CN100578222C - 一种琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与应用，其目的是提供一种表面设有凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与其在制备生物芯片中的应用。该琼脂糖凝胶塑料基片，是表面设有至少2个凹槽的塑料基片，所述凹槽底部设有一层琼脂糖凝胶膜，凹槽底部同塑料基片的左、右边缘位于同一水平面。本发明基片的制备方法包括以下步骤：1)将塑料基片表面用注塑法形成凹槽；所述凹槽底部同塑料基片的左、右边缘位于同一水平面；2)将塑料基片用等离子体清洗；3)向塑料基片的凹槽中注入琼脂糖溶液，干燥后成膜；4)将凹槽处设有琼脂糖膜的塑料基片用高碘酸钠溶液进行氧化；5)将氧化后的琼脂糖塑料膜基片用水清洗，干燥，得到琼脂糖凝胶塑料基片。本发明将在生物芯片领域具有广阔的应用前景。

Description

一种琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与应用，特别是涉及一种表面设有凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片及其制备方法与其在制备生物芯片中的应用。

背景技术

近几年，随着蛋白功能研究时代的到来，蛋白芯片技术已广泛应用于蛋白相关研究中，但是对于该项技术的应用仍然存在诸多限制因素，其中最关键的是蛋白结构的多样性和蛋白多级结构的存在。因此，如何将蛋白分子固定于基片表面并保持蛋白活性的表面技术已成为蛋白芯片技术研究中的一项关键性技术。

琼脂糖是一种高分子聚糖化合物，琼脂糖水溶液是一种水凝胶，能够在固体表面成膜；琼脂糖膜能够较好保持固定于其中的蛋白的活性。2000年Victor Afanassiev等(Victor Afanassiev等，Preparation of DNA and protein mico arrays on glassslides coated with agarose film，Nucleic Acids Research，2000，28，e66)首先报道了在普通载玻片表面制备一层琼脂糖膜，活化后用于制备蛋白芯片和核酸芯片；2002年Hong Wang等(Hong Wang等，Lable-free hybridization detection ofa single nucleotide mismatch by immobilization of molecular beacons on anagarose film，Nucleic Acids Research，2002，30，e61)应用琼脂糖基片制备核酸芯片，然后应用于单核苷酸错配(single nucleotide mismatch)的检测；在申请号为CN1142433C的专利中修饰的玻片表面形成琼脂糖分子层，用双功能试剂(如戊二醛)一端同修饰的琼脂糖膜表面结合，另一端同蛋白结合，然后应用于自身抗体谱抗原微阵列的制备。

在上述文献和专利中以玻璃为基底制备的芯片，可以在同一片琼脂糖基片表面点制多种生物样品，实现多个指标的检测，但是不能够在同一片琼脂糖基片表面实现多份样品同时检测；而芯片作为一种进行生物样品分析和测试高通量手段，不仅要求其在芯片表面固定多种不同样品，实现多种指标的检测，而且需要在同一片基片表面实现多份样品同时检测。若需要在琼脂糖凝胶基片表面实现多份生物样品的同时检测，必须将琼脂糖基片表面分隔成若干个独立区域。在申请号为CN1335501A的专利中提到了一种在载玻片表面设置且不会互相渗漏的腔室多样品微阵列生物芯片，载玻片的表面设有分割设置的单面胶材粘贴于载玻片表面而形成。

玻璃载玻片已被广泛用于充作制造DNA芯片和蛋白质芯片的材料，然而玻璃基片存在易碎、可塑性差等不足，不容易按照芯片制造要求制备各种形式。相比较而言，作为芯片基材的塑料载片不仅比玻璃载片的制作成本低，而且还可通过惯用模注射法轻易地模塑成所需要的形状。目前广泛采用激光共聚焦扫描仪进行生物芯片的信号检测，通常共聚焦扫描仪自动聚焦是以载玻片的左右边缘为聚焦平面，在申请号为CN1194101C的专利中，由于凹槽的存在，使得凹槽底部的聚焦平面同载玻片左右边缘不处于同一平面，并且由于扫描仪存在一定的聚焦深度，使得用申请号为CN1194101C的专利中的芯片检测时存在一定困难。

