CN101015248A - 植物碳同位素标记的方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种植物碳同位素标记的方法及装置，将种子播种于装在土壤的栽培盘中，将栽培盘置于密闭标记箱中。在密闭条件下加入碳－14或碳－13标记的碳酸纳与盐酸溶液于反应槽中，反应产生二氧化碳供植物光合作用。箱内采用电风扇混匀二氧化碳，用日光灯补充光照，以冷却管降低温度和湿度。通过输液瓶向栽培盘中补充水分。栽培结束后取出植株，得到碳－14或碳－13标记的植物。该发明方法操作方便、安全，可防止碳同位素标记的二氧化碳外逸，提高了碳同位素原料的利用率，适合于对各种植物进行碳同位素标记，特别是木本植物。

Description

植物碳同位素标记的方法及装置

技术领域

本发明涉及同位素示踪技术领域，更具体涉及一种植物碳同位素标记的方法，同时还涉及植物碳同位素标记的装置。本发明适合于高等院校和科研单位的研究人员对植物进行碳-14或碳-13同位素标记和示踪研究中应用。

背景技术

同位素示踪技术由于其高度的灵敏性，被称为继显微镜技术发明后的又一大发明，在生物学科各领域的研究中已被广泛应用。在土壤学研究中，土壤有机质不仅是土壤肥力重要的物质基础，而且对于保持土壤团聚结构和保水通气性能具有重要作用，研究土壤有机碳的循环与积累的研究对于保持土壤肥力和农业可持续发展具有重要的意义。同时土壤有机质的积累与分解和矿化对于大气“温室气体”起着关键的调控作用，近20年来研究土壤碳循环已成为土壤学热点问题之一。采用碳-14或碳-13示踪技术是研究植物残体在土壤中分解和转化动力学以及植物根系分泌的有机碳量输入土壤的关键手段，对于了解土壤有机质循环和积累以及为建立土壤有机质计算机模拟模型提供参数方面具有重要的作用。而植物碳同位素标记和示踪技术是上述研究的基础。由于通常只有气体状态的碳-14或碳-13标记的二氧化碳才能被植物吸收和利用，而且二种碳同位素价格均很贵，在进行标记时既要保证植物正常生长，又要严格密闭防止碳同位素标记的二氧化碳外逸，特别是由于碳-14标记的二氧化碳具有放射性。因此，建立合适的植物碳同位素标记的方法和装置是非常重要的。

二十世纪六十年代英国土壤学家Jenkinson设计了一种生产碳-14同位素标记的植物的装置，但较为复杂，不便于操作，而且箱内压力控制方法存在缺陷，特别是在进行标记时加入盐酸与碳-14标记的碳酸氢钠时，因反应剧烈难于保证防止泄漏。此外该装置由于采用液体培养方法进行植物生产，不仅易滋生藻类等非目标生物，而且与土壤中生长的植物可能存在差异，有些木本植物甚至很难在液体培养液中正常生长；且该方法也不适合用于研究植物根系分泌的有机物碳量。在国内很多研究者通常采用间歇标记法，即采用土壤盆栽的植物在自然空气环境条件下进行生长，每隔一定时期将植物移入标记箱中进行碳同位素标记一天，该方法也存在难于严格控制标记的二氧化碳气体的泄漏，也同样不适合用于研究植物根系分泌有机碳量，且标记的植物材料中物质间碳同位素的标记强度不均一，不适合用于研究标记植物的有机碳在土壤中的分解和转化。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种植物碳同位素标记的方法，该方法简便，易于操作，实用性广，对植物进行碳同位素标记和研究植物根系向土壤输入碳量。

本发明的另一个目的是在于提供一种碳同位素标记植物的装置，该装置结构简单，成本低，易于制作，使用操作简便，标记过程完全密闭，严格控制了碳-14或碳-13标记的二氧化碳泄漏，提高了碳-14或碳-13同位素材料的利用率，采用土壤栽培适合于各种植物的碳同位素标记和示踪。

为了实现上述目的，本发明的植物碳同位素标记的方法，包括下列步骤：

A、在栽培盘中加入13-15公斤过2毫米孔径筛的新鲜土壤，在土壤中喷施硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾营养液，将已发芽的种子播种于栽培盘土壤中，根据植物种类调节土壤含水量至饱和持水量的55％-105％，在23-27℃使小苗生长2-3天。

