CN101023173B - 呈现出增加表达的修饰型木聚糖酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了包含引入功能性共有序列糖基化位点的序列的修饰型家族(11)木聚糖酶。所引入的糖基化位点的非限制性实例包括将在位置(34、131、180、182)或其位置组合的氨基酸突变成天冬酰胺。通过将目的木聚糖酶序列与里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列进行比对，测定家族(11)木聚糖酶中的上述氨基酸位置。使用相似的宿主菌株和生长条件，当与自其衍生出所述修饰型木聚糖酶的相应木聚糖酶的表达效率相比，所引入的共有序列糖基化位点可促进修饰型木聚糖酶提高表达效率。
Description
本发明涉及增加表达的木聚糖酶，更具体是涉及自宿主中增加表达和分泌木聚糖酶。
发明背景
通过许多种丝状真菌(filamentous fungi)和细菌生产的木聚糖酶，是具有广泛商业用途的一组酶。木聚糖酶主要的用途是在生产纸张中用于生物漂白纸浆。另外，木聚糖酶已经用作果汁和果酒中的澄清剂、用作精密装置和半导体洗涤剂中的酶促试剂，以及它们也用于改进禽类和猪饲料的可消化性。
工业应用上使用最多的木聚糖酶是在生物化学和生物物理学性质上显示多样性的家族11木聚糖酶。例如，已经从细菌(US6,667,170)、真菌(US6,635,464)或其它极端嗜热生物中分离了耐热的木聚糖酶(Luthi等，1990；Winterhalter等，1995；Simpson等，1991)。或者，通过蛋白质工程已经确定木聚糖酶用于各种工业应用的最佳性能(如U.S.5,759,840；U.S.5,866,408；U.S.5,405,769；以及Turunen等，2001)。
木聚糖酶在工业应用中的有效实施，需要从能在深层发酵期间将木聚糖酶分泌到培养肉汤中的宿主微生物进行经济生产。这尤其是从嗜热生物或极端嗜热生物中大规模生产木聚糖酶所必需的，其中所述的生物难以进行培养或不能充分分泌高水平的蛋白质。通常，用于生产工业酶的宿主微生物是丝状真菌，例如木霉菌(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)或镰孢菌(Fusarium)，放线菌(actinomycete)例如链霉菌(Streptomyces)或杆菌属(Bacillus bacteria)。这表示编码目标木聚糖酶的基因，无论是从不同生物体分离的或是从宿主生物体的木聚糖酶基因经蛋白质工程构建的， 都必须以基因可操纵地连接于能促进其从宿主表达和分泌的DNA序列的方式克隆入生产宿主。
通过遗传修饰工业菌株里氏木霉(T.reesei)来表达和分泌外源蛋白质已经持续多年的显著争议(Conesa等，2001)。在里氏木霉中异源蛋白质的表达，可引起在内质网(ER)腔中由未折叠的或错误折叠的新生多肽的累积而引起的未折叠蛋白质反应(UPR；Saloheimo等，1999)。由于来自里氏木霉的家族11木聚糖酶的折叠和分泌的调节机制的现有信息是有限的，已经实施一些策略来促进相关的外源木聚糖酶在里氏木霉宿主菌株中的高水平表达。这些策略包括使用高度诱导型启动子，例如里氏木霉纤维素酶基因的启动子，以及用包含高度诱导型启动子的木聚糖酶表达构建体来替换天然纤维素酶基因。
从里氏木霉表达细菌木聚糖酶，需要用完整的结构域结构(例如里氏木霉甘露聚糖酶I或CBH II蛋白的催化核心或结合结构域)将木聚糖酶融合到载体里氏木霉多肽(Paloheimo等，2003)。在US 6,635,464和US6,667,170中公开了这一策略，或者其与缺失一个或多个来自宿主里氏木霉菌株的纤维素酶基因(组)组合，由此来指导从细菌(A.flexuosa)和真菌(C.thermophilus)来源表达耐热的家族11木聚糖酶。尽管载体多肽的确增加了US 6,635,464和US 6,667,170中所公开的异源木聚糖酶从里氏木霉宿主菌株的生产和分泌，但载体多肽附着于木聚糖酶以用于工业用途并不总是理想的。这样的话，需要在融合蛋白分泌到培养肉汤之后并在其用于应用之前通过蛋白水解作用来除去载体多肽。然而，由于蛋白水解步骤所需要的成本和温育时间以及在水解除去载体多肽期间目的木聚糖酶的可能产量损失，蛋白水解增加了目的木聚糖酶总产量的时间和成本。
这些使用了将目的蛋白融合到宿主细胞天然的载体蛋白的策略也已经得以成功应用，来提供哺乳动物凝乳酶从曲霉的生产和分泌(Van denBrink等，WO 02/36752和WO 03/106484)。WO 03/106484公开了通过将N-糖基化基序引入到凝乳酶和葡糖淀粉酶融合配偶体之间的人工接头多 肽内部或凝乳酶肽序列内部，来进一步改进从曲霉生产和分泌葡糖淀粉酶-凝乳酶融合蛋白。然而，很难证实通过将糖基化基序引入未包含融合配偶体的构建体而从曲霉生产凝乳酶的效益。
Sagt等人(2000)报导通过将N-糖基化基序引入目的蛋白内部可改进从异源真核宿主分泌目的蛋白。在这些报导中，将N-糖基化位点引入狂犬病突变型序列或真菌角质酶(cutinase)序列或当地骆驼抗体片段序列中，导致增加目的蛋白从毕赤酵母(Pichia yeast)宿主的分泌。然而，将糖基化位点引入天然真菌角质酶并不导致异源酵母宿主的任何表达增加。
WO 02/02597报导包含糖基化位点的FSH-α亚基和葡糖脑苷脂酶多肽的生成。这些研究目的在于改进这些多肽的稳定性和表达。然而，使用添加编码N-糖基化基序的短核苷酸序列而不是通过指导一级肽序列的修饰，来仅仅证明该方法的实用性。
本发明目的是提供增加表达的修饰型木聚糖酶。
发明概述
本发明涉及增加表达的木聚糖酶，更具体是涉及从宿主增加表达和分泌木聚糖酶。
本发明提供一种修饰型家族11木聚糖酶，其包含引入功能性共有序列N-糖基化位点(functional consensus N-glycosylation site)的序列，其中所述位点不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。修饰型家族11木聚糖酶包含将选自位置34(X34N)、位置131(X131N)、位置180(X180N)、位置182(X182N)及其组合的位置替换成天冬酰胺的氨基酸取代，所述位置通过将家族11木聚糖酶与如SEQ IDNO：1中所示的里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II的氨基酸序列进行序列对比而确定。本发明也涉及如上所述的修饰型家族11木聚糖酶，其还包含将选自位置36(X34N-S36T)、位置182(X180N-S182T)、位置184(X182N-S184T)及其组合的位置替换成苏氨酸的氨基酸取代。优选地， 修饰型家族11木聚糖酶包含X131N突变体。还提供了选自下列的修饰型家族11木聚糖酶：ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITXS′、Xln1-131N以及变铅青链霉菌(S.lividans)xlnC-131N。
本发明公开了如上所述的修饰型家族11木聚糖酶，其中当在里氏木霉宿主菌株中表达时，与自其衍生出所述修饰型木聚糖酶的家族11木聚糖酶的表达效率相比，修饰型木聚糖酶的表达效率增加至少40％。
本发明还提供了一种修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体，其包含可操纵地连接于分泌信号的启动子，分泌信号可操纵地连接于包含功能性共有序列N-糖基化位点的编码区，所述位点不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中；当与自其衍生出所编码的修饰型木聚糖酶的所编码的家族11木聚糖酶的表达效率相比，所述修饰型木聚糖酶遗传构建体使得所编码的修饰型木聚糖酶的表达效率增加。
此外，本发明提供包含所述的修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体的遗传修饰的微生物。优选地，遗传修饰的微生物包含木霉属或肉座菌属(Hypocrea)的菌株。此外，遗传修饰的微生物包含属于木霉属分泌信号的分泌信号，例如木霉属木聚糖酶分泌信号。
该本发明还涉及包含编码区的遗传修饰型微生物，其中编码区编码选自下列的修饰型木聚糖酶：ITX1、ITX2、ITX3、ITX3′、ITX4、ITX4′、ITX5、ITX5′、Xln1-131N以及变铅青链霉菌(S.lividans)xlnC-131N。
本发明提供加工食物或饲料的方法，包括用包含修饰型家族11木聚糖酶的添加剂来处理食物或饲料，其中所述的木聚糖酶包含引入了功能性共有序列N-糖基化位点的序列，并且所述位点不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。例如，食物或饲料添加剂选自禽类饲料添加剂、猪饲料添加剂、用于烘焙的食品添加剂或用于酿酒的食品添加剂。
本发明还涉及生产纸浆的方法，包括用修饰型家族11木聚糖酶来处理纸浆，其中所述的木聚糖酶包含引入功能性共有序列N-糖基化位点的序列，并且所述位点不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。
本发明还涉及修饰型木聚糖酶在工业或食品或饲料加工中的用途，其中所述的木聚糖酶包含引入功能性共有序列N-糖基化位点的序列，并且所述位点不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中。工业生产方法可以是生产纸浆。
本发明提供自木霉属宿主增加表达和分泌的修饰型家族11木聚糖酶，该酶在生物化学性质上没有任何明显变化。该菌株在特异性木聚糖酶产量和总蛋白生产率的增加结果，促进用于工业应用的家族11木聚糖酶产品的经济生产。此外，在本发明的实施方案中，可将N-糖基化位点引入位于家族11肽序列的起点、中间或末端的具有保守序列同源性的区域。可在木聚糖酶的官能团上实现这种引入，并且没有任何副作用。
发明概述并不必描述本发明的所有特征。
附图简述
通过后面的描述并参照下列附图，可更加清楚本发明的这些和其它特征，附图中：
图1显示从N末端编序的家族11木聚糖酶的氨基酸序列的比对，其中：Bp-短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)(SEQ ID NO：31)；Ca-丙酮丁醇棱菌(Clostridium acetobutylicum)P262xynB(SEQ ID NO：33)；Cs-粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)xynA(SEQ ID NO：34)；Rf-产黄瘤胃球菌属(Ruminococcus flavefaciens)(SEQ ID NO：35)；Tr2-里氏木霉属(Trichoderma reesei)xyn2(SEQ ID NO：1)；Tv-绿木霉属(Trichoderma viride)(SEQ ID NO：42)；Th-哈茨木霉属(Trichoderma harzianum)(SEQ ID NO：41)；Sc-裂褶菌属(Schizophyllum commune)xynA(SEQ ID NO：36)；An-黑曲霉(Aspergillus niger)(SEQ ID NO：43)；Ak-川地曲霉(Aspergilluskawachii)XynC(SEQ ID NO：44)；At-塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)(SEQ ID NO：29)；Trl-里氏木霉(Trichoderma reesei)xynl(SEQID NO：2)；Aa-泡盛曲霉kawachi变种(Aspergillus awamoro var.kawachi)Xyn B(SEQ ID NO：28)；Fs-产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)Xyn II(SEQ ID NO：44)；Ss-链霉菌属(Streptomyces sp.)36a(SEQ ID NO：37)；S1B-变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)xynB(SEQ ID NO：38)；S1B-变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)xynC(SEQ ID NO：39)；Tl-疏绵状嗜热霉菌(Thermomyces lanuginosus)Xyn(SEQ ID NO：45)；Tf-褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca)TfxA(SEQ ID NO：40)；Bc-环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)(SEQ ID NO：30)；Bs-枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(SEQ ID NO：32)。
图2显示用于指导修饰型木聚糖酶在里氏木霉中表达的载体pC/XHML-TV图。
