酸分子，以及可用于药用的载体
23.一种调节患者免疫反应的方法，这种方法包括：
确定已经或正在为过度免疫反应所累的患者以及给予该患者有效剂量的权利要求1中提到的融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸分子
24.根据权利要求23中所提到的方法，其特征是：所述的患者已经或准备接受同基因或异基因移植。
25.根据权利要求23中所提到的方法，其特征是：其中的病症是炎症、自身免疫疾病、过敏性疾病、或是新生血管形成依赖的肿瘤疾病。
26.根据权利要求25的方法，其特征是：所述的病症是肿瘤疾病，融合蛋白包含序列22，24，和25。
27.一种延长重组蛋白在患者体内半衰期的方法，其特征是：该方法包括：将某重组蛋白与包含序列1，或是其同等功能的序列片段连接，形成融合蛋白嵌合体，决定该融合蛋白在患者体内的半衰期，重组蛋白在体内结合且中和某一细胞因子或生长因子。
28.一种延长重组蛋白在患者体内的功效的方法，其特征是：该方法包括：
将某重组蛋白与包含序列1，或是其它同等功能的序列片段连接，形成融合蛋白嵌合体，决定该融合蛋白在患者体内的功效，
29.一种在患者体内将治疗性蛋白向某一靶位投送的方法，其特征是：该方法包括：
将治疗蛋白与包含序列1，或是其同功能的片段连接，形成融合蛋白嵌合体，以及将该融合蛋白应用于合适的患者，其中的治疗性蛋白能够靶向定位于高表达白细胞介素1受体的炎症位点。
30.根据权利要求28所述的在患者体内将治疗性蛋白向某一靶位投送的方法，其特征是：所述的片段包含序列1或其它同等功能的片段，该片段结合白细胞介素1受体，而重组蛋白是一种能够结合而且中和某一细胞因子或生长因子的治疗性蛋白。
31.根据权利要求30所述的在患者体内将治疗性蛋白向某一靶位投送的方法，其特征是：所述的融合蛋白嵌合体，在患者体内的能够在炎症或高表达白细胞介素1受体的疾病位点同时结合且中和白细胞介素1受体以及另一细胞因子或生长因子。
32.权利要求30所述的在患者体内将治疗性蛋白向某一靶位投送的方法，其特征是：所述融合蛋白嵌合体在患者体内的炎症位点或高表达白细胞介素1受体的疾病位点能够同时中和或拮抗白细胞介素1和其他细胞因子或生长因子。
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