CN100999737A - 旋毛虫副肌球蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及旋毛虫新抗原基因副肌球蛋白基因，含有该基因的载体的构建及原核表达载体，以及所表达的蛋白。本发明还涉及所述基因及编码的蛋白的应用。旋毛虫副肌球蛋白基因重组蛋白免疫动物后产生高滴度的抗体并对攻击感染产生有效的免疫保护性。

Description

旋毛虫副肌球蛋白基因及其应用

发明领域

本发明为一种旋毛虫新抗原基因副肌球蛋白基因，含有该基因的载体的构建及原核表达载体，以及所表达的蛋白及由蛋白免疫动物产生的抗体。本发明还涉及所述基因和蛋白的应用。

背景技术

旋毛形线虫(Trichinella spiralis，简称旋毛虫)，可感染人及150多种动物，它所引起的旋毛虫病是一种人畜共患寄生虫病，呈全球性分布，严重地威胁了人类健康并对畜牧业造成巨大经济损失。旋毛虫生活史简述如下：当人或动物宿主生食或半生食含旋毛虫囊包的肉类(猪肉、狗肉等)，囊包内幼虫在胃液、肠液作用下逸出并在小肠内发育为成虫。雌、雄虫交配后雌虫产新生幼虫。新生幼虫侵入肠粘膜淋巴管或静脉，随淋巴和血循环到达宿主横纹肌继续发育。旋毛虫的致病过程分为三期：侵入期、幼虫移行及囊包形成期，即在该虫生活史的每个环节均可使宿主致病。

旋毛虫病临床表现复杂多样，仅依临床症状及时作出准确诊断较困难，给及时的治疗造成一定难度，因此该病的免疫诊断及预防成为当务之急。由于病原体不能在体外大量传代培养，限制了抗原的获取；加之旋毛虫抗原的复杂性、多样性，造成目前尚无很好的高敏感度高特异性的抗原作为诊断或保护性疫苗的候选抗原分子。

发明内容

本发明的目的在于：寻找和克隆旋毛虫抗原新基因，对该基因的基因重组蛋白进行免疫学功能的研究，为旋毛虫病的免疫诊断及免疫预防、治疗提供新的候选抗原分子。

本发明提供了分离的多核苷酸分子，其包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(A)与SEQ ID NO：1所示序列或SEQ ID NO：1中开放阅读框(第75-2732位核苷酸)至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％同源的核苷酸序列；

(B)与SEQ ID NO：1所示序列或SEQ ID NO：1中开放阅读框的互补序列在中等严格杂交条件、优选高严格杂交条件下可发生杂交的核苷酸序列；

(C)与SEQ ID NO：1编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；

(D)(A)、(B)或(C)所述核苷酸序列的片段；和

(E)与(A)、(B)、(C)或(D)所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，本发明的多核苷酸分子编码具有免疫原性的多肽。

在一个具体实施方案中，所述的多核苷酸分子具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者SEQ ID NO：1第75-2732位核苷酸所示开放阅读框序列。

本发明还提供了分离的多肽，其包含从如下组氨基酸序列中选择的氨基酸序列：

(A)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％同源的氨基酸序列；

(B)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个)氨基酸残基的替代、缺失或插入而与SEQ ID NO：2所示序列有所不同的氨基酸序列；和

(C)(A)或(B)所述氨基酸序列的免疫原性片段。

优选地，本发明的多肽具有免疫原性。

在一个具体实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

本发明还提供重组载体，其包含本发明所述多核苷酸分子。优选所述重组载体是表达载体，其包含并能够表达包含本发明所述多核苷酸分子。

本发明还提供含有本发明重组表达载体的宿主细胞。

本发明还提供生产多肽的方法，包括在能使所述多肽表达的条件下培养本发明所述的宿主细胞和回收所表达的多肽。

本发明还提供抗体，其可特异性结合本发明所述多肽。所述抗体可以是多克隆或者单克隆抗体。

本发明还提供用于预防或治疗动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的药物组合物，所述的药物组合物中含有本发明所述多肽或者多核苷酸或者抗体。

本发明还提供用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的诊断试剂盒，其中含有本发明所述多核苷酸分子、可检测本发明所述多核苷酸分子的核酸探针、可特异性扩增本发明所述多核苷酸分子的引物、本发明所述多肽、或者本发明所述抗体。

本发明提供本发明所述多核苷酸分子、可检测本发明所述多核苷酸分子的核酸探针、可特异性扩增本发明所述多核苷酸分子的引物、本发明所述多肽、或者本发明所述抗体在制备用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的诊断试剂中的用途。

本发明还提供本发明所述多核苷酸分子或者多肽或者抗体在制备用于预防或治疗人畜旋毛虫感染的药物中的用途。

本发明还提供寡核苷酸，其含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或SEQID NO：1第75-2732位核苷酸所示开放阅读框序列或者其互补序列中的至少15个、优选至少25个、更优选至少50个核苷酸或者其相似序列，所述相似序列能够与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者其互补序列在高度严格杂交条件下发生杂交。优选地，所述寡核苷酸是可检测本发明所述多核苷酸分子的核酸探针、或者可特异性扩增本发明所述多核苷酸分子的引物。

本发明还提供本发明寡核苷酸用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的用途。

本发明还提供融合蛋白，其包含本发明所述多肽及另一融合对象。在一个具体实施方案中，所述另一融合对象是β-半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-转移酶或多组氨酸等。

本发明的核苷酸序列可以用免疫筛选从旋毛虫cDNA基因文库中获得。本发明还涉及该序列的变异体，例如一个或多个碱基的缺失、添加或替换，但不改变所编码的蛋白质的功能。变异体可以是天然存在的等效变异体或非天然存在的变异体。

本发明的多肽可以通过构建上述基因的原核或真核表达载体，转化到适合的宿主细胞中，从培养物中纯化多肽来制备。本发明的多肽包括序列2的多肽，以及具有等效功能的它的衍生物、片段或类似物。

作为具体实例，本发明发明人利用分子生物学技术，如：cDNA文库免疫筛选、分子克隆、聚合酶链式反应(PCR)、DNA序列测定、Southern杂交、Western印迹杂交法，克隆鉴定了旋毛虫抗原新基因副肌球蛋白基因；利用基因表达及免疫学技术获得该基因的重组蛋白及高效价免疫血清；并对该蛋白的细胞定位、免疫原性及免疫保护性进行了分析。

该基因达到的技术指标为：

1.在本发明中采用cDNA文库免疫筛选获得该基因的全长cDNA序列。全长2996bp，起始密码子ATG位于序列第74bp处，TGA为终止密码子，编码的蛋白质含885个氨基酸。

2.旋毛虫副肌球蛋白基因的885个氨基酸重组蛋白在大肠杆菌BL21株中获得表达并纯化(图1)。

3.旋毛虫副肌球蛋白基因重组蛋白免疫动物获高滴度抗副肌球蛋白免疫血清。

4.旋毛虫副肌球蛋白基因重组蛋白为感染旋毛虫的病人血清、病猪血清、病兔血清所识别。并与副肌球蛋白基因重组蛋白人工免疫鼠血清发生反应(图2)。

5.旋毛虫副肌球蛋白基因重组蛋白免疫动物后对攻击感染产生有效的免疫保护性(表1)。

本发明发现了旋毛虫副肌球蛋白抗原基因全长cDNA；获得了纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白及进行了免疫学功能的研究，为旋毛虫病的免疫预防提供了新的保护性候选抗原分子。并且也可以用于制备诊断试剂。

附图说明

图1SDS-PAGE电泳：副肌球蛋白基因重组蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化。其中，各泳道代表：

M.蛋白分子量Marker

1.空载体全菌蛋白

2.未经IPTG诱导的全菌蛋白

3.IPTG诱导后的全菌蛋白

4.纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白

箭头所指为重组蛋白带

图2Western免疫印迹鉴定副肌球蛋白基因重组蛋白的免疫特性。其中，各泳道代表：

1.纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白与旋毛虫病人血清反应

2.纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白与感染旋毛虫的猪血清反应

3.纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白与感染旋毛虫的兔血清反应

4.纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白与该重组蛋白人工免疫鼠血清反应。

具体实施方式

本文所用的术语“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等是指单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。

生产和操作本文公开的多核苷酸分子及寡核苷酸分子的方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的重组技术(参见Maniatis等，1989， 分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989， 分子生物学当前技术，Greene Publishing Associates& Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989， 分子克隆，实验室手 册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，Academic Press，Inc.，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，New York)完成。