B、将栽培盘置于标记箱内底板上，在箱门和箱壁连接处涂一层高温真空硅脂，拧紧穿过箱壁和箱门的所有螺丝，密闭箱门。关闭箱体左边吸附瓶二端的阀门，打开箱体右边吸附瓶二端的阀门，开启真空泵抽真空，使箱体内真空度到达-0.01至-0.02Mpa；关闭吸附瓶二端的阀门，关闭真空泵；24小时后压力计上负压力没有变化，表明箱体密闭性良好。

C、在密闭条件下缓慢加入碳-14(或碳-13)标记的碳酸纳溶液与盐酸溶液于反应槽中，反应产生碳-14(或碳-13)标记的二氧化碳供植物进行光合作用生长。

D、箱体内采用电风扇混匀产生的二氧化碳。用日光灯补充光照。采用冷却水流经冷却管降低箱内温度至24-26℃，降低箱体内空气相对湿度至65％-75％。通过输液瓶向栽培盘中补充水或硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾营养液。反应槽中的反应残液通过残液排出管排出箱外，箱内冷凝水通过冷凝水排出管排出箱外。

E、栽培结束时，残留箱内的碳-14(或碳-13)标记的二氧化碳采用真空泵抽气使其通过吸附瓶时吸附于氢氧化钠溶液中。然后打开箱门，完整地取出植株，经洗净、杀青、烘干后得到碳-14(或碳-13)标记的植物。

实现上述标记的方法，必须依靠本发明的装置才能完成，该装置包括：一个密闭的聚乙烯板制成的箱体置于木质箱架上。箱体左右二边各设一个圆型箱门，箱门通过穿过箱壁和箱门的16-18个螺丝固定在箱壁上。箱顶内壁安装2-4根日光灯，日光灯电源线穿过箱壁至箱外，再通过开关与电源相连。箱体左右二边内壁各安装一个电风扇，电风扇电源线穿过箱壁至箱外，在通过开关与电源相连。箱体左右二边内壁各安装一个总长为1-1.5米的铜质蛇型冷却管，冷却管二端穿过箱壁，再通过阀门分别与冷却水进水管和排水管连接。箱内底板上放置3-4个栽培盘。箱内底板左边放置一个反应槽，反应槽底部安装一根反应残液排出管，残液排出管穿过反应槽壁和箱壁至箱外，再与阀门连接。箱体右边底部安装一根冷凝水排出管，冷凝水排出管穿过箱壁至箱外，再与阀门连接。箱体左边安装3-4个装有氢氧化钠溶液的吸附瓶，吸附瓶之间用橡胶管连接；吸附瓶一端通过橡胶管连接阀门，再通过橡胶管穿过箱壁与箱内连通，吸附瓶另一端通过橡胶管连接阀门，再与大气连通。箱体右边也安装3-4装有氢氧化钠溶液的吸附瓶，吸附瓶之间也用橡胶管连接，吸附瓶一端通过橡胶管连接阀门，再通过橡胶管穿过箱壁与箱内连通，吸附瓶另一端通过橡胶管连接阀门，再与无油真空泵连接。箱体正面外壁左边分别固定一个盐酸输液瓶和一个碳-14或碳-13标记的碳酸溶液输液瓶，输液瓶下端分别连接一根带压阀开关的塑料输液管，输液管下端分别穿过箱壁进入箱内，然后置于反应槽中。箱体正面外壁右边固定3-4个营养液输液瓶，输液瓶下端分别连接一根带压阀开关的塑料输液管，输液管下端穿过箱壁进入箱内，再置于栽培盘中。箱体左边壁上安装一根温度计，温度计探头穿过箱壁置于箱内空气中。箱体左边壁外安装一个弯管式压力计，压力计一端穿过箱壁与箱内连通，另一端置于箱外与大气连通，弯管压力计内加入液体石蜡。整个箱体严格密闭，穿过箱壁所有管道周围用玻璃胶密封。