虽然塑料基片已被应用于制造芯片，但是到目前为止并没有在塑料基片表面制备琼脂糖膜基片，特别是未提示或建议利用塑料基片表面的可塑性强特点制备多凹槽的琼脂糖凝胶基片，用于芯片制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备生物芯片的琼脂糖凝胶塑料基片。

本发明所提供的琼脂糖凝胶塑料基片，是表面设有至少2个凹槽的塑料基片，所述凹槽底部设有一层琼脂糖凝胶膜。

为方便检测，凹槽底部同塑料基片的左、右边缘位于同一水平面，即塑料基片左右边缘处的塑料厚度同凹槽处的塑料厚度相同。

凹槽的深度一般设为0.05-1.5mm，塑料基片的厚度一般设为1-2.5mm，琼脂糖凝胶膜的厚度一般设为1-50μm。所述琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量百分浓度可为0.01-2％。

本发明的第二个目的是提供一种上述琼脂糖凝胶塑料基片的制备方法。

本发明所提供的制备方法，包括以下步骤：

1)将塑料基片表面用注塑法形成凹槽；

2)将塑料基片用等离子体清洗，使塑料基片处于亲水状态；

3)向塑料基片的凹槽中注入的琼脂糖溶液，干燥后成膜；

4)将凹槽处设有琼脂糖膜的塑料基片用高碘酸钠溶液进行氧化；

5)将氧化后的琼脂糖塑料膜基片用水清洗，干燥，得到琼脂糖凝胶塑料基片。

在上述制备方法中，所述步骤1)中对于制备塑料基片的材质的选择是多种多样的，如有机玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚环烯羟等；凹槽的深度一般设为0.05-1.5mm，塑料基片的厚度一般设为1-2.5mm。

步骤2)中用等离子体清洗的时间为20-40s，优选为30s。

步骤3)中琼脂糖溶液的质量百分浓度为0.01-2％，干燥后的琼脂糖凝胶膜的厚度为1-50μm。

步骤4)中氧化的方法为将凹槽处设有琼脂糖膜的塑料基片置于高碘酸钠溶液中反应30min-2h。

步骤5)中清洗用的水为超纯水，干燥的方法为离心。

本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片可作为制备生物芯片的基底材料使用。以其作为基底材料制备生物芯片时，可以采用美国Cartesian、GenomicInstrumentation或中国博奥生物等公司生产的微阵列点样仪按一定规则将多样品以阵列形式排布于琼脂糖凝胶塑料基片表面凹槽内的琼脂糖膜表面，在进行芯片反应时可以将相同或不同的生物样品加入琼脂糖凝胶塑料基片凹槽内进行生物反应。

本发明提供了一种表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片。该琼脂糖凝胶塑料基片具有以下优点：1)表面设有多个凹槽，使得不同的生物样品之间不会产生交叉污染；2)具有同凹槽底部等高的塑料基片的左、右边缘，使得凹槽内的样品平面与扫描仪自动聚焦平面位于同一水平面，从而有利于固定于凹槽中琼脂糖膜表面的生物样品的检测；3)制备方法简单，成本低廉；4)用此表面设有多个凹槽的琼脂糖塑料凝胶基片制备生物芯片时，可以实现多项指标和多份相同、不同生物样品的同时检测。基于上述优点，本发明将在生物芯片领域具有广阔的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为含有1×2个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片的主视结构示意图

图2为含有2×2个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片的主视结构示意图

图3为含有2×6个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片的主视结构示意图

图4为含有3×6个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片的主视结构示意图

图5为含有4×4个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片的主视结构示意图

图6为用含有1×2个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备的点阵蛋白芯片的检测结果

图7为用含有2×6个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备的点阵蛋白芯片的检测结果

图8为用含有2×6个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备的抗核抗体检测芯片的检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、用有机玻璃塑料基片制备表面设有1×2个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片

现用有机玻璃塑料基片制备含有1×2个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，具体制备过程包括以下步骤：

