CN100577815C

CN100577815C - 手术中的淋巴结检测

Info

Publication number: CN100577815C
Application number: CN200410059526A
Authority: CN
Inventors: D·阿特金斯; J·巴库斯; R·贝利; S·罗森; R·怀特
Original assignee: Veridex LLC
Current assignee: Janssen Diagnostics LLC
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-30
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2024-04-30
Also published as: AR044160A1; AU2004201842A1; ATE401423T1; ES2310275T3; EP1757705A2; PT1757705E; EP1526187A3; EP1526187B1; BRPI0401651A; EP1757705B1; KR20040094650A; DE602004015037D1; CA2464874C; EP1526187A2; CA2464874A1; CL2004000922A1; EP1757705A3; DK1757705T3; DK1526187T3; BRPI0401651B1

Abstract

在一个微转移的手术中淋巴结检测中，外科医生根据已知的方法在外科手术中确定岗哨淋巴结。岗哨结节被切除并准备用于核苷酸的提取。然后从岗哨结节中快速提取核苷酸(如RNA)。指示微转移的标记，如果存在，然后被扩增和检测。

Description

手术中的淋巴结检测

背景技术

本发明涉及分子诊断领域。

淋巴结增生在很多实体瘤中是最强的预后因素，而且淋巴结微转移的检测是病理学者和外科医生最为关注的。目前的淋巴结评估涉及H&E染色组织切片的微观检验，并有三个主要局限性：(a)容易遗漏单个肿瘤细胞，或细胞的小病灶；(b)不能快速获得结果，意味着岗哨淋巴结分析的任何阳性结果需要另一个外科手术来切除腋淋巴结和(c)只研究了一个或两个组织切片，因此每个淋巴结的大部分没有被检验。连续切片有助于克服取样误差问题，而免疫组织化学(IHC)可用于鉴定单个肿瘤细胞。但是，这些方法的组合对于常规分析来说过于昂贵和费时，并仅限于特殊情况如岗哨淋巴结检验。

外科决定常常基于手术中的淋巴结冷冻切片分析；但是，这些方法的灵敏度相对较低，相当于标准H&E病理学的50-70％，导致过高的二次手术率。没有淋巴结增生的0期和I期乳癌患者的5年存活率分别为92％和87％。另一方面，有淋巴结增生的晚期乳癌患者的5年存活率显著降低。例如，II期乳癌的存活率只有75％，III期为46％，IV期为13％。尽管淋巴结阴性的乳癌患者有提高的存活率，但是20-30％组织学上结节阴性的患者疾病复发。这很可能是由于包括与结节取样相关问题的微转移检测现有技术的局限和检测单个肿瘤细胞或小肿瘤病灶的低灵敏度。

除了在乳癌结节中需要更准确和灵敏的微转移检测之外，在黑素瘤结节中以及更准确的确定外科手术的范围中也有一个快速和灵敏测试的相似需要，尤其是在手术中安排中。

聚合酶链式反应(PCR)是在这种安排中有用的分子生物领域中一个强有力的工具。这种技术可以将少量核苷酸片断复制扩增到可被有效分析的数量。此外，随着实时定量RT-PCR(Q-PCR)的发展，这种技术变得更加可靠和适合于自动操作。Q-RT-PCR较少受到污染，并能够量化基因表达。这种量化可用于手术中淋巴结分析的微转移检测。除了优点，分子诊断中的PCR还有一些局限，使它难以用于典型的临床诊断安排，尤其是手术安排。

这种局限中的一个是进行PCR诊断通常所需时间。典型pCR反应需要数小时，而不是几分钟。如果这种技术将在手术中使用，那么减少进行一个PCR反应所需时间是必需的。更进一步的，尽管Q-RT-PCR能产生定量结果，至今还没有已知的关闭值，用于将基于这种技术的阳性结果从阴性结果中区别开，也是不清楚哪个核苷酸片断被最好检测并与微转移存在相关。扩增和检测核苷酸片断的其它方法也存在并且都遭遇相似的问题。

一种克服了现有困难的手术中的分子淋巴结检测将被医学界接受。

发明概述

本发明是一种用于微转移的手术中淋巴结检测。外科医生在外科手术过程中根据已知方法确定岗哨淋巴结。如下所述切除和制备岗哨结节。然后从岗哨结节中快速提取核苷酸(如，RNA)。如果存在指示微转移的标记，就对其进行扩增和检测。外科医生然后根据该标记的检测结果采取行动。

这种检测优选基于一种快速PCR和RT-PCR方法，该方法能够在几分钟内完成整个PCR反应，从而允许在手术诊断中使用PCR来检测岗哨淋巴结的微转移。

本发明的一个方面，一种手术中的分子诊断方法包括在外科手术过程中采用下述步骤：从患者获得组织样品；从该样品提取RNA，通过核苷酸扩增和检测分析样品；并确定是否存在一个或多个基因表达标记超过了关闭值。关闭值可能是绝对值或相对于对照基因的值。

本发明的另一个方面，基因表达标记是特定组织如乳腺组织的特异性核苷酸片断。

本发明的另一个方面，基因表达标记是恶性肿瘤的指示性核苷酸片断。

本发明的另一个方面，淋巴结样品被匀质的，然后被稀释以确保即使采用加速的提取方法也能提取到足够的RNA。

本发明的另一个方面，标记是乳腺珠蛋白(mammaglobin)(Seq.ID.No.17)和用于乳癌诊断的PIP(Seq.ID.No.18)，B305D(特别地，同种型C，Seq.ID.No.14)，B726(Seq.ID.No.15)，GABA(Seq.ID.No.16)或O8E(Seq.ID.No.-)，以及用于黑素瘤诊断的酪氨酸酶(Seq.ID.No.22)和MART 1(Seq.ID.No.21)。

本发明的另一个方面，微转移通过包括以下步骤的方法在手术中被检测：从一个岗哨淋巴结获得RNA；实行一个特异于一个或多个关注基因的定量RT-PCR方法，并确定是否存在超过预定关闭的标记。关闭值可能是一个绝对值或一个相对于对照基因表达的值。

本发明的另一个方面，包含用于进行微转移的手术中淋巴结检测的试剂的试剂盒。

附图说明

图1表明溶解产物的稀释对RNA回收的影响。

图2表明稀释的影响。

图3显示不同乳腺细胞类型中乳腺珠蛋白的表达。

图4显示不同乳腺细胞类型中B305D的表达。

图5显示不同乳腺细胞类型中乳腺珠蛋白和B305D的组合表达。

发明详述

提供了手术中癌症诊断的方法的。这些方法采用从淋巴结提取核苷酸的快速方法，以及扩增和检测指示转移的核苷酸片断的方法(这种片断在此称作为“标记”)。

本发明方法的一个重要方面是快速扩增和检测指示某种基因表达的标记。只要能在手术中检测可接受的时期内进行(如不超过35分钟)，任何可靠的、灵敏的和特异性的方法都可以使用。这包括PCR方法，滚环扩增方法(RCA)，连接酶链式反应方法(LCR)，链置换扩增方法(SDA)，核苷酸序列基础扩增方法(NASBA)，和其它方法。涉及的快速分子诊断方法最优选定量PCR方法，包括QRT-PCR。

不考虑应用的扩增方法，从用于进行检测的组织中充分地取样是重要的。这包括正确的剪切和处理岗哨淋巴结，以及从中提取RNA。一旦获得结节，重要的是正确地处理以便存在的任何癌症细胞都能被检测出来。

多种方法能用于从组织样品提取核苷酸。每种情况中的标准操作是费时和困难的，即使使用为这种目的设计的商用试剂盒。典型的商用核苷酸提取试剂盒提取核苷酸至少需要15分钟。本发明的方法中，提取核苷酸的时间少于8分钟，优选的少于6分钟。这些快速提取方法是R.Belly，J.Toner，和J.Backus同期并题为“细胞和组织RNA的快速提取”专利申请的主题，在此合并用作参考。

完整RNA的成功分离一般包括四个步骤：细胞和组织的有效裂解，核蛋白质复合物的变性，内源核糖核酸酶(RNAase)的失活以及杂质DNA和蛋白质的去除。用于灭活细胞提取物中的核糖核酸酶的硫氰酸胍盐(GTC)和B-巯基乙醇的破坏的和保护的特性，使它们成为第一步骤的优选试剂。当与表面活性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)联合使用时，破坏核蛋白质复合物，使RNA释放到溶液中，并分离去除蛋白质。稀释存在高浓度的GTC的细胞提取物，导致了细胞蛋白质的选择性沉降但RNA仍保留在溶液中。离心可以分离被沉降蛋白质和细胞DNA的溶解产物，其优选的通过一个柱进行。这些柱可以剪切DNA并降低样品的粘性。RNA纯化优选通过一个含有硅和其它物质的螺旋柱进行。人工破坏细胞和组织可以通过US专利4,715,545中描述的一次性组织研磨机进行。均质时间在1到2分钟内，优选的是30-45秒。样品然后用一个撕碎柱(shredding column)(如，QIAshredder，QIAGEN Inc.，Valencia，CA，或合适的取代物)或一个RNA处理装置如可购自Omni International(Warrenton，VA)的PCR组织均质试剂盒处理，来降低其粘性。RNA通过上述的旋转柱沉降出来，而且离心时间不能超过30秒。当使用如Qiagen，Inc.的那些商业的RNA提取试剂盒时，除了柱干燥步骤外的所有步骤都使用过滤来取代离心。典型地，在过柱之前样品先用等体积的70％乙醇稀释。在过滤冲洗之后，通过离心干燥柱子，在去核糖核酸酶水中洗提RNA。RNA用乙醇选择性沉降出溶液，并结合到一个基质上(优选地，一个含硅的膜或过滤器)。RNA很快的结合到基质中是因为水分子被离液盐破坏，然后核苷酸顺利的吸收到硅中。结合的总RNA通过简单的冲洗步骤进一步从杂质盐，蛋白质和细胞杂质中纯化出来。最后，总RNA通过加入去核酶水从膜中洗提出来。这种快速方法的总时间少于8分钟，优选的少于6分钟。