本发明具有以下优点：

1.在密闭条件下缓慢加入碳-14(或碳-13)标记的碳酸纳溶液与盐酸溶液于反应槽，可防止反应过于剧烈，产生的碳-14或碳-13标记的二氧化碳没有任何外逸损失；

2.整个栽培期中植物都在密闭箱内生长，不仅提高了碳-14(或碳-13)同位素原料的利用效率，且标记的植物中碳同位素具有很好的均一性；

3.采用土壤栽培比用液体栽培更适合于各种植物的生产，特别是木本植物，且生长的植物更接近自然条件栽培的植物：

4.采用冷却管不仅可降低箱温度，而且可降低箱内由于密闭带来的高湿度，同时采用日光灯补充光照，这样更有利于植物正常生长；

5.箱内安装了风扇，使空气流动保证了箱内空气中碳-14(或碳-13)标记的二氧化碳均匀，使植株间碳同位素的标记强度相同；

6.箱内按装了温度计和压力计，有利于随时了解箱内温度和压力并对其进行调控：

7.该装置结构简单、成本低，操作方法简便、安全；

8.实用性广，不仅适合于直接对植物进行碳同位素标记，且适合于植物根系向土壤输入(分泌)的碳量以及植物的光合作用等方面研究的使用。

附图说明

图1为植物碳同位素标记装置的示意图。

具体实施方式

本发明的植物碳同位素标记的方法，包括下列步骤：

A、在栽培盘中加入土壤，取相当于烘干重40-60公斤有机质含量较低的新鲜表层(0-20厘米)土壤，去掉可见的植物残体，适当风干后，过2毫米孔径筛，在土壤中均匀地喷施硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾混合溶液，施入的氮、磷和钾量分别为80、20和80毫克/公斤土，将土壤分装于长×宽×高为45×45×15厘米的栽培盘中，每盘装土壤13-15公斤。将水稻或玉米等种子先用水清洗，置于垫有滤纸的培养皿中，加入10毫升蒸馏水，将培养皿置于25℃下培养3-4天，使种子发芽。将已发芽的水稻或玉米等种子播种到栽培盘中，根据植物种类调节土壤含水量至饱和持水量的55％-105％。在23-27℃使小苗生长2-3天。

B、将栽培盘置于标记箱中，在箱门和箱壁连接处涂一层高温真空硅脂，拧紧穿过箱壁和箱门的16-18个螺丝，密闭箱门。在弯管式压力计中加入液体石蜡。在箱两端的吸附瓶中加入200毫升2摩尔氢氧化钠溶液。先关闭箱左边吸附瓶两端的阀门，用真空泵抽气使箱内形成-0.01至-0.02Mpa真空度，当压力计弯管两边液体石蜡液面相差为3-5厘米时，关闭箱左边吸附瓶两端的阀门，24小时后压力计弯管两边液体石蜡液面差没有明显变化时，表明箱体密封良好可进行下一步植物标记操作。

C、通过碳酸钠溶液输液瓶加入碳-14(或碳-13)标记的碳酸钠溶液300-500毫升于反应槽中，采用碳-14标记时其碳酸钠浓度为1摩尔，碳-14放射性强度为0.15-0.25毫居里，且该碳酸钠溶液中加有3-4滴酚酞指示剂。再通过盐酸输液瓶加入2.5摩尔盐酸溶液300-500毫升于反应槽中，通过调节输液管上阀门使盐酸溶液在12-24小时内慢慢滴完，以防止反应剧烈。当反应液变为红色时，表明碳酸钠已反应完全。根据植物生长情况每周加入1-2次碳-14标记(或碳-13)的碳酸钠和盐酸溶液。

D、标记栽培过程中，开启箱内电风扇使气体中碳-14标记的二氧化碳浓度均匀；开启冷却水通过蛇形冷却管降低箱内温度和空气湿度，每天观察和记录箱内温度1-2次，箱内温度保持应在24-26℃左右；开启日光灯12小时以补充光照；根据植物生长情况和栽培盘中土壤干湿程度，通过营养液输液瓶加入硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾混合营养液或者水溶液；反应槽中完全反应的废液通过打开反应残液排出管阀门排出箱外，箱内水蒸气冷凝后聚集的冷凝水通过打开冷凝水排出管阀门排出箱外。

E、通常标记栽培60-90天即可达到所需要的植物生物量，此时结束栽培。在结束栽培前一周停止加入碳-14(或碳-13)标记的碳酸钠溶液。然后打开吸附瓶两端的阀门，开启真空泵使残留在箱内气体中的碳-14(或碳-13)标记二氧化碳通过气流吸附到氢氧化钠溶液中。再打开标记箱两边的箱门，取出栽培盘，加水淹没栽培盘中土壤，浸泡4-8小时。然后轻轻从栽培盘土壤中取出植株，应尽量保持植株根系完整，小心地用水清洗植株上残留的土壤，沥干植株上的水。再置于烘箱中经80-105℃杀青30分钟后，在50-60℃条件下烘干，得到碳-14(或碳-13)标记的植物材料。标记的植物材料经粉碎，测定其碳-14(碳-13)放射性强度(或风度)后，即可用于植物残体碳在土壤中转化和循环等方面的研究。此外，通过测定栽培盘中土壤残留的碳-14(或碳-13)标记的有机碳放射性强度(或风度)，可计算得到植物根系分泌的有机碳量。(见下表)