图3显示遗传诱变载体pALT-H(I)TXn图，其中“n”是描述符，例如“13”或“18”，载体包含131N突变体(即pALT-ITXn)或者载体不包含131N突变体(即pALT-HTXn)例如当“n”是18并且载体不包含131N突变体时，载体是pALT-HTX18。
图4显示用于指导修饰型木聚糖酶在里氏木霉中表达的遗传诱变载体pc/xH(I)TXn-TV的图，其中“n”是描述符，例如“13”、“18”、“18(R135Y)”或“1(N131Q)”，载体包含131N突变体(即pc/xITXn-TV)或者载体不包含131N突变体(即pc/xHTXn-TV)例如当″n″是18并且载体不包含131N突变体时，载体是pc/XITXn-TV。
图5显示用于指导天然的(和修饰的)里氏木霉木聚糖酶I和变铅青链霉菌木聚糖酶C分别在里氏木霉中表达的载体图。图5A：pc/xxynl-(T118n)-TV；图5B：pc/xxylc-(T128N)-TV。
图6显示修饰型木聚糖酶ITX1及其天然的对应物HTX18的pH活性特征。
图7显示修饰型木聚糖酶ITX1及其天然的对应物HTX18的温度活 性特征。
优选实施方案的描述
本发明涉及具有增加表达的木聚糖酶，更具体是涉及自宿主中增加表达和分泌木聚糖酶。
以下描述了优选的实施方案。如本文概括的，木聚糖酶和修饰型木聚糖酶，可用于漂白纸浆的目的或其它通常需要在温度和pH的活性超过野生型酶的其它应用。为了生物漂白纸浆，优选的木聚糖酶是来自被列入家族11中的木聚糖酶(参见表1)。
通过许多种丝状真菌和细菌生产的木聚糖酶，主要根据结构和机制相似性可被分为两种家族：家族10或家族11(Henrissat，1991)。家族11木聚糖酶是相对低分子量(约20kDa和约200氨基酸残基)的一组小酶。
里氏木霉分泌的家族11木聚糖酶并不是糖基化的，这与木聚糖酶I氨基酸序列中共有序列的N-糖基化基序的缺失是一致的( 等，1992)。然而，尽管在其序列中存在两种N-糖基化共有基序(consensusmotif)，但木聚糖酶II也不是糖基化的。相反，里氏木霉纤维素酶在共有基序Asn-Xaa-Ser/Thr内的天冬酰胺残基处发生N-糖基化，其中Xaa是除了脯氨酸的任何氨基酸(或-X-S/T，其中X是除了脯氨酸的任何氨基酸)。然而，并不是各种纤维素酶内部所有的可能位点都是糖基化的(Hui等，2001年和2002年)。这提示木霉属生物体并不识别天然氨基酸序列中的一些共有基序。
本发明提供修饰型家族11木聚糖酶，其包含糖基化序列或基序，例如但不限于Asn-Xaa-Ser/Thr、Asn-Xaa-Thr、或Asn-Xaa-Ser，所述糖基化序列或基序不存在于自其可制备或衍生出所述修饰型木聚糖酶的对应木聚糖酶中。
此外，本发明提供具有将一个或多个选自位置34、131、180和182的氨基酸取代为天冬酰胺(Asn或N)的修饰型家族11木聚糖酶，其中所述位置通过将家族11木聚糖酶与SEQ ID NO：1所示的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的序列进行对比而确定。所述的取代可以是：X34N、X131N、X180N或X182N，其中氨基酸“X”在指定位置被天冬酰胺或″N″取代。例如，X131N表示位置131(根据家族11木聚糖酶与SEQ ID NO：1所示的里氏木霉木聚糖酶II(TrX II)氨基酸序列的序列对比而确定)的氨基酸“X”由天冬酰胺或“N”取代。优选地，突变体在位置131或在另外的家族11木聚糖酶根据与TrX II(SEQ ID NO：1)序列对比而确定的对应位置，产生X131N。研究者已经观测到包含一个或多个突变例如X131N取代的修饰型木聚糖酶，与产生或衍生修饰型木聚糖酶的家族11木聚糖酶相比，可显示提高的表达效率。包含X34N、X131N、X180N或X182N突变的构建体实例，分别包含ITX5和ITX5′、ITX1和ITX2、ITX3和ITX3′、ITX4和ITX4′。
另外的突变例如X34N-S36T、X180N-S182T以及X182N-S184T，也可被引入家族11木聚糖酶来生产共有序列Asn-Xaa-Thr，从而确保Thr位于木聚糖酶内部的天冬酰胺上游。包含X34N和S36T、X180N和S182T、或X182N和S184T突变的构建体实例，分别包含ITX5′、ITX3′、以及ITX4′。
本发明修饰型木聚糖酶可衍生于任何家族11木聚糖酶，例如衍生于天然木霉属的木聚糖酶，包括但不限于里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶I、绿木霉木聚糖酶；或衍生于曲霉、镰孢菌、放线菌(actinomycete)的木聚糖酶；或衍生于链霉菌属的木聚糖酶，例如但不限于变铅青链霉菌木聚糖酶B和变铅青链霉菌木聚糖酶C；或衍生于芽孢杆菌(Bacillus)、嗜热放线菌(Thermobifida)、马杜拉放线菌(Actinomadura)、毛壳菌(Chaetomium)或Thermatoga的木聚糖酶。
通过比较里氏木霉木聚糖酶II序列(TrX-II；SEQ ID NO：1)而确定的，在位置131引入等价突变的里氏木霉木聚糖酶I(TrX I)的修饰，需要在TrX-I的位置118的突变(即突变T118N)。在这种情况下，具有T118N取代的里氏木霉木聚糖酶I，包含如TrX II中所示X131N的等价突变(参见图1“Tr1”和“Tr2”的比对结果)。同样地，通过比较TrX-11序列而确定的，在位置131引入等价突变的变铅青链霉菌木聚糖酶C的修饰，需要在变铅青链霉菌木聚糖酶C的位置128的突变(即突变T128N)。在这种情况下，在变铅青链霉菌木聚糖酶C中的木聚糖酶T128N，包含如TrXII中所示X131N的等价突变(参见图1“S1C”和“Tr2”的比对结果)。
根据术语“木聚糖酶”，指的是将木聚糖水解成木糖的酶。正如本领域技术人员已知的，木聚糖酶可具有不同的性质，包括结构(分子量、三维取向、氨基酸组成以及活性部位)和催化活性(木聚糖水解的速率和动力学性质，以及能作用于其它底物)。
本发明修饰木聚糖酶可衍生于天然的或野生型木聚糖酶，或者可衍生于已经发生改变的木聚糖酶，其中使用本领域技术人员已知的标准方法例如定点诱变、化学诱变或等价方法，对所述的木聚糖酶进行诱变处理和选择或进行遗传工程构建，来改变其pH性质、温度特性、底物特异性或其组合。所述发生变化的木聚糖酶实例包括本文所公开的实例，例如但不限于HTX18和HTX18-R135Y。发生改变的或遗传工程构建的、也可如本文所述进行进一步修饰的木聚糖酶的额外实例，包括本领域技术人员已知的实例，例如包括但不限于在WO 00/29587、WO 01/92487和WO 03/046169(在此引用作为参考)中公开的实例，以及包括但不限于：TrX-DS1、TrX-162H-DS1、TrX-162H-DS2、TrX-162H-DS4、TrX-162H-DS8、TrX-75A、TrX-HML-105H、TrX-HML-75A-105H、TrX-HML-75C-105R、TrX-HML-75G-105R、TrX-HML-75G-105R-125A-129E、TrX-HML-75G-105H-125A-129E、TrX-HML-75A-105H-125A-129E、TrX-HML-75A-105R-125A-129E、TrX-157D-161R-162H-165H、TrX-HML-AHAE、TrX-HML-AHAE-R、TrX-HML-AHAE-RR、TrX-HML-AHAE-RRR、TrX-HML-AHA-RR-DRHH、TrX-HML-AHAE-RR-DRHH、TrX-HML-AHAE-RRR-DRHH、TrX-116G、 TrX-118C、TrX-HML-AHCAE-R、TrX-H-11D-ML-AHGAE-RR、TrX-HML-AHGAE-R、TrX-H-11D-ML-AHGCAE-RR、TrX-H-11D-ML-AHCAE-RR。
天然木聚糖酶或野生型木聚糖酶是未发生自然过程以外的修饰或改变的木聚糖酶。天然木聚糖酶可包含天然发生的突变。
“里氏木霉木聚糖酶II的序列比对”或“TrX编号”，指的是与基于里氏木霉木聚糖酶II(也称为TrXII；参见表1，Tr2；图1；以及SEQ ID NO：1)的氨基酸序列的氨基酸位置有关的编号。TrX II是家族11木聚糖酶的成员。家族11木聚糖酶显示明显的序列相似性程度(参见图1)，因此，通过直线对准氨基酸来优化木聚糖酶之间的序列相似性和通过使用TrX II的氨基酸编号来作为编号基础，可测定涉及TrX II的其它木聚糖酶内部的氨基酸位置。
结构研究表明，来自细菌和真菌来源的家族11木聚糖酶共有相同的总体分子结构(如U.S.5,405,769)，即展现三种二级结构：β-折叠、卷曲以及α单螺旋。如果木聚糖酶与其它家族11木聚糖酶具有相似性，特别是在作为催化残基的、位置86和位置177(基于里氏木霉木聚糖酶II(TrXII)的氨基酸编号)的两个谷氨酸残基，那么该木聚糖酶可归为“家族11木聚糖酶”类型。家族11木聚糖酶包括表1中所列出的酶。优选地，木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶I、绿木霉木聚糖酶、变铅青链霉菌木聚糖酶B、变铅青链霉菌木聚糖酶C，或来自曲霉、镰孢菌或杆菌属的木聚糖酶。
表1.来自细菌和真菌的典型家族11木聚糖酶
微生物 木聚糖酶 序列号 Swiss Prot No
| 黑曲酶(Aspergillus niger) | SEQ ID NO：43 | - | |
| 泡盛曲霉kawachi变种 (Aspergillus awamori var.kawachi) | Xyn B | SEQ ID NO：28 | P48824 |
| 川地曲霉(Aspergillus kawachii) | Xyn C | SEQ ID NO：44 | - |
| 塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis) | Xyn A | SEQ ID NO：29 | - |
| 环状芽孢杆菌(Bacillus circulans) | Xyn A | SEQ ID NO：30 | P09850 |
| 短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) | Xyn A | SEQ ID NO：31 | P00694 |
| 枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis) | Xyn A | SEQ ID NO：32 | P18429 |
| 粪堆纤维单胞菌属(Cellulomonas fimi) | Xyn D | P54865 | |
| 钦氏菌属(Chainia spp) | Xyn | - | |
| 丙酮丁醇棱菌(Clostridium acetobutylicum) | Xyn B | SEQ ID NO：33 | - |
| 粪堆梭菌(Clostridium stercorarium) | Xyn A | SEQ ID NO：34 | P33558 |
| 产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes) | Xyn II | SEQ ID NO：45 | - |
| Neocallimasterix patriciarum | Xyn A | - | P29127 |
| 达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei) | Xyn II | - | - |
| 产黄瘤胃球菌属(Ruminococcus flavefaciens) | Xyn A | SEQ ID NO：35 | P29126 |
| 裂褶菌属(Schizophyllum commune) | Xyn A | SEQ ID NO：36 | P35809 |
| 链霉菌属No.36a(Streptomyces sp.) | Xyn | SEQ ID NO：37 | - |
| 变铅青链霉菌(Streptomyces lividans) | Xyn B | SEQ ID NO：38 | P26515 |
| 变铅青链霉菌(Streptomyces lividans) | Xyn C | SEQIDNO：39 | P26220 |
| Streptomyces thermoviolaceus | Xyn II | - | - |
| 褐色热单孢菌(Thermomonospora fusca) | Xyn A | SEQ ID NO：40 | - |
| 疏绵状嗜热霉菌(Thermomyces lanuginosus) | Xyn A | SEQ ID NO：46 | O43097 |
| 哈茨木霉属(Trichoderma harzianum) | Xyn | SEQ ID NO：41 | P48793 |
| 里氏木霉(Trichoderma reesei) | Xyn I | SEQ ID NO：2 | P36218 |
| 里氏木霉(Trichoderma reesei) | Xyn II | SEQ ID NO：1 | P36217 |
| 绿木霉属(Trichoderma viride) | Xyn | SEQ ID NO：42 | - |