本发明提供了一种编码免疫原性多肽的分离的多核苷酸分子。在一个实施方案中，本发明分离的多核苷酸分子包含选自下列成员的核苷酸序列：(1)SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：1中开放阅读框(第75-2732位)所示的核苷酸序列；(2)与SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：1中开放阅读框所示核苷酸序列至少70％相同、优选至少80％相同、更优选至少90％相同、最优选95％相同的核苷酸序列；(3)在中等严谨杂交条件下(即在0.5M NaHPO₄、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.2xSSC/0.1％SDS中于42℃洗涤的条件；参见Ausubel等(编)，1989， 分子生物学当前技术，第1卷，GreenPublishing Associntes，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)、优选高度严谨杂交条件(即在0.5M NaHPO₄、7％SDS、1mM EDTA中于65℃与结合于滤膜的DNA杂交，并在0.1xSSC/0.1％SDS中于68℃洗涤条件；参阅Ausubel等，1989，上述文献)下与具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1中开放阅读框或者其互补序列的多核苷酸分子能杂交的核苷酸序列；(4)与SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：1中开放阅读框编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；或者(5)与(1)-(4)中任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明多核苷酸分子包含编码旋毛虫副肌球蛋白的核苷酸序列。

在一个实施方案中，本发明多核苷酸分子可用于以标准扩增技术扩增旋毛虫特异性多核苷酸分子，或作为诊断试剂用以检测被旋毛虫感染的动物体液或组织样品中旋毛虫特异性多核苷酸的存在。

本发明进一步提供包含编码同源于本发明旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽之多肽的核苷酸序列的一种分离多核苷酸分子。本文中提到同源于旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽的多肽时所使用的术语“同源”是指多肽本来具有旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽的氨基酸序列，但其中一个或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个)氨基酸残基已被不同的氨基酸残基保守地替代，并且所得到的多肽可用于实施本发明。保守氨基酸替代是本领域已知的。造成这样的替代的规则包含由Dayhof，M.D.(1978，国家生物医学研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的替代规则。更具体地说，保守氨基酸替代发生在与其酸性、极性或侧链大小相关联的氨基酸家族内。一般可将遗传编码的氨基酸分为四组：(1)酸性氨基酸＝天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸＝赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸＝丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不带电的极性氨基酸＝甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分类为芳香氨基酸。任何特定组内的一个或多个替代，例如用异亮氨酸或缬氨酸替代亮氨酸、或用谷氨酸替代天冬氨酸、或用丝氨酸替代苏氨酸，或任何其他氨基酸残基结构上相关的氨基酸残基，例如有相似酸性、极性、侧链大小的，或在其某些组合方面有相似性的氨基酸残基替代，一般对多肽的功能或免疫原性不会有太大影响。

基本同源的蛋白质和多肽其特征在于具有一个或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个)氨基酸替代、删除或添加。这些改变优选影响较小的变换，即保守氨基酸替代(见表2)及其它不会严重影响蛋白质或多肽的折叠和活性的替代；小的删除，通常是1-约30个氨基酸的小删除；及小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基，长达约20-25个残基的小连接肽，或便于纯化的小延伸(亲和标记)，如多组氨酸束、蛋白A(Nilsson等，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson等，酶学方法，198：3，1991)。编码亲和标记的DNA可从产品供应商处购买到。

本文中所说的多肽“可用于实施本发明”是指该多肽可用作诊断试剂，以检测新近被旋毛虫感染的、或已被旋毛虫感染的动物血液或血清样品中旋毛虫特异性抗体的存在；或者可用作抗原产生旋毛虫特异性抗体(例如特异结合的抗体、中和性抗体、治疗性抗体)；或者可作为免疫原对动物进行预防性免疫或者治疗性免疫，或者本文提到的该多肽的任何用途。

本发明进一步提供与本发明上述多核苷酸分子能杂交，或与具有作为本发明上述多核苷酸分子之互补物的核苷酸序列的多核苷酸分子能杂交的寡核苷酸分子。这样的寡核苷酸分子较好是至少长约15nt，更好是长约25nt，尤其是至少50nt，并可在高度严紧条件下与一种或多种上述多核苷酸分子杂交。所说的高度严紧条件是在6XSSC/0.5％焦磷酸钠中洗膜，并且洗膜温度对于长约14碱基者为大约37℃，长约17碱基者为大约48℃，长约20碱基者为大约55℃，长约23碱基者为大约60℃。本发明的较长寡核苷酸分子的其他杂交条件可由本领域技术人员按照标准技术来确定。在一优选实施方案中，本发明的寡核苷酸分子互补于本发明上述多核苷酸分子至少之一的一部分。

本发明的寡核苷酸分子可用于多种目的，其中包括作为扩增旋毛虫特异性多核苷酸分子的引物以用于诸如疾病鉴别诊断，或者编码或用作基因调节的反义分子。就诊断方面来说，可使用适当设计的引物检测动物组织或体液等样品中旋毛虫特异性多核苷酸分子的存在。特异性扩增产物的产生可支持旋毛虫感染的诊断，而缺少扩增的产物则可能指示没有感染。例如Innis等人(1995，出处同前)和Erlicch(1992，出处同前)编辑的前述文献中描述了进行扩增的方法，例如聚合酶链反应(PCR)方法。本领域已知的其他扩增技术也可使用，例如连接酶链反应法。也可使用本文公开的多核苷酸分子的序列设计用于从旋毛虫的其他种或株系中分离同源基因的引物。

本发明进一步提供包含本发明多核苷酸分子的克隆载体、表达载体、包含任何所说载体的被转化宿主细胞，以及由其衍生的新的株系或细胞系。在一优选实施方案中，本发明提供包含一种多核苷酸分子的重组载体，所说多核苷酸分子具有编码旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽的核苷酸序列。

优选地，本发明的重组载体，特别是表达载体的构建方式能使得本发明多核苷酸分子的编码序列与转录和翻译编码序列所需的一个或多个调节元件可操作性地连接，以产生多肽。本文中使用的术语“调节元件”包括但不只限于编码诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵子及本领域已知的可用于驱动和/或调节多核苷酸编码序列表达的其它元件的核苷酸序列。另外，本文所说的编码序列与一个或多个调节元件“可操作性地连接”是指调节元件可有效地调节并允许转录编码序列或翻译其mRNA，或发挥两方面的功能。

构建包含与适当的调节元件可操作性地连接的特定编码序列的重组载体的方法是已知的，并可使用这些方法实现本发明。这些方法包括体外重组技术、合成技术和体内遗传重组(如参见Maniatis等人(1989)的上述文献)。

可用于表达本发明的旋毛虫副肌球蛋白或者本发明免疫原性多肽编码序列的各种载体是本领域已知的，其中包括含有特定编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA和粘粒DNA表达载体。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的质粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(BioradLaboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-T EASY(Promega，Madison，WI)等。可经加工而含有本发明的多核苷酸分子的典型真核表达载体包括蜕皮激素诱导型哺乳动物表达系统(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基于巨细胞病毒启动子-增强子的系统(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)，和基于杆状病毒的表达系统(Promega)等。

这些和其他载体的调节元件可在其强度和特异性方面各不相同。基于所利用的宿主/载体系统，可以使用多种适当的转录和翻译元件中的任一种。例如，当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可使用从哺乳动物细胞基因组中分离的启动子，如小鼠金属硫蛋白启动子，或从生长于这些细胞内的病毒中分离的启动子，如痘苗病毒7.5K启动子或莫洛尼鼠类肉瘤病毒长末端重复序列。可使用以重组DNA或合成技术得到的启动子以转录被插入的序列。另外，在特定诱导子，例如适于金属硫蛋白启动子的锌和镉离子的存在下，由某些启动子启动的表达可以被增强。转录调节区或启动子的非限制性例子包括用于细菌的β-gal启动子、T7启动子、TAC启动子、trp和lac启动子、trp-lac融合启动子等；用于酵母的糖酵解酶启动子，如ADH-和ADH-II启动子、GPK启动子、PGI启动子、TRP启动子等；以及用于哺乳动物细胞的SV40早期和晚期启动子、腺病毒主要晚期启动子等。本发明进一步提供包含旋毛虫副肌球蛋白基因之启动子的核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用于在旋毛虫中表达本发明的编码序列。

为足够地翻译被插入的编码序列，还需要特异性起始信号。这些信号一般包括ATG起始密码子及相邻序列。在将包含其自身的起始密码子和相邻序列的本发明的多核苷酸分子插入到适当的表达载体中的情况下，可能不必加入另外的翻译控制信号。然而，当只插入一部分编码序列时，可能需要包括ATG起始密码子等的外源翻译控制信号。可从各种来源，即天然和合成来源，得到这些外源翻译控制信号和起始密码子。再者，起始密码子必须与编码区的读框一致，以确保整个插入片段符合读框地翻译。