标记箱法栽培碳-14标记的水稻生物量及其放射性强度(表1)

标记方法	植物种类	植株部分	生物量干重(g)	碳含量(％)	碳-14放射性强度(DPM/mgC)
						本发明	水稻	茎叶根	47.013.8	39.938.5	1270013800

试剂配制

1、硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾混合溶液：20.0g(NH₄)₂SO₄、4.08g NaH₂PO₄、8.0g KCl溶于蒸馏水定容至2L。

2、氢氧化钠溶液(2mol/L)：80.0化学纯NaOH溶于蒸馏水定容至1L。

3、盐酸溶液(2mol/L)：167.0ml化学纯浓盐酸(HCI，比重为1.19g/ml)溶于蒸馏水释释到1L。

4、碳-14标记的碳酸钠溶液：1166.0g Na₂CO₃溶于10L蒸馏水，加入5毫居里C¹⁴-Na₂CO₃，得碳-14标记的碳酸钠溶液。

5、碳-13标记的碳酸钠溶液：583.0g丰度为10Atom％的C¹³-Na₂CO₃溶于5L蒸馏水。

本发明的方法的装置如图1所示，箱体1由厚12毫米的聚乙烯板制成，其长×宽×高为2.5-2.8×1.3-1.5×1.0-1.5米，箱体1严格密封，箱体1置于长×宽×高为2.5-2.8×1.3-1.5×0.4-0.6米的木质箱架10上。箱体1左右二边壁上各设一个直径为40-50厘米的圆型聚乙烯板箱门2(箱门2或为椭圆型或正方形或长方形)，箱门2通过穿过箱壁和箱门2的16-18个螺丝固定在箱壁上。箱顶内壁安装2-4根40瓦的日光灯3，日光灯3电源线穿过箱壁至箱外，再通过开关与电源相连，日光灯3的作用为增加光照。箱体1左右二边内壁各安装一个30-50瓦的电风扇4，电风扇4电源线穿过箱壁至箱外，再通过开关与电源相连，电风扇4的作用是混合箱内气体。箱体1左右二边内壁各安装一个总长为1-1.5米的铜质蛇型冷却管5，冷却管5二端穿过箱壁，再通过阀门与冷却水管连接，冷却管5的作用为降低箱内温度和湿度。箱内底板上放置3-4个长×宽×高为45×45×15厘米的聚乙烯栽培盘6，栽培盘6内放有土壤用于栽培植物。箱内底板左边还放置一个长×宽×高为25×15×45厘米的聚乙烯反应槽7，用于碳-14(碳-13)标记的碳酸钠溶液与盐酸溶液反应产生碳-14(碳-13)标记的二氧化碳，供作物生长利用。反应槽7底部安装一根玻璃反应残液排出管8，残液排出管8穿过反应槽7壁和箱壁至箱外，再与阀门连接，用于反应残液排出。箱体1右边底部安装一根玻璃冷凝水排出管9，冷凝水排出管9穿过箱壁至箱外，再与阀门连接，用于箱内冷凝水排出。箱体1左边安装3-4个400毫升的吸附瓶11，吸附瓶11内装有200-250毫升2摩尔的氢氧化钠溶液；吸附瓶11之间用橡胶管连接，吸附瓶11一端通过橡胶管连接阀门，再通过橡胶管穿过箱壁与箱内连通，吸附瓶11另一端通过橡胶管连接阀门，再与大气连通，吸附瓶11的作用主要是栽培结束时吸收箱内残余的碳-14(碳-13)标记的二氧化碳气体。箱体1右边同样安装3-4装有氢氧化钠溶液的吸附瓶11，吸附瓶11之间也用橡胶管连接，吸附瓶11一端通过橡胶管连接阀门，再通过橡胶管穿过箱壁与箱内连通，吸附瓶11另一端通过橡胶管连接阀门，再与无油真空泵12连接，真空泵12的作用是抽真空或箱内气体。箱体正面外壁左边分别固定二个500毫升的输液瓶13、14，一个为2摩尔的盐酸溶液输液瓶13，一个为1摩尔的碳-14(或碳-13)标记的碳酸纳溶液输液瓶14，输液瓶13、14下端分别连接一根带压阀开关的塑料输液管16，输液管16下端分别穿过箱壁进入箱内，再置于反应槽7中，分别用于输送盐酸溶液和碳-14(或碳-13)标记的碳酸纳溶液至反应槽7中。箱体1正面外壁右边固定3-4个500毫升的输液瓶15，输液瓶15下端分别连接一根带压阀开关的塑料输液管16，输液管16下端穿过箱壁进入箱内，再置于栽培盘6中，用于输送氮磷钾营养液或者水至栽培盘6中。箱体1左边壁上安装一根量程100度的温度计17，温度计探头穿过箱壁置于箱内空气中，用于观察箱内温度。箱体1左边壁上安装一个高度为50-80厘米高的玻璃弯管式压力计18，压力计18一端穿过箱壁与箱内连通，另一端置于箱外与大气连通，压力计18弯管内装液体石蜡，用于观察箱内压力变化。箱壁所有穿过管道处均用玻璃胶密封，以保证箱体严格密封。