当与自其制备或衍生出本发明的修饰型木聚糖酶的木聚糖酶相比，本发明的修饰型木聚糖酶是通过遗传工程化以引入或包含改变的糖基化位点的任何木聚糖酶。
所述修饰的非限制性实例包括X34N、X34N-S36T、X131N、X180N、X180N-S182T、X182N或X182N-S184T(TrX编号)、或其组合。优选地，修饰型木聚糖酶是家族11木聚糖酶。本发明修饰型木聚糖酶包括里氏木霉木聚糖酶I或II，或变铅青链霉菌木聚糖酶B或C。通常认为可对天然木聚糖酶的氨基酸序列进行加尾，来改变其生物化学或生物物理学性质。本发明修饰型木聚糖酶实例包含通过比较目的木聚糖酶序列与TrX II序列(SEQ ID NO：1)而确定的X131N突变或其等价物，以及包括其它修饰，如涉及相应天然木聚糖酶的取代或缺失。表2显示一些并不是用于限制的修饰型木聚糖酶的实例。
位置131的天冬酰胺取代以及在家族11木聚糖酶中是高度保守的位置133的Thr/Ser取代，产生N-糖基化基序形成物：Asn-Xaa-Thr/Ser。已经观测到包含131N突变的木聚糖酶带来木聚糖酶的产量增加。并不期望受到理论限制，当与没有131N修饰的天然木聚糖酶相比，引入N-糖基化基序可使修饰型木聚糖酶提高表达效率、减少降解、增加分泌或其组合。与对应的天然家族11木聚糖酶相比，修饰型木聚糖酶可显示提高从里氏木霉宿主菌株中的表达，并显示相似的生物化学和生物物理学性质。也可在木聚糖酶中接近保守Thr/Ser的其它位置制备相似的突变，例如但不限于X34N、X180N和X182N(依次为ITX2、ITX3和ITX4；参见表2)，以便制备Asn-Xaa-Thr/Ser序列。在这些位置的每一个位置中，氨基酸Ser是保守的，并且折叠蛋白的3-D模型显示这些位置位于蛋白的外表面上。可获得的另外修饰包括X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T(依次为ITX5′、ITX3′和ITX4′)来产生糖基化基序Asn-Xaa-Thr。
本领域技术人员清楚：通过许多方法例如改变木聚糖酶一级肽序列的定点诱变法或随机诱变法，可进行氨基酸取代来制备共有序列N-糖基化基序。任何合适的方法均可用于将X34N、X131N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T突变引入木聚糖酶基因家族。例如，通过直接取代木聚糖酶一级序列中的一个或多个密码子而不是加入编码N-糖基化基序的额外核苷酸，来引入N-糖基化基序，从而提高宿主的木聚糖酶产量而无需改变酶的生物物理学和生物化学的性能。
“直接取代”指的是通过在木聚糖酶编码区内部引入特定的核苷酸 改变来引入糖基化位点，从而改变一级肽序列而无需由于插入或缺失一个或多个氨基酸而改变序列长度。
如实施例11所示，并参照图5和图6，包含T131N突变以及具有相似于HTX18(参见表2；ITX1没有Y135R突变)的其它突变的ITX1木聚糖酶，具有相似于HTX18木聚糖酶的pH和温度活性特征。因此，T131N突变的插入不改变木聚糖酶的生物物理学和生物化学性质。此外，如实施例9和10的表3和4所示，当与HTX18或HTX18(R135Y)相比时，制备具有提高约73％-100％表达效率的ITX1酶。
表2：修饰型木聚糖酶的实例
| TrX-HML | 具有N10H、Y27M和N29L的TrX(参见U.S.5,759,840) |
| HTX13 | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E的TrX |
| HTX18 | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、Y135R、H144R、 N157D、Q161R、Q162H以及T165H的TrX |
| ITX1 | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、T131N、H144R、 N157D、Q161R、Q162H以及T165H的TrX |
| ITX2 | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、T131N、Y135R、 H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H的TrX |
| ITX3 | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、 Q161R、Q162H、T165H以及F180N的TrX |
| ITX3′ | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、 Q161R、Q162H、T165H、F180N以及S182T的TrX |
| ITX4 | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、 Q161R、Q162H、T165H以及S182N的TrX |
| ITX4′ | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、 Q161R、Q162H、T165H、S182N以及S184T的TrX |
| ITX5 | 具有N10H、Y27M、N29L、Q34N、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、 N157D、Q161R、Q162H以及T165H的TrX |
| ITX5′ | 具有N10H、Y27M、N29L、Q34N、S36T、S75A、L105H、Q125A、I129E、 H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H的TrX |
| HTX18-135Y | 具有N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、 |
| Q161R、Q162H以及Q165R的TrX | |
| Xln1(131N) | 具有突变T118N的里氏木霉木聚糖酶I |
| 变铅青链霉菌 xlnC(131N) | 具有突变T128N的变铅青链霉菌木聚糖酶C |
| Q161R、Q162H以及T165H的TrX | |
| Xln1(131N) | 具有突变T118N的里氏木霉木聚糖酶I |
| 变铅青链霉菌 xlnC(131N) | 具有突变T128N的变铅青链霉菌木聚糖酶C |
“表达效率”是通过生产宿主而产生的活性酶的量或酶的活性。所有发酵条件保持恒定时，计算发酵培养物的每单位体积产生的活性酶的量或酶的活性来作为表达效率。如果所制备第一种木聚糖酶的水平高于在相同发酵条件下通过相同宿主制备的第二种木聚糖酶，那么认为第一种木聚糖酶具有高于第二种木聚糖酶的表达效率。例如，如果与在相同发酵条件下通过相同宿主制备的第二种木聚糖酶相比，所制备的第一种木聚糖酶的量增加约40％至约2500％，或高于在此之间的数值，那么第一种木聚糖酶的表达效率大于第二种木聚糖酶的表达效率。例如，与在相同发酵条件下通过相同宿主制备的第二种木聚糖酶相比，制备的第一种木聚糖酶的量增加40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1250、1500、1750、2000、2250、或2500％，或在此之间的数值。优选地，与在相同发酵条件下通过相同宿主制备的第二种木聚糖酶相比，制备的第一种木聚糖酶的量至少增加50％。
“可操纵地连接”指的是特殊序列相互作用，来直接或间接地实施预定功能，例如基因表达的干涉或调控。例如，通过对可操纵地连接的序列有影响的蛋白来干涉可操纵地连接的序列的相互作用。
“木聚糖酶基因”指的是包含编码木聚糖酶序列的DNA区。木聚糖酶基因可编码天然的或修饰型木聚糖酶。木聚糖酶基因另外包含启动子、分泌信号、编码区和转录终止子。
“木聚糖酶遗传构建体”指包含产生和分泌天然的或修饰型木聚糖酶 所必需的元件的核酸序列。优选地，优化木聚糖酶遗传构建体来允许从合适的生产宿主进行表达，例如但不限于自里氏木霉宿主种生产。这些成分包括：
木聚糖酶编码区
木聚糖酶编码区包含编码分离自细胞外培养物滤液的功能性木聚糖酶所必需的DNA序列。木聚糖酶编码区由编码天然木聚糖酶的序列、编码预先进行工程构建的突变木聚糖酶序列和编码前述修饰型木聚糖酶序列及其组合而组成。修饰型木聚糖酶编码区包括X34N、X131N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T或X182N-S184T突变(TrX II编号)，但不包括氨基末端的分泌信号。木聚糖酶编码区来自预先进行改造的家族11木聚糖酶基因(参见以上提供的非限制性实例，例如但不限于在WO00/29587、WO 01/92487和WO 03/046169中公开的实例；在此引用作为参考)，或来自天然家族11木聚糖酶，例如来自木霉属或链霉菌属基因，例如但不是用于限制，本发明修饰型木聚糖酶编码区可来自木霉属xln2、里氏木霉xln2或变铅青链霉菌xlnC的天然或工程构建的编码区。
如本领域技术人员所理解的，通过置换、取代、插入或删除一个或多个核苷酸而不改变其功能，可改造或工程构建天然编码区。本发明的实施并不限于对木聚糖酶编码区进行所述的改造。
分泌信号
“分泌信号”是存在于分泌蛋白质内部的肽序列，通常位于分泌蛋白质的氨基末端，它可指导蛋白质进入内质网(ER)；随后通过信号肽酶可从成熟的分泌蛋白质切除分泌信号。
本发明修饰型木聚糖酶基因的编码区可以可操纵地连接于编码任何分泌信号的DNA序列(即，以可将转录序列定向于ER的方式进行连接)，其中所述的分泌信号在期望的生产宿主(例如但不限于Trichoderrma)中是 起作用的，例如，木聚糖酶分泌信号可来自任何分泌的木霉属蛋白质，例如来自木霉属木聚糖酶或来自另外的真菌或细菌蛋白质。不是出于限制目的，分泌信号可来自里氏木霉木聚糖酶I(Xln1)基因或木聚糖酶(xln2)基因。
本领域技术人员可清楚：通过置换、取代、插入或删除一个或多个核苷酸而不改变其分泌信号功能，可修饰天然的分泌信号本发明的实施并不限于对分泌信号进行所述的改造。
启动子
本发明的实施并不限于在遗传构建体中选择启动子。优选在生产宿主中起作用的启动子。启动子可操纵地连接于修饰型木聚糖酶基因编码区或可操纵地连接于分泌信号，使得启动子分别控制编码区、或分泌信号和编码区的表达，其中所述的分泌信号可操纵地连接于修饰型木聚糖酶基因的编码区。不出于限制于任何方式的目的，用于实施本发明的优选启动子包括木霉属cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、Xln1和xln2启动子，或者两个或多于上述两个启动子的组合。
本领域技术人员可清楚：通过置换、取代、插入或删除一个或多个核苷酸而不改变其启动子功能，可修饰天然的启动子。本发明的实施并不限于对启动子进行所述的改造。
在分泌信号和成熟木聚糖酶编码区之间的额外序列
木聚糖酶遗传构建体包含可编码分泌信号和木聚糖酶编码区或如文中所述的修饰型木聚糖酶编码区之间的额外氨基酸的额外序列。这些天然或人工的序列，可编码构建体编码的分泌信号所对应的成熟蛋白质的一个或多个氨基酸，或者在连接分泌信号编码序列和修饰型木聚糖酶编码区所必需的限制酶位点进行插入，可获得这些序列。本发明的实施并不限于在分泌信号编码序列和成熟木聚糖酶编码区之间存在的额外DNA 序列
其它元件
如本领域技术人员所知，木聚糖酶遗传构建体包含在生产宿主中起作用的转录终止子，转录终止子直接位于木聚糖酶编码区的下游。本发明的实施并不限于选择可有效指导生产宿主中RNA聚合酶转录的终止的转录终止子。如实施例5.1-5.4所述，并不是限制于任何方式的转录终止子实例，包含直至木霉属cbh2基因终止密码子的1.9kb DNA 3′。
木聚糖酶遗传构建体包含用于测定转化生产宿主的选择标记，选择标记可存在于相同质粒载体上、遗传构建体的上游或下游(即，在构建体的5′或3′端)，或者选择标记可与构建体在一个质粒载体上进行共转化。
对于本领域技术人员而言，选择标记的选择是众所周知的，包括赋予转化细胞能利用通常不能被微生物代谢的代谢物能力(如，编码乙酰胺酶并赋予能在作为唯一氮源的乙酰胺上生长能力的A.nidulans amdS基因)或抗生素抗性(如，编码潮霉素-β-磷酸转移酶并赋予潮霉素抗性的Escherichia coli hph基因)的基因(人工的或天然的)。如果宿主菌株缺乏选择标记的功能基因，那么那些基因可以作为标记。所述标记的实例包括trp、pyr4、pyrG、argB、leu等等。因此相应宿主菌株毫无疑问缺乏选择标记相对应的功能基因，即缺乏trp、pyr、arg、leu等等的表达。在实施例5.1中描述了用于遗传构建体的选择标记的非限制性实施例。在该实施例中，选择标记是利用木霉属磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子进行表达的大肠杆菌hph基因。在实施例5.2中描述了另外的选择标记，其包含依赖其天然启动子表达的粗糙链孢霉(Neurospora crassa)pyr4基因。