总的来说，快速RNA提取方法包括以下步骤：

(a)获得一个来自生物系统的含有细胞的样品，

(b)合适地，从样品中去除不含有所关注RNA的细胞，产生一个工作样品，

(c)溶解含有所关注RNA的细胞，并制备其匀浆，

(d)合适地，稀释该匀浆，

(e)使该湿润的匀质工作样品与一个含有或粘附有RNA结合物质的基质接触，

(f)使样品接合到基质上，

(g)去除杂质和干扰物，

(h)干燥基质，和

(i)从基质洗提RNA；

在使用离心的情况中，在步骤g，h，或i之后使用离心，真空/过滤优选用于提取步骤。

该快速提取过程中涉及的试剂是：

分析/接合缓冲液(优选地，4.5M胍盐-盐酸，100mM磷酸钠)，

冲洗缓冲液I(优选地，5M胍盐-盐酸中37％乙醇，20mM Tris-HCl)，

冲洗缓冲液II(优选地，20mM中80％乙醇，2mM Tris-HCl)，

洗提缓冲液，和

去核酶无菌双蒸馏水。

由于结节中的癌细胞的分布是不均衡的，优选从结节的多切片中采样。合适地，根据病理学研究一个或多个结节。对同一个结节样品分子检测和病理学检查的方法是将该结节切成用于病理学检查的外和内切片和用于分子测试的外和内切片的至少四个切片。由于组织中的转移和微转移在结节或其它组织中的分布是不均衡的，必须获得一个足够大的样品以便转移不被遗漏。解决本发明方法中的取样问题的方法是，匀质一个大的组织样品，然后稀释很好混合的匀质样品，用于后继的分子测试。

一个典型的PCR反应包括多个扩增步骤，或能选择性地扩增目标核苷酸种类的循环。一个典型的PCR反应包括三个步骤：一个变性步骤，其中目标核苷酸被变性；一个退火步骤，其中一组PCR引物(正向和反向引物)与互补DNA链退火；和一个延伸步骤，其中一个热稳定性DNA聚合酶延伸引物。重复这个步骤多次，一个DNA片断被扩增并产生一个相应于目标DNA序列的扩增子。典型的PCR反应包括20或更多个循环的变性、退火和延伸。在很多情况中，退火和延伸步骤可以同时进行，在该情况中循环只包括两个步骤。

在该应用RT-PCR的创造性方法中，RT-PCR扩增反应在一个适于手术中诊断的时间内进行，这些步骤中每一个的长度可以在秒的范围内，而不是在分钟内。特别地，用几个能产生热倾斜速率为至少每秒约5℃的新热循环仪，使用RT-PCR扩增为30分钟或更少。更优选地，进行扩增少于25分钟。考虑到这个，PCR循环每个步骤接着的时间不包括倾斜的时间。变性步骤进行的时间为10秒或更少。实际上，一些热循环仪已经设定为“0秒”，其可能是变性步骤合适的持续时间。也就是说，它对热循环仪达到变性温度是足够的。每个退火和延伸步骤最优选都少于10秒，而且当在同一温度进行时，退火/延伸步骤的组合可以少于10秒。但是，一些同源探针检测方法要求一个单独的延伸步骤来实现最快速检测。为了最小化总扩增时间和非特异性副反应的形成，退火温度典型地高于50℃，更优选地，退火温度高于55℃。

由于一些原因没有试验者干涉的单个RT-PCR组合反应是渴望得到的：(1)减少试验误差危险，(2)降低目标或产物杂质危害和(3)提高检测速度。该步骤可能包括一个或两个聚合酶。在两个聚合酶的情况中，这些酶中的一个典型是基于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)，一个是热稳定性的基于DNA的DNA聚合酶。为了最大化检测，优选对这两种酶使用一种“热启动”技术形式。US专利5,411,876和5,985,619提供了不同“热启动”方法的例子，在这里合并用作参考。优选方法包括使用一个或多个热活化方法，其隔绝一个或多个充分DNA聚合所需的成分。US专利5,550,044和5,413,924描述了制备用于这些方法的试剂的方法。US专利6,403,341描述了一个涉及化学该变PCR试剂成分之一的隔绝方法。这里都合并用于参考。一个最优选的方面，RNA和DNA依赖的聚合酶活性都位于单个酶中。充分扩增需要的其它成分包括核苷三磷酸，二价盐和缓冲成分。在一些例子中，非特异性核苷酸和酶稳定剂是有益的。

任何特定的基于扩增的分子诊断的特异性，严重地但不是专有地依赖于引物组的同一性。引物组是与目标DNA退火从而扩增目标序列的正向和反向寡核苷酸引物对，从而产生目标序列的特异性扩增子。引物必须能扩增所关注的疾病状态的标记。在本发明中，这些标记是指示乳癌和黑素瘤。

在乳癌的情况中，创造性方法涉及一个特异于乳组织或乳癌组织的组织标记的扩增。使用至少两种标记的组合，以便当淋巴结中存在乳和/或癌细胞时，能在临床上被显著和可靠地检测出。优选地，在一个反应容器中同时扩增和检测标记(如，它们是多元的)。最优选地，引物组与那些标记的特异核苷酸片断互补。标记包括乳腺珠蛋白(Seq.ID.No.17)和下述中的一个或多个(优选一个)：B305D(Seq.ID.No.14)，PIP(Seq.ID.No.18)，B726(Seq.ID.No.15)，GABA(Seq.ID.No.16)或O8E(Seq.ID.No._)。组织特异性标记与癌特异性标记的组合提供了分别超过90％和95％的灵敏度和特异性。一些标记存在多种异构体，但这些异构体中的某种比其它异构体更特异于一种组织或癌。在B305D中，最优选的异构体是B305D异构体C。它也是与乳腺珠蛋白标记组合的标记中最优选的。

在黑素瘤中，创造性的方法涉及扩增特异于黑素瘤癌症的标记。这样，引物组与特异于那些标记的核苷酸片断互补。标记包括下述的一个或多个(优选两个或更多个)：酪氨酸酶(Seq.ID No.22)和MART 1(Seq.ID No.21)。这些标记的灵敏度和特异性超过90％。

反应必须还包含一些特异信号检测的手段。其优选地，通过使用一个检测来自所关注目标序列聚合的DNA序列区域的试剂来完成。当接合于关注的特异核苷酸序列时，检测的优选试剂提供了一个可检测的信号差异。常常，这些方法涉及当接合于所关注的序列时提供增加的荧光的核苷酸探针。创造性方法的PCR反应过程典型地通过分析每个PCR引物组扩增产物的相对速率来监控。监控扩增产物可以通过很多检测试剂和方法来实现，不限于荧光引物，与双链DNA相结合的荧光探针和荧光染料，分子信标，scorpins及其它。监控PCR反应的常用方法采用荧光5’核酸酶检测。这种方法使用某种热稳定性DNA聚合酶(如Taq或Tfl DNA聚合酶)的5’核酸酶活性在PCR过程中裂开一个寡聚探针。在延伸情况下，筛选低聚体来退火扩增的目标序列。探针典型的在其5’末端有一个荧光报告分子，在其3’末端有一个报告分子的荧光猝灭利。只要低聚物是完整的，来自报告分子的荧光信号就被猝灭。但是，当低聚物在延伸过程中被消化时，荧光报告分子不再接近猝灭。特定扩增的无荧光标记分子的相对积累可以与一个对照样品和/或对照基因例如不限于β-肌动蛋白和PBDG(胆色素原脱氨酶)同样扩增的积累相比较，来决定RNA群中特定RNA的特定cDNA产物的相对丰度。荧光5’核酸酶检测的产物和试剂很容易购买得到，如购自AppliedBiosystems。

优选的检测试剂是常称作“scorpion”，描述于US专利6,326,145和5,525,494，在此合并用作参考。这些试剂包括一个或多个包含一个加尾引物和一个完整的信号系统的分子。该引物有一个模板结合区域与一个含有一个连接和一个目标结合区域的尾巴。在尾巴中的目标结合区域与引物的延伸产物的互补序列杂交。这种目标特异性杂交事件与一个信号系统结合，其中杂交导致一个可检测的改变。在PCR反应中，合理地安排目标结合区域与尾巴区域，以便使尾巴区域保持单链，即未拷贝的。这样，尾巴区域在PCR扩增产物中是不可扩增的。连接包括一个防止聚合酶介导的链在引物模板上延伸的阻断部分。

可以用于在PCR和QRT-PCR中控制和监控扩增积累的仪器和软件包括，购自Cepheid of Sunnyvale，California的Smart Cycle热循环仪，和购自AppliedBiosystem的ABI Prism 7700序列检测系统。

在优选的RT-PCR反应中，某种反转录酶和PCR反应成分的量是非典型的，是为了利用一些热循环仪较快的倾斜次数。尤其是当引物浓度很高时。

典型用于反转录酶反应的基因特异性引物浓度低于20nM。为了取得一个1到2分钟的快速反转录酶反应，反转录酶引物浓度升高到大于20nM，优选至少大约50nM，典型的大约100nM。标难的PCR引物浓度为100nM到300nM。在标准PCR反应中可以使用更高的浓度来补偿Tm的变异。但是，为了实现本发明目的，参考引物浓度用于不需要Tm补偿的情况。当需要或者期望进行Tm补偿时，可以根据经验确定并使用相应较高浓度的引物。为了实现快速PCR反应，PCR引物浓度典型的大于250nM，优选的大于300nM，典型的大约500nM。