也可构建将表达包含本发明蛋白质或多肽和融合对象的融合蛋白质的表达载体。这样的融合蛋白质例如可用于产生抗旋毛虫蛋白的抗血清、研究旋毛虫蛋白的生化性质、工程化修饰表现有不同免疫学或功能性质的旋毛虫蛋白、帮助鉴定或纯化重组表达的旋毛虫蛋白或改善其稳定性。可能的融合蛋白表达载体包括但不只限于插入了编码β半乳糖苷酶和trpE融合体、麦芽糖结合蛋白融合体、谷胱甘肽-S-转移酶融合体及多组氨酸融合体(载体区域)之序列的载体。可用于构建编码这些和其他融合蛋白的表达载体的方法是本领域已知的。

可用融合蛋白质帮助纯化已表达的蛋白质。在一非限制性实施方案中，可使用直链淀粉树脂纯化副肌球蛋白或免疫原性多肽-麦芽糖结合性融合蛋白，可使用谷胱甘肽琼脂糖小球纯化副肌球蛋白或免疫原性多肽-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质，可使用二价镍树脂纯化副肌球蛋白或免疫原性多肽-多组氨酸融合蛋白质。或者，也可使用抗载体蛋白质或肽的抗体对融合蛋白质进行亲和层析纯化。例如，可将编码单克隆抗体之靶表位的核苷酸序列工程化转移到与调节元件可操作性地连接的表达载体中，并限定其位置以使所表达的表位融合到本发明的旋毛虫蛋白上。在一非限制性实施方案中，可用标准技术在相当于副肌球蛋白或免疫原性多肽之氨基或羧基末端的某个点上插入编码FLAG^TM表位标记(其为亲水性标记肽)(Znternational Biotechnologies Inc.)的核苷酸序列中，然后可使用市售的抗FLAG^TM抗体检测并亲和纯化所表达的副肌球蛋白或免疫原性多肽-FLAG^TM表位融合体产物。

也可以修饰表达载体使之含有编码特定蛋白酶切割位点的多接头序列，从而可经特定蛋白酶处理而从载体区域或融合对象释放出已表达的旋毛虫蛋白。例如，融合蛋白载体可包含编码凝血酶或因子Xa裂解位点的核苷酸序列。

可使用已知方法将位于旋毛虫蛋白编码序列上游且读框一致的信号序列加工到表达载体中，以指导所表达之蛋白质的运输和分泌。信号序列的非限制性实例包括α因子、免疫球蛋白、外膜蛋白质、青霉素酶及T细胞受体等的信号序列。

为了有助于筛选出经本发明重组载体转化或转染的宿主细胞，可以工程化修饰载体使之进一步包含报道基因产物或其他选择标志的编码序列。这样的编码序列较好是与上述调节元件可操作性地连接的。用于实施本发明的报道基因是本领域熟知的，包括编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)、绿色荧光蛋白、荧火虫荧光素酶和人生长激素等的基因。编码选择标志的核苷酸序列是本领域已知的，包括编码赋予抗生素抗性或抗代谢物抗性，或提供营养缺陷型需要等的基因产物的那些核苷酸序列。这些序列的例子包括编码胸苷激酶活性，或抗氨甲喋呤、氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、氨基糖苷或潮霉素等的那些序列。

本发明进一步提供包含本发明的多核苷酸分子或重组载体的已转化宿主细胞，以及由之衍生的细胞系。可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞。这样的已转化宿主细胞包括但不只限于微生物，例如用重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA载体转化的细菌，或者用重组载体转化的酵母，或者是动物细胞，如用重组病毒载体如杆状病毒感染的昆虫细胞，或用重组病毒载体如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳动物细胞等。例如，可使用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主细胞包括酵母细胞，但也可有效地利用小鼠、仓鼠、牛、猴或人细胞系等哺乳动物细胞。可用于表达本发明的重组蛋白质的真核宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH/3T3等。

较好是将本发明的重组载体转化或转染到细胞的基本均一培养物的一个或多个宿主细胞中。一般可按照已知技术，例如原生质体转化、磷酸钙沉淀、氯化钙处理、微量注射、电穿孔、经与重组的病毒接触进行感染、脂质体介导的转染、DEAE-葡聚糖转染、转导、接合或微粒轰击等技术将载体导入宿主细胞内。可使用标准方法选择转化体，例如通过选择表达与重组表达载体相关的可选择标志如抗生素抗性的细胞的方法。

一旦将表达载体导入宿主细胞后，即可使用Southern杂交分析、限制性酶切分析、包括反转录酶PCR(rt-PCR)的PCR分析等标准技术证实本发明的多核苷酸分子是否整合并保留在宿主细胞基因组中或以附加体形式存在，或者用免疫学检测法检测预期的蛋白质产物。可用本领域已知的至少下列四种一般性方法中的一种鉴定含有和/或表达本发明的多核苷酸分子的宿主细胞：(i)DNA-DNA、DNA-RNA、或RNA-反义RNA杂交；(ii)检测“标志”基因功能的存在；(iii)检测特异性mRNA转录本在宿主细胞中的表达，以估计转录水平；或(iv)以本领域已知的免疫检测法检测成熟多肽产物的存在。

一旦已将本发明的多核苷酸分子稳定导入到适当的宿主细胞中之后，即可克隆增殖已转化的宿主细胞，并在有助于最大量产生所编码的多肽的条件下培养所得到的细胞。这样的条件一般包括培养已转化的细胞达到高密度。当表达载体含有诱导型启动子时，可根据需要，利用温度改变、营养素耗尽、加入义务诱导剂(如糖类类似物，例如异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、过量代谢付产物积聚等适当诱导条件以诱导表达。

当多肽保留在宿主细胞内时，应收获并裂解细胞，并在本领域已知的尽可能减少蛋白质降解的提取条件下，例如于4℃和/或有蛋白酶抑制剂存在条件下，从裂解物中基本上纯化或分离产物。如多肽能从宿主细胞中分泌出来，则可简单地收集已耗竭的营养素培养基，并从中基本上纯化或分离多肽。

必要时，可使用标准方法，包括但不只限于硫酸铵沉淀，大小分级分离、离子交换层析、HPLC、密度梯度离心及亲和层析法，从细胞裂解物或培养基中基本上纯化或分离多肽。如果多肽缺乏生物学活性，则可作根据分子大小、或与多肽特异性抗体的反应性，或根据融合体标记的存在检测之。用于实施本发明时，多肽可以是已分泌到培养液中或存在于细胞裂解物中的未纯化状态，但较好是已从中得到基本纯化或分离。本文中所说的多肽“基本上已纯化”，是指该多肽构成特定制剂中蛋白质的至少约20％(重量)。另外，本文中所说的多肽“已分离”，指的是该多肽构成特定制剂中蛋白质的至少约80％(重量)。

因此，本发明提供由本发明多核苷酸编码的基本上已纯化或分离的旋毛虫副肌球蛋白或者免疫原性多肽。在一优选实施方案中，旋毛虫副肌球蛋白或者免疫原性多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

本发明进一步提供同源于所述旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽的多肽，其中术语“同源”具有上文就多肽所限定的含义。

本发明进一步提供由本发明任何一种上述多肽的基本部分组成的多肽。本文使用的术语-本发明多肽的“基本部分”或“肽片段”意指组成上小于相应全长度多肽之完整氨基酸序列、但包含其氨基酸序列的至少约10％、较好至少约20％、并可用于实施本发明的多肽(“可用于”具有上文就多肽所限定的含义)。特别优选的是具有免疫原性(即能够诱导免疫反应而产生特异地抗相应的全长度旋毛虫多肽的抗体)的肽片段。

本发明进一步提供包含与本领域已知的载体或融合对象融合的任一种上述多肽的融合蛋白质。

本发明的多肽可用于多种目的，包括作为诊断试剂，例如以ELISA检测等标准检测法筛选动物血液或血清样品中的旋毛虫特异性抗体；或如下所述用作产生多克隆或单克隆抗体的抗原，其中可以使用所述抗体作为诊断试剂，例如以Western印迹检测法等标准技术筛选动物细胞、组织或体液样品中的旋毛虫特异性蛋白质。

可以在蛋白质水平上修饰本发明的任何多肽，以改善或改变其生物学或免疫学特征。可使用已知技术对多肽进行一种或多种化学修饰，以制备其类似物。

可以在分子上连接一个或多个化学基团或另一种蛋白质如血清白蛋白、匙孔虫戚血兰蛋白或BSA，或者多聚氨基酸(如多聚赖氨酸)，或多糖(如Sepharose，琼脂糖，或经过修饰或未经修饰的纤维素)上等，以制备本发明多肽的衍生物。进行这些连接反应的方法是蛋白质化学领域中已知的。