本发明提供表达在木聚糖酶中引入或改变糖基化位点的修饰型木聚糖酶的遗传构建体和遗传修饰的生产宿主，例如木霉属菌株。包含引入糖基化位点的修饰型木聚糖酶的非限制性实例，包括一个或多个选自X34N、X131N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T或 X182N-S184T突变(TrXII编号)。
本发明的修饰型木聚糖酶遗传构建体并不限于制备构建体的以下方法，所述方法包括但不限于标准分子生物学技术，例如通过碱裂解从大肠杆菌分离质粒DNA、用限制性核酸内切酶消化质粒DNA、通过琼脂糖凝胶电泳分开和分离DNA片段、用T4DNA连接酶连接DNA片段、通过聚合酶链式反应在DNA片段末端插入稀有限制性酶切位点、或用T4DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段来加入寡核苷酸接头和补平DNA片段。在实施例1-5中描述了所述的方法。
在本发明另外的方面中，将修饰型木聚糖酶遗传构建体导入并在期望微生物(生产)宿主中表达。优选地，提高来自所得重组微生物的修饰型木聚糖酶的表达效率。例如，与由相应遗传构建体所产生的相应家族11木聚糖酶的表达效率相比，上述表达效率至少增加40％或更多，其中所述的构建体来自在根据相似发酵条件下生长的相同微生物宿主中可衍生或生产修饰型木聚糖酶的构建体。例如，与在相同发酵条件下由相同宿主生产的第二种木聚糖酶相比，第一种木聚糖酶的产量增加40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、425、450、474、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1250、1300、1500、1750、2000、2250或2500％，或者多于在此之间的任何数值。优选地，与在相同发酵条件下由相同宿主生产的第二种木聚糖酶相比，第一种木聚糖酶的产量至少增加50％(参见实施例9和10)。
本发明现有的实施方面并不限于将木聚糖酶遗传构建体导入微生物宿主(生产宿主)的方法。本领域技术人员熟悉将DNA构建体导入生产宿主的方法，这包括但不限于，氯化钙处理细菌细胞或真菌原生质体来弱化细胞膜、加入聚乙二醇融合细胞膜、通过电穿孔法去极化细胞膜、或通过用基因枪微弹轰击使DNA穿过细胞壁和细胞膜。
生产宿主是木霉属成员(在不同时期已经进行分类，如绿木霉、长枝木霉(T.longibrachiatum)和最近的红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))。参见Simmons(1977)、Bissett(1984)、Cannon(1986)、Kuhls等(1996)。这些菌种是很适合的，因为它们可生产家族11木聚糖酶。另外，已经公开了用于将DNA构建体导入纤维素酶木霉属生产菌株的方法(Lorito等，1993；Goldman等，1990；Penttila等，1987)。
实施例7.1描述了一种利用微弹枪将木聚糖酶遗传构建体导入木霉属孢子的方法
实施例7.2描述了一种利用聚乙二醇和氯化钙处理而将木聚糖酶遗传构建体导入木霉属原生质体的方法。
表达效率的提高，例如对天然木聚糖酶家族增加50％表达效率，反映远远超过菌株的天然变化率并具有商业意义的显著性增加。结果表明，通过该方法提高木聚糖酶产量的程度，可高达2倍并达到10倍。如实施例8所述，通过培育培养物和测量木聚糖酶活性，测量木聚糖酶产量的提高程度。
本领域技术人员理解：酶混合物的特异木聚糖酶活性(以IU/mg蛋白)随着酶混合物中纤维素酶含量和其它蛋白含量的减少而增加。通过物理分离和机械分离酶混合物来从混合物除去纤维素酶和其它蛋白，或通过来自生产宿主的重组工具来缺失纤维素酶基因或其它基因，以便减少或清除纤维素酶或其它蛋白的表达。所述的方法对生产宿主的木聚糖酶实际产量几乎没有影响。
如本文概括的，木聚糖酶和修饰型木聚糖酶，可用于漂白纸浆的目的或其它通常需要在温度和pH的活性超过野生型酶的其它应用。为了生物漂白纸浆，通常使用来自被列入家族11中的木聚糖酶(参见表1)。天然木聚糖酶蛋白中可发现如本文所述的修饰；当在候选的(非天然的)生产宿主中表达时，这些天然的木聚糖酶可显示如本文所述的期望特征，并归入本发明中。
发明的实施并不限于修饰木聚糖酶的工业应用。据本发明所生产的木聚糖酶的工业应用，包括但不限于食品加工，例如禽类或猪饲料添加剂的烘焙或酿造；或工业加工，例如生产纸浆和纸张。
下是本发明中所公开序列的概要(SEQ ID NO：28至45涉及所列出生物体的木聚糖酶，参见表2更多细节)：
在以下实施例中进一步举例说明本发明。
实施例
实施例1描述从里氏木霉菌株M2C38及其遗传修饰的衍生物中分离基因组DNA。施例2-5描述构建基因组DNA文库、克隆各种基因、修饰木聚糖酶基因序列，及修饰一些用于表达来自里氏木霉菌株RutC30和M2C38的修饰型木聚糖酶的遗传构建体。施例7-10描述在里氏木霉菌株RutC30和M2C38中转化和表达木聚糖酶遗传构建体。实施例11和实施例12描述修饰的和天然的木聚糖酶的生物化学特征。
实施例1：里氏木霉基因组DNA的分离和里氏木霉基因组文库的构建库
里氏木霉菌株M2C38是Iogen公司从里氏木霉RutC30(ATCC_#56765；Montenecourt和Eveleigh，1979)中衍生的专有菌株，而RutC30是从里氏木霉Qm6A(ATCC#_13631；Mandels和Reese，1957)依次衍生而来。本领域技术人员熟知：本文所述来自这些菌株的遗传构建体、在这些菌株中表达遗传构建体的方法，都适于所有来源于Qm6A的木霉属菌株。
为了分离基因组DNA，通过无菌接种环将从马铃薯葡萄糖琼脂平板中收集的里氏木霉孢子接种50ml马铃薯葡萄糖肉汤(Difco)。培养物以200rpm在28℃振荡温育2-3天。在GFA玻璃微纤维滤纸(Whatman)上过滤菌丝体，并用冷去离子水洗涤。在液氮中冰冻真菌块，并用预冷的研钵和研棒磨成粉末；将0.5g粉末生物量重悬浮于5ml的添加了1％十二烷基硫酸钠(SDS)的100mM Tris、50mM EDTA(pH7.5)中。离心裂解物(在4℃以5000g离心20分钟)以除去细胞碎片沉淀。用1体积苯酚饱和的缓冲液(10mMTris、1 mMEDTA，pH8.0)抽提上清，随即用1体积苯酚饱和的缓冲液∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)进行抽提以便除去可溶的蛋白。通过加入0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5体积的95％冰乙醇，从溶液中沉淀 DNA。在-20℃温育至少1h后，离心沉淀DNA(在4℃以5000g离心20分钟)，用10ml的70％乙醇洗涤，干燥后重悬浮在1ml 10mM Tris、1mMEDTA(pH8.0)。加入直至终浓度0.1mg/ml的核糖核酸酶A(BoehringerMannheim)并在37℃1小时，来消化RNA。用1体积苯酚饱和的缓冲液和1体积苯酚饱和的缓冲液∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)相继抽提上清，用于除去DNA溶液的核糖核酸酶。用0.1体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5体积的95％冰乙醇再次沉淀DNA、离心沉淀、用70％乙醇洗涤、干燥并重悬浮于50μl的10mM Tris、1mM EDTA(pH8.0)。通过在260nm测量溶液的吸光度，来测定DNA浓度(p.Cl in Sambrook等，1989)。
使用分离自里氏木霉菌株M2C38的基因组DNA，构建两种质粒文库和一种噬菌体文库。根据以下步骤在载体pUC119(Viera和Messing，1987)中构建质粒文库：将10μg基因组DNA在100μl体积的含2单位/ug的HindIII、BamHI或EcoRl限制性内切酶中于37℃消化20小时。消化的DNA在0.75％琼脂糖凝胶上通过0.04M Tris-醋酸盐、1mM EDTA进行电泳分离，并用溴化乙啶染色。切下目的基因大小相对应的胶片并进行电洗脱来复性DNA片段(Sambrook等，pp.6.28-6.29)。通过在包含20-50μg/mlDNA(以载体：插入DNA＝2∶1的摩尔比率)、1mMATP和5单位T4DNA连接酶的10-15μl总体积中，于4℃进行连接16h，将这些DNA富集部分连接到pUC119以便构建基因文库。使用Cell Porator系统(Gibco/BRL)并根据制造商的方法，将连接反应产物电穿孔大肠杆菌株HB101，并在含70μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上筛选转化子。
在λ载体DASH(stratagene，Inc.)中根据以下步骤构建噬菌体文库：用2、1、0.5和0.5单位/μg的Bam HI在37℃消化基因组DNA(3μg)1小时，来产生9-23kB大小的片段。用1体积Tris饱和的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提、随即用10μl的3M醋酸钠(pH5.2)和250μl的95％乙醇(-20℃)沉淀，来纯化来自各个消化产物的DNA。通过微离心沉淀消化的DNA、用0.5毫升70％冰乙醇洗涤、干燥并重悬浮10μl无菌去离子 水。通过琼脂糖凝胶电泳(0.04MTris-醋酸盐、1mM EDTA的0.8％琼脂糖)确定的9-23kB大小的富集DNA片段。在总体积5μl的反应体系(包含2单位DNA连接酶和1mMATP，4℃过夜)中，将消化的DNA(0.4μg)连接到用BamHI(Stratagene)预消化的1μgDASH臂上。根据制造商的方法，使用 
II Gold提取盒(Stratagene)将连接混合物组装入噬菌体粒子中。使用大肠杆菌宿主菌株XLl-Blue MRA(P2)滴定测定文库，并得到含有3×105单个克隆。
实施例2：从里氏木霉M2C38文库分离基因组克隆
2.1来自pUC119文库的细胞纤维二糖水解酶I(cbh1)和纤维二糖水解酶II(cbh2)基因
通过菌落转移杂交(colony lift hybridization)来鉴定含有来自重组体pUC119-BamHI或-EcoRI文库的cbh1或cbh2克隆的大肠杆菌HB101转化体：将1-3X104菌落转移到HyBondTM尼龙膜(Amersham)上；将菌落面向上的膜在用0.5M NaOH、1M NaC1饱和的吸滤纸(VWR 238)上放置5分钟来裂解细菌细胞并变性DNA；然后通过将菌落面向上的膜在用添加了1M NaCl的1.5M Tris(pH7.5)饱和的吸滤纸(VWR 238)上放置5分钟来中和膜；将膜晾干30分钟，然后通过在80℃烘干2h将DNA固定在膜上。
在总体积20μ的标记反应体系中(包含10-50ng靶DNA、0.2mM各种d(GCT)TP、0.5μMdATP、20-40μCi的α-32P-dATP、10pmole寡核苷酸引物和0.5单位Taq聚合酶)，通过从BamBl或EcoRI酶切的片段富集库分别PCR扩增cbh1和cbh2编码区的短片段(0.7-1.5kB)，制备32P标记的探针。反应进行6-7个扩增循环(95℃为2分钟；56℃为1.5分钟；70℃为5分钟)。通过加入0.5ml的10％(w/v)三氯乙酸和0.5mg酵母tRNA，沉淀所扩增的、32p标记DNA。通过微离心沉淀DNA，用1ml的70％乙醇洗液两次、干燥并重悬浮于1M Tris(pH7.5)、1mM EDTA中。
已经将重组pUC119质粒固定在上面的尼龙膜置于含有1M NaCl、1％SDS、50mM Tris、1mM EDTA(pH 7.5)连同100μg/ml变性的剪切鲑鱼精子DNA的热密封袋中，于60-65℃进行预杂交1h。在含有相同缓冲液但仅是50μg/ml变性剪断的鲑鱼精子DNA和5×106-5×107cpm变性bgll、cbh1或cbh2探针的热密封袋中，于60-65℃杂交16-20h。用1MNaCl、0.5％SDS将膜在60℃洗涤一次(15分钟)，用0.3M NaCl、0.5％SDS在60℃洗涤两次(15分钟/每次)以及用0.03M NaCl、0.5％SDS在55℃洗涤一次(15分钟)。将膜再次放入热密封袋中，并在柯达RP X射线底片上于-70℃曝光16-48h。根据制造商的方法，显影X射线底片。挑选产生强或弱信号的菌落，并培养在补充70pg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中。使用碱裂解法(Sambrook等，pp.1.25-1.28)从这些培养物分离质粒DNA，并通过限制性酶切、Southem杂交(Sambrook等，pp.9.38-9.44)以及PCR(Sambrook等，pp.14.18-14.19)进行分析。