商业上使用的诊断，优选使用一个或多个内部阳性对照，其确定进行一个阴性结果的特殊扩增反应。在一个RT-PCR反应中，必须被控制的导致假阴性结果的可能原因包括：不充足的RNA量，RNA降解，RT和/或PCR抑制以及试验误差。在基因表达检测中，优选使用一个在所关注的组织中组成型表达的基因。由于几个原因，PBGD(Seq ID No.20)常用作内部对照的基因：它在人体中没有假基因，在人体组织中组成型表达，它以相对较低的水平表达，因此不太可能引起所关注的目标序列扩增的抑制。用PBGD作为对照，最小化或消除了由假阴性结果的所有可能来源产生的错误结果。

商业化QRT-PCR用于检测特定核苷酸序列的试剂盒的所述方法是特别有用的。在一个实施例中，试剂盒包括扩增和检测标记的试剂。合适地，试剂盒包括从淋巴结组织提取核苷酸的样品制备试剂和/或制品(如试管)。试剂盒也可以包括最小化样品杂质危害的制品(如淋巴结解剖和制备中的一次性解剖刀和表面)。

在一个优选的试剂盒中，包括上述的一个管的QRT-PCR过程所必需的试剂，如反转录酶，一个反转录酶引物，一个相应的PCR引物组(优选用于标记和对照)，一个热稳定性DNA聚合酶如Taq聚合酶，和一个合适的检测试剂，例如，但不限于一个scorpion探针，一个荧光5’核酶检测探针，一个分子信标探针，一个双链DNA特异性的单染料引物或荧光染料，如溴乙锭。引物的量优选能产生上述高浓度。热稳定性DNA聚合酶是常用的并可购自多个制造商。试剂盒中的附加物质可包括：合适的反应试管或小管，一个屏障组合物，典型地有一个蜡珠，合适地包括镁；反转录和PCR阶段的反应混合物(典型地10X)，包括必需的缓冲液和试剂如dNTPs；去核酶或RNA酶的水；RNA酶抑制剂；对照核苷酸和/或任何附加缓冲液，化合物，协作因子(co-factor)，离子成分，蛋白质和酶，聚合物，以及可用于反转录和/或QRT-PCR反应PCR阶段的类似物。合适地，试剂盒包括核苷酸提取试剂和物质。

下面的非限制性实施例有助于更进一步描述本发明。

实施例

实时PCR

本发明的实施例是基于实时PCR的使用。在实时PCR中，聚合酶链式反应的产物在PCR指数期实时监控而不是在终点进行测量。因此，DNA和RNA的量准确得多，而且是可重复的。荧光值在每个循环中都记录，并代表在扩增反应中那个点的扩增产物的量。反应开始时存在的模板量越多，达到其中荧光信号首次被记作统计学上显著于背景的某个点所需要的循环数就越少，其被定义为C_t值。使用基于荧光的RT-PCR，阈值循环(C_t)概念产生准确的和可重复的量。PCR产物的同源测定优选的基于下述进行：(a)双链接合染料(例如SYBRGreen)，(b)荧光探针(例如Taq Man探针，分子信标)，和(c)直接标记引物(例如Amplifluor引物)。

实施例1使用Taqman检测，比较用快速方法与用基于实时PCR的现有技术方法提取的RNA

总共16个H&E阳性结节和15个H&E阴性乳结节样品购自GenomicsCollaborative。从每个结节取两个30mg的组织切片。

部分I(现有技术).一个30mg组织切片处理如下：加入600μl的RLT缓冲液，样品用一个一次性组织研磨机(cat 15704-126，VWR Scientific，West Chester，PA)手工均质20-40秒。试管在Eppendorf型5415C微型离心机以最大速度离心3分钟。上清液转移到一个新管中，加入1倍体积的70％乙醇。

样品(700μl)加到一个置于QIA vac24真空歧管上的RNeasy小型柱，并用真空。RWI缓冲液(700μl)用于过滤通过该柱。RPE缓冲液(500μl)被滴加柱中并过滤通过。另一个500μl的RPE缓冲液被加入到柱中并过滤通过。RNeasy柱放到一个2ml的收集管中，并在一个微型离心机中以最大速度离心1分钟。然后通过转移RNeasy柱到一个新的1.5ml收集管柱，加入50μl去RNA酶水并以8000X.g离心1分钟，将RNA从柱中被洗提出来。部分II(快速提取)第二个30mg的乳结节组织切片通过下述方案处理：(1)组织切片加入600μl的RLT缓冲液，并用一次性组织研磨机手工均质20到40秒。(2)匀浆用一个QIAshredder柱以最大速度离心30秒。(3)加入1倍体积的70％乙醇到溶解产物中并吹打混合。(4)样品(700μl)然后置于QIA vac24真空歧管上的Rneasy小型柱，并用真空。(5)700μl RWI缓冲液加入到柱中并过滤通过该柱。(6)500μl RPE缓冲液加入柱中并可以过滤通过。(7)把柱转移到一个2ml的收集管中，并以10,000rpm离心30秒。(8)加入25μl去RNA酶水到膜上，柱子以10,000rpm离心30秒来洗提RNA。快速方案中的所有离心步骤在10MVSS VWR型离心机上进行。

提取的RNA被反转录，RNA和cDNA如前所述的进行定量。

为了进行Taqman检测，Taqman Core试剂盒，Gene Amp 10X PCR缓冲液1，Amp Erase Uracil N-糖苷酶，和Ampli Taq金聚合酶都购自Applied Biosystems，Forster City，CA。其它的所有试剂来自如实施例1所述的商业来源。甘油购自SigmaChemical Co(St.Louis，Mo.)，Tween20购自Eastman OrganicChemicals(Rochester，NY)。

乳腺珠蛋白引物(Seq ID No.3和Seq ID No.4)由Invitrogen Crop.(carlsbad，CA)合成，乳腺珠蛋白Taqman探针(Seq ID No.7)来自Epoch Bioscience(SanDiego，CA)。PBGD引物(Seq ID No.8和Seq ID No.9)由QIAGEN Operon(Alameda，CA)合成，探针(Seq ID No.23)由SYNTHEGEN，LLC(Houston，TX)合成。B305D引物(Seq ID No.11和Seq ID No.12)在Invitrogen Corp合成，探针(Seq ID No.13)由Applied Biosystems，Inc.合成，对于所有的Taqman探针，羧基荧光素(FAM)和羧基四甲基玫瑰精(TAMRA)用作染料和促灭对(quencherpair)。

SEQ ID NO.3 CAAACGGATG AAACTCTGAG CAATGTTGA

SEQ ID NO.4 TCTGTGAGCC AAAGG TCTTG CAGA

SEQ 1D NO.7 6-FAM-TGTTTATGCA ATTAATATAT GACAGCAGTC

TTTGTG-TAMRA

SEQ ID NO.8 CTGAGGCACC TGGAAGGAGG

SEQ1D NO.9 CATCTTCATG CTGGGCAGGG

SEQ ID NO.23 6-FAM-CCTGAGGCAC CTGGAAGGAG GCTGCAG TGT-

TAMRA

SEQ ID NO.11 TCTGATAAAG GCCGTACAAT G

SEQ ID NO.12 TCACGACTTG CTGTTTTTGC TC

SEQ ID NO.13 6-FAM-ATCAAAAAACA AGCATGGCCTA CACC-TAMRA

为了进行Taqman检测，一个主要混合物通过加入10μl的10X PCR缓冲液#1，14μl的25mM MgCl₂，8μl 10mM各种dNTP，1μl的AmpErase UNG(1U/μl)，16μl甘油，1μl 1％w/v Tween 20，0.75μl AmpliTaq Gold(5U/μl)，来自一个5μM母液的每个引物各6μl，0.4μl的一个10μM的探针母液，和水达到一个96μl的终体积来制备。主要混合物(48μl)和2μl来自每个结节样品的cDNA被加入到每个光学反应微量滴定板小孔中。盖上光学盖子后，该板置于一个ABI Prism 7900HT序列测定系统(Applied Biosystems，Inc.，ForsterCity，CA)中进行处理。商业试剂，和Taqman B-actin测定试剂购自AppliedBiosystems，(Forster City，CA)，测定根据制造商建议的方案进行。一个0.02的阈值用于乳腺珠蛋白检测的分析，0.03用于B305D检测，0.08用于B-actin检测，0.1用于PBDG检测。Taqman检测的三次测定的平均值如图1和2所示。

在15个H&E阴性结节样品和16个H&E阳性结节与两个对照cDNA样品中的管家基因B-肌动蛋白与PBDG实时测定的比较如表1所示。这些试验的结果表明本发明的快速方法与标准商业方法(QIAGEN)获得的C_t值一致性较好，说明用快速RNA提取方案提取的RNA与根据一个标准商业方案提取的RNA能进行反转录和RNA扩增到一个相似的程度。

表2基于乳癌标记乳腺珠蛋白和B305D的C_t值，用表1所评估的相同乳癌结节样品比较了基因表达结果。为了确定是否基于实时PCR结果的H&E阳性和H&E阴性乳癌结节样品之间有一个相关，测定了H&E阴性结节样品中的每个标记乳腺珠蛋白和B305DH&E的最低C_t值。任意地，但保守地，H&E阴性样品值低于这个最低值的2.5C_t值的关闭用于H&E阳性样品。在表2中为阴影的样品较高地表达两个乳癌标记，因为C_t值至少比在H&E阴性样品中观察到的C_t值低2.5C_t。使用本发明的快速方法和商业制造商推荐的方案(QIAGEN)测定的这些标记的表达间有一个相关。

使用乳腺珠蛋白作为标记，本发明的快速方法与QIAGEN RNA提取方案的15个H&E结节样品的两个样品的C_t值之间没有严格的相关。这些样品中的GCLNC-24中，C_t值的差异是0.4，其在试验误差的范围之内。第二个样品显示了一个大的C_t值差异。乳腺珠蛋白与B305D中较大的C_t值差异可能是由于在这些样品中难于进行光谱RNA定量以及已确定的淋巴结中转移非均衡分布导致可能取样问题。(Cserni.1999.通过彻底的组织病理学分析确定乳腺癌在腋窝岗哨淋巴结节中转移(Metastases in axillary sentinel lymph nodes in breast cancer asdetected by intensive histopathological work up.)临床病理学杂志(J.ClinPathol)，52：0922-924.)