本发明进一步提供抗本发明多肽的分离抗体。在一优选实施方案中，可使用已知方法产生抗旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽的抗体。可用部分或基本上纯化或分离的旋毛虫副肌球蛋白或免疫原性多肽重组蛋白，或其如上文描述的同系物、融合蛋白、基本部分、类似物或衍生物免疫选自猪、牛、马、兔、山羊、绵羊或小鼠等各种宿主动物。可使用下文描述的佐剂提高抗体产生量。

可从被免疫动物的血清中得到和分离多克隆抗体，并使用常规方法试验其对抗原的特异性。或者，也可使用由培养的连续细胞系生产抗体分子的任何技术制备并分离单克隆抗体。这些技术包括但不只限于原先由Kohler和Milstein(自然，1975，256：495-497)描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，今日免疫学，4：72；Cote等，1983，美国国家科学院院报，80：2026-2030)，以及EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-86)。或者，可采用已述的生产单链抗体的技术(如参见美国专利4,946,778)生产旋毛虫抗原特异性单链抗体。

含有本发明多肽的特异性结合位点的抗体片段也包括在本发明范围内，并可用已知技术制备。这样的片段包括但不只限于可由胃蛋白酶消化完整抗体分子而产生的F(ab′)₂片段，和可经还原F(ab′)₂片段的二硫桥而产生的Fab片段。或者，也可构建Fab表达文库(Huse等，1989，科学，246：1275-1281)，以迅速鉴定对旋毛虫蛋白有所需特异性的Fab片段。

生产和分离单克隆抗体及抗体片段的技术是本领域已知的，并在例如下列文献中给出了更详细的描述：Harlow和Lane，1988， 抗体：实验 室手册，冷泉港实验室和J.W.Cooding，1986， 单克隆抗体：原理与实 践，Academic Press，London(其列为本文参考文献)。

下列实施例只是举例描述，而不用来限制本发明的范围。

实施例

实施例1旋毛虫副肌球蛋白基因的克隆及序列分析

1.筛选血清(人工免疫兔血清和人工感染兔血清)的制备

收集分离自猪体的黑龙江株旋毛虫(国际标准虫株编码ISS533)成虫，将成虫虫体放于研磨器中，冰浴下快速研磨15分钟。将研磨后的液体移入10ml离心管，超声(于冰上)3次，3分钟/次，中间休息1分钟。反复冻融数次，离心取上清即得全虫可溶性抗原。免疫日本大耳白兔(1.6mg/只)，每周加强1次，加强4次，获得人工免疫兔血清；实验兔喂以4000条旋毛虫肌幼虫，4周后获人工感染兔血清。经ELISA测定，人工免疫兔血清和人工感染兔血清的血清滴度均达1∶4000以上。

2.免疫筛选表达文库

旋毛虫成虫λZAP II cDNA表达文库购自刘明远(参考文献《中国旋毛虫分离株成虫和新生幼虫基因文库的构建和筛选》，中国兽医学报，1998，18(2)：147-150.)。

1μl旋毛虫成虫λZAP II cDNA表达文库稀释液加入600μl宿主菌XL1-Blue中，37℃，吸附20分钟加入顶层琼脂，倒置于42℃温箱中培养至有针尖大小的噬菌斑长出。把硝酸纤维素膜(Gelman公司)铺在平板上，放在37℃温箱培养过夜。第二天在室温下将膜做好标记，从平板上揭下，浸入一抗工作液(人工免疫兔血清用TBST以1∶1000稀释)30分钟，血清中加入了大肠杆菌噬菌体裂解液(STRTAGENE公司)。把膜浸入二抗工作液-1∶7500碱性磷酸酶-羊抗兔IgG(Promega公司)，30分钟。浸入显色液NBT、BCIP中(Promega公司)，显色充分后，加入ddH₂O终止。用1∶1000人工免疫兔血清筛选获得的阳性克隆，再用人工感染兔血清作为一抗(用TBST以1∶1000稀释)复筛，获得3个阳性克隆。经PCR及Southern Blot鉴定后，选取Ts86克隆进行DNA序列测定。3.Ts86cDNA序列与编码的氨基酸分析

Ts86cDNA全长2996bp(见SEQ ID NO：1)，开放阅读框(第75-2732位碱基，共2658b)，编码885个氨基酸(见SEQ ID NO：2)，其理论分子量为102KD。编码的蛋白经同源性分析，发现与十二指肠钩虫、旋盘尾丝虫、马来丝虫的副肌球蛋白同源性分别为82％，82％和79％，推断为旋毛虫副肌球蛋白基因。