使用0.7kb cbh1探针，通过对pUC119-BamHl酶切的文库进行菌落转移杂交，鉴定携带cbh1基因的克隆，其中用设计成能扩增公开cbh1序列的597-1361bp片段(Shoemaker等，1983)的寡核苷酸引物制备探针。分离包含相当于启动子(4.7kb)和1kb cbh1结构基因(2.3kb)的5.7kb BamHl片段的cbh1克隆，pCOR132。由此，将包含cbh1启动子(2.1kb)和cbh1编码区5端(0.4kb)的2.5kb EcoRl片段亚克隆入pUC119中，来生成pCB152。使用1.5kb cbh2探针，通过对pUC119-EcoRl酶切的文库进行菌落转移杂交，鉴定携带cbh2基因的克隆，其中用设计成能扩增公开cbh2序列的580-2114bp片段(Chen等，1987)的寡核苷酸引物制备探针。分离包含相当于启动子(600bp)和结构基因(2.3kb)以及终止子(1.9kb)的4.8kbEcoR1片段的cbh2克隆，pZUK600。
2.1从λDASH文库克隆cbh1终止子、木聚糖酶H(xln2)基因以及磷酸甘油酸激酶启动子(pgkp)
使用DIG标记和检测试剂盒(Boehringer Mannheim)并根据制造商的方法，通过随机引物标记法来PCR扩增cbh1、xln2以及pgk基因的编码区，制备地高辛-11-dUTP标记探针。通过λDASH文库的噬菌斑转移杂交法，鉴定包含cbh1、xln2以及pgk基因的基因组克隆。对于每个目的基因，将1x104克隆转移到Nytran(Schleicher和Schull)尼龙膜上。通过将噬菌斑面向上的膜在用0.5M NaOH、1M NaCl饱和的吸滤纸(VWR238)上放置5分钟，裂解噬菌体颗粒和变性噬菌体DNA；然后通过将噬菌斑面向上的膜在用添加1M NaCl的1.5M Tris(pH7.5)饱和的吸滤纸上放置5分钟，来中和膜；将膜干燥30分钟，然后通过在80℃烘干2h，将DNA固定在膜上。将膜在含有6X SSPE、5X Denhardt、1％SDS加上100μg/ml变性的剪断鲑鱼精子DNA的热密封袋中于65℃预杂交2h。然后，将膜置于含有相同溶液但含50μg/ml变性、剪断的鲑鱼精子DNA和0.5μg地高辛-dUTP标记探针的热密封袋中，于65℃过夜杂交。在2X SSPE、0.1％SDS中于室温洗膜两次(15分钟)，在0.2X SSPE、0.1％SDS中于65℃洗膜两次(15分钟)以及在2X SSPE中洗膜一次(5分钟)。根据制造商的方法，通过抗地高辛/碱性磷酸酶抗体缀合物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐和4-硝基四氨唑蓝氯化物(Boehringer Mannheim)进行反应，来鉴定阳性杂交克隆。通过用地高辛-dUTP标记探针的第二轮筛选，进一步纯化阳性杂交克隆。
如Sambrook等(1989，pp.2.118-2.121)所述，通过用1体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)和1体积氯仿∶异戊醇(24∶1)替代CsCl梯度步骤的排除法(exception)，分离单个克隆和纯化噬菌体DNA。用0.1体积3M醋酸钠(pH5.2)和2.5体积95％冰乙醇，沉淀DNA。用0.5毫升70％冰乙醇洗涤噬菌体DNA沉淀物，干燥并重悬浮于50μl10mM Tris、1mM EDTA(pH8.0)中。使用用于筛选λDASH文库的地高辛-dUTP标记的相同探针，通过限制性消化纯化的噬菌体DNA和进行Southern印迹杂交法(Sambrook等，pp.9.38-9.44)，鉴定包含目的基因的限制性片段。通过用于噬菌斑转移的相同方法，进行杂交膜并目测阳性杂交片段。一旦从每个λDASH克隆鉴定期望的限制性片段，重复限制性消化，并将片段在TAE的0.8％琼脂糖凝胶上跑胶，并切下期望的胶带。根据制造商的方法，使用SephaglasBandPrep试剂盒(Pharmacia)从胶片洗脱DNA。
用包含公开cbh1序列的45-2220bp(Shoemaker等)的acbh1探针，通过λDASH文库(实施例2)的菌落转移杂交，鉴定携带cbh1基因的克隆。通过对来自λDASH cbh1克隆纯化的噬菌体DNA进行限制性消化，分离包含cbh1编码区3′端(0.5kb)和cbh1终止子(1.3kb)的1.8kb BamHI片段。将这些片段亚克隆入大肠杆菌质粒载体pUC119的BamHI位点，来生成质粒pCBlTa。用包含公开xln2序列的100-783bp(Saarelainen等，1993)，通过λDASH文库的菌落转移杂交，鉴定携带xln2基因的克隆。通过对从λDASH xln2克隆纯化的噬菌体DNA进行限制性消化，分离包含xln2基因的启动子(2.3kb)、编码区(0.8kb)和终止子(2.6kb)的5.7kb Kpnl片段。将这些片段亚克隆入pUC119的Kpnl位点，来生成质粒pXYN2K-2。用包含公开pgk序列的4-1586bp(Vanhanen等，1989)，通过λDASH文库(实施例2)的菌落转移杂交，鉴定携带pgk基因的克隆。通过对从λDASH pgk克隆纯化的噬菌体DNA进行限制性消化，分离包含pgk基因的启动子(2.9kb)、编码区(1.6kb)和终止子(0.5kb)的5.0kb EcoR1片段。将这些片段亚克隆入pUC119的EcoR1位点，来生成质粒pGK5.0。
实施例3：里氏木霉木聚糖酶I和变铅青链霉菌木聚糖酶C基因的克隆和修饰
使用可将NheI位点和KpnI位点分别引入编码序列上、下游的引物，从分离自变铅青链霉菌的基因组DNA中，扩增木聚糖酶C(xylc；SEQ IDNO：39)。巨型引物(megaprimer)PCR用于将T128N突变引入xylC。诱变引物联合反向引物用于将KpnI位点引入下游。分离所得的PCR产物，并作为反向引物连同正向引物来将NheI位点引入上游。SEQ ID NO：48显示了修饰的变铅青链霉菌木聚糖酶C的序列。引物序列如下所示：
T128N：CCCTCCGTGGAAGGCAACAAGACCTTCCAG(SEQ ID NO：15)
XynC-5F(Nhe)：GCCCACGCCGCTAGCACCATCACC(SEQ ID NO：16)
XynC-3R(Kpn)：CGTCCACCGGTACCAGGTCAACC(SEQ ID NO：17)
使用可将NheI位点和BamHI位点分别引入编码序列上、下游的引物，从分离自里氏木霉株M2C38分离的基因组DNA中，扩增编码木聚糖酶I的基因(xynI，SEQ ID NO：2)。巨型引物PCR用于将T118N突变引入xynI诱变引物联合反向引物用于将BamHI位点引入下游。分离所得的PCR产物，并作为反向引物连同正向引物来将NheI位点引入上游。SEQ ID NO：47显示了修饰的里氏木霉的木聚糖酶C的序列。如下所示引物序列：
T118N：CCATCCAGGG CAACGCGACC TTC(SEQ ID NO：18)
XynI-F：CGTCGTGCTA GCATCAACTA CGAC(SEQ ID NO：19)
XynI-R(BamHI)：GGATCCTAGT TGCTGACAC (SEQ ID NO：20)
在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：39中，分别显示了由实施例5.4和5.5中所述的遗传构建体编码的天然型、未修饰型里氏木霉木聚糖酶I和变铅青链霉菌木聚糖酶C的氨基酸序列。
实施例4：诱变里氏木霉木聚糖酶II来产生变体HTX18、ITX1-、ITX3′-5′、HTX18(R135Y)
4.1突变N10H、Y27M、N29L的引入：
通过盒式诱变人工xln2基因(Sung等，1995；也参见WO 01/92487和WO 03/046169；在此引用作为参考)，从M2C38菌株遗传工程构建xln2基因。具体地说，体外合成包含密码子8-33的双链ApaI/PinAI片段，其中如SEQ ID：2所示，改造密码子10、27和29。然后这些片段用于取代质粒pUC/Xln中的天然xln2序列(Sung等，1993)。用里氏木霉xln2(包含密码子58处的108bp内含子)的相对应基因组片段，取代包含pUC/XLN中的密码子32-190的人工DNA，其中使用里氏木霉DNA作为模板并在密码子31和32处引入唯一的PinAI位点和在TAG终止密码子的毗邻下游引入唯一的BamHI位点，可扩增所述的内含子。
4.2突变75A、105H、125A、129E的引入：
从pC/XHML-TV(参见下列实施例5.1)分离包含启动子区、xln2基因、cbh2部分终止子的3.2kb的SstI片段，并克隆入诱变载体 
-1(promega)的多接头SstI位点。使用特别设计能插入期望突变的引物，进行四轮连线诱变来改造特殊氨基酸：
S75A：AGCTACCTCG CCGTGTACGG(SEQ ID NO：3)，
L105H：CCACCAAGCA CGGCGAGGT(SEQ ID NO：4)，
S125A：ACGCAGCGCGTCAACGCCCCGTCCATCATC GGC(SEQ ID NO：5)，和
I129E：AACGCCCCGT CCATCGAGGG CACCGCCACC TTT(SEQ ID NO：6)
(参见WO 01/92487和WO 03/046169；在此引用作为相关方法的参考)；这生成质粒pALT-HTX13(图3中显示该质粒的普通形态，“pALT-H(I)TXn”)。通过DNA测序分析法，检验所有突变的插入。
4.3突变Y135R、H144R、N157D、Q161R、Q162H和T165H的引/入
使用Promega Altered 
II体外诱变系统，在质粒pALT-HTX13上进行四轮连续诱变，来引入六个靶氨基酸取代并产生pALT-HTX18，
步骤如下：
-使用引物序列：
Y135R：GGCACCGCCACCTTTCGCCAGTACTGGTCC(SEQ ID NO：7)和
H144R：GTCCGCCGCAACCGCCGCTC GAGCGGCTC(SEQ ID NO：8)
将135R 和144R 突变加入pALT-HTX13，来生成 pALT-HTX13+135R/144R；
-使用引物序列：
N157D：AACCACTTCG ACGCGTGG(SEQ ID NO：9)和
Q162H：GGCTCAGCAC GGCCTGACG(SEQ ID NO：11)
将157D和162H突变加入pALT-HTX13+135R/144R，来生pALLT-HTX13+135R/144R/157D/162H；
一使用引物序列：
Q161R：TTCGACGCGT GGGCTCGCCA CGGCCTGACG CTC(SEQ ID NO：10)
将161R突变加入pALT-HTX13+135R/144R/157D/162H，来生成pALT-HTX13+135R/144R/157D/161R/162H；
-使用引物序列：
T165H：GCTCGCCACGGCCTGCACCTCGGGACGATGGAT(SEQ ID NO：12)
将165H突变加入pALT-HTX13+135R144R157D/161R/162H，来生成pALT-HTX18。
在图3中显示了质粒的普通形态“pALT-H(I)TXn”。通过DNA测序分析，来检验所有突变的插入。
4.4突变Y135R的回复突变和T131N引入HTX18
使用Promega A1tered 
II体外诱变系统和引物序列：
T131N、R135Y：GGCAACGCCA CCTTTTACCA GTACTGGTCC(SEQ ID NO：13)
在质粒pALT-HTX18上进行一轮诱变，来引入T131N和R135Y突变，并生成pALT-ITXI。在图3中显示了质粒的普通形态“pALT-H(I)TXn”。通过DNA测序分析，来检验所有突变的插入。
4.5Y135R突变在HTX18中的回复突变
使用Promega 
II体外诱变系统和引物序列：
R135Y：GGCACCGCCA CCTTTTACCA GTACTGGTCC(SEQ IDNO 14)，
在质粒pALT-HTX18上进行一轮诱变，来引入R135Y突变并生成pALT-HTX18R135Y。在图3中显示了质粒的普通形态“pALT-H(I)TXn”。通过DNA测序分析，来检验所有突变的插入。
4.6在HTX18内部位点34、131、180和182引入糖基化位点
使用Promega Altered SiteS II体外诱变系统和下列引物序列，在pALT-HTX18上进行一轮诱变，来生成质粒pALT-ITXn和pALT-ITXn′(其中n等于2至5)：
T131N：CCGTCCATCGAGGGCAACGC CACCTTTCGC(SEQ ID NO：21)
F180N：GTGGAGGGTT ACAACAGCTC TGGCTCTGCT(SEQ ID NO：22)
F180N、S182T：GTGGAGGGTT ACAACAGCAC CGGCTCTGCT(SEQ ID NO：23)
S 182N：GGTTACTTTA GCAACGGCTC TGCTTCCATC(SEQ ID NO：24)
S182N、S184T：GGTTACTTTA GCAACGGCAC CGCTTCCATC(SEQ ID NO：25)
Q34N：GGTCCCGGCG GGAACTTCTC CGTCAACTGG(SEQ ID NO：26)
Q34N、S36T：GGTCCCGGCG GGAACTTCAC CGTCAACTGG(SEQ ID NO：27)。
在图3中显示了这些质粒的普通图“pALT-H(I)TXn”。通过DNA测序分析，来检验所有突变的插入。
实施例5：用于指导里氏木霉中表达天然型和修饰型家族11木聚糖酶的载体的构建
5.1pC/XHML-TV的构建：