1)取75.6mm×25.2mm×2.5mm有机玻璃(PMMA)载玻片，用注塑法在载玻片中间形成2行×1列的凹槽，每个凹槽的尺寸为15×15mm²(长×宽)，凹槽深度为1.5mm，两点阵中心距离为20mm，塑料载玻片左右边缘各2mm宽范围内的塑料载玻片处同凹槽底部处于同一水平面；

2)将注塑后的塑料基片放入等离子清洗机中，清洗30s，使塑料基片表面处于亲水状态；

3)琼脂糖凝胶膜的制备，具体方法为：称量0.01克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解，用加样枪取500μL琼脂糖溶液滴加到塑料凹槽中，让琼脂糖溶液均匀分布在凹槽底部，然后室温下放置，自然挥发干燥后成膜；

4)将步骤3)获得的添加有琼脂糖膜的塑料基片放入0.1M高碘酸钠(NaIO₄)溶液中氧化反应60min；

5)将塑料基片用超纯水清洗，离心甩干，得到表面设有1×2个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，其主视结构示意图如图1所示。

可按与上述相同的注塑方法制备成表面设有2行×2列(其主视结构示意图如图2所示)、2行×3列、2行×6列(其主视结构示意图如图3所示)、3行×2列、3行×6列(其主视结构示意图如图4所示)、4行×4列(其主视结构示意图如图5所示)、5行×2列、6行×3列等不同大小和不同数量凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，塑料基片左右边缘处同凹槽底部处于同一水平面。此外，可根据需要配制不同浓度的琼脂糖溶液，如0.01％、0.1％、0.5％、1％或2％等，得到适用于不同样品的琼脂糖凝胶塑料基片。

实施例2、用聚苯乙烯塑料基片制备表面设有6个(3行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片

现用聚苯乙烯塑料基片制备含有6个(3行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，具体制备过程包括以下步骤：

1)取75.6mm×25.2mm×2mm聚苯乙烯(PS)载玻片，用注塑法在载玻片中间形成3行×2列的凹槽，每个凹槽的尺寸为8×8mm²(长×宽)，凹槽的深度为1mm，两点阵中心距离为12mm；塑料左右边缘各1.5mm宽范围内的塑料载玻片处同凹槽底部处于同一水平面；

2)将注塑后的塑料基片放入等离子清洗机中，清洗30s，使塑料基片表面处于亲水状态；

3)琼脂糖凝胶膜的制备，具体方法为：称量0.5克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解，用加样枪取400μL琼脂糖溶液滴加到塑料凹槽中，让琼脂糖溶液均匀分布在凹槽底部，然后室温下放置，自然挥发干燥后成膜；

4)将步骤3)获得的添加有琼脂糖膜的塑料基片放入0.1M高碘酸钠(NaIO₄)溶液中氧化反应30min；

5)将塑料基片用超纯水清洗，离心甩干，得到表面设有6个(3行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片。

可按与上述相同的注塑方法制备成表面设有1行×2列、2行×2列、2行×3列、4行×4列、5行×2列、6行×3列等不同大小和不同数量凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，塑料基片左右边缘处同凹槽底部处于同一水平面。此外，可根据需要配制不同浓度的琼脂糖溶液，如0.01％、0.05％、0.5％、1％或2％等，得到适用于不同样品的琼脂糖凝胶塑料基片。

实施例3、用聚碳酸酯塑料基片制备表面设有10个(5行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片

现用聚碳酸酯塑料基片制备含有10个(5行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，具体制备过程包括以下步骤：

1)取75.6mm×25.2mm×1.5mm聚碳酸脂塑料(PC)载玻片，用注塑法在载玻片中间形成5行×2列的凹槽，每个凹槽的尺寸为7×7mm²(长×宽)，凹槽的深度为0.2mm，两点阵中心距离为9mm；塑料左右边缘各1.5mm宽范围内的塑料载玻片处同凹槽底部处于同一水平面；

2)将注塑后的塑料基片放入等离子清洗机中，清洗30s，使塑料基片表面处于亲水状态；

3)琼脂糖凝胶膜的制备，具体方法为：称量1.0克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解，用加样枪取30μL琼脂糖溶液滴加到塑料凹槽中，让琼脂糖溶液均匀分布在凹槽底部，然后室温下放置，自然挥发干燥后成膜；