核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(加下划线的碱基为开放阅读框的起始终止位置)：

GGCACGAGCAGATCTAAAAGGATCTGTTGTAAATTGATTCTCCATTCGACAATCGAAAAAAC

TACATCAGCACC ATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGTGCGTCAGTGATGAGATCAGCAAGCAT

GCTCAGCCGAAGTGGCGGATTCGATGCTTACGGATTTGGAGGTTACGGTGCGCCAAGCCTCA

ACGTTGCCGACTTGGGTTCTTTGACCAGACTCGAGGATAAAATTCGCCTGCTTCAAGATGAT

TTGGAAACGGAAAGAGAATTGCGAAACCGAATTGAACGCGAACGTGCCGATTTGTCCTGCCA

ACTGATCAGCTTAACCGATCGATTGGAAGAGGCTGAAGGAACCACCGATGCCCAGATCGACG

CCAATCGAAAGCGTGAATCCGAATTGCAAAAGTTGAGAAAAATATTGGAAGATTCGCAATTG

GAAAGCGAAGATTCGCTGAACCAGCTGCGCAAGAAGCACCAAGAATCCCTTTTAGATTATCA

GCAGCAAATTGAACAACTTCAAAAGAAAAATAGCAAAATCGACAGAGAACGACAACGTTTGC

AGCATGAAGTCATTGAACTTACTGCCGGAATTGATCAGATGCAAAAAGACAAGCATGCCGCG

GAAAAAGCTGCCGAAAAGCACGAAGCGCATGCCAGAGAGCTTCAGAACAGAGTTGACGATCT

GGCAAAAAATTTGAACGACCTGGCCTCGCAGCGTCAACGTCTGCAACAGGAAAACAACGATT

TGATGAAAGAGTTGCACGATGTCAAAGTGCAAATGGAAAATATTCAACACGTCAAGACTCAA

CTTGCTCAACAGCTCGAAGAAGCACGTCGTCGACTCGAAGATGCGGAACGTGAACGTTCGCA

AATGCAAACCCAGTTGCATCAGATGCAGCTGGAATTGGATTCAATTCAAGGTGCGTTGGAAG

AGGAATCGTCCGCACGTGCCGAAGCAGAGCACAAATTGTCGTTGGCAAATACGGAAATTTCC

CAGTGGAAGAGCAAATTCGACGCCGAAGTTTCACTCCACCAAGAAGAAGTTGACGATCTGCG

TAAAAAAATGATCCAAAAACAAGCAGAATATGAGGAACAAATTGAAATTATGCTGCAAAAGA

TTTCCCAATTGGAAAAAGCGAAAAGCCGTCTGCAGTCGGAAGTTGAAGTTTTGATAGTTGAT

TTGGAAAAGGCTCAAAGCACCATTGCCATTTTGGAAAGACAAAAAGAACAGCTCGAAAGAAT

GGTCGCCGAGATGAAGACACGCCTGGACGAGGTGACACAAGAGCTCGAAGCTACGCAACGAG

AACTCAGAGCGACGCAAGCGGAATTGCAAAAGATGAAGCATCTTTATGAAAAAGCCGTCGAA

CAGAAAGAAGCTCTGGCTAGGGAGAACAAAAAATTGCAAGACGATTTGCATGAAGCAAAGGA

AGCTTTGGCCGACGCGAACAGAAAATTGCACGAGCTGGATTTGGAGAATGCACGTCTGGCCG

GTGAAATCAGAGAACTGCAAATCGCGCTCAAGGAAGCCGAAGCGGCTAGACGTGACGCGGAA

AGTCGCGCACAGCGTGCAGTAGCTGAATTGCAAGCTCTGCGCGTGGAAATGGAACGTCGTTT

ACAAGAAAAAGAAGAAGAAATGGAAGCATTGCGCAAAAATATGCAGTTCGAAATTGACCGAC

TGGCTGCAGCGTTGGCTGACGCTGAGGCTCGCATGAAGGCGGAAATTTCCCGTCTGAAGAAG

AAATACCAGGCGGAAATTGCCGAACTGGAAATGACCATCGACAATTTGAACCGGGCCAATTT

GGAAGCACAAAAGACGATCAAAAAACAAGCAGACCAACTGAGGGCTTTGCAAAGCAGCTTCG

AAGATTGCCAACGTCAACTGCAACAAACGCTCGACCAGTATGCAATTGCCCAGCGCAAGTTG

TCCGCTTTGTCGGCCGAATTGGAAGACTGCAAGAGTGCCTTGGACACGGCGATCCGGGTGCG

CAAACAAGCCGAAGCGGATCTGGAAGAAGCCCAGGGGAAAATTGCCGATTTGGTCAGCTTGA

ACAACAATTTGACCGCGATCAAGGGCAAATTGGAGACCGACTTGTCGACATGCCAAGCCGAT

TTGGACGAGACGACCAAAGAACTGCGAGCCGCCGACGACCGTGCCAACCGAGCTCAGCAGGA

TGCGGTCCGGGCTATGGAACAACTCCACGAAGAGCAGGAACATTCGATGAAAATCGACGCCA

TGCGCAAAGCGTTGGAAGAGCACGTCAAACAGTTGCAAGTGCAAATCCAAGAAGCCGAAGCG

GCAGCTCTGCTCGGTGGCAAGCGCGTCATTGCCAAACTCGAGACCAGGATTCGAGATTTGGA

AATGGCGTTGGATGAAGAATCGAGACGACACAAAGAAACCCAAGCCTGCTTGCGCAAAAAGG

ACCGTCGCGTCAAGGAAATGCAAATGCAAGTGGACGAGGAGCACAAAAATTTCGTCATGGCC

CAAGATACTGCCGAACGATTGGCCGAAAAATTGAACATCTACAAGCGACAGTTGACTGAAGC

GGAATCGTTGACAATGCAAAATTTGCAACGTGTCCGTCGTTACCAGCACGAATTGGAAGATG

CCGAAGGTCGAGCCGAACAAGCCGAAAGTAGCTTGCACTTGATCCGTGCCAAGCATCGTTCT

TCCGTTTCCATGGGAAAAAGTCTCTCTTCCAAGGTTTACGTGATGGAAGAAGGACATGAATA

T TGATGAACAATACACTAATAATTAATTGCAGAAATTTATTTTTCTGGTGGAAGAGCAACCA

TGTTTTAGCTTCTTTCTTTCTCAATTTACTACCATAATAATAATAATATTATTAATATATTT

TTAATATACAATGATGATCAATTTTCTTTTTATTCAGAATGTAATCGCCAATTAGCTTTTTT

CTTTTTCTCTCTCAAACAACCAACCAATCATAATTCTCTTCTTCATTCACGCCAACAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

开放阅读框内的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

MSLYRSPSASVMRSASMLSRSGGFDAYGFGGYGAPSLNVADLGSLTRLEDKIRLLQDDLETE

RELRNRIERERADLSCQLISLTDRLEEAEGTTDAQIDANRKRESELQKLRKILEDSQLESED

SLNQLRKKHQESLLDYQQQIEQLQKKNSKIDRERQRLQHEVIELTAGIDQMQKDKHAAEKAA

EKHEAHARELQNRVDDLAKNLNDLASQRQRLQQENNDLMKELHDVKVQMENIQHVKTQLAQQ

LEEARRRLEDAERERSQMQTQLHQMQLELDSIQGALEEESSARAEAEHKLSLANTEISQWKS

KFDAEVSLHQEEVDDLRKKMIQKQAEYEEQIEIMLQKISQLEKAKSRLQSEVEVLIVDLEKA

QSTIAILERQKEQLERMVAEMKTRLDEVTQELEATQRELRATQAELQKMKHLYEKAVEQKEA

LARENKKLQDDLHEAKEALADANRKLHELDLENARLAGEIRELQIALKEAEAARRDAESRAQ

RAVAELQALRVEMERRLQEKEEEMEALRKNMQFEIDRLAAALADAEARMKAEISRLKKKYQA

EIAELEMTIDNLNRANLEAQKTIKKQADQLRALQSSFEDCQRQLQQTLDQYAIAQRKLSALS

AELEDCKSALDTAIRVRKQAEADLEEAQGKIADLVSLNNNLTAIKGKLETDLSTCQADLDET

TKELRAADDRANRAQQDAVRAMEQLHEEQEHSMKIDAMRKALEEHVKQLQVQIQEAEAAALL

GGKRVIAKLETRIRDLEMALDEESRRHKETQACLRKKDRRVKEMQMQVDEEHKNFVMAQDTA

ERLAEKLNIYKRQLTEAESLTMQNLQRVRRYQHELEDAEGRAEQAESSLHLIRAKHRSSVSM

GKSLSSKVYVMEEGHEY

实施例2制备副肌球蛋白基因重组蛋白及人工免疫鼠血清

1.副肌球蛋白基因原核表达及纯化

根据Ts86 cDNA序列，设计一对引物，上游引物为5‘-CGGGATCCATGTCTCTGTATCGCAGTCCCAGT-3’(SEQ ID NO：3)(共32nt，含一个BamH I 酶切位点)，下游引物为5‘-CGGAATTCATATTCATGTCCTTCTTCCATCAC-3’(SEQ ID NO：4)(共32nt，含一个EcoR I酶切位点)。以免疫筛库得到的Ts86 cDNA克隆为模板，进行PCR，产物经BamH I和EcoR I双酶切后，亚克隆于原核表达载体PET-28a(+)(Novagen公司)。正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21株(Novagen公司)，经37℃150转/分1.0mM IPTG诱导3小时，获得副肌球蛋白基因重组蛋白(全部开放阅读框共885个氨基酸)，重组蛋白经His-binding亲和层析柱(Novagen公司)纯化后，经电洗脱仪(BIO-RAD公司)洗脱使纯度更高(图1)。

2.纯化的副肌球蛋白基因重组蛋白经皮肤多点注射免疫BALB/c小鼠(20μg/只)，以后每隔14天以相同剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂，加强2次。5周后摘眼球取血。ELISA测定抗体效价高达1∶128000以上。

实施例3副肌球蛋白基因重组蛋白的免疫特性

1.酶联免疫吸附(ELISA)检测

以1μg副肌球蛋白基因重组蛋白(实施例2制备)为抗原包被96孔酶标板，一抗为待检血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的相应(羊抗人、羊抗兔或羊抗猪)二抗，正常人血清、正常兔血清、正常猪血清分别作为阴性对照。根据待测血清样本OD值大于阴性对照2.1倍者为阳性判断结果。经ELISA检测，旋毛虫病人血清(23份)阳性率为86.96％、旋毛虫病兔血清(2份)及旋毛虫病猪血清(4份)均为阳性，说明该副肌球蛋白基因的重组蛋白具有特异的抗原性，是具有应用潜力的诊断试剂。

2.Western印迹分析

纯化的副肌球蛋白基因表达蛋白(实施例2制备)(200ng)经SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，用ECL化学发光试剂盒(Amersham公司)检测，分别以病人血清1∶200、感染猪血清1∶200、感染兔血清1∶1000、副肌球蛋白基因重组蛋白人工免疫鼠血清(实施例2制备)1∶10000作为第一抗体。结果显示约110KDa处均呈现一明显的蛋白印迹带(图2)，表明副肌球蛋白基因重组蛋白可为感染旋毛虫的病人血清、感染旋毛虫的猪血清、感染旋毛虫的兔血清及副肌球蛋白基因重组蛋白人工免疫鼠血清所识别。

实施例4  动物体内保护性实验

BALB/c小鼠30只，随机分为2组，每组15只。副肌球蛋白基因重组蛋白免疫组以20μg/只的抗原(实施例2制备)加等量的弗氏完全佐剂(FCA)皮下注射。以后每隔14天以相同剂量抗原加等量不完全弗氏佐剂，加强2次。末次注射后10天，每只鼠用400条旋毛虫感染性幼虫进行攻击感染。对照组注射相同剂量的Tris-HCL，与免疫组同时接受400条旋毛虫感染性幼虫攻击。于攻击45天后将小鼠处死，取全部肌肉用胃蛋白酶消化收集幼虫，计数。经单因素方差分析，副肌球蛋白基因重组蛋白免疫组减虫率(肌幼虫减虫率％＝(对照组肌幼虫数-免疫组肌幼虫数)/对照组肌幼虫数×100％)为47％，与对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)(表1)。