使用在190-195bp处含有PinA1的和含有密码子31和32的xln2特异引物以及pUC反向引物(目录号18432-013，Gibco/BRL)，通过来自xln2亚克隆pXYN2K-2的Pwo聚合酶，扩增包含xln2基因的启动子和分泌信号的2.4kb片段(-2150至+195bp，其中+1表示ATG起始密码子，+193-195表示密码子32)，其中所述引物在X1712基因的5′端Kpnl位点下游进行退火。以多聚接头的BamHI位点是3′至Pifai位点的方向，将这些xln2PCR 产物作为平末端片段插入pUC119的多聚接头的SmaI位点；这些生成质粒pUC/XynPSS(Pin)。通过用EcoRl(其中从pXYN2K-2扩增pUC119的部分多聚接头)和BamHI进行消化，从pUC/XynPSS(Pin)再次分离相同的xln2PCR产物，并插入也用EcoRI和RamHI消化的质粒pBR322L(在565bp和650bp的原始Sphl和Sall位点之间包含Sphl-Notl-Sal1接头的pBR322衍生物)中，从而生成质粒pBR322LXP。为了便于高水平表达HTX4木聚糖酶，用包含cbh1启动子的-1399bp至-204bp的1.2kb HindIII片段替换包含pBR322LXP的xln2启动子的-1400bp至-121bp的1.3kbHindIII片段，其中所述的1.2kb HindIII片段通过HindIII消化pCOR132而分离；这生成质粒pBR322LXC。最后，用Klenow补平pBR322LXC的EcoRl位点，并加入Spel接头(目录号1086，New England Biolabs)以生成pBR322SpXC。
从被NheI和BamHI消化的质粒pUC/HTX4(以上实施例4.1所述的)，分离包含木聚糖酶基因(包含突变N10H、Y27M、N29L)密码子1-190的片段，并插入用NheI和BamHI消化的pCB219N-N中，从而生成pHTX4/C2ter。为了制备pCB219N-N，使用与公开的cbh2基因3′非翻译区2226bp-2242bp(Chen等，1987)相同的引物和pUC正向引物(目录号1224，New England Biolabs)，从pZUK600(以上实施例2所述的)模板扩增acbh2终止子片段，其中cbh2基因在5′端包含含有XbaI-Nhel-BamHI-SmaI-Kpnl位点的短多聚接头，并且所述的引物在pZUK6003′端EcoRI位点上游进行退火。在工程构建的Xbal和EcoRI位点消化该片段，并插入pUC119的相应位点来生成pCB219。将EcoRI-NotI接头(目录号35310-010，Gibco/BRL)插入pCB219的唯一EcoRI位点来生成pCB219N。通过用PinAI和NotI进行消化，从pHTX4/C2ter分离包含HTX4基因的密码子9-190和cbh2终止子的2.7kb片段，并插入用PinAI和NotI消化的pBR322SpXC，来生成表达盒pXHML-EC。
用Pwo聚合酶从质粒pVU1005(Van den Elzen等，1989)从木霉扩增作 为选择标记的大肠杆菌潮霉素磷酸转移酶基因(hph)。分别设计在hph编码区(所公开的hph序列的211-1236bp，Gritz和Davies，1983)的5′和3′端引入SphI和KpnI位点的引物。用SphI和KpnI消化PCR产物，并插入pUC119多聚接头区的相应位点。得到的质粒pHPT100作为用于构建选择盒的起始质粒。
将两个新的连接区引入质粒pHPT100来便于启动子和终止子片段的克隆。将HindIII-XbaI-XhoI-SphI接头插入HindIII和SphI之间的位点，以及将插入pUC119的KpnI和SacI位点之间的KpnI-NotI-SacI保留在pHPT100中。该构建体被称为pHPT102。设计用于扩增pgk启动子(Vanhanen等，1991)的引物，来在启动子-970和+1位点分别引入XhoI位点和SphI位点。这些位点随后用于将启动子pgk插入pHPT102的XhoI和SphI位点来生成pHPT115使用在cbh1的3′非翻译区(公开的cbh1序列的1864bp-1899bp)退火的引物和pUC反向引物(目录号18432-013，Gibco/BRL)，通过Pwo聚合酶从pCBlTa扩增1.3kb cbh1终止子片段，其中所述的cbh1在1877bp-1882bp处包含Kpnl位点，并且反向引物在pCBlTa的cbh1终止子3′端的EcoRI位点下游进行退火。用KpnI消化cbh1终止子的PCR产物，并插入pHPT115的唯一KpnI位点，来生成选择盒质粒pHPT136。通过包含xln2转录终止子的2.6kbKpnI片段替换选择盒质粒pHPT136中的cbh1终止子。使用将在公开的xln2序列(Saarelainen等1993)780bp下游处引入KpnI点的引物和pUC正向引物(目录号18431-015，Gibco/BRL)，通过Pwo聚合酶从基因组亚克隆pXYN2K-2扩增xln2终止子，其中所述的正向引物在pXYN2K-2xln2基因3′端下游进行退火。用KpnI消化xln2终止子的PCR产物，并连接到来自pHPT136的5.1kb KpnI片段(包含pUC119的pgk驱动的hph基因)，来生成选择盒质粒pHPT136X，从而在选择盒3′端保留唯一的NotI位点。
为了制备转化载体，通过NotI消化、用Klenow DNA聚合酶补平NotI位点以及SpeI消化，从pC/XHML-EC分离表达盒。同时，通过用XhoI、 用Klenow DNA聚合酶补平XhoI位点以及随后用XbaI消化，制备选择盒质粒来接纳这些片段。将SpeI表达盒-NotI片段插入pHPT136X选择盒上游的XbaI和XhoI位点之间。在通过如实施例7所述的微弹轰击导入里氏木霉M2C38之前，通过用NotI消化，线性化最终的转化载体pC/XHML-TV(图2)。
5.2pC/XH(I)TXn-TV的构建：
将包含来自pALT-H(I)TXn的启动子区、修饰的xln2基因和cbh2部分终止子(如实施例4中所述的)的3640bp SacI片段，克隆入含有pSP72中剩余的cbh2终止子序列的质粒的SacI位点。这生成含有表达盒的质粒pc/xH(I)TXnPSP。含有质粒pNCBglNSNB(r)的选择盒，衍生于含有质粒pFB6的(Radford等，1985)的粗糙链孢霉(Neurospora crassa)pyr4中。将来自pFB6的3.2kb BglII片段(含有粗糙链孢霉pyr4基因(GenBank登录号M13448)及其启动子、终止子和一些5′UTR序列)，克隆入在多聚接头(介于Eco RI和SacI之间)中含有NotI、SmaI、Nhe I以及Bgl II位点的修饰型pUC119的Bam HI位点，从而生成pNCBgl-NSNB(r)。从pNCBgl-NSNB(r)分离含有粗糙链孢霉pyr4全部编码区、启动子以及终止子序列的2238bp的KpnI片段，并克隆入pc/xHTX18PSP中唯一的KpnI位点，来生成pc/xHTX18-TV(图4中显示普通形式的质粒“pc/xH(I)TXn-TV”)。
5.3pc/xHTX18(R135Y)-TV的构建
将包含来自pALT-HTX18(R135Y)的启动子区、修饰的xln2基因和cbh2部分终止子(如实施例4中所述的)的3640bp SacI片段，克隆入含有pSP72中剩余的cbh2终止子序列的质粒的SacI位点。这生成含有表达盒的质粒pc/xHYX18(R135Y)PSP。从pNCBgl-NSNB(r)(以上实施例5.2中所述)分离含有粗糙链孢霉pyr4全部编码区、启动子以及终止子序列的 2238bp的KpnI片段，并克隆入含有表达盒的质粒的唯一的KpnI位点，来生成pc/xHTX18-TV(R135Y)-TV(图4中显示普通形式的质粒“pc/xH(I)TXn-TV”，其中“n”是“18(R135Y)”)。
5.4pc/xxyn1-TV和pc/xxyn1-T118N-TV的构建
用NheI和BamHI消化675bp野生型和修饰型xyn1 PCR产物(如以上实施例3所述)，并插入质粒pCB219N-N中的相应位点(如以上实施例5.1所述)，来生成质粒pXlC2ter和pXl(118N)C2ter。使用在cbh1启动子的-1399bp处引入XbaI位点并在Gln密码子(包括木聚糖酶II成熟蛋白的第一个氨基酸)的毗邻下游引入NheI位点的引物，从质粒pBR322LXC(如在实施例5.1中所述)扩增包含cbh1启动子-1399bp至-204bp和xln2启动子-121bp至-1bp以及包含编码xln2分泌信号的序列的1.6kb片段。用Xba1和NheI消化这些PCR产物，并插入与天然型和修饰型木聚糖酶I编码区相对应的质粒pXlC2ter和pXl(118N)C2ter位点中，来生成表达盒质粒pc/xxynl-EC和pc/xxynl-T118N-EC。通过用xbaI消化、用Klenow DNA聚合酶补平XbaI位点并用EcoRI消化，来切下表达盒。通过用NotI消化、用Klenow DNA聚合酶补平NotI位点并用EcoRI消化，制备含有粗糙链孢霉pyr4的质粒pNCBglNSNB(r)(如以上实施例5.2中所述)来接纳该片段。将EcoRI-xynI表达盒XbaI片段插入选择盒的下游EcoRI和NotI位点之间，来制备转化载体pc/xxynl-TV和pc/xxynl-T118N-TV(图5)。如实施例7中所述，在通过PEG介导的原生质体转化而导入里氏木霉M2C38aux5之前，通过用XbaI消化来线性化最终的转化载体。
5.5pc/xxynC-T128N-TV的构建
用NheI和KpnI消化木聚糖酶I表达盒质粒pc/x Xlnl-EC，敲除木聚糖酶I编码区，并将大片段与用NheI和Kpnl消化的修饰型xync PCR产物(如以上实施例3中所述)进行连接，从而生成表达盒质粒 pc/xxynC-T128N-EC通过用NotI消化、用Klenow DNA聚合酶补平NotI位点并用XbaI消化，切下表达盒。同时，通过用XhoI消化、用Klenow DNA聚合酶补平XhoI位点并随后用XbaI消化，制备含有hph的选择盒质粒pHPT136(如以上实施例5.1所述)来容纳该片段。将XbaI-xynC表达盒-NotI片段插入pHPT136的选择盒上游的XbaI和XhoI位点之间。如实施例7中所述，在通过PEG介导的原生质体转化而导入里氏木霉RutC30之前，通过用XbaI消化来线性化最终的转化载体pc/xxynC-T128N-TV。
实施例6：里氏木霉株M2C38的pyr4营养缺陷型的分离
为了将粗糙链孢霉pyr4基因作为选择标记，根据下列步骤分离M2C38的天然pyr4营养缺陷型：如先前用于筛选里氏木霉pyr4营养缺陷型所述(Berges和Barreau，1991)，将1×106个M2C38孢子铺在含有5mM尿苷盒0.15％(w/v)的尿苷类似物5-氟乳清酸(fluoroorotic acid，FOA)。在含FOA培养基上生长的能力，可筛选在编码乳清苷(orotidine)磷酸核糖基转移酶的pyr2基因中或在编码乳清苷5’-磷酸脱羧酶的pyr2基因中的突变中断。将天然FOA抗性克隆进行含或不含尿苷的基本培养基的二次筛选。然后通过微弹轰击用pNCBglNSNB(r)来转化不能在基本培养基上生长的FOA抗性菌落孢子，从中筛选可在基本培养基上生长的孢子。仅仅将通过pNCBglNSNB(r)中的粗糙链孢霉pyr4基因补足的那些菌株，在基本培养基上生长，这些是真正的pyr4营养缺陷型。使用该方法，选出营养缺陷型5(M2C38aux)作为M2C38的稳定pyr4营养缺陷型。
实施例7：里氏木霉M2C38的转化
7.1通过微弹轰击进行转化
Biolistic PDS-1000/He系统(BioRad；E.I.DuPont de Nemours andCompany)用于转化M2C38木霉菌株的孢子，并且所有方法根据制造商的建议进行。金粒子(粒径中值0.6μM，BioRad目录号1652262)作为微载 体。以下参数用于转化的最佳条件：1100psi爆破压、29毫米汞柱的氦压、0.95cm的间隙距离、16mm的微弹飞行距离以及9cm的靶距离。在基本培养基琼脂(下列实施例7.2)上制备具有1×106孢子的平板。轰击的平板在28℃温育。在菌落转入单独的MM琼脂培养皿中并可长出孢子的3-6天培育之后，观测转化体。
7.2使用聚乙二醇(PEG)和CaCl2进行原生质体转化
将5×106个M2G38aux5孢子铺在补充5mM尿苷的马铃薯葡萄糖琼脂上的无菌玻璃纸上，并在30℃温育20小时来促进孢子萌发和菌丝体生长。将具有菌丝体的玻璃纸培养皿转入10ml原生质体溶液，其中该溶液在含有0.6M硫酸铵(缓冲液P)的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中含有7.5g/lDriselase和4g/l β-葡聚糖酶(InterSpex Products Inc.，目录号分别是0465-1和0439-2)。菌丝丛以60rpm在28℃振动消化5小时室温下以1000-1500×g离心10分钟，来回收原生质体用5ml缓冲液P洗涤原生质体，并在室温下以1000-1500×g再次离心10分钟。将原生质体重悬浮在1ml STC缓冲液(1.2M山梨糖醇、10mMCal2、10mM Tris-HCL，pH7.5)，并穿过无菌No.60MIRACLOTHTM来从未消化的菌丝体分离原生质体，并收集在无菌微量离心管中。