表1：使用Taqman测试测量看家基因B-肌动蛋白和PBDG，比较用快速方法与现有技术的方法提取的RNA

关闭值 33.7 37.5 36.1 36.1

表2：通过Taqman测试测量癌症基因乳腺珠蛋白与B305D，比较用快速方法与现有技术的方法提取的RNA

关闭值＝ 33.7 37.5 36.1 36.1

实施例2.QIAshredder柱评估

这个实施例的目的是为了证实在淋巴结组织均质后使用QIAshredder柱，并离心匀浆仅30秒就可以产生可接受的RNA提取物。

从Genomics Collabrative(Cambridge，MA)获得了一个H&E阴性乳腋结节。一个490mg的组织切片于5.5ml的缓冲液RLT中混合，均质结节。600微升的匀浆被移走，RNA用实施例1中所述的快速提取进行提取。作为对照，另一个600μl的匀浆，除其中3分钟的离心替换QIAshredder柱外，使用同样的快速RNA提取方法处理。对每个反应得到的RNA如实施例1所述进行反转录和定量。使用Taqman探针进行实时PCR。

这些研究的结果表明，包含QIAshredder方法的方案与离心方案有相似的RNA产量，分别为0.31μg/μl和0.34μg/μl。在两个样品中获得了显示高质量RNA的同样的2.1的260/280nm比值。实时RNA检测也表明了，与离心方法相比，用QIAshredder柱提取的RNA具有相似的乳腺珠蛋白C_t值(22.5对2.0)，以及B305D(26.7对26.6)，看家基因PBDG(29.1对29.0)和B-肌动蛋白(SEQ IDNO19，18.5对18.2)。

总的来说，这个试验具有与在均质后用含有QIAshredder代替一个3分钟离心步骤的方法相似的RNA产量、质量和实时PCR扩增结果。这使进行RNA提取所需的时间减少了2.5分钟，其在开发适于手术中和其中需要影响患者治疗的快速结果的其它应用的方案中是重要的。

实施例3.溶解产物的稀释对RNA产量和精确度的影响

下面的实施例阐述了溶解产物的稀释对RNA产量和RNA回收(recovery)精度的影响。在这个实施例中，切取20mg，10mg或5mg的冷冻猪结节组织。组织用50ml组织研磨机研磨30秒，并搅拌样品。对于每个结节称重重复三次。将1ml各个溶解产物转移到一个1.7ml微型离心机的离心管中，然后在Eppendorf微型超速离心机中以最大速度(14,000RPM)离心30秒钟。700μL样品通过QIA切碎筒离心，以最大速度离心30秒钟。然后如先前在实施例2的第I部分步骤4-8所述，洗涤该柱、干燥和洗提RNA。通过Gene Spec II定量RNA。这些试验的结果显示于表5中，说明与含有10mg和20mg的重量较大的样品相比，在600ml均质缓冲液中均质的重2.5mg的初始结节组织具有优良的精确度。这些结果表明在较低结节重量时能获得改进的RNA回收精确度。同时，可以预期较稀的匀浆可以更快地滤过柱，并且将更不易存在过滤器堵塞的问题。

实施例4.淋巴结样品RNA的Taqman测试

反转录

由20μg总RNA于42℃在一个250μl的反应液中反应60分钟合成cDNA，该反应液含有50mM Tris-Cl pH8.3，7.5mM KCl，3mM MgCl₂，10mM DTT，2000U上标(Superscript)，400U Rnasin，2μg寡dT引物，0.08mg/mlBSA和ACT，CTP，GTP和TTP各0.2mM。生成的cDNA与水以1∶8稀释。

PCR扩增

稀释的cDNA各2μl以每孔50ml的总体积在Applied Biosystems7900中进行扩增。扩增按以下方案进行：50℃ 2min，95℃ 10min，然后进行(95℃ 15sec，60℃ 1min(B276为58℃)，68℃ 1min)40个循环。反应混合成分和终浓度如下：1X Taqman缓冲液A(ABI)，3.5mM MgCl₂，0.2mM dGTP，dCTP和cATP，0.4mM dUTP(ABI)，0.01U/μl AmpErase UNG(ABI)，0.375U/μl AmpliTaqGold(ABI)，8％甘油(Sigma)，0.01％ Tween 20(Kodak)，引物各0.3μM(Invitrogen)，去Rnase/Dnase水(Sigma)，40nM 5’-FAM，3’-TAMRA寡核苷酸探针(Synthegen)。在由PCR产物增加引起荧光强度增加的对数线性范围内，相对于内比染料(ROX)的信号阈值赋予各个引物/探针组。结果的C_t值用于确定所有测试样品基因的相对表达。

所用的引物：

乳腺珠蛋白

引物1，SEQ ID NO 3-CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA

引物2，SEQ ID NO 4-TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA

探针，SEQ ID NO 7-FAM-

TGTTTATGCAATTAATATATGACAGCAGTCTTTGTG-TAMRA

B305D

引物1，SEQ ID NO 11-TCTGATAAAGGCCGTACAATG

引物2，SEQ ID NO 12-TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC

探针，SEQ ID NO 24-FAM ATCAAAAAACAAGCATGGCCTCACACC

PBGD

引物1，SEQ ID NO 25-CTGCTTCGCTGCATCGCTGAAA

引物2，SEQ ID NO 26-CAGACTCCTCCAGTCAGGTACA

探针，SEQ ID NO 23-FAM-CCTGAGGCACCTGGAAGGAGGCTGCAGTGT-

TAMRA

PIP

引物1，SEQ ID NO 27-GCTTGGTGGTTAAAACTTACC

引物2，SEQ ID NO 28，-TGAACAGTTCTGTTGGTGTA

探针，SEQ ID NO 29-FAM-CTGCCTGCCTATGTGACGACAATCCGG-

TAMRA

GABA

引物1，SEQ ID NO 30-CAATTTTGGTGGAGAACCCG

引物2，SEQ ID NO 31-GCTGTCGGAGGTATATGGTG

探针，SEQ ID NO 32-FAM CATTTCAGAGAGTAACATGGACTACACA

TAMRA

B726

引物1，SEQ ID NO 33-GCAAGTGCCAATGATCAGAGG

引物2，SEQ ID NO 34-ATATAGACTCAGGTATACACACT

探针，SEQ ID NO 35-FAM TCCCATCAGAATCCAAACAAGAGGAAG

结果：

附表包含获得的11个组织学阴性和24个组织学阳性淋巴结的C_t值。通过从组织学阳性样品观察到的最小C_t值减去2.5个循环来确定每个标记的阳性关闭。阳性样品用阴影表示。基于这些标准，确定单个标记的检测速率。乳腺珠蛋白与B305DA/C组合检测23/24个组织学阳性样品，获得最佳互补。乳腺珠蛋白，B305D和GABA的组合检测所有的24个样品。见表3。