4)将步骤3)获得的添加有琼脂糖膜的塑料基片放入0.2M高碘酸钠(NaIO₄)溶液中氧化反应30min；

5)将塑料基片用超纯水清洗，离心甩干，得到表面设有10个(5行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片。

可按与上述相同的注塑方法制备成表面设有1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×2列、4行×4列、6行×3列等不同大小和不同数量凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，塑料基片左右边缘处同凹槽底部处于同一水平面。此外，可根据需要配制不同浓度的琼脂糖溶液，如0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％或2％等，得到适用于不同样品的琼脂糖凝胶塑料基片。

实施例4、用聚环烯烃塑料基片制备表面设有18个(6行×3列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片

现用聚环烯烃塑料基片制备含有18个(6行×3列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，具体制备过程包括以下步骤：

1)取75.6mm×25.2mm×1mm聚环烯烃塑料(COP)载玻片，用注塑法在载玻片中间形成6行×3列的凹槽，每个凹槽的尺寸为5×5mm²(长×宽)，凹槽的深度为0.05mm，两点阵中心距离为6mm；塑料左右边缘各1.5mm宽范围内的塑料载玻片处同凹槽底部处于同一水平面；

2)将注塑后的塑料基片放入等离子清洗机中，清洗30s，使塑料基片表面处于亲水状态；

3)琼脂糖凝胶膜的制备，具体方法为：称量10克琼脂糖加入1000mL烧杯中，随后加入500mL超纯水，放入微波炉中用中火加热溶解，用加样枪取10μL琼脂糖溶液滴加到塑料凹槽中，让琼脂糖溶液均匀分布在凹槽底部，然后室温下放置，自然挥发干燥后成膜；

4)将步骤3)获得的添加有琼脂糖膜的塑料基片放入0.1M高碘酸钠(NaIO₄)溶液中氧化反应30min；

5)将塑料基片用超纯水清洗，离心甩干，得到表面设有10个(5行×2列)凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片。

可按与上述相同的注塑方法制备成表面设有1行×2列、2行×2列、2行×3列、3行×2列、4行×4列、5行×2列等不同大小和不同数量凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片，塑料基片左右边缘处同凹槽底部处于同一水平面。此外，可根据需要配制不同浓度的琼脂糖溶液，如0.01％、0.05％、0.1％、0.5％或1％等，得到适用于不同样品的琼脂糖凝胶塑料基片。

实施例5、用本发明表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备生物芯片

现用本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备蛋白芯片，制备过程包括以下步骤：

1)将10mg/mL的人IgG样品用60％的甘油点样缓冲液(60％甘油/40％1×PBS)进行稀释，配成浓度分别为0.25、0.5、1.0和2.0mg/mL的人IgG样品，取出10μL转移加入384孔样品板中；

2)利用自动点样装置将准备好的样品按照一定点阵方式分配到本发明的表面设有12个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片表面，每张芯片包含2个(2行×1列)凹槽，每个凹槽中包含100个点，每个点间距离是400μm，每个凹槽形成独立的反应腔；

3)将点样后的芯片室温放置固定12-24小时；

4)将固定后的芯片用0.1％BSA溶液摇动封闭反应30min；

5)将封闭后的芯片用超纯水清洗，离心甩干；

6)向芯片的每个凹槽中加入20μL经荧光标记的羊抗人抗体(购于晶美生物工程有限公司)溶液，随后室温反应30min；

7)反应后芯片用超纯水清洗，离心甩干；

8)进行芯片扫描和数据处理。

芯片扫描结果如图6所示，表明用本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备生物芯片，可获得较好的检测效果。

实施例6、用本发明表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备生物芯片

现用本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备生物芯片，制备过程包括以下步骤：

1)将10mg/mL的人IgG样品用60％的甘油点样缓冲液(60％甘油/40％1×PBS)进行稀释，配成浓度分别为0.25、0.5、1.0和2.0mg/mL的人IgG样品，取出10μL转移加入384孔样品板中；