为了转化，将0.1ml重悬浮的原生质体(约5×106原生质体)混和2μg载体DNA和25μl PEG溶液(25％PEG 4000、50mM CaCl2、10mM Tris-HCl，pH7.5)。冰上温育30分钟后，加入1ml PEG溶液并将混和液室温下温育5分钟。用2ml 1.2M山梨糖醇的PEG溶液稀释转化混和液，将0.75ml混和液加入冷却到约47℃的25mL熔融MMSS琼脂培养基(见下文)，并将原生质体悬浮液倒在MM琼脂上(见下文)。在30℃温育平板，直至菌落生长肉眼可见。将转化体转入含有MM琼脂的单个平板，使其形成孢子收集孢子，以高稀释度铺在MM琼脂上来分离同核体转化体，然后铺在PDA上使其生长并形成足够的孢子来接种以下实施例9中所述的筛选 培养物。
基本培养基(MM)琼脂包含：
试剂 每升
KH2PO4 10g
(NH4)2SO4 6g
二水柠檬酸钠 3g
FeSO4-7H2O 5mg
MnSO4-H2O 1.6mg
ZnSO4-7H2O 1.4mg
CaCl2-2H2O 2mg
琼脂 20g
20％葡萄糖f.s. 50ml
1MMgSO4-7H2Of.s. 4mL
pH 5.5
MMSS琼脂含有MM琼脂的相同成分，并添加1.2M山梨糖醇、4mMMgSO4、lg/LYNB(油包水型酵母氮碱氨基酸，购自DIFCO，目录号291940)以及0.12g/l氨基酸(-Ura DO补充物，购自CLONTECH，目录号8601-1)。
实施例8：里氏木霉培养物滤液中木聚糖酶活性的检测
表达HTX18、HTZ18(R135Y)、ITX1-5以及ITX′-5的嗜热木聚糖酶活性的检测
通过在65℃测量还原糖从可溶的阿糖基木聚糖底物的释放量，测定里氏木霉转化体培养物滤液中嗜热木聚糖酶活性的存在。具体地说，将30μl合适稀释度的培养物滤液在65℃预温育5分钟随后，将再溶解于也在65℃预温育了5分钟的、含有0.04％Tween的磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的300μl的1.5％小麦阿糖基木聚糖(Megazyme International)溶液，加入微量离心管中的酶试样中。短暂涡旋试管来促进混合，然后将反应液在 65℃温育20分钟。通过加入150μl含有43.64mM 2-羟基3，5-二硝基苯甲酸、0.93M酒石酸钾钠、0.4M氢氧化钠以及0.4M氢氧化钾的终止溶液，来终止酶催化水解反应。然后煮沸所得溶液10分钟，来促进2-羟基-3，5-二硝基苯甲酸与通过酶从阿糖基木聚糖底物释放的还原糖进行反应。在冷水浴中冷却试管5分钟，然后加入1.5ml去离子水。在530nm测量溶液的吸光度。根据标准曲线，计算温育期间嗜热木聚糖酶释放的还原糖的量，其中所述的标准曲线是基于与相同终止液反应的纯木糖溶液的几种稀释度的A530测量值。
天然的或修饰的里氏木霉木聚糖酶I和变铅青链霉菌木聚糖酶C-131N超表达的木聚糖酶I活性的检测
除了在40℃进行温育以及在含有0.04％Tween的醋酸盐缓冲液(pH4.0)中制备1.5％小麦阿糖基木聚糖底物之外，根据以上章节8.1所述的，对超表达天然或修饰木聚糖酶I的里氏木霉菌株的培养物滤液中木聚糖酶I活性进行检测。
除了在40℃进行温育以及在醋酸盐缓冲液(pH6.0)中制备1.5％小麦阿糖基木聚糖底物之外，根据以上章节8.1所述的，对超表达修饰的变铅青链霉菌木聚糖酶C的里氏木霉菌株的培养物滤液中的xylC-131N活性进行检测。
实施例9：存液体培养物中生产修饰型木聚糖酶
将单个木霉属菌落转入用于增殖各个培养物的PDA平板。孢子形成是均一接种摇瓶所必需的，其中摇瓶用于测试培养物生产嗜热木聚糖酶和纤维素酶的能力。以下是培养基组成：
组成 g/L
(NH4)2SO4 6.35
KH2PO4 4.00
MgSO4-7H2O 2.02
CaCl2-2H2O 0.53
CSL 6.25
CaCO3 10.00
碳源** 5-200
示踪元素* 1mL/L
*踪元素溶液含有5g/LFeSO4*7H2O、1.6g/LMnSO4*H2O、1.4g/LZnSO4*7H2O。
**葡萄糖、Solka floc、乳糖、纤维二糖、槐糖、玉米糖浆或微晶纤维素(Avicel)碳源以水性溶液形式在pH2至7进行单独灭菌，并在发酵过程开始或期间加入剩余的培养基中。
将单个转化体在含有上述培养基的150mL培养液的1升烧瓶中或在24孔微平板的1ml培养液中进行培养。接种之前，起始pH是5.5，并用蒸汽高压锅将培养基在121℃灭菌30分钟。对于天然的和转化的细胞，如实施例8所述，从PDA平板分离孢子，并将104-106孢子/ml用于接种各个培养液。将培养液以200-300rpm在28℃振荡培养6天通过GF/A玻璃微纤维滤纸(Whatman)进行过滤或通过在12000rpm进行离心，从含有分泌蛋白的滤液分离生物量。使用Bio-Rad Protein Assay(目录号500-0001)，测定蛋白浓度。如实施例8中所述，测定木聚糖酶活性。从每个构建体选择表达最高木聚糖酶活性的和显示高蛋白质总产量的菌株，以用于在14升预发酵(pilot fermentation)中生长。
实施例10：存14L分批供料发酵中生产木聚糖酶
里氏木霉菌株在马铃薯葡萄糖琼脂上于28-30℃生长，直至得到铺满的孢子菌苔。收集孢子并用于在1L挡板烧瓶中接种750ml Berkeley培养基(10g/l葡萄糖、1.4g/l(NH4)2SO4、2.0g/l KH2PO4、0.31g/lMgSO4*7H2O、0.53g/l CaCl2、5.1g/l干玉米浸出物、5mg/l FeSO4*7H2O、0.8mg/lMnSO4*H2O、0.7mg/lZnSO4*7H2O)。在28℃和150rpm中生长3天后，将该培养物用于接种具有下列初始成分的10L发酵培养基：13g/l 葡萄糖、2.2g/l(NH4)2SO4、1.39g/l KH2PO4、0.7g/l MgSO4*7H2O、0.185g/lCaCl2、6g/l干玉米浸出物、3.75mg/l FeSO4*7H2O、1.2mg/lMnSO4*H2O、1.05g/l ZnSO4*7H2O。在14L的New Brunswick Microform发酵罐中，使用一个或多个在实施例9中列出的诱导碳水化合物来源，在pH4.5和28-30℃下实施6天的分批供料需氧发酵6天后，将培养物对Harborlite过滤，调节培养物滤液至pH4.5，并用0.5％苯甲酸盐保存来防止微生物生长。
因为到6天生长结束时所有发酵都积累相似数量的生物质(表3)，因此表达修饰木聚糖酶并未显著改变木霉宿主菌株的生长。根据下列步骤测定发酵罐样品中生物质浓度：称重并记录5-10g发酵肉汤。然后经过预称重的玻璃微纤维滤纸(Whatman)过滤发酵肉汤，并用水洗涤将过滤的生物质在110℃烘箱中过夜干燥。通过加上滤纸的干生物质的质量减去滤纸质量，测定干生物质重量。如下计算生物质量：
生物量(g/L)＝[干生物质量(g)/湿生物质量(g)]×[样品密度(g/mL)]×1000mL/L
与产生相应的未修饰木聚糖酶(表3)的菌株相比，产生包含X34N、X131N、X180N或X182N突变的修饰木聚糖酶(参见表2描述的突变)的菌株，可产生更高水平的总蛋白。使用Bio-Rad Protein Assay(目录号500-0001)，测定每天发酵罐样品的蛋白浓度。
表3：从转化的里氏木霉菌株表达修饰型木聚糖酶(生物量和木聚糖酶活性)
| 菌株 | 酶 | 新 N-X-S/T 位点 | 蛋白 (mg/ml) | 生物量 (g/l) | 木聚糖酶酶 活(XU/ml) | 表达增加倍 数x(增加％)b |
| RutC30 | 天然木聚糖酶 | -- | 40.89 | 30.35 | 812.5e | -- |
| M2C38 | 天然木聚糖酶 | -- | 23.93 | 18.11 | 141a | -- |
| P67AB | HTX18 | 无 | 18.9 | 20.1 | 3302 | -- |
| 2013B | HTX18-R135Y | 无 | 34.9 | 24.0 | 6166 | 1.86x(86％) |
| P210A | ITX1 (T131N，R135Y) | 131N | 44.7 | 26.5 | 15288 | 4.6x(360％)c 2.5x(150％)d |
| P284A | ITX2 | 131N | 42.9 | 21.3 | 9691 | 2.9x(190％) |
| P304B | ITX3 | 180N | 43.2 | 20.5 | 6546 | 2.0(100％)x |
| P321H | ITX3′ | 180N/18 2T | 40.5 | 22.8 | 7192 | 2.2x(120％) |
| P322B | ITX4 | 182N | 39.0 | 20.2 | 11083 | 3.4x(240％) |
| P323B | 1TX4′ | 182N/18 4T | 33.0 | 19.2 | 12061 | 3.6x(260％) |
| P331B | ITX5 | 34N | 34.5 | 22.5 | 5275 | 1.6x(60％) |
| P336B | ITX5′ | 34N/36 T | 38.0 | 22.6 | 6933 | 2.1x(110％) |
| P300A | Xynl | No | 31.0 | 23.2 | 136a | -- |
| P279A | Xynl-131N | 118N | 31.75 | 25.5 | 2042a | 15.0x(1400％) |
| P348C | xlnC-131N | 128N | 35.2 | 23.8 | 2365e | ND |
a：在40℃、pH4.0下测量；
b：涉及表达包含除新引入糖基化基序之外的相同一级氨基酸序列的相应未修饰木聚糖酶；
c：涉及表达包含Y135R但无131N突变的修饰木聚糖酶的P67AB的木聚糖酶表达效率；
d：涉及表达不包含T131N或Y135R突变的修饰木聚糖酶菌株2013B的木聚糖酶表达效率；
e：在40℃、pH6.0下测量。
如实施例8中所述，测定木聚糖酶活性。
与HTX18生产菌株P67AB相比，包含修饰木聚糖酶遗传构建体的菌株P210A和P284A，可分别产生4.6和2.9倍高的木聚糖酶活性，其中所述的构建体除存在于HTX18的突变之外，还含有里氏木霉木聚糖酶II 序列的位置131-133处的N-糖基化基序N-X-T。
与表达未修饰HTX18的菌株P67AB相比，包含修饰木聚糖酶遗传构建体的菌株P304B和P321H，可产生直到两倍高的木聚糖酶活性，其中所述的构建体除存在于HTX18的突变之外，还含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置180-182处的N-糖基化基序N-X-S/T。
与表达未修饰HTX18的菌株P67AB相比，包含修饰木聚糖酶遗传构建体的菌株P322B和P323B，可产生直到3.5倍高的木聚糖酶活性，其中所述的构建体除存在于HTX18的突变之外，还含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置182-184处的N-糖基化基序N-X-S/T。
与HTX18生产菌株P67AB相比，包含修饰木聚糖酶遗传构建体的菌株P331B和P336B，可分别产生1.6和2.1倍高的木聚糖酶活性，其中所述的构建体除存在于HTX18的突变之外，含有里氏木霉木聚糖酶II序列的位置34-36处的N-糖基化基序N-X-S/T。
与表达未修饰木聚糖酶I的菌株P300A相比，包含修饰木聚糖酶遗传构建体的菌株P279A，可产生直到15.0倍高的木聚糖酶活性，其中所述的构建体除含有天然里氏木霉木聚糖酶I序列的位置118-120处的N-糖基化基序N-X-T该突变相当于里氏木霉木聚糖酶II的X131N(参见图1)。
包含修饰木聚糖酶遗传构建体(含有天然变铅青链霉菌木聚糖酶C序列的位置128-130处N-糖基化基序N-X-T)的菌株P348C，可产生与菌株P279A相同高水平的木聚糖酶活性，其中菌株P279A也包含修饰木聚糖酶遗传构建体(含有天然木聚糖酶I序列的位置118-120处N-糖基化基序N-X-T)，并具有用于生产工业应用的木聚糖酶的商业用途该突变相当于里氏木霉木聚糖酶II的X131N(参见图1)。
与包含修饰木聚糖酶遗传构建体(含有木聚糖酶II序列内部各自相同位点的N-X-S糖基化基序)的菌株P304B、P322B和P331B相比，包含修饰木聚糖酶遗传构建体(含有N-X-T糖基化基序)的菌株P321H、P323B 和P336B，可产生更高量的木聚糖酶活性。
实施例11：比较修饰木聚糖酶ITX1与其天然配对物HTX18的嗜碱性和耐热性
如实施例8中所述，测定酶活为了测定嗜碱性(图6)，将测试的温育温度降至55℃，并将含有Tween-20和NSP底物液的磷酸盐缓冲液调至适于测量酶活的期望pH。为了测定耐热性(图7)，将温育温度调至适于测量酶活的期望温度。