由于本实验副肌球蛋白基因重组蛋白在动物体内产生有效的减虫率，据此可作为保护性候选抗原，应用于旋毛虫病的免疫预防。

表1  副肌球蛋白基因重组蛋白免疫BALB/c小鼠的保护性结果

上文列出的所有专利、专利申请和出版物均全文引入本文作为参考文献。

本发明的范围不只限于所述的特定实施方案，这些方案只是作为本发明个别方面的单一举例说明给出的。功能等同的组合物和方法均在本发明的范围之内。确实，除了本文所示的和描述的内容外，对本发明各种改动对于阅读了上述内容的本领域技术人员来说都是显而易见的。这些改动将落入本发明待批权利要求的范围之内。

序列表

<110>首都医科大学

<120>旋毛虫副肌球蛋白基因及其应用

<130>IDC060097

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2996

<212>DNA

<213>1

<220>

<221>CDS

<222>(75)..(2732)

<400>1

ggcacgagca gatctaaaag gatctgttgt aaattgattc tccattcgac aatcgaaaaa     60

actacatcag cacc atg tct ctg tat cgc agt ccc agt gcg tca gtg atg      110

                Met Ser Leu Tyr Arg Ser Pro Ser Ala Ser Val Met

                1               5                   10

aga tca gca agc atg ctc agc cga agt ggc gga ttc gat gct tac gga      158

Arg Ser Ala Ser Met Leu Ser Arg Ser Gly Gly Phe Asp Ala Tyr Gly

        15                  20                  25

ttt gga ggt tac ggt gcg cca agc ctc aac gtt gcc gac ttg ggt tct      206

Phe Gly Gly Tyr Gly Ala Pro Ser Leu Asn Val Ala Asp Leu Gly Ser

    30                  35                  40

ttg acc aga ctc gag gat aaa att cgc ctg ctt caa gat gat ttg gaa      254

Leu Thr Arg Leu Glu Asp Lys Ile Arg Leu Leu Gln Asp Asp Leu Glu

45                  50                  55                  60

acg gaa aga gaa ttg cga aac cga att gaa cgc gaa cgt gcc gat ttg      302

Thr Glu Arg Glu Leu Arg Asn Arg Ile Glu Arg Glu Arg Ala Asp Leu

                65                  70                  75

tcc tgc caa ctg atc agc tta acc gat cga ttg gaa gag gct gaa gga      350

Ser Cys Gln Leu Ile Ser Leu Thr Asp Arg Leu Glu Glu Ala Glu Gly

            80                  85                  90

acc acc gat gcc cag atc gac gcc aat cga aag cgt gaa tcc gaa ttg      398

Thr Thr Asp Ala Gln Ile Asp Ala Asn Arg Lys Arg Glu Ser Glu Leu

        95                  100                 105

caa aag ttg aga aaa ata ttg gaa gat tcg caa ttg gaa agc gaa gat      446

Gln Lys Leu Arg Lys Ile Leu Glu Asp Ser Gln Leu Glu Ser Glu Asp

    110                 115                 120

tcg ctg aac cag ctg cgc aag aag cac caa gaa tcc ctt tta gat tat      494

Ser Leu Asn Gln Leu Arg Lys Lys His Gln Glu Ser Leu Leu Asp Tyr

125                 130                 135                 140

cag cag caa att gaa caa ctt caa aag aaa aat agc aaa atc gac aga      542

Gln Gln Gln Ile Glu Gln Leu Gln Lys Lys Asn Ser Lys Ile Asp Arg

                    145             150                 155

gaa cga caa cgt ttg cag cat gaa gtc att gaa ctt act gcc gga att      590

Glu Arg Gln Arg Leu Gln His Glu Val Ile Glu Leu Thr Ala Gly Ile

                160             165                 170

gat cag atg caa aaa gac aag cat gcc gcg gaa aaa gct gcc gaa aag      638

Asp Gln Met Gln Lys Asp Lys His Ala Ala Glu Lys Ala Ala Glu Lys

        175                 180                 185

cac gaa gcg cat gcc aga gag ctt cag aac aga gtt gac gat ctg gca      686

His Glu Ala His Ala Arg Glu Leu Gln Asn Arg Val Asp Asp Leu Ala

    190                 195                 200

aaa aat ttg aac gac ctg gcc tcg cag cgt caa cgt ctg caa cag gaa      734

Lys Asn Leu Asn Asp Leu Ala Ser Gln Arg Gln Arg Leu Gln Gln Glu

205                 210                 215                 220

aac aac gat ttg atg aaa gag ttg cac gat gtc aaa gtg caa atg gaa      782

Asn Asn Asp Leu Met Lys Glu Leu His Asp Val Lys Val Gln Met Glu

                225                 230                 235

aat att caa cac gtc aag act caa ctt gct caa cag ctc gaa gaa gca      830

Asn Ile Gln His Val Lys Thr Gln Leu Ala Gln Gln Leu Glu Glu Ala

            240                 245                 250

cgt cgt cga ctc gaa gat gcg gaa cgt gaa cgt tcg caa atg caa acc      878

Arg Arg Arg Leu Glu Asp Ala Glu Arg Glu Arg Ser Gln Met Gln Thr

        255                 260                 265

cag ttg cat cag atg cag ctg gaa ttg gat tca att caa ggt gcg ttg      926

Gln Leu His Gln Met Gln Leu Glu Leu Asp Ser Ile Gln Gly Ala Leu

    270                 275                 280

gaa gag gaa tcg tcc gca cgt gcc gaa gca gag cac aaa ttg tcg ttg      974

Glu Glu Glu Ser Ser Ala Arg Ala Glu Ala Glu His Lys Leu Ser Leu

285                 290                 295                 300

gca aat acg gaa att tcc cag tgg aag agc aaa ttc gac gcc gaa gtt     1022

Ala Asn Thr Glu Ile Ser Gln Trp Lys Ser Lys Phe Asp Ala Glu Val

                305                 310                 315

tca ctc cac caa gaa gaa gtt gac gat ctg cgt aaa aaa atg atc caa     1070

Ser Leu His Gln Glu Glu Val Asp Asp Leu Arg Lys Lys Met Ile Gln

            320                 325                 330

aaa caa gca gaa tat gag gaa caa att gaa att atg ctg caa aag att     1118

Lys Gln Ala Glu Tyr Glu Glu Gln Ile Glu Ile Met Leu Gln Lys Ile

        335                 340                 345

tcc caa ttg gaa aaa gcg aaa agc cgt ctg cag tcg gaa gtt gaa gtt     1166

Ser Gln Leu Glu Lys Ala Lys Ser Arg Leu Gln Ser Glu Val Glu Val

    350                 355                 360

ttg ata gtt gat ttg gaa aag gct caa agc acc att gcc att ttg gaa     1214

Leu Ile Val Asp Leu Glu Lys Ala Gln Ser Thr Ile Ala Ile Leu Glu

365                 370                 375                 380

aga caa aaa gaa cag ctc gaa aga atg gtc gcc gag atg aag aca cgc     1262

Arg Gln Lys Glu Gln Leu Glu Arg Met Val Ala Glu Met Lys Thr Arg

                385                 390                 395

ctg gac gag gtg aca caa gag ctc gaa gct acg caa cga gaa ctc aga     1310

Leu Asp Glu Val Thr Gln Glu Leu Glu Ala Thr Gln Arg Glu Leu Arg

            400                 405                 410

gcg acg caa gcg gaa ttg caa aag atg aag cat ctt tat gaa aaa gcc     1358

Ala Thr Gln Ala Glu Leu Gln Lys Met Lys His Leu Tyr Glu Lys Ala

        415                 420                 425

gtc gaa cag aaa gaa gct ctg gct agg gag aac aaa aaa ttg caa gac     1406

Val Glu Gln Lys Glu Ala Leu Ala Arg Glu Asn Lys Lys Leu Gln Asp

    430                 435                 440

gat ttg cat gaa gca aag gaa gct ttg gcc gac gcg aac aga aaa ttg     1454

Asp Leu His Glu Ala Lys Glu Ala Leu Ala Asp Ala Asn Arg Lys Leu

445                 450                 455                 460

cac gag ctg gat ttg gag aat gca cgt ctg gcc ggt gaa atc aga gaa     1502

His Glu Leu Asp Leu Glu Asn Ala Arg Leu Ala Gly Glu Ile Arg Glu

                465                 470                 475

ctg caa atc gcg ctc aag gaa gcc gaa gcg gct aga cgt gac gcg gaa     1550

Leu Gln Ile Ala Leu Lys Glu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Asp Ala Glu