表3

样品	MG	PIP	B305D	GABA	BT26	PBGO	Actin
样品	MG	PIP	B305D	GABA	BT26	PBGO	Actin	N1	50.0	36.2	35.8	36.6	50.0	30.6	21.6
N2	50.0	36.7	38.0	37.0	60.0	30.4	21.1	N1	50.0	36.2	35.8	36.6	50.0	30.6	21.6
N2	50.0	36.7	38.0	37.0	60.0	30.4	21.1	N3	50.0	37.8	39.6	38.1	50.0	28.6	23.1
N4	35.6	36.4	39.0	40.0	60.0	32.4	18.8	N3	50.0	37.8	39.6	38.1	50.0	28.6	23.1
N4	35.6	36.4	39.0	40.0	60.0	32.4	18.8	N5	48.4	40.0	40.0	40.0	50.0	35.8	21.1
N6	46.9	34.5	36.8	35.1	50.0	28.5	20.3	N5	48.4	40.0	40.0	40.0	50.0	35.8	21.1
N6	46.9	34.5	36.8	35.1	50.0	28.5	20.3	N7	50.0	35.2	40.0	38.4	50.0	27.8	20.3
N8	36.8	38.5	36.9	37.5	50.0	28.4	21.7	N7	50.0	35.2	40.0	38.4	50.0	27.8	20.3
N8	36.8	38.5	36.9	37.5	50.0	28.4	21.7	N9	50.0	37.0	37.8	36.4	50.0	30.0	20.1
N10	50.0	40.0	38.1	40.0	50.0	31.0	22.3	N9	50.0	37.0	37.8	36.4	50.0	30.0	20.1
N10	50.0	40.0	38.1	40.0	50.0	31.0	22.3	N11	50.0	38.4	35.8	38.8	50.0	28.4	18.7
C1	25.7	26.1	25.9	36.7	25.8	28.8	21.7	N11	50.0	38.4	35.8	38.8	50.0	28.4	18.7
C1	25.7	26.1	25.9	36.7	25.8	28.8	21.7	C2	35.0	32.5	35.5	27.2	41.5	28.0	23.2
C3	28.2	30.7	28.8	37.2	35.2	28.8	24.1	C2	35.0	32.5	35.5	27.2	41.5	28.0	23.2
C3	28.2	30.7	28.8	37.2	35.2	28.8	24.1	C4	25.7	22.3	28.7	30.4	37.8	27.3	20.5
C5	25.9	23.3	34.8	38.0	38.1	27.8	21.1	C4	25.7	22.3	28.7	30.4	37.8	27.3	20.5
C5	25.9	23.3	34.8	38.0	38.1	27.8	21.1	C6	22.7	35.6	28.8	28.9	40.4	26.2	20.4
C7	35.0	33.9	25.4	23.4	42.7	27.1	22.5	C6	22.7	35.6	28.8	28.9	40.4	26.2	20.4
C7	35.0	33.9	25.4	23.4	42.7	27.1	22.5	C8	22.7	25.3	28.3	36.0	37.8	27.8	18.9
C9	18.2	26.6	27.7	36.3	35.0	28.2	21.1	C8	22.7	25.3	28.3	36.0	37.8	27.8	18.9
C9	18.2	26.6	27.7	36.3	35.0	28.2	21.1	C10	20.2	30.0	27.4	33.6	38.7	29.4	23.2
C11	30.4	33.2	29.0	26.2	40.7	27.8	21.4	C10	20.2	30.0	27.4	33.6	38.7	29.4	23.2
C11	30.4	33.2	29.0	26.2	40.7	27.8	21.4	C12	18.6	27.7	24.3	38.0	33.6	26.8	19.4
C13	23.4	17.0	23.1	36.2	24.3	27.4	21.6	C12	18.6	27.7	24.3	38.0	33.6	26.8	19.4
C13	23.4	17.0	23.1	36.2	24.3	27.4	21.6	C14	35.8	30.7	25.0	38.6	42.3	31.3	21.7
C15	27.0	28.1	25.6	34.6	25.5	28.7	21.1	C14	35.8	30.7	25.0	38.6	42.3	31.3	21.7
C15	27.0	28.1	25.6	34.6	25.5	28.7	21.1	C16	32.5	34.5	36.8	23.6	46.1	27.7	27.8
C17	38.8	35.7	27.5	26.3	37.4	28.8	28.7	C16	32.5	34.5	36.8	23.6	46.1	27.7	27.8
C17	38.8	35.7	27.5	26.3	37.4	28.8	28.7	C18	36.9	34.8	28.2	24.7	50.0	28.4	22.0
C19	31.5	22.9	24.5	38.0	39.1	28.8	24.7	C18	36.9	34.8	28.2	24.7	50.0	28.4	22.0
C19	31.5	22.9	24.5	38.0	39.1	28.8	24.7	C20	22.3	27.6	21.4	32.6	32.8	27.0	21.6
C21	19.8	24.6	25.1	36.2	25.8	28.4	21.3	C20	22.3	27.6	21.4	32.6	32.8	27.0	21.6
C21	19.8	24.6	25.1	36.2	25.8	28.4	21.3	C22	32.2	28.4	25.8	37.9	37.3	30.6	23.5
C23	20.7	24.2	27.2	37.4	27.4	28.8	22.6	C22	32.2	28.4	25.8	37.9	37.3	30.6	23.5
C23	20.7	24.2	27.2	37.4	27.4	28.8	22.6	C24	33.0	27.1	22.6	24.3	40.4	26.4	20.0

culoff 33.8 32.3 33.3 33.6 37.5

检测的阳性样品 18/24 17/24 21/24 10/24 11/24

实施例5.多标记

反转录

由20μg总RNA于42℃在一个100μl的反应液中利用锚定寡dT引物反应60分钟合成cDNA。稀释的cDNA各20ng以每孔50ml的总体积在AppliedBiosystems7900中进行扩增。扩增按以下方案进行：94℃ 2min，然后进行(94℃ 15sec，62℃ 15sec及72℃ 45sec)50个循环。反应混合成分和终浓度如下：1XPCR缓冲液(ABI)，2.5Mm终MgCl₂，0.05mM dGTP，dCTP，cATP和TTP，0.05U/μl含有一个超过5-20X的2种抗-Taq抗体(TP4-9和TP1-12)的Taq聚合酶，引物各0.2μM(Invitrogen)，去Rnase/Dnase水(Sigma)和一个SYBRGreen母液(Sigma)的1∶20000的稀释液。扩增引物序列与那些用于淋巴结的TaqMan测试的一致。一个275荧光单位常用的阈值用于测定C_t值。C_t值然后转换为定量基因表达并相对于一个假定为从背景表达区分淋巴结所需的基因表达的最小水平的关闭值进行划分。

所用的引物：

乳腺珠蛋白

引物1，SEQ ID NO 3-CAAACGGATGAAACTCTGAGCAATGTTGA

引物2，SEQ ID NO 4-TCTGTGAGCCAAAGGTCTTGCAGA

B305D

引物1，SEQ ID NO 11-TCTGATAAAGGCCGTACAATG

引物2，SEQ ID NO 12-TCACGACTTGCTGTTTTTGCTC

图3-5中显示的数据表明了组合基因乳腺珠蛋白与B305D信号对获得大量的乳癌样品的平均值的作用。

实施例5：纯化的RNA的快速RT-PCR

将乳腺珠蛋白体外转录RNA(100,000拷贝)稀释到20ng白血细胞RNA中，并在一个Cepheid Smart CyclerII中于一个含有下述成分的反应液中进行一步RT-PCR扩增：50mM N-二(羟乙基)甘氨酸/氢氧化钾，pH 8.2，115mM醋酸钾，8％v/v甘油，0.2mg/ml BSA，150mM海藻糖，0.2％ v/v Tween 20，0.2mM Tris-HClpH8，3.5mM硫酸锰，0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM dTTP，100U/ml Tth，20μg/ml抗体TP6-25.3，0.45μM乳腺珠蛋白Scorpion和0.5μM乳腺珠蛋白引物。

PCR反应条件如下(星号表明其中荧光被测定的循环部分)：

条件A-95℃ 3sec，60℃ 7min，70℃ 2min，然后40个循环(95℃ 3sec，54℃6sec*，68℃ 6sec)-总时间＝34min

条件B-95℃ 3sec，60℃ 3min，然后40个循环(95℃ 3sec，54℃ 6sec^*，68℃6sec)-总时间＝29min

条件C-95℃ 3sec，60℃ 3min，然后40个循环(95℃ 3sec，58℃ 6sec^*，68℃6sec)-总时间＝26min

这个检测的结果如下表所示：

条件	模板	平均C<sub>t</sub>	总的检测时间(min)
条件	模板	平均C<sub>t</sub>	总的检测时间(min)	AA	IVT-RNANT	30.4750.00	34.00..
BB	IVT-RNANT	30.2650.00	29.00..	AA	IVT-RNANT	30.4750.00	34.00..
BB	IVT-RNANT	30.2650.00	29.00..	CC	IVT-RNANT	31.1550.00	26.00..

从数据可以看出，把反转录步骤由9min减少到3min对检测没有可观察到的影响。把退火温度升高到58℃对扩增只有最小的影响，并把总的RT-PCR时间减少到了26min。可以通过引物和探针结构和较高的最佳检测温度来进一步减少循环的时间。

实施例6：检测淋巴结转移的快速多元RT-PCR检测(预后的)

在这个实施例中，纯化的淋巴结RNA(每100μl反应液中≥100ng总RNA用于减少产生阳性结果所需的循环数)在一个Cepheid Smart Cycler II中进行一步RT-PCR扩增。反应液含有下述成分：50mM N-二(羟乙基)甘氨酸/氢氧化钾，pH8.2，115mM醋酸钾，8％ v/v甘油，0.2mg/ml BSA，150mM海藻糖，0.2％ v/v Tween20，0.2mM Tris-Cl，pH 8，3.5mM硫酸锰或醋酸锰，0.3mM dATP，0.3mM dCTP，0.3mM dGTP，0.3mM dTIP，100U/ml Tth，20μg/ml抗本TP6-25.3，Scorpion和引物各0.4-0.8μM。Scorpion和引物序列设计成使非特异性引物事件最小化，而且与具有下述的快速RT-PCR模式的多元扩增/检测谐调：

95℃ 3sec，60℃ 3min，然后32个循环：95℃ 1sec，65℃ 6sec^*，72℃ 3sec)-总扩增时间＝16min。

描述的快速样品制备方法需要≤4min完成(参考申请中的样品制备实施例)，结果总的检测时间≤20min。

为了检测乳癌转移到淋巴结，扩增了下述基因：乳腺珠蛋白，B305D和PBGD。乳腺珠蛋白和/或B305D信号指示转移，而PBGD用作一个看家基因。该实施例中，癌症阳性淋巴结的C_t值范围为：乳腺珠蛋白的是12-30，B305D的是12-28-在该C_t范围内检测任一基因都能指示一个癌症阳性淋巴结。该实施例中，对照基因PBGD的C_t值必须落在24-30个循环的范围内，以使一个癌症阴性结果被认为是有效的。