由菌株P210A(包含HTX18的相同突变但无Y135R突变和T131N突变，参见表2)产生的修饰ITX1木聚糖酶，具有与HTX18木聚糖酶相似的pH和温度活性特征(图6和图7)。因此，加入T131N突变不会因为另一个突变而改变木聚糖酶的期望生物物理和生物化学性质。通过引入X131N突变(TrX编号)，这可有效用于提高所有木霉属目的家族11的表达。
实施例12：包含T131N突变的ITX1酶的质谱分析
通过菌株P210A产生的、并含有修饰木聚糖酶ITX1的发酵滤液，稀释在2×Laemmli缓冲液(62.5mM Tris-HCl(pH6.8)、10％丙三醇、2％SDS、5％β-巯基乙醇)，煮沸5分钟并冷却。使用含有12％丙烯酰胺(37.5∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺，BioRad目录号161-0122)的分辨胶以及使用Mini-PROTEAN 
3 Electrophoresis Cell(BioRad目录号165-3301)，在200V(恒压)电泳40分钟，通过SDS-PAGE来分离蛋白。使用Bio-SafemCoomassie Stain(BioRad目录号161-0786)，通过染色来目测凝胶中的蛋白质。从凝胶切下20kDa的蛋白带，脱色并用胰蛋白酶根据标准方法进行胶内消化。简言之，在100mM碳酸氢铵中，用30％乙腈短暂洗涤凝胶带约10分钟，并弃去上清。重复该过程直至染色被完全除去。然后用去离子水之后用乙腈洗涤凝胶带将含有20ng胰蛋白酶的约20mL碳酸氢铵(50 mM)加入每条凝胶带中。使凝胶带再次膨胀10分钟，并用约30mL碳酸氢铵(50mM)终止(在消化期间，足以保证完全浸没凝胶块)。将来自每种样品的液体转入新的小瓶中。之后，使消化继续进行4小时将溶液在Savant上蒸发直至终体积约10mL。
使用配备了Q-TOF2四极杂交飞行时间质谱仪(Waters)的CapLC系统(Waters)，通过纳米HPLC串联质谱分析法(纳米LC-MS/MS)分析消化液。将10mL消化液中的3mL注射到0.3×5mm的C18 Micro PrecolumnCartridge(Dionex/LC Packings)上留住肽，而冲去盐和其它溶液成分。然后将阱沿着75mm×150mm的C18纳米Series柱(Dionex/LC-Packings)排列，并通过梯度洗脱(35分钟的3-45％乙腈和0.2％甲酸，随即在38.5分钟内甲酸浓度激增至85％)分离肽。以适于两倍和三倍电荷离子的自动模式设定质谱仪来获得MS/MS谱。优选收集来自具有和没有吸附的HexNAc 残基的重胰蛋白酶肽123-141的多倍电荷离子。手动分析MS/MS谱。
表4：通过LC-MS/MS检测在131N的糖基化
| 肽 | LC 持续时间 | 两倍电荷离子 M/z | 氨基酸序列 | 分布 |
| aa123-141 | 25.4分钟 | 1203.5367 | VNAPSIEGN*ATFYQYWSVR +N-乙酰己糖胺 | ～80％ |
| aa123-141 | 26.7分钟 | 1102.009 | VNAPSIEGNATFYQYWSVR | ～20％ |
这些结果证实：木霉属宿主菌株可识别通过T131N突变而引入的NAT共有序列N-糖基化基序，并且引入该功能性糖基化基序可促进木霉属的修饰木聚糖酶的高水平表达。
总之，通过X131N突变(TrX编号)，可从木霉属构建显示表达效率提高的修饰型木聚糖酶。如本文所述的，当家族11木聚糖酶联合TrxII时，通过将其它N-糖基化基序(N-X-S/T)导入家族11木聚糖酶的位置 X34N、X180N、X182N、X34N-S36T、X180N-S182T、X182N-S184T或其位置组合，也可获得相似增加的表达效率。
本发明描述了可自木霉属宿主增加表达和分泌的突变木聚糖酶。这些突变木聚糖酶可用于工业生产方法，例如纸浆和纸张加工、或作为动物饲料添加剂、或用于烘焙和酿造用途。
通过一个或多个相关的实施方案已经描述了本发明。然而，对本领域技术人员显而易见的是：在不背离如权利要求书所限定的发明范围的基础上，可对本发明进行许多改变和修饰。
所有文献和引文在此引用作为参考。
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Claims (25)
1.一种修饰型家族11木聚糖酶，其包含引入功能性共有序列N-糖基化位点的序列，其中所述位点不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中，所述N-糖基化位点选自Asn-Xaa-Ser和Asn-Xaa-Thr，其中Xaa是除了脯氨酸的任何氨基酸，所述N-糖基化位点由位置34、位置131、位置180或位置182的取代的天冬酰胺组成，所述位置通过将修饰型家族11木聚糖酶与如SEQ ID NO：1中所示的里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II的氨基酸序列进行序列对比而确定，其中当在木霉属宿主菌株中表达时，与自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的相应的家族11木聚糖酶的表达效率相比，所述修饰型木聚糖酶的表达效率增加至少40％。
2.权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶，其中位置131的氨基酸被天冬酰胺取代。
3.权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶，其中所述功能性共有序列N-糖基化位点是Asn-Xaa-Thr并由位置34的取代的天冬酰胺和位置36的取代的苏氨酸组成；由位置180的取代的天冬酰胺和位置182的苏氨酸组成；或由位置182的取代的天冬酰胺和位置184的苏氨酸组成。
4.权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶，其中家族11木聚糖酶是木霉属木聚糖酶。
5.权利要求4的修饰型家族11木聚糖酶，其中木霉属木聚糖酶是来自里氏木霉的木聚糖酶I或木聚糖酶II。
6.权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶，其中所述修饰型家族11木聚糖酶来自如SEQ ID NO：39所示的变铅青链霉菌(S.lividans)木聚糖酶C并包含氨基酸取代T131N，所述位置通过将变铅青链霉菌木聚糖酶C与如SEQ ID NO：1中所示的里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列进行序列对比而确定。
7.权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶，其中所述修饰型家族11木聚糖酶来自如SEQ ID NO：2所示的里氏木霉木聚糖酶I并包含氨基酸取代T131N，所述位置通过将里氏木霉木聚糖酶I与如SEQ ID NO：1中所示的里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列进行序列对比而确定。
8.一种修饰型家族11木聚糖酶，其包含引入功能性共有序列N-糖基化位置的序列，其中所述位置不存在于自其衍生出所述修饰型家族11木聚糖酶的家族11木聚糖酶中，其中所述修饰型家族11木聚糖酶来自如SEQ ID NO：1所示的里氏木霉木聚糖酶II，所述修饰型家族11木聚糖酶由选自以下一组的氨基酸取代组成：
N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、T131N、H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX1表示；
N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、T131N、Y135R、H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX2表示；
N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、Q161R、Q162H、T165H以及F180N，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX3表示；
N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、Q161R、Q162H、T165H、F180N以及S182T，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX3′表示；
N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、Q161R、Q162H、T165H以及S182N，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX4表示；
N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、Q161R、Q162H、T165H、S182N以及S184T，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX4′表示；
N10H、Y27M、N29L、Q34N、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX5表示；和
N10H、Y27M、N29L、Q34N、S36T、S75A、L105H、Q125A、I129E、H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H，该里氏木霉木聚糖酶II由ITX5′表示。
9.一种修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体，其包含可操纵地连接于分泌信号的启动子，所述分泌信号可操纵地连接于编码如权利要求1所述的修饰型家族11木聚糖酶的编码区，与自其衍生出所编码的修饰型家族11木聚糖酶的相应的所编码的家族11木聚糖酶的表达效率相比，所述修饰型木聚糖酶遗传构建体使得所编码的修饰型家族11木聚糖酶的表达效率增加至少40％。
10.权利要求9的修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体，其中所述修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体的分泌信号是木霉属分泌信号。
11.权利要求10的修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体，其中木霉属分泌信号是木聚糖酶分泌信号。
12.权利要求11的修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体，其中木聚糖酶分泌信号是木霉属木聚糖酶I分泌信号或木霉属木聚糖酶II分泌信号。
13.权利要求9的修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体，其中所述编码区来自如SEQ ID NO：1所示的里氏木霉木聚糖酶II编码区，所述里氏木霉木聚糖酶II编码区由以下氨基酸取代组成：N10H、Y27M、N29L、S75A、L105H、Q125A、I129E、T131N、H144R、N157D、Q161R、Q162H以及T165H，由ITX1所表示。
14.权利要求9的遗传构建体，其中启动子选自：木霉属cbh1启动子、cbh2启动子、eg1启动子、eg2启动子、eg3启动子、eg5启动子、xln1启动子、xln2启动子以及这些启动子的两个或多个启动子组合。
15.一种遗传修饰的微生物，其包含权利要求9的修饰型家族11木聚糖酶遗传构建体。
16.权利要求15的遗传修饰的微生物，其中所述微生物包含木霉属或肉座菌属(Hypocrea)的成员。
17.权利要求15的遗传修饰的微生物，其中所述分泌信号是木霉属分泌信号。
18.权利要求17的遗传修饰的微生物，其中木霉属分泌信号是木霉属木聚糖酶分泌信号。
19.权利要求18的遗传修饰的微生物，其中木霉属木聚糖酶分泌信号是木霉属木聚糖酶I分泌信号或木霉属木聚糖酶II分泌信号。
20.权利要求15的遗传修饰的微生物，其中所述启动子选自：木霉属cbh1启动子、cbh2启动子、eg1启动子、eg2启动子、eg3启动子、eg5启动子、xln1启动子、xln2启动子以及这些启动子的两个或多个启动子组合。
21.一种加工食品的方法，包括用权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶处理食品。
22.权利要求21的方法，其中食品选自禽类饲料添加剂、猪饲料添加剂、用于烘焙的食品或用于酿造的食品。
23.一种生产纸浆的方法，包括用权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶处理纸浆。
24.权利要求1的修饰型家族11木聚糖酶在工业加工或食品加工中的用途。
25.权利要求24的用途，其中工业加工是生产纸浆。
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