            480                    485                    490

agt cgc gca cag cgt gca gta gct gaa ttg caa gct ctg cgc gtg gaa     1598

Ser Arg Ala Gln Arg Ala Val Ala Glu Leu Gln Ala Leu Arg Val Glu

        495                 500                 505

atg gaa cgt cgt tta caa gaa aaa gaa gaa gaa atg gaa gca ttg cgc     1646

Met Glu Arg Arg Leu Gln Glu Lys Glu Glu Glu Met Glu Ala Leu Arg

    510                 515                 520

aaa aat atg cag ttc gaa att gac cga ctg gct gca gcg ttg gct gac     1694

Lys Asn Met Gln Phe Glu Ile Asp Arg Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp

525                 530                 535                 540

gct gag gct cgc atg aag gcg gaa att tcc cgt ctg aag aag aaa tac     1742

Ala Glu Ala Arg Met Lys Ala Glu Ile Ser Arg Leu Lys Lys Lys Tyr

                545                 550                 555

cag gcg gaa att gcc gaa ctg gaa atg acc atc gac aat ttg aac cgg     1790

Gln Ala Glu Ile Ala Glu Leu Glu Met Thr Ile Asp Asn Leu Asn Arg

            560                 565                 570

gcc aat ttg gaa gca caa aag acg atc aaa aaa caa gca gac caa ctg     1838

Ala Asn Leu Glu Ala Gln Lys Thr Ile Lys Lys Gln Ala Asp Gln Leu

        575                 580                 585

agg gct ttg caa agc agc ttc gaa gat tgc caa cgt caa ctg caa caa     1886

Arg Ala Leu Gln Ser Ser Phe Glu Asp Cys Gln Arg Gln Leu Gln Gln

   590                 595                 600

acg ctc gac cag tat gca att gcc cag cgc aag ttg tcc gct ttg tcg     1934

Thr Leu Asp Gln Tyr Ala Ile Ala Gln Arg Lys Leu Ser Ala Leu Ser

605                 610                 615                 620

gcc gaa ttg gaa gac tgc aag agt gcc ttg gac acg gcg atc cgg gtg     1982

Ala Glu Leu Glu Asp Cys Lys Ser Ala Leu Asp Thr Ala Ile Arg Val

                625                 630                 635

cgc aaa caa gcc gaa gcg gat ctg gaa gaa gcc cag ggg aaa att gcc     2030

Arg Lys Gln Ala Glu Ala Asp Leu Glu Glu Ala Gln Gly Lys Ile Ala

            640                 645                 650

gat ttg gtc agc ttg aac aac aat ttg acc gcg atc aag ggc aaa ttg     2078

Asp Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Thr Ala Ile Lys Gly Lys Leu

        655                 660                665

gag acc gac ttg tcg aca tgc caa gcc gat ttg gac gag acg acc aaa     2126

Glu Thr Asp Leu Ser Thr Cys Gln Ala Asp Leu Asp Glu Thr Thr Lys

    670                 675                 680

gaa ctg cga gcc gcc gac gac cgt gcc aac cga gct cag cag gat gcg     2174

Glu Leu Arg Ala Ala Asp Asp Arg Ala Asn Arg Ala Gln Gln Asp Ala

685                 690                 695                 700

gtc cgg gct atg gaa caa ctc cac gaa gag cag gaa cat tcg atg aaa     2222

Val Arg Ala Met Glu Gln Leu His Glu Glu Gln Glu His Ser Met Lys

                705                 710                 715

atc gac gcc atg cgc aaa gcg ttg gaa gag cac gtc aaa cag ttg caa     2270

Ile Asp Ala Met Arg Lys Ala Leu Glu Glu His Val Lys Gln Leu Gln

            720                 725                 730

gtg caa atc caa gaa gcc gaa gcg gca gct ctg ctc ggt ggc aag cgc     2318

Val Gln Ile Gln Glu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg

        735                 740                 745

gtc att gcc aaa ctc gag acc agg att cga gat ttg gaa atg gcg ttg     2366

Val Ile Ala Lys Leu Glu Thr Arg Ile Arg Asp Leu Glu Met Ala Leu

    750                 755                 760

gat gaa gaa tcg aga cga cac aaa gaa acc caa gcc tgc ttg cgc aaa     2414

Asp Glu Glu Ser Arg Arg His Lys Glu Thr Gln Ala Cys Leu Arg Lys

765                 770                 775                 780

aag gac cgt cgc gtc aag gaa atg caa atg caa gtg gac gag gag cac     2462

Lys Asp Arg Arg Val Lys Glu Met Gln Met Gln Val Asp Glu Glu His

                785                 790                 795

aaa aat ttc gtc atg gcc caa gat act gcc gaa cga ttg gcc gaa aaa     2510

Lys Asn Phe Val Met Ala Gln Asp Thr Ala Glu Arg Leu Ala Glu Lys

            800                 805                 810

ttg aac atc tac aag cga cag ttg act gaa gcg gaa tcg ttg aca atg     2558

Leu Asn Ile Tyr Lys Arg Gln Leu Thr Glu Ala Glu Ser Leu Thr Met

        815                 820                 825

caa aat ttg caa cgt gtc cgt cgt tac cag cac gaa ttg gaa gat gcc     2606

Gln Asn Leu Gln Arg Val Arg Arg Tyr Gln His Glu Leu Glu Asp Ala

    830                 835                 840

gaa ggt cga gcc gaa caa gcc gaa agt agc ttg cac ttg atc cgt gcc     2654

Glu Gly Arg Ala Glu Gln Ala Glu Ser Ser Leu His Leu Ile Arg Ala

845                 850                 855                 860

aag cat cgt tct tcc gtt tcc atg gga aaa agt ctc tct tcc aag gtt     2702

Lys His Arg Ser Ser Val Ser Met Gly Lys Ser Leu Ser Ser Lys Val

                865                 870                 875

tac gtg atg gaa gaa gga cat gaa tat tga tgaacaatac actaataatt       2752

Tyr Val Met Glu Glu Gly His Glu Tyr

            880           885

aattgcagaa atttattttt ctggtggaag agcaaccatg ttttagcttc tttctttctc   2812

aatttactac cataataata ataatattat taatatattt ttaatataca atgatgatca   2872

attttctttt tattcagaat gtaatcgcca attagctttt ttctttttct ctctcaaaca   2932

accaaccaat cataattctc ttcttcattc acgccaacaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa   2992