2)利用自动点样装置将准备好的样品按照一定点阵方式分配到本发明的表面设有12个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片表面，每张芯片包含12个(6行×2列)凹槽，每个凹槽中包含20个点，每个点间距离是400μm，每个凹槽形成独立的反应腔；

3)将点样后的芯片室温放置固定12-24小时；

4)将固定后的芯片用0.1％BSA溶液摇动封闭反应30min；

5)将封闭后的芯片用超纯水清洗，离心甩干；

6)向芯片的每个凹槽中加入20μL经荧光标记的羊抗人抗体溶液，随后室温反应30min；

7)反应后芯片用超纯水清洗，离心甩干；

8)进行芯片扫描和数据处理。

芯片扫描结果如图7所示，表明用本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备生物芯片，可获得较好的检测效果。

实施例6、用本发明表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备抗核抗体检测芯片

现用本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备抗核抗体检测芯片，制备过程包括以下步骤：

1)将各种抗核抗体样品用60％的甘油点样缓冲液(60％甘油/40％1×PBS)稀释到一定浓度，每种样品取出10μL转移加入384孔样品板中；

2)通过自动点样装置将准备好的点样液按照一定点阵方式排分配到凹槽底部琼脂糖凝胶膜表面，每张芯片包含12(6行×2列)个阵列，每个阵列包含63个点，每个点阵间距离是400μm，每个凹槽形成独立反应腔；

3)将点样后的芯片室温放置固定12-24小时；

4)将固定后芯片用0.1％BSA溶液摇动封闭反应30min；

5)将封闭后的芯片用超纯水清洗，离心甩干；

6)向芯片的每个凹槽中加入15μL血清样品，室温反应30min；

7)将反应后的芯片用超纯水清洗，离心甩干；

8)加入荧光标记的羊抗人抗体溶液，室温下反应30min；

9)将反应后的芯片用超纯水清洗，离心甩干；

10)进行芯片扫描和数据处理。

芯片扫描结果如图8所示，表明用本发明的表面设有多个凹槽的琼脂糖凝胶塑料基片制备抗核抗体检测芯片，可获得较好的检测效果。

Claims (12)

1、一种琼脂糖凝胶塑料基片，是表面设有至少2个深度为0.05-1.5mm的凹槽，厚度为1-2.5mm的塑料基片；所述凹槽底部设有一层琼脂糖凝胶膜；所述凹槽底部同塑料基片的左、右边缘位于同一水平面。

2、根据权利要求1所述的琼脂糖凝胶塑料基片，其特征在于：所述琼脂糖凝胶膜的厚度为1-50μm。

3、根据权利要求1或2所述的琼脂糖凝胶塑料基片，其特征在于：所述琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量百分浓度为0.01-2％。

4、一种权利要求1所述的琼脂糖凝胶塑料基片的制备方法，包括以下步骤：

1)将厚度为1-2.5mm的塑料基片表面用注塑法形成深度为0.05-1.5mm的凹槽；所述凹槽底部同塑料基片的左、右边缘位于同一水平面；

2)将塑料基片用等离子体清洗；

3)向塑料基片的凹槽中注入琼脂糖溶液，干燥后成膜；

4)将凹槽处设有琼脂糖膜的塑料基片用高碘酸钠溶液进行氧化；

5)将氧化后的琼脂糖塑料膜基片用水清洗，干燥，得到琼脂糖凝胶塑料基片。

5、根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中塑料基片的材质为有机玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚环烯羟。

6、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中用等离子体清洗的时间为20-40s。

7、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中琼脂糖溶液的质量百分浓度为0.01-2％，琼脂糖凝胶膜的厚度为1-50μm。

8、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤4)中氧化的方法为将凹槽处设有琼脂糖膜的塑料基片置于高碘酸钠溶液中反应30min-2h。

9、根据权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤5)中清洗用的水为超纯水，干燥的方法为离心。

10、权利要求1所述的琼脂糖凝胶塑料基片在制备生物芯片中的应用。

11、根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述生物芯片为蛋白芯片。

12、根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述蛋白芯片为抗核抗体检测芯片。

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