为了检测黑素瘤转移到淋巴结，利用同样的条件，除了下述以外：(1)处理怀疑含有黑素瘤的淋巴结和(2)扩增以下基因：MART，酪氨酸酶和PBGD。MART1和/或酪氨酸酶信号指示黑素瘤转移到淋巴结，而PBGD用作一个看家基因。该实施例中，癌症阳性淋巴结的C_t值范围为：酪氨酸酶的是18-30，MART1的是12-27-在该范围内检测任一基因都能指示一个癌症阳性淋巴结。该实施例中，对照基因PBGD的C_t值必须落在24-30个循环的范围内，以使一个癌症阴性结果被认为是有效的。

表7

不同乳腺细胞类型中B305D的表达

表8

不同乳腺细胞类型中乳腺珠蛋白和B305的组合表达

序列表 CPCH0461241

<110>Johnson & Johnson

Atkins，David

Backus，John

Belly，Robert

Rosen，Steven

White，Robert

<120>手术中淋巴结检测

<130>CDS 5009

<160>35

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>1

atgactgcct tgcctcctca gta 23

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>2

ggctgttgct tggacttctc taaaga 26

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>3

caaacggatg aaactctgag caatgttga 29

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>4

tctgtgagcc aaaggtcttg caga 24

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>5

ggccaacaaa gctcaggaca aca 23

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>6

gcagtgactt cgtcatttgg acgta 25

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是一个探针

<400>7

tgtttatgca attaatatat gacagcagtc tttgtg 36

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>8

ctgaggcacc tggaaggagg 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>9

catcttcatg ctgggcaggg 20

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>10

ctgaggcacc tggaaggagg ctgcagtgt 29

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>11

tctgataaag gccgtacaat g 21

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>12

tcacgacttg ctgtttttgc tc 22

<210>13

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是一个探针

<400>13

atcaaaaaac aagcatggcc tacacc 26

<210>14

<211>1155

<212>DNA

<213>人类的

<400>14

atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc 60

aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag 120

agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag 180

atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg 240

ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag 300

tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcagca agagcaaggt gggcgcttgg 360

ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg 420

gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg 480

ctcagggaca ctgacgtgaa caagcaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc 540

tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat 600

gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa 660

tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat 720

accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta 780

tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta 840

catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaattaaga aaaaagcgaa tttaaatgca 900

ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata 960

gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020

gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac 1080

aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140

accagaaata aataa 1155

<210>15

<211>3865

<212>DNA

<213>人类的

<400>15

tccgagctga ttacagacac caaggaagat gctgtaaaga gtcagcagcc acagccctgg 60

ctagctggcc ctgtgggcat ttattagtaa agttttaatg acaaaagctt tgagtcaaca 120

cacccgtggg taattaacct ggtcatcccc accctggaga gccatcctgc ccatgggtga 180

tcaaagaagg aacatctgca ggaacacctg atgaggctgc acccttggcg gaaagaacac 240

ctgacacagc tgaaagcttg gtggaaaaaa cacctgatga ggctgcaccc ttggtggaaa 300

gaacacctga cacggctgaa agcttggtgg aaaaaacacc tgatgaggct gcatccttgg 360

tggagggaac atctgacaaa attcaatgtt tggagaaagc gacatctgga aagttcgaac 420

agtcagcaga agaaacacct agggaaatta cgagtcctgc aaaagaaaca tctgagaaat 480

ttacgtggcc agcaaaagga agacctagga agatcgcatg ggagaaaaaa gaagacacac 540

ctagggaaat tatgagtccc gcaaaagaaa catctgagaa atttacgtgg gcagcaaaag 600

gaagacctag gaagatcgca tgggagaaaa aagaaacacc tgtaaagact ggatgcgtgg 660

caagagtaac atctaataaa actaaagttt tggaaaaagg aagatctaag atgattgcat 720

gtcctacaaa agaatcatct acaaaagcaa gtgccaatga tcagaggttc ccatcagaat 780

ccaaacaaga ggaagatgaa gaatattctt gtgattctcg gagtctcttt gagagttctg 840

caaagattca agtgtgtata cctgagtcta tatatcaaaa agtaatggag ataaatagag 900

aagtagaaga gcctcctaag aagccatctg ccttcaagcc tgccattgaa atgcaaaact 960

ctgttccaaa taaagccttt gaattgaaga atgaacaaac attgagagca gatccgatgt 1020

tcccaccaga atccaaacaa aaggactatg aagaaaattc ttgggattct gagagtctct 1080

gtgagactgt ttcacagaag gatgtgtgtt tacccaaggc tacacatcaa aaagaaatag 1140

ataaaataaa tggaaaatta gaagagtctc ctaataaaga tggtcttctg aaggctacct 1200

gcggaatgaa agtttctatt ccaactaaag ccttagaatt gaaggacatg caaactttca 1260

aagcagagcc tccggggaag ccatctgcct tcgagcctgc cactgaaatg caaaagtctg 1320

tcccaaataa agccttggaa ttgaaaaatg aacaaacatt gagagcagat gagatactcc 1380

catcagaatc caaacaaaag gactatgaag aaagttcttg ggattctgag agtctctgtg 1440

agactgtttc acagaaggat gtgtgtttac ccaaggctrc rcatcaaaaa gaaatagata 1500

aaataaatgg aaaattagaa gggtctcctg ttaaagatgg tcttctgaag gctaactgcg 1560

gaatgaaagt ttctattcca actaaagcct tagaattgat ggacatgcaa actttcaaag 1620

cagagcctcc cgagaagcca tctgccttcg agcctgccat tgaaatgcaa aagtctgttc 1680

caaataaagc cttggaattg aagaatgaac aaacattgag agcagatgag atactcccat 1740

cagaatccaa acaaaaggac tatgaagaaa gttcttggga ttctgagagt ctctgtgaga 1800

ctgtttcaca gaaggatgtg tgtttaccca aggctrcrca tcaaaaagaa atagataaaa 1860

taaatggaaa attagaagag tctcctgata atgatggttt tctgaaggct ccctgcagaa 1920

tgaaagtttc tattccaact aaagccttag aattgatgga catgcaaact ttcaaagcag 1980

agcctcccga gaagccatct gccttcgagc ctgccattga aatgcaaaag tctgttccaa 2040

ataaagcctt ggaattgaag aatgaacaaa cattgagagc agatcagatg ttcccttcag 2100

aatcaaaaca aaagaasgtt gaagaaaatt cttgggattc tgagagtctc cgtgagactg 2160

tttcacagaa ggatgtgtgt gtacccaagg ctacacatca aaaagaaatg gataaaataa 2220

gtggaaaatt agaagattca actagcctat caaaaatctt ggatacagtt cattcttgtg 2280

aaagagcaag ggaacttcaa aaagatcact gtgaacaacg tacaggaaaa atggaacaaa 2340

tgaaaaagaa gttttgtgta ctgaaaaaga aactgtcaga agcaaaagaa ataaaatcac 2400

agttagagaa ccaaaaagtt aaatgggaac aagagctctg cagtgtgaga ttgactttaa 2460

accaagaaga agagaagaga agaaatgccg atatattaaa tgaaaaaatt agggaagaat 2520

taggaagaat cgaagagcag cataggaaag agttagaagt gaaacaacaa cttgaacagg 2580

ctctcagaat acaagatata gaattgaaga gtgtagaaag taatttgaat caggtttctc 2640

acactcatga aaatgaaaat tatctcttac atgaaaattg catgttgaaa aaggaaattg 2700

ccatgctaaa actggaaata gccacactga aacaccaata ccaggaaaag gaaaataaat 2760

actttgagga cattaagatt ttaaaagaaa agaatgctga acttcagatg accctaaaac 2820

tgaaagagga atcattaact aaaagggcat ctcaatatag tgggcagctt aaagttctga 2880

tagctgagaa cacaatgctc acttctaaat tgaaggaaaa acaagacaaa gaaatactag 2940

aggcagaaat tgaatcacac catcctagac tggcttctgc tgtacaagac catgatcaaa 3000

ttgtgacatc aagaaaaagt caagaacctg ctttccacat tgcaggagat gcttgtttgc 3060

aaagaaaaat gaatgttgat gtgagtagta cgatatataa caatgaggtg ctccatcaac 3120

cactttctga agctcaaagg aaatccaaaa gcctaaaaat taatctcaat tatgcmggag 3180

atgctctaag agaaaataca ttggtttcag aacatgcaca aagagaccaa cgtgaaacac 3240

agtgtcaaat gaaggaagct gaacacatgt atcaaaacga acaagataat gtgaacaaac 3300

acactgaaca gcaggagtct ctagatcaga aattatttca actacaaagc aaaaatatgt 3360

ggcttcaaca gcaattagtt catgcacata agaaagctga caacaaaagc aagataacaa 3420

ttgatattca ttttcttgag aggaaaatgc aacatcatct cctaaaagag aaaaatgagg 3480

agatatttaa ttacaataac catttaaaaa accgtatata tcaatatgaa aaagagaaag 3540

cagaaacaga aaactcatga gagacaagca gtaagaaact tcttttggag aaacaacaga 3600

ccagatcttt actcacaact catgctagga ggccagtcct agcatcacct tatgttgaaa 3660

atcttaccaa tagtctgtgt caacagaata cttattttag aagaaaaatt catgatttct 3720

tcctgaagcc tacagacata aaataacagt gtgaagaatt acttgttcac gaattgcata 3780

aagctgcaca ggattcccat ctaccctgat gatgcagcag acatcattca atccaaccag 3840

aatctcgctc tgtcactcag gctgg 3865

<210>16

<211>3282

<212>DNA

<213>人类的

<400>16

gggacagggc tgaggatgag gagaaccctg gggacccaga agaccgtgcc ttgcccggaa 60

gtcctgcctg taggcctgaa ggacttgccc taacagagcc tcaacaacta cctggtgatt 120

cctacttcag ccccttggtg tgagcagctt ctcaacatga actacagcct ccacttggcc 180

ttcgtgtgtc tgagtctctt cactgagagg atgtgcatcc aggggagtca gttcaacgtc 240

gaggtcggca gaagtgacaa gctttccctg cctggctttg agaacctcac agcaggatat 300

aacaaatttc tcaggcccaa ttttggtgga gaacccgtac agatagcgct gactctggac 360

attgcaagta tctctagcat ttcagagagt aacatggact acacagccac catatacctc 420

cgacagcgct ggatggacca gcggctggtg tttgaaggca acaagagctt cactctggat 480

gcccgcctcg tggagttcct ctgggtgcca gatacttaca ttgtggagtc caagaagtcc 540

ttcctccatg aagtcactgt gggaaacagg ctcatccgcc tcttctccaa tggcacggtc 600

ctgtatgccc tcagaatcac gacaactgtt gcatgtaaca tggatctgtc taaatacccc 660

atggacacac agacatgcaa gttgcagctg gaaagctggg gctatgatgg aaatgatgtg 720

gagttcacct ggctgagagg gaacgactct gtgcgtggac tggaacacct gcggcttgct 780

cagtacacca tagagcggta tttcacctta gtcaccagat cgcagcagga gacaggaaat 840

tacactagat tggtcttaca gtttgagctt cggaggaatg ttctgtattt cattttggaa 900

acctacgttc cttccacttt cctggtggtg ttgtcctggg tttcattttg gatctctctc 960

gattcagtcc ctgcaagaac ctgcattgga gtgacgaccg tgttatcaat gaccacactg 1020

atgatcgggt cccgcacttc tcttcccaac accaactgct tcatcaaggc catcgatgtg 1080

tacctgggga tctgctttag ctttgtgttt ggggccttgc tagaatatgc agttgctcac 1140

tacagttcct tacagcagat ggcagccaaa gataggggga caacaaagga agtagaagaa 1200

gtcagtatta ctaatatcat caacagctcc atctccagct ttaaacggaa gatcagcttt 1260

gccagcattg aaatttccag cgacaacgtt gactacagtg acttgacaat gaaaaccagc 1320

gacaagttca agtttgtctt ccgagaaaag atgggcagga ttgttgatta tttcacaatt 1380

caaaacccca gtaatgttga tcactattcc aaactactgt ttcctttgat ttttatgcta 1440

gccaatgtat tttactgggc atactacatg tatttttgag tcaatgttaa atttcttgca 1500

tgccataggt cttcaacagg acaagataat gatgtaaatg gtattttagg ccaagtgtgc 1560

acccacatcc aatggtgcta caagtgactg aaataatatt tgagtctttc tgctcaaaga 1620

atgaagctcc aaccattgtt ctaagctgtg tagaagtcct agcattatag gatcttgtaa 1680

tagaaacatc agtccattcc tctttcatct taatcaagga cattcccatg gagcccaaga 1740

ttacaaatgt actcagggct gtttattcgg tggctccctg gtttgcattt acctcatata 1800

aagaatggga aggagaccat tgggtaaccc tcaagtgtca gaagttgttt ctaaagtaac 1860

tatacatgtt ttttactaaa tctctgcagt gcttataaaa tacattgttg cctatttagg 1920

gagtaacatt ttctagtttt tgtttctggt taaaatgaaa tatgggctta tgtcaattca 1980

ttggaagtca atgcactaac tcaataccaa gatgagtttt taaataatga atattattta 2040

ataccacaac agaattatcc ccaatttcca ataagtccta tcattgaaaa ttcaaatata 2100

agtgaagaaa aaattagtag atcaacaatc taaacaaatc cctcggttct aagatacaat 2160

ggattcccca tactggaagg actctgaggc tttattcccc cactatgcat atcttatcat 2220

tttattatta tacacacatc catcctaaac tatactaaag cccttttccc atgcatggat 2280

ggaaatggaa gatttttttg taacttgttc tagaagtctt aatatgggct gttgccatga 2340

aggcttgcag aattgagtcc attttctagc tgcctttatt cacatagtga tggggtacta 2400

aaagtactgg gttgactcag agagtcgctg tcattctgtc attgctgcta ctctaacact 2460

gagcaacact ctcccagtgg cagatcccct gtatcattcc aagaggagca ttcatccctt 2520

tgctctaatg atcaggaatg atgcttatta gaaaacaaac tgcttgaccc aggaacaagt 2580

ggcttagctt aagtaaactt ggctttgctc agatccctga tccttccagc tggtctgctc 2640

tgagtggctt atcccgcatg agcaggagcg tgctggccct gagtactgaa ctttctgagt 2700

aacaatgaga cacgttacag aacctatgtt caggttgcgg gtgagctgcc ctctccaaat 2760

ccagccagag atgcacattc ctcggccagt ctcagccaac agtaccaaaa gtgatttttg 2820

agtgtgccag ggtaaaggct tccagttcag cctcagttat tttagacaat ctcgccatct 2880

ttaatttctt agcttcctgt tctaataaat gcacggcttt acctttcctg tcagaaataa 2940

accaaggctc taaaagatga tttcccttct gtaactccct agagccacag gttctcattc 3000

cttttcccat tatacttctc acaattcagt ttctatgagt ttgatcacct gattttttta 3060

acaaaatatt tctaacggga atgggtggga gtgctggtga aaagagatga aatgtggttg 3120

tatgagccaa tcatatttgt gattttttaa aaaaagttta aaaggaaata tctgttctga 3180

aaccccactt aagcattgtt tttatataaa aacaatgata aagatgtgaa ctgtgaaata 3240

aatataccat attagctacc caccaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3282