Claims (4)

1、一种植物碳同位素标记的方法，其特征在于：它包括下列步骤：

A、在栽培盘中加入新鲜土壤，在土壤中喷施硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾营养液，将已发芽的种子播种于栽培盘土壤中，调节土壤含水量，在23-27℃使小苗生长2-3天；

B、将栽培盘置于标记箱内底板上，在箱门和箱壁连接处涂一层高温真空硅脂，拧紧穿过箱壁和箱门的螺丝，密闭箱门，关闭箱体左边吸附瓶二端的阀门，打开箱体右边吸附瓶二端的阀门，开启真空泵抽真空，使箱体内真空度到达-0.01至-0.02Mpa，关闭吸附瓶二端的阀门，关闭真空泵；

C、在密闭条件下加入碳-14或碳-13标记的碳酸纳溶液与盐酸溶液于反应槽中，反应产生碳-14标记的二氧化碳供植物进行光合作用生长；

D、箱体内采用电风扇混匀产生的二氧化碳，用日光灯补充光照，采用冷却水流经冷却管降低箱内温度至24-26℃，降低箱体内空气相对湿度至65％-75％，通过输液瓶向栽培盘中补充水或硫酸铵、磷酸二氢钠和氯化钾营养液，反应槽中的反应残液通过残液排出管排出箱外，箱内冷凝水通过冷凝水排出管排出箱外；

E、栽培结束时，残留箱内的碳-14标记的二氧化碳采用真空泵抽气使其通过吸附瓶时吸附于氢氧化钠溶液中，然后打开箱门，取出植株，经洗净、杀青、烘干后得到碳-14标记的植物。

2、一种用于实现权利要求1所述的植物碳同位素标记方法的装置，其特征在于：

箱体(1)左右各设一个箱门(2)，箱门(2)穿过箱壁和箱门(2)的螺丝固定在箱壁上，箱顶内壁安装日光灯(3)，箱体(1)二边内壁各安装一个电风扇(4)，箱体(1)二边内壁各安装铜质蛇型冷却管(5)，箱内底板放置反应槽(7)，反应槽(7)底部安装反应残液排出管(8)，残液排出管(8)穿过反应槽(7)壁和箱壁至箱外，再与阀门连接，箱体(1)底部安装冷凝水排出管(9)，冷凝水排出管(9)穿过箱壁至箱外，再与阀门连接，箱体(1)左边安装盛有氢氧化钠溶液的吸附瓶(11)，吸附瓶(11)之间用橡胶管连接，吸附瓶(11)通过橡胶管连接阀门，再通过橡胶管穿过箱壁与箱内连通，吸附瓶(11)另一端通过橡胶管连接阀门，再与大气连通，箱体(1)右边安装盛有氢氧化钠溶液的吸附瓶(11)，箱体(1)外壁分别固定盐酸输液瓶(13)和一个碳-14或碳-13标记的碳酸溶液输液瓶(14)，输液瓶(13、14)下端分别连接一根带压阀开关的塑料输液管(16)，输液管(16)下端分别穿过箱壁进入箱内，然后置于反应槽(7)中，箱体(1)外壁固定输液瓶(15)，输液瓶(15)下端分别连接一根带压阀开关的塑料输液管(16)，输液管(16)下端穿过箱壁进入箱内，再置于栽培盘(6)中。

3、根据权利要求2所述的一种植物同位素标记方法的装置，其特征在于：吸附瓶(11)之间用橡胶管连接，吸附瓶(11)一端通过橡胶管连接阀门，再通过橡胶管穿过箱壁与箱内连通，吸附管(11)另一端通过橡胶管连接阀门，再与真空泵(12)连接。

4、根据权利要求2所述的一种植物同位素标记方法的装置，其特征在于：箱体(1)上装温度计(17)，压力计(18)。

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