aaaa                                                                2996

<210>2

<211>885

<212>PRT

<213>1

<400>2

Met Ser Leu Tyr Arg Ser Pro Ser Ala Ser Val Met Arg Ser Ala Ser

1               5                   10                  15

Met Leu Ser Arg Ser Gly Gly Phe Asp Ala Tyr Gly Phe Gly Gly Tyr

            20                  25                  30

Gly Ala Pro Ser Leu Asn Val Ala Asp Leu Gly Ser Leu Thr Arg Leu

        35                  40                  45

Glu Asp Lys Ile Arg Leu Leu Gln Asp Asp Leu Glu Thr Glu Arg Glu

    50                  55                  60

Leu Arg Asn Arg Ile Glu Arg Glu Arg Ala Asp Leu Ser Cys Gln Leu

65                  70                  75                  80

Ile Ser Leu Thr Asp Arg Leu Glu Glu Ala Glu Gly Thr Thr Asp Ala

                85                  90                  95

Gln Ile Asp Ala Asn Arg Lys Arg Glu Ser Glu Leu Gln Lys Leu Arg

            100                 105                 110

Lys Ile Leu Glu Asp Ser Gln Leu Glu Ser Glu Asp Ser Leu Asn Gln

        115                 120                 125

Leu Arg Lys Lys His Gln Glu Ser Leu Leu Asp Tyr Gln Gln Gln Ile

    130                 135                 140

Gli Gln Leu Gln Lys Lys Asn Ser Lys Ile Asp Arg Glu Arg Gln Arg

145                 150                 155                 160

Leu Gln His Glu Val Ile Glu Leu Thr Ala Gly Ile Asp Gln Met Gln

                165                 170                 175

Lys Asp Lys His Ala Ala Glu Lys Ala Ala Glu Lys His Glu Ala His

            180                 185                 190

Ala Arg Glu Leu Gln Asn Arg Val Asp Asp Leu Ala Lys Asn Leu Asn

        195                 200                 205

Asp Leu Ala Ser Gln Arg Gln Arg Leu Gln Gln Glu Asn Asn Asp Leu

    210                 215                 220

Met Lys Glu Leu His Asp Val Lys Val Gln Met Glu Asn Ile Gln His

225                 230                 235                 240

Val Lys Thr Gln Leu Ala Gln Gln Leu Glu Glu Ala Arg Arg Arg Leu

                245                 250                 255

Glu Asp Ala Glu Arg Glu Arg Ser Gln Met Gln Thr Gln Leu His Gln

            260                 265                 270

Met Gln Leu Glu Leu Asp Ser Ile Gln Gly Ala Leu Glu Glu Glu Ser

        275                 280                 285

Ser Ala Arg Ala Glu Ala Glu His Lys Leu Ser Leu Ala Asn Thr Glu

    290                 295                 300

Ile Ser Gln Trp Lys Ser Lys Phe Asp Ala Glu Val Ser Leu His Gln

305                 310                 315                 320

Glu Glu Val Asp Asp Leu Arg Lys Lys Met Ile Gln Lys Gln Ala Glu

                325                 330                 335

Tyr Glu Glu Gln Ile Glu Ile Met Leu Gln Lys Ile Ser Gln Leu Glu

            340                 345                350

Lys Ala Lys Ser Arg Leu Gln Ser Glu Val Glu Val Leu Ile Val Asp

        355                 360                 365

Leu Glu Lys Ala Gln Ser Thr Ile Ala Ile Leu Glu Arg Gln Lys Glu

    370                 375                 380

Gln Leu Glu Arg Met Val Ala Glu Met Lys Thr Arg Leu Asp Glu Val

385                 390                 395                 400

Thr Gln Glu Leu Glu Ala Thr Gln Arg Glu Leu Arg Ala Thr Gln Ala

                405                 410                 415

Glu Leu Gln Lys Met Lys His Leu Tyr Glu Lys Ala Val Glu Gln Lys

            420                 425                 430

Glu Ala Leu Ala Arg Glu Asn Lys Lys Leu Gln Asp Asp Leu His Glu

        435                 440                 445

Ala Lys Glu Ala Leu Ala Asp Ala Asn Arg Lys Leu His Glu Leu Asp

    450                 455                 460

Leu Glu Asn Ala Arg Leu Ala Gly Glu Ile Arg Glu Leu Gln Ile Ala

465                 470                 475                 480

Leu Lys Glu Ala Glu Ala Ala Arg Arg Asp Ala Glu Ser Arg Ala Gln

                485                 490                 495

Arg Ala Val Ala Glu Leu Gln Ala Leu Arg Val Glu Met Glu Arg Arg

            500                 505                 510

Leu Gln Glu Lys Glu Glu Glu Met Glu Ala Leu Arg Lys Asn Met Gln

        515                 520                 525

Phe Glu Ile Asp Arg Leu Ala Ala Ala Leu Ala Asp Ala Glu Ala Arg

    530                 535                 540

Met Lys Ala Glu Ile Ser Arg Leu Lys Lys Lys Tyr Gln Ala Glu Ile

545                 550                 555                 560

Ala Glu Leu Glu Met Thr Ile Asp Asn Leu Asn Arg Ala Asn Leu Glu

                565                 570                 575

Ala Gln Lys Thr Ile Lys Lys Gln Ala Asp Gln Leu Arg Ala Leu Gln

            580                 585                 590

Ser Ser Phe Glu Asp Cys Gln Arg Gln Leu Gln Gln Thr Leu Asp Gln

        595                 600                 605

Tyr Ala Ile Ala Gln Arg Lys Leu Ser Ala Leu Ser Ala Glu Leu Glu

    610                 615                 620

Asp Cys Lys Ser Ala Leu Asp Thr Ala Ile Arg Val Arg Lys Gln Ala

625                 630                 635                 640

Glu Ala Asp Leu Glu Glu Ala Gln Gly Lys Ile Ala Asp Leu Val Ser

                645                 650                 655

Leu Asn Asn Asn Leu Thr Ala Ile Lys Gly Lys Leu Glu Thr Asp Leu

            660                 665                 670

Ser Thr Cys Gln Ala Asp Leu Asp Glu Thr Thr Lys Glu Leu Arg Ala

        675                 680                 685

Ala Asp Asp Arg Ala Asn Arg Ala Gln Gln Asp Ala Val Arg Ala Met

    690                 695                 700

Glu Gln Leu His Glu Glu Gln Glu His Ser Met Lys Ile Asp Ala Met

705                 710                 715                 720

Arg Lys Ala Leu Glu Glu His Val Lys Gln Leu Gln Val Gln Ile Gln

                725                 730                 735

Glu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Lys Arg Val Ile Ala Lys

            740                 745                 750

Leu Glu Thr Arg Ile Arg Asp Leu Glu Met Ala Leu Asp Glu Glu Ser

        755                 760                 765

Arg Arg His Lys Glu Thr Gln Ala Cys Leu Arg Lys Lys Asp Arg Arg

    770                 775                 780

Val Lys Glu Met Gln Met Gln Val Asp Glu Glu His Lys Asn Phe Val

785                 790                 795                 800

Met Ala Gln Asp Thr Ala Glu Arg Leu Ala Glu Lys Leu Asn Ile Tyr

                805                 810                 815

Lys Arg Gln Leu Thr Glu Ala Glu Ser Leu Thr Met Gln Asn Leu Gln

            820                 825                 830

Arg Val Arg Arg Tyr Gln His Glu Leu Glu Asp Ala Glu Gly Arg Ala

        835                 840                 845

Glu Gln Ala Glu Ser Ser Leu His Leu Ile Arg Ala Lys His Arg Ser

    850                 855                 860

Ser Val Ser Met Gly Lys Ser Leu Ser Ser Lys Val Tyr Val Met Glu

865                 870                 875                 880

Glu Gly His Glu Tyr

                885

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgggatccat gtctctgtat cgcagtccca gt    32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cggaattcat attcatgtcc ttcttccatc ac    32

Claims (16)

1、分离的多核苷酸分子，其中包含从如下组核苷酸序列中选择的核苷酸序列：

(A)与SEQ ID NO：1所示序列或SEQ ID NO：1中开放阅读框至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％同源的核苷酸序列；

(B)与SEQ ID NO：1所示序列或SEQ ID NO：1中开放阅读框的互补序列在中等严格杂交条件、优选高严格杂交条件下可发生杂交的核苷酸序列；

(C)与SEQ ID NO：1编码相同序列的蛋白质、但因遗传密码的简并性而在序列上有所不同的核苷酸序列；

(D)(A)、(B)或(C)所述核苷酸序列的片段；和

(E)与(A)、(B)、(C)或(D)所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2、如权利要求1所述的多核苷酸分子，特征在于具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。

3、分离的多肽，其中包含从如下组序列中选择的氨基酸序列：

(A)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、尤其是至少95％同源的氨基酸序列；

(B)由于一或多个(例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个)氨基酸残基的替代、缺失或插入而与SEQ ID NO：2所示序列有所不同的氨基酸序列；和

(C)(A)或(B)所述氨基酸序列的免疫原性片段。

4、权利要求3的分离的多肽，其中包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。

5、重组载体(优选表达载体)，其中包含权利要求1或2所述多核苷酸分子。

6、含有权利要求5的重组表达载体的宿主细胞。

7、生产多肽的方法，包括在能使所述多肽表达的条件下培养权利要求6所述的宿主细胞和回收所表达的多肽。

8、抗体，其可特异性结合权利要求3或4所述多肽。

9、用于预防或治疗动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的药物组合物，所述的药物组合物中含有权利要求3或4所述多肽。

10、用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的诊断试剂盒，其中含有权利要求1或2所述多核苷酸分子、可检测权利要求1或2所述多核苷酸分子的核酸探针、可特异性扩增权利要求1或2所述多核苷酸分子的引物、权利要求3或4所述多肽、或者权利要求8所述抗体。

11、权利要求1或2所述多核苷酸分子、可检测权利要求1或2所述多核苷酸分子的核酸探针、可特异性扩增权利要求1或2所述多核苷酸分子的引物、权利要求3或4所述多肽、或者权利要求8所述抗体在制备用于诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的诊断试剂中的用途。

12、权利要求1或2所述多核苷酸分子或者权利要求3或4所述多肽或者权利要求8所述抗体在制备用于预防或治疗人畜旋毛虫感染的药物中的用途。

13、寡核苷酸，其中含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者其互补序列中的至少15个、优选至少25个、更优选至少50个核苷酸或者其相似序列，所述相似序列能够与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或者其互补序列在高度严格杂交条件下发生杂交。

14、权利要求13的寡核苷酸用于体外诊断动物，尤其是牲畜和人中的旋毛虫感染的用途。

15.融合蛋白，其中包含权利要求3或4所述多肽及另一融合对象。

16.权利要求15的融合蛋白，其中所述融合对象是β-半乳糖苷酶，谷胱苷肽-S-转移酶或多组氨酸等。

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