<210>17

<211>503

<212>DNA

<213>人类的

<400>17

gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60

atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120

ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180

gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240

gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300

atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360

gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt 420

ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg 480

tttattttaa taaattgatg gca 503

<210>18

<211>503

<212>DNA

<213>人类的

<400>18

gacagcggct tccttgatcc ttgccacccg cgactgaaca ccgacagcag cagcctcacc 60

atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 120

ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 180

gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 240

gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgaggtgttt 300

atgcaattaa tatatgacag cagtctttgt gatttatttt aactttctgc aagacctttg 360

gctcacagaa ctgcagggta tggtgagaaa ccaactacgg attgctgcaa accacacctt 420

ctctttctta tgtcttttta ctacaaacta caagacaatt gttgaaacct gctatacatg 480

tttattttaa taaattgatg gca 503

<210>19

<211>1793

<212>DNA

<213>人类的

<400>19

cgcgtccgcc ccgcgagcac agagcctcgc ctttgccgat ccgccgcccg tccacacccg 60

ccgccagctc accatggatg atgatatcgc cgcgctcgtc gtcgacaacg gctccggcat 120

gtgcaaggcc ggcttcgcgg gcgacgatgc cccccgggcc gtcttcccct ccatcgtggg 180

gcgccccagg caccagggcg tgatggtggg catgggtcag aaggattcct atgtgggcga 240

cgaggcccag agcaagagag gcatcctcac cctgaagtac cccatcgagc acggcatcgt 300

caccaactgg gacgacatgg agaaaatctg gcaccacacc ttctacaatg agctgcgtgt 360

ggctcccgag gagcaccccg tgctgctgac cgaggccccc ctgaacccca aggccaaccg 420

cgagaagatg acccagatca tgtttgagac cttcaacacc ccagccatgt acgttgctat 480

ccaggctgtg ctatccctgt acgcctctgg ccgtaccact ggcatcgtga tggactccgg 540

tgacggggtc acccacactg tgcccatcta cgaggggtat gccctccccc atgccatcct 600

gcgtctggac ctggctggcc gggacctgac tgactacctc atgaagatcc tcaccgagcg 660

cggctacagc ttcaccacca cggccgagcg ggaaatcgtg cgtgacatta aggagaagct 720

gtgctacgtc gccctggact tcgagcaaga gatggccacg gctgcttcca gctcctccct 780

ggagaagagc tacgagctgc ctgacggcca ggtcatcacc attggcaatg agcggttccg 840

ctgccctgag gcactcttcc agccttcctt cctgggcatg gagtcctgtg gcatccacga 900

aactaccttc aactccatca tgaagtgtga cgtggacatc cgcaaagacc tgtacgccaa 960

cacagtgctg tctggcggca ccaccatgta ccctggcatt gccgacagga tgcagaagga 1020

gatcactgcc ctggcaccca gcacaatgaa gatcaagatc attgctcctc ctgagcgcaa 1080

gtactccgtg tggatcggcg gctccatcct ggcctcgctg tccaccttcc agcagatgtg 1140

gatcagcaag caggagtatg acgagtccgg cccctccatc gtccaccgca aatgcttcta 1200

ggcggactat gacttagttg cgttacaccc tttcttgaca aaacctaact tgcgcagaaa 1260

acaagatgag attggcatgg ctttatttgt tttttttgtt ttgttttggt tttttttttt 1320

tttttggctt gactcaggat ttaaaaactg gaacggtgaa ggtgacagca gtcggttgga 1380

gcgagcatcc cccaaagttc acaatgtggc cgaggacttt gattgcacat tgttgttttt 1440

ttaatagtca ttccaaatat gagatgcatt gttacaggaa gtcccttgcc atcctaaaag 1500

ccaccccact tctctctaag gagaatggcc cagtcctctc ccaagtccac acaggggagg 1560

tgatagcatt gctttcgtgt aaattatgta atgcaaaatt tttttaatct tcgccttaat 1620

acttttttat tttgttttat tttgaatgat gagccttcgt gccccccctt cccccttttt 1680

gtcccccaac ttgagatgta tgaaggcttt tggtctccct gggagtgggt ggaggcagcc 1740

agggcttacc tgtacactga cttgagacca gttgaataaa agtgcacacc tta 1793

<210>20

<211>1377

<212>DNA

<213>人类的

<400>20

cacacagcct actttccaag cggagccatg tctggtaacg gcaatgcggc tgcaacggcg 60

gaagaaaaca gcccaaagat gagagtgatt cgcgtgggta cccgcaagag ccagcttgct 120

cgcatacaga cggacagtgt ggtggcaaca ttgaaagcct cgtaccctgg cctgcagttt 180

gaaatcattg ctatgtccac cacaggggac aagattcttg atactgcact ctctaagatt 240

ggagagaaaa gcctgtttac caaggagctt gaacatgccc tggagaagaa tgaagtggac 300

ctggttgttc actccttgaa ggacctgccc actgtgcttc ctcctggctt caccatcgga 360

gccatctgca agcgggaaaa ccctcatgat gctgttgtct ttcacccaaa atttgttggg 420

aagaccctag aaaccctgcc agagaagagt gtggtgggaa ccagctccct gcgaagagca 480

gcccagctgc agagaaagtt cccgcatctg gagttcagga gtattcgggg aaacctcaac 540

acccggcttc ggaagctgga cgagcagcag gagttcagtg ccatcatcct agcaacagct 600

ggcctgcagc gcatgggctg gcacaaccgg gtggggcaga tcctgcaccc tgagaaatgc 660

atgtatgctg tgggccaggg ggccttgggc gtggaagtgc gagccaagga ccaggacatc 720

ttggatctgg tgggtgtgct gcacgatccc gagactctgc ttcgctgcat cgctgaaagg 780

gccttcctga ggcacctgga aggaggctgc agtgtgccag tagccgtgca tacagctatg 840

aaggatgggc aactgtacct gactggagga gtctggagtc tagacggctc agatagcata 900

caagagacca tgcaggctac catccatgtc cctgcccagc atgaagatgg ccctgaggat 960

gacccacagt tggtaggcat cactgctcgt aacattccac gagggcccca gttggctgcc 1020

cagaacttgg gcatcagcct ggccaacttg ttgctgagca aaggagccaa aaacatcctg 1080

gatgttgcac ggcagcttaa cgatgcccat taactggttt gtggggcaca gatgcctggg 1140

ttgctgctgt ccagtgccta catcccgggc ctcagtgccc cattctcact gctatctggg 1200

gagtgattac cccgggagac tgaactgcag ggttcaagcc ttccagggat ttgcctcacc 1260

ttggggcctt gatgactgcc ttgcctcctc agtatgtggg ggcttcatct ctttagagaa 1320

gtccaagcaa cagcctttga atgtaaccaa tcctactaat aaaccagttc tgaaggt 1377

<210>21

<211>1524

<212>DNA

<213>人类的

<400>21

agcagacaga ggactctcat taaggaaggt gtcctgtgcc ctgaccctac aagatgccaa 60

gagaagatgc tcacttcatc tatggttacc ccaagaaggg gcacggccac tcttacacca 120

cggctgaaga ggccgctggg atcggcatcc tgacagtgat cctgggagtc ttactgctca 180

tcggctgttg gtattgtaga agacgaaatg gatacagagc cttgatggat aaaagtcttc 240

atgttggcac tcaatgtgcc ttaacaagaa gatgcccaca agaagggttt gatcatcggg 300

acagcaaagt gtctcttcaa gagaaaaact gtgaacctgt ggttcccaat gctccacctg 360

cttatgagaa actctctgca gaacagtcac caccacctta ttcaccttaa gagccagcga 420

gacacctgag acatgctgaa attatttctc tcacactttt gcttgaattt aatacagaca 480

tctaatgttc tcctttggaa tggtgtagga aaaatgcaag ccatctctaa taataagtca 540

gtgttaaaat tttagtaggt ccgctagcag tactaatcat gtgaggaaat gatgagaaat 600

attaaattgg gaaaactcca tcaataaatg ttgcaatgca tgatactatc tgtgccagag 660

gtaatgttag taaatccatg gtgttatttt ctgagagaca gaattcaagt gggtattctg 720

gggccatcca atttctcttt acttgaaatt tggctaataa caaactagtc aggttttcga 780

accttgaccg acatgaactg tacacagaat tgttccagta ctatggagtg ctcacaaagg 840

atacttttac aggttaagac aaagggttga ctggcctatt tatctgatca agaacatgtc 900

agcaatgtct ctttgtgctc taaaattcta ttatactaca ataatatatt gtaaagatcc 960

tatagctctt tttttttgag atggagtttc gcttttgttg cccaggctgg agtgcaatgg 1020

cgcgatcttg gctcaccata acctccgcct cccaggttca agcaattctc ctgccttagc 1080

ctcctgagta gctgggatta caggcgtgcg ccactatgcc tgactaattt tgtagtttta 1140

gtagagacgg ggtttctcca tgttggtcag gctggtctca aactcctgac ctcaggtgat 1200

ctgcccgcct cagcctccca aagtgctgga attacaggcg tgagccacca cgcctggctg 1260

gatcctatat cttaggtaag acatataacg cagtctaatt acatttcact tcaaggctca 1320

atgctattct aactaatgac aagtattttc tactaaacca gaaattggta gaaggattta 1380

aataagtaaa agctactatg tactgcctta gtgctgatgc ctgtgtactg ccttaaatgt 1440

acctatggca atttagctct cttgggttcc caaatccctc tcacaagaat gtgcagaaga 1500

aatcataaag gatcagagat tctg 1524

<210>22

<211>2384

<212>DNA

<213>人类的

<400>22

tattgagttc ttcaaacatt gtagcctctt tatggtctct gagaaataac taccttaaac 60

ccataatctt taatacttcc taaactttct taataagaga agctctattc ctgacactac 120

ctctcatttg caaggtcaaa tcatcattag ttttgtagtc tattaactgg gtttgcttag 180

gtcaggcatt attattacta accttattgt taatattcta accataagaa ttaaactatt 240

aatggtgaat agagtttttc actttaacat aggcctatcc cactggtggg atacgagcca 300

attcgaaaga aaagtcagtc atgtgctttt cagaggatga aagcttaaga taaagactaa 360

aagtgtttga tgctggaggt gggagtggta ttatataggt ctcagccaag acatgtgata 420

atcactgtag tagtagctgg aaagagaaat ctgtgactcc aattagccag ttcctgcaga 480

ccttgtgagg actagaggaa gaatgctcct ggctgttttg tactgcctgc tgtggagttt 540

ccagacctcc gctggccatt tccctagagc ctgtgtctcc tctaagaacc tgatggagaa 600

ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagcttt caggcagagg 660

ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttc ccttcacagg 720

ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgcc agtgctctgg 780

caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggac caaactgcac 840

agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccag agaaggacaa 900

attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatg tcatccccat 960

agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgaca tcaatattta 1020

tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttg ggggatctga 1080

aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgcctt ggcatagact 1140

cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaa acttcactat 1200

tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatg agtacatggg 1260

aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttct cctcttggca 1320

gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgca atggaacgcc 1380

cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccc caaggctccc 1440

ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctg gttccatgga 1500

taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtc cacttactgg 1560

gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctata tgaatggaac 1620

aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcacc atgcatttgt 1680

tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaag tttatccaga 1740

agccaatgca cccattggac ataaccggga atcctacatg gttcctttta taccactgta 1800

cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactata gctatctaca 1860

agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg 1920

gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactg ccctgctggc 1980

agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaag aaaagcagcc 2040

actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttat aaaaggctta 2100

ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaat gtccaggttc 2160

ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgt aacctaatac 2220

aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttg ctgttttcac 2280

tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatg ctatttggta 2340

atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta tttt 2384

<210>23

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是一个探针

<400>23

cctgaggcac ctggaaggag gctgcagtgt 30

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的一个探针

<400>24

atcaaaaaac aagcatggcc tcacacc 27

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>25

ctgcttcgct gcatcgctga aa 22

<210>26

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>26

cagactcctc cagtcaggta ca 22

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>27

gcttggtggt taaaacttac c 21

<210>28

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>28

tgaacagttc tgttggtgta 20

<210>29

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是一个探针

<400>29

ctgcctgcct atgtgacgac aatccgg 27

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>30

caattttggt ggagaacccg 20

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>31

gctgtcggag gtatatggtg 20

<210>32

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是一个探针

<400>32

catttcagag agtaacatgg actacaca 28

<210>33

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>33

gcaagtgcca atgatcagag g 21

<210>34

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是引物

<400>34

atatagactc aggtatacac act 23

<210>35

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列是一个探针

<400>35

tcccatcaga atccaaacaa gaggaag 27

Claims

1.由Seq ID No1-6，8-12，25-28，30和33-35组成的引物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于进行手术中的淋巴结检测。

2.一种进行手术中淋巴结检测的试剂盒，包括：核苷酸扩增和检测试剂，其中所述的试剂包括具有检测存在选自Seq ID No.14-18和Seq ID No21-22的标记的序列的引物，而且所述的引物为Seq ID No1-6，8-12，25-28，30和33-35。

3.权利要求2的试剂盒，还包括RT-PCR试剂。